CINETICA ENZIMATICA Dra EMMA GUERRERO HURTADO

CINETICA QUIMICA Cintica Qumica es aquella parte de la Qumica que se encarga de estudiar la velocidad de una Reaccin Qumica y los factores que permiten su control. Se limita a :

Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICASSegn el nmero de molculas:A P

A + B p

A + B + C P

SEGN EL NMERO DE REACCIN

R. Primer Orden: A P

V= -d A= K (A)dTR. Segundo Orden: A+ B PV= -dA = -dB + dP dT dTdT

V= K (A) (B)

CINETICA DE MICHAELIS-MENTENEn 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teria para explicar la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima, en funcin a la concentracin del sustrato.

La concentracin de sustrato que produce la mitad de la velocidad mxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como funcin de [S].La expresin de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :

Sacarosa Glucosa + Fructosa

Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales

a)(E) variable y (S) constante

b)(E) constante y (S) variableinvertasaagua

(E) A) Efecto de la (E) sobre la velocidad EnzimticaVoVo & (E)

-------------------------------------------------------Vo1/2 VmaxSustrato KMB) Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de una reaccin

(S)

KM = Constante de Michaelis -MentenConstante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reaccin de interaccin entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reaccin

Vmax = Cuando el enzima se halla saturado Se supone: E + S ES ES E + P

Como se relacionan Vmax, Km y Vo?Observemos : * K1 K3 E + S ES E + P K2 K4Que hay un solo sustrato Que la velocidad K4 se desprecia* Que la concentracin del E es muy pequea* Que la E puede estar como: E libre y ES* Que el equilibrio alcanzado por K1 es ms rpido que K3, por lo que ste es limitante determina, o limita, la cantidad de producto formado

POR LO QUE...LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:VO = K 3(ES)LA ECUACION RESULTANTE SERA: VO =Vmax.(S) Ecuac. MichaelisMenten(S) + Km

La dependencia de la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuacin de Michaelis-Menten como sigue:

.-1)Cuando [S] es igual que Km:

vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax Km + [S] [S]+ [S] 2[S] 2

2)Km= K2 + K3/ K1

Si K2>> K3 Km =K2/K1

K m= (E) (S) K = (E) (S) (ES) ES)

SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA

Vmax= K3 (ET)

# de recambio

K3= nmero de molculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

NMERO DE RECAMBIO

Carboxipeptidasa102Tripsina102 a 103Cinasas103Deshidrogenasas103Transaminasas103Anhidrasa carbonica106Superoxido dismutasa106catalasa107

DETERMINACIN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL

Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S]

Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax

La ecuacin de la recta es: y = a * x + b

La ecuacin de la recta es: y = a * x + b

donde: y = 1 y x = 1 Vo [S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la grfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la interseccin negativa de x.

-1/Km1/Vmax y = a * x + b

INHIBICION ENZIMATICA

ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA

APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIIBIDORESInhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:E + IEI2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:E + IEES + IESI

INHIBICIN REVERSIBLE(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIN DEL SUBSTRATO: Inhibicin Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero s impide la accin cataltica: Inhibicin No Competitiva

EESEIISE + PCaractersticas:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del substrato.- El inhibidor es tan especfico como el substratoSe define una constante deequilibrio de disociacin delinhibidor:Ki = [E] [I][EI]Inhibicin Competitiva

Por tanto, en la inhibicin competitiva, 1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia del inhibidor competitivo.

-1/Km-1/(Km(1 + i/Ki))1/VmaxInhibicin competitiva - Representacin recproca doble

Succinato deshidrogenasaInhibidorescompetitivos

Inhibidores competitivoscomo nalogos estructuralesdel substrato

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVA

E + I EI

I + ES ESI

El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe as de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

DROGAUSO TERAPEUTICOENZIMA AFECTADATIPO DE INHIBICION

LovastinaHipercolesterolemiaHMGCoA reductasaCompetitiva5fluoroacilcancerDihidrofolato reductasacompetitivaalopurinolgotaXantino oxidasairreversiblecumadinanticoagulanteGlutamilcarboxilasacompetitivacaptoprilhipertensinECAcompetitiva

concepto de Anlogo de Estado de Transicin (AET)- El inhibidor no es estrictamente anlogo del substrato, sino del Estado de Transicin de la reaccin.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijacin es tan fuerte que puede considerarse irreversible

SubstratoEstado detransicinAnlogo deestado de transicin

EN EL ESTADO DE TRANSICIN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON PTIMAS

INHIBICIN IRREVERSIBLE- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente

E + I EEl efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, (a) Agentes alquilantesYodoacetato(b) Compuestos insaturadosN-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2(c) Formadores de mercptidos p-Hidroximercuribenzoato(d) Oxidantes

Promueven la oxidacin de dos tioles a un disulfuro

OrganofosfricosDFP:diisopropilfluorofosfato- Actan sobre enzimas sernicas- nicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinacin de metalesEs el caso del ion cianuro, CN-Se fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacindel Fe hemnico, impidiendo toda modificacin posterior.

Por ello acta sobre sistemas de Fe hemnico con la sexta posicin de coordinacin libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadsima toxicidad

SUBSTRATOS SUICIDAS(Inhibidores activados enzimticamente)- Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivndola

Tienen por tanto : (a) la especificidad del inhibidor competitivo y

(b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + IEIEI*E + I*Modo de accin de los inhibidores suicidas1231. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS, - SISTEMA DE LA b-LACTAMASA BACTERIANALa utilizacin masiva de antibiticos b-lactmicos (penicilinas,sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparicin de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son porproducir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibi-ticos b-lactmicos.

b-LactamasaPenicilina (activa)c.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintticas se formulan aadiendo un inhibidor suicidade la b-lactamasa, el cido clavulnicob-LactamasaEsta molculareacciona con laserina activa de lab-lactamasa, produciendo suinactivacinc.clavulnico

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRALLos estados depresivos, en general, estn relacionados con undescenso en la concentracin de neurotransmisores adrenrgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradacin de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibicin de la monoamino oxidasa se emplea comoteraputica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

NoradrenalinaDihidroxifenilglicolMonoaminooxidasaLa MAO es una flavoprotena:tiene un grupo prostticoflavnico (FAD) fundamentalpara la catlisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

FlavinaFlavina modificadaN,N dimetilpropargilamina(pargilina)Inhibicin suicida de laMAO mediante Pargilina

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES

1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple

Azahar:

A +E AE

A E + B AEB

B+ E BE

BE + A BEA

2) ORDENADA

MALATO + NAD

OXALACETATO + NADH.

E-NAD-MALATO 1 2

M.D

2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO

ASPARTATO + OXOGLUTARATO

OXALACETATO + GLUTAMATO

1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + Oxalacetato

2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + Glutamato

PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE UNION DE LIGANDOS:1.- Catalticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato.2.- Reguladoras (Centro Alostrico) a las que se unen las molculas denominada efectores o moduladores.ENZIMAS ALOSTERICOS

MOLCULAS EFECTORAS O MODULADORASSon molculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad cataltica.

No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.

cuando es el sustrato se denominan HOMOTROPICO

Cuando es otra sustancia se le denomina HETEROTROPICO

SEFSEFENZIMACAC.ALOST.ENZIMAS ALOSTERICAS

Enzimas susceptibles de ser modificadas por molculas pequeas. ENZIMAS ALOSTERICAS

CINETICA SIGMOIDEALa unin cooperativa de la primera molcula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unin de subsecuentes molculas de sustrato a los otros sitios de unin: cooperatividad positiva

TESTADO CONFORMACIONALRBaja afinidad por el sustratoAlta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS

MODELO CONCERTADO:+ SRRRRTT

MODELO SECUENCIAL :+ S+ SRTRRTT

*