INTEGRANTES:

VIII CICLO INGENIERIA AGROINDUSTRIALCULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO, UTILIZANDO LA CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATCC 4126INTEGRANTES:FLORES MORENO MARLY MORALES VALDIVIEZO DARWINRAMOS CALVO HERNAN TAMARIS ALVARADO SAIRAVILLASECA ROJAS VIANKAGRUPO: B-2

I. OBJETIVOS1.1. Objetivo general Disear y realizar una experiencia de cultivo por lotes alimentado (CLA) con aireacin y alimentacin constante, utilizando una cepa de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126. 1.2. Objetivos especficos

Identificar y describir las partes, accesorios y geometra, conocimiento de la operacin del fermentador, esterilizacin, carga y descarga y toma de muestras.

Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y control automtico, as como la calibracin de los sensores.

Diseo del medio de cultivo.

Activacin celular y desarrollo del inoculo.

Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar mx y Yx/s as mismo determinar el KLapor el mtodo Dinmico de Humphrey.

Obtener los perfiles de masa celular y fuente de carbono a travs del tiempo de operacin.

Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

Determinar Yx/s y Qx del CLA.

II. METODOLOGIA EXPERIMENTALAntes de disear un medio de cultivo, de preparar los medios y el cultivo de los microorganismos, es importante conocer las caractersticas de los microorganismos con el que se va a trabajar, en este caso una cepa de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126.

Diseo y preparacin del medio de cultivo:

Este diseo tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas.

Consideraciones y condiciones de cultivo:Para disear el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos proporciona la gua de prctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su mantencin, activacin y para la fermentacin del cultivo por lote alimentado.

Fuente de carbono: Sacarosa Duracin de la etapa: 5 horas de la etapa de CLA. Fermentador: Automatizado Biostat A Plus de 5 litros. Temperatura: 35 C Velocidad de agitacin: 200 RPM pH: Se controlara usando electrodo y unidad control.

Se utilizar una cepa Saccharomycescerevisiae ATCC 4126,con max = 0.37 h-1 en glucosa a 35C.Composicin elemental m.o.:C45% - N9% - Mg0.4% - S0.25% - K0.5% - P2%

Formula qumica Sacarosa es: C12H22O11Masa molecular: 342 g

MACRONUTRIENTESMICRONUTRIENTES

C, N, Mg, S, K y PCa, Cu, Co, Cl, Fe, Zn, Mo, Na, Mn

Requerimientos nutricionales: Fuente de carbono y energaSacarosa

Fuente de NSulfato de amonio

Fuente de MgSulfato de magnesio heptahidratado

Fuente de SSulfato de amonio y Sulfato de magnesio heptahidratado

Fuente de KFosfato mono potsico

Fuente de PFosfato mono potsico

COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE MANTENCIN, ACTIVACIN Y FERMENTACIN PARA Saccharomycescerevisiae ATTC 4126

DISEO DEL MEDIO DE CULTIVOPara disear el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos proporciona la gua de prctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su mantencin, activacin y para la fermentacin del cultivo por lote alimentado.Otro modo de operar un biorreactor es empleando la tcnica de batch alimentado (BA) o fedbatch. Esta tcnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta tcnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo.El BA es particularmente til en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formacin de producto son sensibles a la concentracin del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. As, este mtodo se emplea cuando se quieren evitar fenmenos de inhibicin por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentracin de biomasa.ESQUEMA

Donde F(t): caudal de alimentacinSr(t):concentracin de sustrato de la alimentacinVf: volumen final de trabajoVo: volumen al inicio de la alimentacinXo: concentracin de biomasa al inicio de la alimentacinSo: concentracin de sustrato limitante al inicio de la alimentacin

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So son las condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentacin, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variacin de la concentracin de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Prctico se utilizar el sistema ms simple, es decir F=cte y Sr=cte.Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEADO una alimentacin para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aqu tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habr de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.

PREPARACIN DE MEDIOS

2.1. MEDIO DE MANTENCIN

La preparacin de este medio se realizara de acuerdo a los componentes que se encuentran en la tabla N 01.

Tabla N 01: Concentracin de nutrientes para el medio de mantencin de 50 ml.

NUTRIENTECONCENTRACION (g/l)PESO ( gr)(para 50 ml)

Extracto de levadura30.15

Peptona50.25

Extracto de Malta30.15

Agar201

Glucosa100.5

Procedimiento: 1. Pesamos las cantidades requeridas para 50ml de cada compuesto, segn la tabla N 01.2. Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando a stos agua destilada, hasta llegar a los 50 ml requeridos.3. Se lleva el matraz al mechero Bunsen para calentarlo, y agitando con una varilla de vidrio, hasta la ebullicin (primera burbuja), a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.4. Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente se adicionara 6 ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.5. Los tubos se colocaran en un vaso de precipitado, y se llevarn a la olla a presin, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.6. Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilizacin.7. Ajustar las tapas de los tubos estando dentro de la olla, luego colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando con alcohol para tener una rea estril prendemos el mechero cinco minutos antes de realizar la resiembra con el SaccharomycescerevisiaeATCC41268. Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen, flameando para evitar la contaminacin, teniendo la aza bacteriolgica calentada al rojo vivo esperamos un momento que se enfre.9. Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar, flameamos y cerramos el tubo y as en los 8 tubos con agar.

2.2. MEDIO DE ACTIVACINNuestro medio de activacin servir para inocular el medio de fermentacin realizado en el matraz en este caso se preparara con un volumen de 15 ml.

Tabla N 02: Concentracin de nutrientes para un medio de activacin (75 ml de solucin)

NUTRIENTECONCENTRACION(g/l)PESO (gr)

Sacarosa50.375

Extracto de levadura30.225

Extracto de malta50.375

Solucin de sales5ml/L0.375ml

Procedimiento:1. Pesar los componentes descritos en la tabla N 2.2. En un matraz Erlemenyer se coloc la cantidad pesada de sacarosa ms 8 ml de agua destilada.3. El extracto de levadura se coloc en tubo de ensayo y se agreg 10 ml de agua destilada4. En cuanto a la solucin de sales tambin se coloc en tubo se ensay y se agreg 7 ml de agua.5. Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo de ensayo cada uno, la sacarosa en un matraz de 125 ml todo esto en un vaso precipitado colocado dentro de una olla a presin.6. Despus de haber esterilizado se dej enfriar para luego mezclar y realizar la activacin con el microorganismo.7. Al mezclar estos componentes (las sales y la levadura con la sacarosa) se procedi a activar el microorganismo bajo mechero para evitar la contaminacin. 8. Sacamos dos azadas y colocamos en el medio de activacin, luego tapamos con el tapn previamente elaborado.9. Colocar en el shaker por un tiempo de 12h.

2.3. MEDIO DE FERMENTACINRealizaremos dos medios de fermentacin el primero ser diseado para un cultivo por lote, el cual servir como inoculo para nuestro fermentador con CLA. El segundo medio de fermentacin ser el realizado en el fermentador en el cual realizaremos el CLA.Como sabemos el comportamiento del CLA es el que se muestra en la figura siguiente:

De esta grafica vemos que primero se presentara un cultivo por lote y una vez que se utilice una alimentacin constante se empezara lo que es el CLA.Entonces teniendo en cuenta esto haremos primeramente un diseo para el cultivo por lotes en donde el volumen y concentracin inicial sern los valores iniciales para nuestro CLA.Primeramente haremos el diseo para alcanzar un volumen de 100 ml con una concentracin de 1.5 g/L, el cual servir de inoculo para el fermentador en donde se realizar el CLA

Tabla N 03: Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin inicial de 100 ml.(Para una concentracin final = 1.5 g/l)ElementoNutriente% en Clula% en nutrienteY x/s (g/g)S`0 (g/l)S0 (g/l)pesar (gr)

CSacarosa (C12H22O11)4542,1050,56143,20633,20632.4047

NSulfato de Amonio (NH4)2SO4921,212,35670,76381,14570.8593

KFosfato Potasico (KH2PO4)0,528,67657,3520,03140,04710.0353

MgSulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O)0,49,8624,650,07300,10950.0821

PFosfato Potasico (KH2PO4)222,7911,3950,15800,23690.1777

-Extracto de Levadura----1,81.44

-Solucion de sales----10 ml/L7.5

Condiciones de Cultivo: pH inicial:4,2 Temperatura:35C Velocidad de agitacin:200 rpm

Entonces de esta tabla tenemos el diseo para una concentracin de 1.5g/L.Ahora una vez obtenido nuestro diseo para nuestro medio de fermentacin 1 en el matraz, procedemos a inocular al fermentador, ahora haremos un diseo para llegar en el fermentador a una concentracin de 1.5 g/L con un volumen inicial de 2000 ml, una vez cumplido este requerimiento procederemos con la alimentacin empezando el CLA.

Como la sacarosa es el nutriente limitante haremos un diseo aparte en base a una concentracin final de 1.5 g/L, que es la concentracin con la cual empezara el CLA.

Tabla N 04: Concentracin de sacarosa para un medio de fermentacin de con Vi = 2000 ml. (Para una concentracin final = 1.5 g/l)FuenteConcentracin (g/l)Peso (gr)Para V = 2000 ml

C12H22O11C3.346.68

Para los otros nutrientes haremos el diseo en base a la concentracin final del CLA el cual se calculara a continuacin:

Entonces para esto necesitamos conocer: y

Flujo de Alimentacin:

Nuestro volumen final ser de 2800 ml, para esto necesitamos el siguiente flujo en un tiempo de 5h.

Entonces una vez que se utilice este flujo de 0.4 L/h comenzara el CLA con una concentracin inicial de 1.5 g/L, y un sustrato inicial de .

Condiciones iniciales dadas:COMPOSICION ELEMENTAL DEL MICROORGANISMOC 45%N 9%Mg 0.4%K 0.5%P 2.0%

Calculemos el Yx/s, teniendo a la fuente de Carborno (Sacarosa) como factor limitante, asi tenemos:

Yx/s=(42.105/45)x0.6 Yx/s= 0.5614 g/g As mismo, de acuerdo con las condiciones de cultivo: U mx =0.37h-1T=35C

Concentracin de la fuente de Alimentacin:

Para el tendremos en cuenta un tiempo de transicin

Tenemos que el para el sustrato limitante, en este caso la sacarosa es 0.5614 y que el

Entonces sabiendo esto podemos hallar la concentracin final del CLA:

Entonces una vez obtenido nuestra concentracin final del CLA () procederemos a disear el medio de cultivo para los dems nutrientes.

Tabla N 05: Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi = 2000 ml. (Para una concentracin final = 3.032793 g/l)NutrienteFuenteConcentracin (g/l)Peso (gr)Para V = 2000 ml

(NH4)2SO4N2.1684.336

(NH4)2SO4S0.0260.052

KH2PO4K0.0890.178

KH2PO4P0.4490.898

MgSO4.7H2OMg0.2070.414

MgSO4.7H2OS0.0480.096

Extracto de levadura-1.83.6

Solucin de sales-10ml/L20ml

Realizamos diseos separados para la sacarosa y los dems nutrientes debido a que como la sacarosa es el nutriente limitante se terminara cuando se llegue a la concentracin de 1.5 g/L y es ah cuando se iniciara el flujo de alimentacin, en cambio los dems nutrientes seguirn en el medio hasta el final del CLA por esto se disea en base a 3.032793g/L.

Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi = 2000 ml. (Para una concentracin final = 3.032793 g/l)FUENTEELEMENTO% CELULA% NUTRIENTEYx/sS (g/L)S (g/L)

(NH4)2SO4N921.212.361.4452.168

(NH4)2SO4S0.1224.242020.0170.026

KH2PO4K0.528.7557.50.0590.089

KH2PO4P222.7711.390.2990.449

MgSO4.7H2OMg0.49.8724.680.1380.207

MgSO4.7H2OS0.1212.99108.250.0320.048

Tenemos:X1 = 1.5 g/L X2 = 3.03279 gr/L Entonces: X = 1.53279 g/L

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. Medio de mantencin y resiembra del microorganismo

Materiales y equipos Balanza analtica Olla a presin Mechero Bunsen Pipetas de 10 ml. Aza bacteriolgica Tubos de ensayo con tapas (8 tubos) Varilla de vidrio Matraz Erlenmeyer (250ml) Guantes. Esptula Probeta graduada Capachos de papelmetlico Reactivos Muestra: Saccharomycescerevisiae ATCC 4126 Sustrato: sacarosa Agua destilada. Extracto de levadura. Peptona. Agar.

3.2. Medio de activacin

Materiales y equipos Matraz de 250ml. Matraz de 125 ml Tubos de ensayo con tapa Algodn Gasa Varilla de vidrio Balanza analtica Esptula Agua destilada Pinzas Guantes Shaker Mechero Bunsen, trpode y rejilla. Olla a presin Pipetas Capachos de papel metlico.

Reactivos Componentes segn tabla de medio de activacion Alcohol HClcc.

3.3. Medio de fermentacin y proliferacin

Materiales y equipos Matraz de 1 L Matraces de 125 ml Varilla de vidrio Capachos de papel metlico. Balanza analtica

Reactivos Segn la tabla de medio de fermentacin Agua destilada Alcohol

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREASDESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE ALIMENTADO AIREADO DE Saccharomycescerevisiae ATCC 4126ACTIVIDADESFECHA

Presentacin del pre informe de prcticas.13/10/14

Reconocimiento del reactor15/10/14

Resiembra en medio de mantencin. Preparacin del medio de activacin.22/10/1422/10/14

Activacin del microorganismo. Curva de calibrado para peso seco de biomasa. (utilizar la obtenida en la experiencia de cultivo por lote)29/10/14

Esterilizacin de pipetas y preparacin de viales. Preparacin del inoculo. Seguimiento de cintica en cultivo por lote. Seguimiento de cintica microbiana por CLA.04/10/14

05/10/14

Anlisis DNS Curva de calibrado de biomasa Imprevistos 07/11/14

Presentacin del informe final11/11/14

V. ANEXOS Fuente de carbono y energa:Sacarosa (C12 H22 O11), M =342 g

YX/S=(42.105/45) x0.6 (este factor por ser aireado)YX/S = 0.936x 0.6 = 0.5614 g/g

DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACIN Y DE FERMENTACIN

(1)

Para fuente de carbono, =0.6

Para otra fuente, =1Dnde:

(2)

(3)De (3):

(4)

De (4):

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5

Para el limitante, =1

Como el tiempo total de CLA

Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi = 800 ml. (Para una concentracin final = 3.03279 g/l)FUENTEELEMENTO% CELULA% NUTRIENTEYx/sS (g/L)S (g/L)

(NH4)2SO4N921.212.360.65090.9763

(NH4)2SO4S0.1224.242020.00760.0114

KH2PO4K0.528.7557.50.02670.0399

KH2PO4P222.7711.390.13470.2020

MgSO4.7H2OMg0.49.8724.680.06280.0942

MgSO4.7H2OS0.1212.99108.250.01410.02121

Tenemos:X1= 1.5 g/L X2= 3.03279 gr/L Entonces: X = 1.53279 g/LComposicin elemental del m.o: Elemento% en clula

N9.0

Mg0.4

K0.5

P2.0

S0.12

ELEMENTO: NITROGENO (N):

Calculando % en clula:

% en nutrienteFUENTE: (NH4)2SO4

PM:N: 14 14*2 = 28H: 1 1 * 8 = 8 132 g/molO: 16 16*4 = 64S: 32 32*1 = 32

Rendimiento

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

ELEMENTO: ASUFRE (S): Calculando % en clula:

% en nutrienteFUENTE: (NH4)2SO4

PM:N: 14 14*2 = 28H: 1 1 * 8 = 8 132 g/molO: 16 16*4 = 64S: 32 32*1 = 32

Rendimiento

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

ELEMENTO: POTASIO (K): Calculando % en clula

% en nutriente

FUENTE: (KH2PO4)PM:K: 39.0983 39.0983*1 = 39.0983H: 1 1*2 = 2136.0721 g/mol O: 16 16*4 = 64P:30.973830.9738*1 = 30.9738

Reemplazando:

Rendimiento:

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

ELEMENTO: FOSFORO (P):

Calculando % en clula

% en nutrienteFUENTE: (KH2PO4)PM:K: 39.0983 39.0983*1 = 39.0983H: 1 1*2 = 2136.0721 g/mol O: 16 16*4 = 64P:30.973830.9738*1 = 30.9738

Reemplazando:

Rendimiento

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

ELEMENTO: MAGNESIO (Mg):

Calculando % en clula

% en nutriente

FUENTE: (MgSO4.7H2O)

PM:Mg: 24 24*1 = 24S: 32 32*1=32 246 g/molO: 16 16*11 = 176H: 1 1*14 = 14

Reemplazando:

Rendimiento

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

ELEMENTO: ASUFRE (S):

Calculando % en clula %

% en nutriente

FUENTE:( MgSO4.7H2O)

PM:Mg: 24 24*1 = 24S: 32 32*1=32 246 g/molO: 16 16*11 = 176H: 1 1*14 = 14

Reemplazando:

Rendimiento

Reemplazando:

Concentracin inicial de sustrato:

Si. Entonces; (5 Para cada fuente, =1.5 Para el limitante, =1

Determinamos los VVM, el Qf y el valor de Kla:VELOCIDAD DE AEREACION:

Otra formula para determinar VVM:)Na=Demanda de Oxigeno 1.6 gr/l. hr:)0.10

HALLANDO CALOR DE FERMENTACION:

PARA DETERMINAR EL kla:

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