clase bioprocesos gortiz

Introducción a los

Bioprocesos

Gastón [email protected]

Introducción a la Biotecnología 2011IIB-UNSAM

� Una breve historia� Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y más tarde las

chinas comienzan a producir alimentos y bebidas fermentadas.

� Sin embargo, pasan casi 7000 años para descubrir el origen microbiano de la fermentación (1856).

� Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos químicos industriales (1900).

� 70 años más para obtener el primer organismo transgénico (1972).

� Y 5 años más para la obtención de la primera proteína humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)

Introducción a los Bioprocesos


� ¿Que es un bioproceso?� Es todo proceso industrial que involucra la manipulación

de organismos vivos o sus componentes celulares para proveer bienes o servicios� Bienes: (antibióticos, hormonas, fermentos, vacunas,

ácidos orgánicos, amino ácidos, biocombustibles, biomasa, etc.)

� Servicios (biorremediación, biolixiviación, tratamiento de efluentes)

De acuerdo a su definición tenemos: Bioprocesos

y biotransformaciones.

BIOPROCESOSon los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS(nutrientes) son transformados por acción biológica (microorganismos, células, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS

Moléculas complejasAntibióticos, drogas, vacunas, efluente tratado, vitaminas, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, hormonas,

Moléculas sencillasFuentes de carbono y energía, fuente de

Nitrógeno y sales

Glucosa + amonio + sales + oxígeno BIOMASA + PRODUCTOS + calor

Biocatalizador

BIOTRANSFORMACIÓNSon los procesos en los que sustratos naturales o sintéticos son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimática

Sustrato + agua Sustrato modificado

Enzimas, células

inmovilizadas

Moléculas complejasAlmidón

Moléculas sencillasGlucosa Fructosa

Un bioproceso se caracteriza entonces por:

� Uso de un catalizador biológico: Enzima, microorganismos, células vegetales, células animales, células insecto, hongos filamentosos, algas, plantas y animales

� Uso de un Biorreactor: La reacción ocurre en forma controlada

� Generación de un Producto o Servicio

Artificial

Downstream Process

Upstream Process


Upstream Processing Process Downstream Processing

� Elección del microorganismo.

� Preparación de medio (Formulación).

� Esterilización.� Preparación del inoculo.

� Elección del reactor.� Elección del sistema de

operación: Bacth; Alimentado; Sistema Continuo; etc.

� Estequeometría y cinética.� Instrumentación y control.

� Recuperación del producto por medio de operaciones unitarias (físicas/químicas)

� Acondicionamiento y estabilización del producto

� Formulación del producto

Aspectos bAspectos b áásicos de un proceso Biotecnolsicos de un proceso Biotecnol óógicogico

El microorganismo productor

� Tenemos varias posibilidades� Partir del microorganismo productor wild type� Microorganismos modificados genéticamente

para tal fin.� Recurrir a sistemas de expresión heteróloga

Microorganismos productores wild type

� Ventajas� Generalmente suele ser el mejor productor.

(seleccionado por la naturaleza)

� La manipulación genética es mínima o nula, esto nos ahora tiempo y dinero.

� Posibles desventajas� Puede que no cumpla con las normas GRAS

(Generally recognized as safe)� Su utilización pueden presentar dificultades al

momento del escalado y etapas danwstream. Ejhongos filamentosos.

Algunos microorganismos productores wild type

Ac. orgánicos Alcoholes

Algunos microorganismos productores wild type

EnzimasAntibióticos

Sistemas de expresión heteróloga

� Son utilizados para la producción de proteínas recombinantes

� Ventajas� Sistemas preparados para una finalidad determinada� Amplia variedad de hospedadores� Gran variedad de herramientas moleculares disponibles

(vectores, marcadores de selección, etc.)

� Desventajas� No siempre el producto final posee las mismas

características que el deseado.� Es por eso que debemos poner énfasis en elegir el mejor

sistema de expresión para nuestro fin

� A tener en cuenta para la elección del sistema de expresión � Productividad (es difícil determinar a priori pero se un buen tip es

comenzar con una búsqueda de bibliografía)� Complejidad estructural � Modificaciones postraduccionales� Bioactividad de la proteína de interés� Manipulación del sistema de expresión� Bioseguridad del sistema de expresión


Sistemas de expresión heteróloga: Escherichia coli

� Ventajas� Alta tasa de crecimiento� Amplio conocimiento de su genética y fisiología� Fácil manipulación genética: gran variedad de vectores y cepas disponibles,

alta eficiencia de transformación, etc)� Fácil de cultivar� Bajo costo de cultivo� Alta acumulación de proteínas recombinantes (30% del total celular).� Lisis y recuperación relativamente sencilla

� Desventajas� No es GRAS� Contaminación con endotoxinas

� Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión� No posee modificaciones postranducionales

Sistemas de expresión heteróloga: Escherichia coli

� Desventajas� No todos los genes se expresan eficientemente debido a:

� Características de la secuencia nucleotídica del gen endógeno.� Estabilidad y eficiencia traducción del RNAm� Diferencias de uso de determinados codones de � Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formación de

puentes S-S.

� Toxicidad de la proteína recombinante � No es GRAS� Contaminación con endotoxinas� Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión� Generalmente se requiere un refolding de la proteína� No posee modificaciones post-traduccionales

� Ventajas� Unicelular eucariota, fácil crecimiento y manipulación� Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales

(glicosilación, acetilación, fosforilación, eliminación del Met-1, procesamiento proteolítico de precursores)

� Fácilmente escalable � Bajo o nulo nivel de endotoxinas� Proteínas extracelulares e intracelulares

� Desventajas� Baja eficiencia de transformación� Hiperglicosilación (S. cerevisiae principalmente)

Sistemas de expresión heteróloga: Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris)

Crecimiento microbiano

� En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividenhasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante)

� También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos.

� Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como en un reactor: � Estequiométrico:

� Nos permite conocer la concentración final de microorganismos a obtener a partir de datos de la composición del medio de cultivo, saber si hay formación de algún producto, etc.

� Cinético: � Nos dice con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.

Crecimiento microbiano (Estequiometría)

Rendimientos

� Para poder conocer la Estequiometría del proceso es necesario conocer los coeficientes (S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:� Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,

EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de carbono y energía consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)

Por que el signo negativo ?

S FCE + N FN + B O2 X Biomasa + P Producto + W H2O + C CO2

Dada la ecuación de crecimiento microbiano

Como seria el rendimiento para el nitrógeno ?


El carbono mol (C-mol)� Si deseamos efectuar cálculos estequiométricos debemos conocer el

rendimiento en moles.� La pregunta es ¿qué peso de células (o biomasa) corresponde a "un m ol"?.

� Experimentalmente se vio que la composición elemental promedio de un microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85

� De la cual podemos definir una "fórmula mínima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que está representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales)

� Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene un átomo gramo de Carbono.

� Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta representado por CH20 y pesará 30 g

� En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado es:

Donde σσσσσσσσX tiene unidades de (cmol/g) de X

Donde σσσσσσσσS tiene unidades de (cmol/g) de S

Cn Hf Oq Nm C Hf/n Oq/n Nm/n 12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n


Ecuación de crecimiento y balances de materia

� Balance de Carbono : Puesto que los rendimientos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta

¿Como seria el balance de materia para el Nitrogeno?Tarea plantear los

balances para el resto de los componentes Hidrogeno y Oxigeno

¿De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. fórmula mínima de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2

•• YYxx/s /s es f (FCE, FN) y de ces f (FCE, FN) y de c óómo son estos son metabolizadosmo son estos son metabolizados

•• De la naturaleza microorganismo y como este aprovec ha dichas fueDe la naturaleza microorganismo y como este aprovec ha dichas fue ntesntes

Crecimiento microbiano (Cinética)

Velocidades volumétricas y especificas

Los rendimientos pueden expresarse como cocientes de velocidades

Y x/s = rx/rs = µµµµ/qs

• Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto nos llevaría a pensar que el microorganismo consume FCE a la misma velocidad en ambos tiempos. Esto es engañoso por que al final del cultivo hay mas células

•A diferencia de las velocidades volumétricas, las velocidades especifica nos dan idea de lo que ocurre en el cultivo

Donde µ µ µ µ = rx/X


Ecuación de Monod dependencia de µ con el Sustrato limitante

Monod estudio la dependencia del µµµµ con el sustrato limitante y encontróque la incorporación de un sustrato limitante a la célula sigue una cinética del tipo de Michaelis-Menten

Supuestos de Monod

•El proceso difusión del sustrato limitante es rápido comparado con la cinética de crecimiento

•El sustrato es metabolizado por una única E que controla la velocidad de todo el metabolismo

•El proceso sigue la cinética de Michaelis-Menten

El sustrato limitante es aquel que controlara la ve locidad de crecimiento del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE


¿De que factores depende el µ ?

La composición del medio de cultivo (FCE, FN) afectan al µµµµ

El sustrato limitanteS >> Ks �� µ µ µ µ = µµµµm

S<< Ks �� µ µ µ µ = f (S)


¿De que factores depende el µ ?

pH

10 g/l FCE


Mantenimiento celular� Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como

� Pero esta ecuación solo nos dice que el consumo de sustrato solo es posible cuando hay crecimiento.

� Pregunta: ¿puede ocurrir consumo de sustrato sin que se produzca crecimiento (generación de biomasa)?

� Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su homeostasis.

� A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt)

Y x/s = rx/rs = µµµµ/qs

rs = r’ s + ms.X

qs = (µ µ µ µ / / / / Y’x/s) + ms.X 1/Yx/s = (1111 / / / / Y’x/s) + ms/µµµµDivido por µµµµ .X

Ecuación de Pirt Otra forma de la ecuación de Pirt

Y’x/s es el rendimiento máximo teórico el que tendr ía si no hay mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el re al el que mido


Mantenimiento celular

� ¿Qué factores afectan el mantenimiento?

� Resp. Todos los factores que afectan al µ y al Y’x/s

� Temperatura, � pH� Composición del medio de cultivo particularmente

naturaleza del sustrato limitante (recordar la dependencia de µ con S “Monod” )

� Presión osmótica

Ayuda (q s - (µµµµ / Y’x/s) ) / X = ms

Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Película

� ¿Como llega el oxigeno al microorganismo?� 1°debe este disolverse en el líquido

(Burbujas). Ley de Henry(PO2 = H.C*)

� 2°debe transferirse desde la burbuja al microorganismo. Ley de Fick(JO2 = -DO2 .(dC/dX))

� El modelo que combina estos dos principios es el modelo de la película, este nos dice� Que existe una película estanca de

líquido alrededor de la burbuja en donde la transferencia de materia sigue la ley de Fick

� La fuerza impulsora de esta transferencia es la diferencia de Concentraciones entre el seno del liquido y la Burbuja

Transferencia de Oxigeno Kla

Henry

C* = PO2 / H

Fick

JO2 = -DO2 . (dC/dL)Henry

C* = PO2 / H

Transferencia de Oxigeno.

Factores que afectan al Kla.

� Agitación: si aumenta la agitación aumenta el Kla por que:� Disminuye el espesor de la película (pendiente mas pronunciada)� Disminuye el tamaño de la burbuja el área volumétrica (A)

aumenta.� Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el

Kla por que:� Aumenta el espesor de la película

� Temperatura: el Kla aumenta con la raíz cuadrada de la temperatura, dado que el coeficiente de difusión aumenta con la temperatura.

� Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensión superficial forman burbujas mas chicas aumenta el área volumétrica de transferencia

� Antiespumantes: estos aumentan la tensión superficial, burbujas mas grandes, disminuye el Kla

Consumo de Oxigeno� Bueno sabemos que:

� El suministro de oxigeno esta dado por Ro2

� La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la ecuación de Monod.

� Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno disuelto.

� Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno, es decir no se limite en oxigeno.� El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la

velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max.

� Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con la siguiente igualdad.

Kla = ro2 max / (C* - Cc)

Transferencia de Oxigeno

100-10000.2 - 0.6Levaduras Hongos filamentosos

Bacterias

Cél. Vegetales

Cél. Animales

Tipo Celular

100-1000 0.6-1.4

20-300.007-0.03

1-250.01-0.04

Kla apropiadoµµµµmax

100-1000 según la agitación

Reactor tipo tanque agitado

50-150Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su capacidad y agitación

10Tubo de ensayo sin agitación

KlaEquipo

Bioreactores� Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el

proceso se denomina biorreactor o fermentador,� El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el

desarrollo de los microorganismos� Para eso un biorreactor debe poseer:

�� Sistema de Mezclado: Sistema de Mezclado: � Debe mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de

cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.� Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.

�� Sistema de Sistema de TermostatizaciTermostatizaci óónn::� Debe mantener constante y homogénea la temperatura.

�� Sistema de OxigenaciSistema de Oxigenaci óón:n:� Debe suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo

�� Sistema de Esterilidad:Sistema de Esterilidad:� El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores

de mas de 100 l o vidrio menor volumen).� Fácil de limpiar y de esterilizar (por calor húmedo preferentemente)� Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire)

�� Sistema de Control y AutomatizaciSistema de Control y Automatizaci óón: n: � Debe garantizar las condiciones estables de pH, O2, agitación y temperatura como

mínimo, también puede controlarse el volumen por medio de la alimentación, nivel de espuma, etc.

Biorreactores de uso mas frecuentes

Tanque agitadoVentajas

� Alta flexibilidad de operación (controlada por agitación y flujo de gas).

Desventajas� Mecánicamente complejos

(agitador, eje, sellos, etc.).

� En muchas ocasiones provocan alta cizalladura.

� Transferencia de O2 limitada por el diseño de las paletas

� Difíciles de limpiar; mayores posibilidades contaminación en operaciones extendidas


Air LiftCaracterísticas� Estructura sencilla.� Agitación por inyección de aire.� Separación física de las corrientes

ascendentes y descendentes.

� Adecuado rendimiento de transferencia de materia y calor.

� Bajo shear.� Usos:

� Cultivo de células animales, vegetales, procesos con catalizadores inmovilizados, producción de proteínas unicelulares a partir de metanol y tratamiento de aguas residuales.


Columna de burbujeo

Características� Estructura sencilla.� Agitación por inyección de aire.� Bajo shear.� Adecuado rendimiento de transferencia de

materia y calor.� Bajo costo.� Usos:

� Producción de levaduras de panificación, cerveza, vinagre, tratamiento de aguas residuales.

Biorreactores

Distribución más uniforme de la turbulenciaEn medios no-Newtoniano se creancanales de gas a través de zona

impelente

Fáciles de limpiar, posibilitan operaciónaséptica extendida

Difíciles de limpiar; mayoresposibilidades contaminación en

operaciones extendidas

Limitada flexibilidad. Requieren de un diseño más cuidadoso

Flexibilidad de operación (controladapor velocidad impelente y flujo de

gas)

Posibilidad de admitir altas cargas de gas (especialmente los airlift)

Carga de gas limitadapor inundación del impelente

Muy baja cizalladura, adecuados paracultivos frágiles

En muchas ocasiones provocan altacizalladura

Mecánicamente simples y robustosMecánicamente complejos (agitador, eje, sellos, etc.)

AgitaciAgitaci óónn neumneum ááticatica (Airlift, y (Airlift, y ColumnasColumnas de de burbujeoburbujeo ))

AgitaciAgitaci óónn mecmec áánicanica ((TanquesTanquesagitadosagitados ))

Sistemas de operación o de cultivo� Llamamos así al modo de operar el biorreactor, este puede

ser de forma continua o discontinua. Suponemos mezclado Suponemos mezclado perfecto perfecto

Velocidad deacumulación

Velocidad de ingreso

Velocidad desalida

Velocidad deformación

Velocidad deconsumo

Balance de materia Balance de materia

Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres tipos de cultivos.tipos de cultivos.

•• Si F1Si F1 = = F2 Tenemos un F2 Tenemos un CultCult. Continuo.. Continuo.

•• Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Si F1>0 y F2=0 Tenemos un CultCult. Alimentado.. Alimentado.

•• Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un BatchBatch..

Opera en continuoOpera en continuo

Opera en discontinuoOpera en discontinuo

AcumulaciAcumulaci óón de volumenn de volumen

Cultivo en batch� Es el cultivo mas simple� Se realiza a volumen constante� La composición inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo

Ecuación de diseño de un batch

F1 = F2 =0

Entonces el balance de materia nos queda

Como V= cte

BatchBatch

= 0 = ctePor lo que

En un Batch tenemos que

Descripción matemática del Batch en fase

exponencial

¿Para que nos sirve todo esto?

Para calcular el tiempo que nos demandara el proceso.

� ¿Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno?� ¿los microorganismos continúan creciendo?� ¿el tiempo del proceso se verá afectado?

Descripción matemática del Batch limitado en

Oxigeno

� Resp. 1: Sí, continúan creciendo.� En estas condiciones el

microorganismo continua creciendo pero quien manda a que velocidad debe hacerlo es el sustrato limitante en este caso el Oxigeno

� Resp. 2: Sí , el tiempo del proceso será mayor ¿Por qué?

Características de un cultivo batch

� La duración del cultivo batch depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo.

� Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes disponibles.

� Cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch.

� El crecimiento puede cesar también por la acumulación de algún producto toxico. (esto se puede solucionar con un cultivo continuo)

Cultivo continuoCultCult . continuo. continuoBatchBatch

Se inicia con un batch

CultCult . continuo. continuo

Ecuación de diseño de un cultivo continuo

F1 = F2 = FEn un C. Continuo tenemos que

= 0 = ctePor lo que V= cte

El balance de materia nos queda

Despejando V Donde D = F / V y es la velocidad de dilución.

En el estado estacionario

Balances de materia en continuo

Biomasa

Sustrato: Para el sustrato tenemos

El sustrato limitante es quien controla la velocida d de crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la ecuación de Monod en términos de la velocidad de dilución D

Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenem os la dependencia de X con D

Balances de materia en continuo

Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado estacionario, tenemos la dependencia de X con D.

Nos dice que cual será la concentración de biomasa e n el estado estacionario

Situación real cuando tengo mantenimiento

Dc

Dilución critica cuando el D es igual al µµµµmax

Velocidad óptima de operación 80% del µµµµmax

Cultivo continuo

� Aplicaciones del cultivo continuo� Permite obtener los parámetros de crecimiento µmax, ms,

Ks, Y’x/s, entre otros.

� Permite realizar estudios fisiológicos. � Podemos discriminar los efectos de la velocidad de

crecimiento µ, de la composición del medio de cultivo y del pH y la Temperatura, sobre la fisiología celular del microorganismo.

� Permite realizar estudios de ingeniería metabólica.

� Inconvenientes del cultivo continuo� Inestabilidad genética de la cepa en cultivos extendidos

(perdida de plásmidos)� Riesgos de contaminación en cultivos extendidos.

Cultivo Batch Alimentado

� El objetivo de este cultivo es � Al igual que el continuo es evitar la acumulación de

productos tóxicos o inhibitorios

� Controlar la velocidad de crecimiento µ de forma constante (alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor (alimentado lineal)

� Incrementar la obtención de productos como intermediarios del metabolismo primario y proteínas recombinantes

� Maximizar la producción de biomasa o de proteínas unicelulares.

En este tipo de cultivos el volumen varia con el tiempo debido a la alimentación esto permite mantener controlada la concentración “Ci”dentro del reactor.

Productos

� Productos de bajo peso molecular :: alcoholes, ác. orgánicos, aa, nucleótidos, antibióticos, etc.� Tipo I: Productos finales del catabolismo anaeróbico� Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario� Tipo III: Productos del metabolismo secundario

�� Productos de alto peso molecular:Productos de alto peso molecular:polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas etc.

Productos Tipo I Productos Tipo I (productos finales del (productos finales del

catabolismo anaercatabolismo anaeróóbico)bico)� En este grupo tenemos: etanol, acido láctico, acético, butírico,

butanol y otros compuestos asociados a procesos anaeróbicos.� Su formación es consecuencia directa de la degradación FCE

acoplada a la producción de ATP por fosforilación al nivel del sustrato.(proceso anaeróbico)

� Siguen una cinética qp =αµ + β� Donde β es directamente proporcional al ms y α con

1/Y’x/s.

� Por lo que para este tipo de productos busco:� Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura

o tonicidad del medio.� Que m se lo mas pequeño posible, lo logro por ejemplo limitando

en Nitrógeno al cultivo.� En definitiva busco un Y’x/s bajo de forma tal que todo el sustrato

sea destinado a la formación de productos

Productos Tipo II (Intermediarios del

metabolismo primario)

� En este grupo tenemos: aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y ácidos orgánicos provenientes del ciclo de krebs.

� En este caso los procesos de obtención son aerobios.� A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia

directa entre la FCE y la obtención del producto.� Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario,

los microorganismos mas utilizados son los modificados genéticamente y estos se combinan con un buen sistema de cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo). � Ejemplo: producción de lisina por Corynebacteriuin

glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasaauxotrofo para metionina y treonina

Productos Tipo II (Ej. producción de lisina)

La estrategia para obtener lisina consiste en:

� Realizar el cultivo en condiciones tales que la concentración de treoninalibre sea mínima. ¿Cómo se logra esto?

� Limitando el cultivo en treonina (batch alimentado exponencial o cultivo continuo)

� Esto nos demuestra lo importante que resulta la elección del sistema de cultivo adecuado para nuestra cepa.

Auxotrofo

Retroinhibiciónconcertada

� En este grupo tenemos: antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas.

� Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios.

� Estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis.� Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de

regulación de la síntesis de los precursores.� Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente

que el ms sea lo menor posible.� Por otra parte las fuentes de nitrógeno fácilmente metabolizadas como sulfato

de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja.� Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a µ

bajos. � A µ altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas

(represión catabólica)� Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su

acumulación inhibe su síntesis)� Pregunta: ¿que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos?

� El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el µ y mantener a raya el feed back negativo del producto

Productos Tipo III (Metabolitos secundarios)

Resumen productos Tipo: I, II y III

Batch alimentado

Alto(siempre y cuando a m

altos no forme productos).

Ej. efecto crabtree en S. cereviciae

BajoAerobioBiomasa

Batch alimentado Cultivo continuo

Bajo

Bajo(la formación de

producto consume energía)

AerobioIII


BajoAlto o Bajo(depende del

producto)AerobioII

Batch limitado en nitrógeno


BajoAltoAnaerobioI

Sistema de cultivo¿µµµµ?¿ms?Tipo cultivoProducto

Productos de alto peso molecular

� En este grupo tenemos: polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas, etc.

� Es importante entender la cinética de formación le estos productos, para ello definimos:� La concentración intrínseca de nuestro producto i (enzima,

antígeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X) � Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.proteínas, UE, etc y X son los g.biomasa.

� Por otra parte la velocidad neta de formación de nuestro producto será igual a lo que se forma menos lo que se degrada.

� La variación de la concentración intrínseca en el tiempo es:

� Tenemos dos factores que afectan a Ri� La velocidad neta de producción

� La velocidad con la que se diluye (µ.Ri)

Productos de alto peso molecular

� Para maximizar su producción � Entonces � Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde

la velocidad de producción debe ser igual a la de dilución� ¿Cómo lo logro? � Experimentando a varios

D en un continuo

Enzima inducible en

K. Latis

18,30,25

8,250,1

Ri (UE/mg.biomasa)D (h-1)

K. lactis limitado en lactosa

Downstream Processing

IntracelularIntracelularIntracelularIntracelular1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACI1. SEPARACIÓÓÓÓÓÓÓÓN CELULARN CELULARN CELULARN CELULARN CELULARN CELULARN CELULARN CELULAR

6 ACABADO6 ACABADO6 ACABADO6 ACABADO

5. PURIFICACI5. PURIFICACI5. PURIFICACI5. PURIFICACIÓÓÓÓN DE ALTA RESOLUCIN DE ALTA RESOLUCIN DE ALTA RESOLUCIN DE ALTA RESOLUCIÓÓÓÓNNNN

3. REMOCI3. REMOCI3. REMOCI3. REMOCIÓÓÓÓN DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES Y DESECHOSY DESECHOSY DESECHOSY DESECHOS

2. DISRUPCI2. DISRUPCI2. DISRUPCI2. DISRUPCIÓÓÓÓN CELULARN CELULARN CELULARN CELULAR

ExtracelularExtracelularExtracelularExtracelular4. CONCENTRACI4. CONCENTRACI4. CONCENTRACI4. CONCENTRACIÓÓÓÓNNNN

remociremociremociremocióóóón del n del n del n del componente mcomponente mcomponente mcomponente máááás s s s abundanteabundanteabundanteabundante

Es muy importante la elecciEs muy importante la elecciEs muy importante la elecciEs muy importante la eleccióóóón del n del n del n del PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayoreliminar la mayoreliminar la mayoreliminar la mayoríííía de los a de los a de los a de los contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor importanciaimportanciaimportanciaimportancia

Downstream Processing1. Remoción celular: centrifugación y filtración.

2. Disrupción celular y separación de restos celular es:

• Homogenizadores : La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer).

• Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.

• La concentración celular no afecta la eficiencia

• Es necesario refrigerar (4-5ºC)

• Los modelos más grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)

• Molinos de perlas

• Las células se rompen mediante la abración generada por pequeñas perlas de vidrio (0.3-0.4mm φ)

• concentración de células afecta la eficiencia, la concentración óptima ∼ 30-60% peso húmedo

• Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h

• Ruptura química o enzimática

• Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)

3. Separación de restos celulares

• centrifugación (no adecuada)

• Ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor)

• Microfiltración (0.1µ m.)

• Partición en dos fases acuosas

• CDR (cell Debris Remover: Whatman)

4. Concentración

• Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.

• Técnica preferida : Ultrafiltración

• partición líquido-líquido. Extracción con solventes

• Precipitación (sulfato de NH4)

• Evaporación o destilación


5. Purificación de alta resolución• Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)• Cromatografía de intercambio iónico de alta

resolución• Cromatografía de afinidad• Cromatografía metal quelante (IMAC)

6. Acabado• Esterilización y estabilización del producto• Deshidratación, liofilizado, estabilización (sales)


� Utilizando de las reglas de oro de la purificación

� REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas”

� REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero”Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso.

Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial� REGLA 3 “Seleccionar un procesos que permita aprovechar al

máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes.

Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas

� REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al final”

KEEP IT SIMPLE!

¿¿¿¿CCCCóóóómo elegimos las operaciones y la secuencias ?mo elegimos las operaciones y la secuencias ?mo elegimos las operaciones y la secuencias ?mo elegimos las operaciones y la secuencias ?


Bibliografía

� Microbiología Industrial. Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone.

� Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5, Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation] - M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)

� Bioprocess Engineering Principles. Pauline M. Doran

� Cat. de Biotecnología - Bioprocesos II UNQUI� Cat. de Ingeniería bioquímica UNLP

clase bioprocesos gortiz

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