citomorfoloŠka dijagnoza akutnih leukemija i...

BIOCHEMIA MEDICA god. 12, br. 3–4, 2002. 87

M. Su~i} i sur. Citomorfolo{ka dijagnoza akutnih leukemija i citomorfolo{ko otkrivanje minimalne ostatne bolesti

Pregledni ~lanakReview

CITOMORFOLOŠKA DIJAGNOZA AKUTNIH LEUKEMIJA ICITOMORFOLOŠKO OTKRIVANJE MINIMALNE OSTATNE

BOLESTIMirna Su~i}1, Dubravka Boban1, Mirjana Markovi}-Glamo~ak1, Koraljka Gjadrov-Kuve`di}1, Sun~ica Ries1,

Boris Labar2

1Zavod za citologiju, Klini~ki zavod za laboratorijsku dijagnostiku, 2Zavod za hematologiju, Klinika za unutra{nje bolesti,

Klini~ki bolni~ki centar Zagreb

SA@ETAK – Cilj rada bio je citomorfološki opisati akutne leukemije (AL), te usporediti staru FAB-citomorfološkuklasifikaciju s novom WHO klasifikacijom AL.

Akutne leukemije uzrokovane su zlo}udnom transformacijom mati~ne hematopoetske stanice. Leukemijske stanicenastale zlo}udnom transformacijom genoma izraàvaju citomorfološke, citokemijske, imunološke, citogenetske imolekularne zna~ajke i promjene koje su osnova za dijagnozu i klasificiranje AL. AL se i prema FAB i WHOklasifikaciji dijele na dvije osnovne skupine, AML i ALL. Nalaz od 20% ili više blasta u koštanoj srì je citomor-fološki kriterij za dijagnozu AL prema WHO. Klasificiranje AL prema WHO (tj. svim zna~ajkama leukemijskihstanica i nekim klini~kim pokazateljima) neobi~no je va`no ne samo zbog izbora lije~enja koje je razli~ito zapojedine tipove AL, ve} i zbog prognoze bolesti. Tako|er, prepoznavanje pojedinih imunoloških, citogenetskih imolekularnih promjena u akutnoj fazi bolesti osnova je za pra}enje minimalne ostatne bolesti te bolje razumije-vanje uzroka zlo}udne transformacije hematopoetskih stanica. Kombinacijom citomorfologije s navedenim dija-gnosti~kim pristupima pove}ava se razina osjetljivosti citomorfološkog prepoznavanja MRD, no za sada se ti meto-dološki pristupi rutinski ne primjenjuju u laboratorijskoj dijagnostici.

Klju~ne rije~i: akutne mijeloi~ne leukemije, akutne limfoblasti~ne leukemije, minimalna ostatna bolest

Adresa za dopisivanje:Doc. dr. Mirna Su~i}, Zavod za citologiju, Klini~ki zavod za labora-

torijsku dijagnostiku, Kišpati}eva 12, 10 000 Zagreb, Tel: 01-2388702,Fax: 01 2317079, E-mail: [email protected]

Akutna leukemija (AL) je uzrokovana zlo-}udnom transformacijom mati~ne hematopoet-ske stanice. Diobom zlo}udno promijenjene he-matopoetske stanice (naj~eš}e jedne) nastajeklon stanica istih bioloških osobina kao po~etnastanica. Zlo}udna transformacija uzrokovana jeporeme}ajem u genomu stanice zbog kojeg leuke-mijske stanice izraàvaju citogenetske i mole-kularne promjene (1). Uz karakteristi~nu klini~-ku sliku i ostale laboratorijske pokazatelje dija-gnoza bolesti temelji se na citomorfološkom na-lazu brojnih blasta u punktatima koštane srì ihistološkom nalazu blasta u biopsiji kosti. Leuke-mijske stanice ne mogu normalno sazrijevati te

su “zaustavljene” na putu diferencijacije i izra-àvaju citomorfološke, citokemijske, imunološkei molekularne zna~ajke nezrelih limfocitnih i mi-jeloi~nih stanica poput nezrelih stanica normalnehematopoeze (1,2).

Citomorfološka dijagnoza AL zasnovana je naizrazito pove}anom broju blasta u punktatu ko-štane srì i razmazu periferne krvi koji su obo-jeni metodom May-Grünwald-Giemsa (MGG). ALse citomorfološki klasificiraju po FAB-klasifika-ciji koju su 1976. godine predloìli i 1985. su-stavno dopunili francuski, ameri~ki i britanskihematolozi i citomorfolozi. Prema FAB-klasifi-kaciji osnovni citomorfološki kriterij za dijagnozuAL je nalaz od najmanje 30% ili više blasta uukupnom broju svih stanica s jezgrom u punk-tatu koštane srì. Za daljnje klasificiranje AL u

88 BIOCHEMIA MEDICA god. 12, br. 3–4, 2002.

Citomorfolo{ka dijagnoza akutnih leukemija i citomorfolo{ko otkrivanje minimalne ostatne bolesti M. Su~i} i sur.

pojedine tipove AL potrebno je uz citomorfološkeanalizirati i citokemijske zna~ajke leukemijskihstanica. Citomorfološki i citokemijski kriterijimogu se pouzdano primijeniti ako je koštana sr`hiper ili normocelularna i ako bolesnik nije pri-mio citostatsku terapiju (3)

Prema FAB-klasifikaciji iz 1976. i dopunama,AL se dijele na dvije osnovne skupine: akutnelimfati~ne leukemije (ALL) i akutne mijeloi~neleukemije (AML) ili akutne ne-limfati~ne leuke-mije (ANNL) i podtipove (Tablica 1) (3,4).

specifi~nog po~etnog i dugotrajnog terapijskogpristupa, koji je druga~iji za pojedine tipove AL.Potrebno je istaknuti da se prema WHO mijenja iosnovni kriterij za citomorfološku dijagnozu AL -u punktatima koštane srì potrebno je na}i naj-manje 20% ili više blasta u ukupnom broju stani-ca s jezgrom. Prihva}anjem tih novih kriterija tipmijelodisplazije (MDS) RAEB-t (refraktorna ane-mija s ekscesom blasta u transformaciji više sene svrstava u MDS ve} u AL (11).

CITOMORFOLOŠKA KLASIFIKACIJA ALs opisom pojedinih osnovnih imunoloških,

citogenetskih i molekularnih zna~ajkipodtipova AL

Za citomorfološko klasificiranje AL u analizikoštane srì potrebno je procijeniti koli~inu he-matopoeze (obilna, srednje obilna, oskudna), po-stotak blasta u ukupnom broju stanica s jezgrom,postotak zrelih stanica granulocitopoeze, eozi-nofila, bazofila, postotak eritroblasta te opisatimegakariocitopoezu. Tako|er je potrebno opisaticitomorfologiju blasta (veli~ina i izgled leuke-mijskih stanica, jezgre i citoplazme) U zrelijimtipovima AML potrebno je definirati broj blastatipa I (bez azurofilnih zrnaca u citoplazmi), bla-sta tipa II (do 20 azurofilnih zrnaca u citoplazmi)i blasta tipa III (više od 20 azurofilnih zrnaca ucitoplazmi). U postotak blasta potrebno je kodAML-M3 uvrstiti i atipi~ne promijelocite, kodAML-M5 monoblaste i kod tipa AML-M7 mega-karioblaste (1-3).

Kada su eritroidne stanice umnoène i ~ineviše ili 50% svih stanica s jezgrom, prema pri-jedlogu FAB-skupine broji se i postotak blasta upopulaciji neeritroidnih stanica s jezgrom. Tadase limfociti, plazmociti i makrofagi ne uklju~ujuu postotak neeritroidnih stanica. Prijašnji krite-riji FAB skupine za citomorfološko razlikovanjeAL i MDS prikazani su u tablici 2 (4). Me|utim,postavlja se pitanje, kada se nalazi eritroidna hi-

T a b l i c a 1. Citomorfološka podjela AL prema FABklasifikaciji

T a b l e 1. Cytomorphologic FAB classification of

AL

Skupina AL Podtip AL

ALL L1, L2, L3AML M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7

Prema analizi FAB skupine ukupno slaganjeu klasificiranju pojedinih tipova AL je 61%. Po-dudaranje u dijagnozi AML-M3 je 88%, dok po-stoje dijagnosti~ke teško}e u razlikovanju AML-M2 i AML-M4 te AML-M4 i AML-M5. U oko 15%AL razlikovanje ALL od nezrelih AML nije mo-gu}e samo na citomorfološkoj osnovi (2).

Imunološko klasificiranje AL temelji se naprepoznavanju pojedinih biljega na leukemij-skim stanicama jer je za pojedine citomorfološketipove AL specifi~an odre|en imunofenotip, tj.skupina biljega. Leukemijske stanice u AML iz-raàvaju mijeloi~ne biljege, u ALL limfocitne bi-ljege, a u miješanim leukemijama na istim leuke-mijskim stanicama nalaze se i mijeloi~ni i lim-focitni biljezi ili nalazimo dvije populacije blasta -jednu s mijeloi~nim i drugu s limfocitnim bilje-zima (1,2,5-9). Tako|er, pojedine citogenetske imolekularne promjene ~eš}e se nalaze u poje-dinim tipovima AL (10). Sve nabrojene zna~ajkeleukemijskih stanica (citomorfološke, citokemij-ske, imunološke, citogenetske i molekularne)imaju ne samo dijagnosti~ko ve} i prognosti~kozna~enje, a imunološke, citogenetske i moleku-larne zna~ajke mogu biti i osnova za pra}enje mi-nimalne ostatne bolesti (engl. minimal residualdisease-MRD). Stoga je danas prihva}ena klasi-fikacija AL prema WHO (World Health Organiza-tion) koja se temelji na analizi svih zna~ajki leu-kemijskih stanica AL i nekim klini~kim poka-zateljima tijeka bolesti (npr. transformacija u ALiz mijelodisplazije) (11). Taj multdisciplinaranpristup u dijagnostici AL potreban je zbog

Ta b l i c a 2. Razlikovanje AML od mijelodisplazija(MDS)

Ta b l e 2. Distinction between AML and myelo-

displasia (MDS)

Eritroblasti > 50% SJ Eritroblasti < 50% SJ

mijeloblasti mijeloblasti mijeloblasti mijeloblasti> 30% NES < 30% NES < 30% NES > 30% NES

AML-M6 Mijelodisplazije sve AML osim M6

SJ-stanice s jezgrom; NES - neeritroidne stanice s jezgrom

¯ ¯¯



perplazija, treba li prema WHO promijeniti po-stotak s 30% na 20% blasta i tada kada se blastibroje samo u ne-eritroidnim stanicama s jez-grom. Park i suradnici u svojoj studiji tako|erprepoznaju to pitanje i smatraju da bi se pri-jašnja FAB AML-M6 prema sadašnjim WHO kri-terijima ovisno o broju blasta i drugim citomor-fološkim zna~ajkama mogla podijeliti u multi-linijsku displaziju, sekundarne leukemije i M6 sdvije podskupine M6a (eritroidna/mijeloidna) iM6b (“~ista” eritroidna leukemija) (4,11,12).

Prema WHO AML se dijele na 4 podskupinei podskupinu akutnih bifenotipskih leukemija(Tablica 3) (11).

tivan i CD34. U blastima se uz mijeloidne biljegemoè imunološki na}i i nezreli oblik MPO. Nezrelioblik enzima MPO nema enzimsku aktivnost pa sene moè prepoznati citokemijski (1-9,11).

T a b l i c a 3. Podjela AML prema WHO

T a b l e 3. WHO classification of AML

1. AML s citogenetskim translokacijama

AML s t(8,21)

Akutna promijelocitna leukemija i varijante s t(15;17)

AML s eozinofilijom u koštanoj srì, inv(16) ili t(16;16)

AML s promjenom 11q23 (MLL)

2. AML sa znacima mijelodisplazije

3. AML- sekundarne nakon terapije

4. AML koje nisu drugdje uvrštene

AML minimalno diferencirana

AML bez sazrijevanja

AML sa sazrijevanjem

Akutna mijelomonocitna leukemija

Akutna monocitna leukemija

Akutna eritroidna leukemija

Akutna megakariocitna leukemija

Akutna bazofilna leukemija

Akutna panmijeloza s mijelofibrozom

5. Akutne bifenotipske leukemije

Citomorfološki se AML dijele prema smjerui stupnju diferencijacije leukemijskih stanica na9 podtipova (M0-M8) (1-9,11). Uz naziv citomor-fološkog podtipa naveden je i odgovaraju}i nazivprema WHO klasifikaciji. Blasti u akutnim bife-notipskim leukemijama prema WHO citomor-fološki mogu imati zna~ajke mijeloi~nih blasta ililimfocitnih i nediferenciranih blasta. Nediferen-cirana AL (zadnji, 10. podtip) nije uvrštena uWHO klasifikaciju (6,11).

M0-AML bez citomorfološkog sazrijeva-nja (WHO- AML minimalno diferenci-rana)AML tip u kojem se u punktatu koštane srì i

perifernoj krvi nalaze citomorfološki nediferen-cirani blasti (slika 1). Mijeloperoksidaza (MPO)je u blastima citokemijski negativna. DijagnozaM0 postavlja se na temelju imunološki pozitivnihmijeloidnih biljega (CD33, CD13). êsto je pozi-

S l i k a 1. AML-M0 - citomorfološki nediferenciraniblasti u punktatu koštane srì, (MGG,(1000)

F i g u r e 1. AML-MO - cytomorphologically undiffer-entiated blasts in bone marrow

S l i k a 2. AML-M1 - nezreli mijeloblasti i pokojimijeloblast sa znacima sazrijevanja(MiBs) u citoplazmi (pojedinim sitnimcrvenim, azurofilnim granulama); punk-tat koštane srì (MGG, (1000)

F i g u r e 2. AML-M1 - immature myeloblasts and so-me myeloblasts with signs of maturation-fine azurophilic granules in cytoplasm inbone marrow.



M1-AML s minimalnim sazrijevanjem(WHO- AML bez sazrijevanja)Blasti su srednje veliki, bez ili s vrlo malo

azurofilnih zrnaca u citoplazmi (slika 2). Auerovištapi}i (kristaloidne aurofilne citoplazmatskestrukture - kondenzirana azurofilna zrnca) u bla-stima se tako|er nalaze iznimno. Promijelocitaima manje od 3%. MPO je citokemijski pozitivnau najmanje 3% blasta i obi~no nije pozitivno višeod 10 do 20% blasta. Blasti su CD34, CD33 iCD13 pozitivni (1-9,11).

M2-AML sa sazrijevanjem (WHO-AML sasazrijevanjem)U punktatima koštane srì nalazi se više od

30% blasta tipa I i II, dok postotak nezrelihmonocitnih stanica ne prelazi 20% (slika 3). Višeod 10% leukemijskih stanica izraàva citomor-fološke znakove diferencijacije prema stanicamakoje su zrelije od promijelocita, ali sa znacimaatipije (pseudo-Pelgerova anomalija jezgre, Aue-rovi štapi}i i manjak granula u citoplazmi). Ueozinofilnom podtipu (M2eo) nalaze se brojnieozinofili (više od 5%), dok se u bazofilnompodtipu (M2bazo) nalaze brojne stanice bazofilne

M3 - akutna promijelocitna leukemija(WHO-akutna promijelocitna leukemija)U punktatima koštane srì najbrojniji su

blasti tipa II i atipi~ni promijelociti s brojnimatipi~nim granulama u citoplazmi koja ponekadprekrivaju jezgru (slika 4). U citoplazmi se ~estonalaze i brojni Auerovi štapi}i koji mogu formi-rati i nakupine (engl, “faggots”, “faggot cells”).Ponekad su još izraèniji u citoplazmi nakoncitokemijskih bojenja MPO i Sudan.

S l i k a 3. AML-M2 - nezreli mijeloblasti i mijelo-blasti sa znacima sazrijevanja (pojedinimcrvenim, azurofilnim granulama) (MiBs)u citoplazmi; punktat koštane srì, (MGG,(1000)

F i g u r e 3. AML-M2 - myeloblasts with signs of ma-turation - azurophilic granules in cyto-plasm in bone marrow.

granulocitopoeze. Blasti su izrazito MPO citoke-mijski pozitivni, imunološki se nalaze mijeloidnibiljezi CD34 i CD33, CD13, CD15. êsta citoge-netska promjena u M2 je t(8;21)(q22;q22) s po-sljedi~nom molekularnom promjenom AML1-ETO (1-9,11).

S l i k a 4. AML-M3 - brojni blasti i atipi~ni promi-jelociti s brojnim velikim crvenim, azu-rofilnim granulama u citoplazmi (poje-dinim crvenim, azurofilnim granulama);punktat koštane srì, (MGG, (1000)

F i g u r e 4. AML-M3 - myeloblasts and atypical pro-myelocytes with numerous coarse gran-ules in cytoplasm in bone marrow.

U mikrogranularnoj varijanti M3 (AML-M3vili M3mikro) nalaze se sitna, “prašinasta” gra-nula u citoplazmi. Jezgre su ~esto bubreàste. Tavarijanta se ponekad teško moè razlikovati odakutne monocitne leukemije ili zrelog oblika M2.U M3 i M3mikro varijanti citokemijski MPO iSudan su pozitivni u više od 30% leukemijskihstanica (~esto u 100%), nespecifi~na esteraza jeobi~no slabo pozitivna i ne inhibira se s natri-jevim fluridom (NaF), dok PAS-citokemijska re-akcija moè biti i pozitivna i negativna.

U M3bazo varijanti dio leukemijskih stanicasazrijeva prema bazofilima koji su pozitivni zatoluidin i PAS citokemijska bojenja. MPO i Su-dan su negativne ili pozitivne u tek manjem bro-ju blasta.

U sva tri M3 tipa blasti su naj~eš}e HLA-DR– iCD33+CD13+, nose specifi~nu citogenetsku pro-mjenu t(15;17)(q22;q21-22) i PML/RARa moleku-larni prijepis. Bolesnici s AML-M3 i varijantama



~esto imaju klini~ke i laboratorijske znakove di-seminirane intravenske koagulacije (DIK) (1-9,11).

M4 - akutna mijelomonocitna leukemija(WHO-akutna mijelomonocitna leukemi-ja)U ovom podtipu bujaju dvije razli~ite popu-

lacije stanica: mijeloi~ne (MPO pozitivne) i mo-nocitne (pozitivne za nespecifi~nu esterazu) le-ukemijske stanice (slika 5). Postotak mijeloi~nihi monocitnih leukemijskih stanica prelazi 20%.Ponekad se u citoplazmi blasta mogu na}i iAuerovi štapi}i. Broj monocitnih stanica u peri-fernoj krvi je ve}i od 5 x 103/mL. êsto se nalaze ipove}ane vrijednosti lizozima u serumu. Bole-snici s AML-M4 ~esto imaju hiperplaziju gingiva.U M4 eozinofilnoj varijanti (M4eo) nalaze sebrojniji eozinofili (³ 3%) koji ~esto imaju i pse-udo-Pelgerovu anomaliju jezgri. Citogenetski se~esto nalazi inv (16)(p13;q22), rje|e t(16;16) smolekularnim nalazom CBF-beta/MYH11X). UM4bazo varijanti nalaze se brojnije stanice bazo-filne granulocitopoeze. Imunološki su blasti u M4tipu ~esto CD34, CD33, CD13, CD15 i CD14pozitivni (1-9,11).

inhibira s NaF. MPO je obi~no pozitivan u manjeod 20% blasta. Blasti su imunološki pozitivni zaCD34, mijeloidne i CD14 biljeg.

M5a - akutna monocitna leukemija - slabo di-ferenciranaMonoblasti (obi~no veliki blasti s nepravilnom

jezgrom, bazofilnom citoplazmom sa sitnim, ma-lobrojnim azurofilnim zrncima) ~ine više od 80%stanica (slika 6). Kada monoblasti izraàvajuizrazitu bazofiliju citoplazme uz citoplazmatskevakuole, postoje dijagnosti~ke teško}e u razliko-vanju M5a od ALL-L3. Me|utim, izrazito pozi-tivna nespecifi~na esteraza u blastima M5a, kojase inhibira s NaF, pomaè u to~noj dijagnozi.Lizozim je u serumu u M5a ~esto tek neznatnopovišen. Nalaze se i koagulacijski poreme}aji iekstramedularni infiltrati leukemijskih stanica.

S l i k a 5. AML-M4- brojni mijeloblasti (MiB) imonoblasti (MoB) u punktatu koštanesrì, (MGG, (1000)

F i g u r e 5. AML-M4- myeloblasts and monoblasts inbone marrow.

M5-akutna monocitna leukemija (WHO-akutna monocitna leukemija)Ovaj tip AML javlja se u dva oblika- nezrela i

zrela varijanta. Citomorfološki nalaz potvr|ujeizrazito pozitivna nespecifi~na esteraza u bla-stima ~ija se aktivnost u monocitnim stanicama

S l i k a 6. AML-M5a - brojni monoblasti (MoB) ipojedini promonociti (ProM) u punktatukoštane srì; (MGG, (1000)

F i g u r e 6. AML-M5 - monoblasts and some promo-cytes in bone marrow

M5b - akutna monocitna leukemija - diferen-ciranaU ovom podtipu AML-M5 nalaze se nešto

brojnije zrelije, citomorfološki atipi~ne, monocit-ne stanice- promonociti i monociti (više od 20%).Monocitne leukemijske stanice imaju velike ne-pravilne jezgre, sivkastu citoplazmu s azurofil-nim zrncima. Ponekad se nalazi i fagocitoza (eri-trocita, trombocita, eritroblasta, M5b s fagoci-tozom). Auerovi štapi}i se nalaze vrlo rijetko.Lizozim je u serumu izrazito pove}an (1-9,11).

Laurencet FM je 1994. godinu predloìo icitomorfološki podtip M5c (malignu histiocitozu s



leukemijskom slikom), no za sada taj podtip nijeuvršten u klasifikaciju AL (13).

M6-akutna eritroleukemija (WHO-akut-na eritroidna leukemija)U punktatima koštane srì nalazi se više od

50% atipi~nih eritroidnih stanica, te mijeloblastitipa I i II koji ~ine oko 30% ili više svih neeri-troidnih stanica (slika 7). Ve}ina eritroblasta jeatipi~na, gigantska s lobuliranim megaloblasti~-nim jezgrama, nuklearnim ulomcima i s vaku-loiziranim citoplazmama. U mijeloblastima semogu na}i Auerovi štapi}i, dok se eritrofago-citoza rijetko nalazi. êsto se nalazi i citomor-fološki atipi~na megakariocitopoeza. Tako|er senalaze i obi~ni i prstenasti sideroblasti, citoke-mijski su eritroblasti naj~eš}e PAS-pozitivni, aimunološki se u blastima nalaze glikoforini (1-9,11). Prema prijašnjim kriterijima, ovisno obroju mijeloblasta u broju neeritroidnih stanica ibroju proeritroblasta (proEbl) u broju eritroidnihstanica, M6 se moè podijeliti na tri varijante(14):

Prema WHO M6 se dijeli samo na dva podti-pa: M6a (eritroidna/mijeloidna) i M6b (“~ista” eri-troidna leukemija) (11,12).

M7 - akutna megakariocitna leukemija(WHO akutna megakariocitna leukemija)To je rijetki oblik AML, a zove se i “maligna

mijeloskleroza” ili “akutna mijelofibroza”. Upunktatima koštane srì i perifernoj krvi nalazese samo blasti i atipi~ni megakariociti (slika 8).Zbog fibroze koštane srì ~esto je potrebno u~initii biopsiju kosti. Blasti imaju citoplazmatske pro-duètke i ~esto se u citoplazmi nazire stvaranjetrombocita. Zrelije stanice megakariocitopoezeizraàvaju citomorfološku atipiju - npr. ~esto senalaze izrazito maleni mikromegakariociti. Imu-nološki su leukemijske stanice pozitivne zaCD33, CD41 (glikoprotein IIb/IIIa) i druge trom-bocitne biljege. U elektronskoj mikroskopiji (EM)se u blastima nalazi trombocitna mijeloperoksi-daza (1-9,11).

S l i k a 7. AML-M6 - brojni blasti (Bl) i atipi~neeritroidne (Ae) stanice u punktatu koštanesrì; (MGG, (1000)

F i g u r e 7. AML-M6 - myeloblasts and atypical im-mature erythtroid cells in bone marrow

M6a (³ 30% mijeloblasta/monoblasta; < 30%proEbl)- Di-Guglielmov sindrom

M6b (< 30% mijeloblasta/monoblasta; ³ 30%proEbl)- Di-Guglielmova bolest

M6c (³ 30% mijeloblasta/monoblasta; ³ 30%proEbl)

Di-Guglielmovova bolest ili M6b prije se sma-trala eritroleukemijom, no po svojim zna~ajkamaviše pripada skupini MDS (2).

S l i k a 8. AML-M7 - pojedini megakarioblasti(MgB)i mikromegakariociti (MiMg) upunktatu koštane srì; (MGG, (1000)

F i g u r e 8. AML-M7 - myeloblasts, megakaryoblastsand micromegakaryocytes in bone mar-row.

M8-akutna mastocitna leukemija (WHO-akutna bazofilna leukemija)U FAB-klasifikaciji se ne izdvaja ovaj rijetki

oblik leukemije u kojem se u koštanoj srì nalazenezrele bazofilne (nezrele mastocitne stanice)(slika 9). Me|utim, iako mastociti potje~u od mi-jeloi~ne linije stanica, smatra se da postojerazlike izme|u mijeloi~nih bazofilnih stanica imastocitnih stanica. Blasti su u M8 izrazito po-zitivni za toluidin (slika 10) i MPO negativni.PAS-reakcija i klor-acetat-esteraza su u bazofil-nim blastima ~esto pozitivne. U EM se u cito-plazmi bazofilnih blasta nalaze karakteristi~na



teta, bazo i mastocitna zrnca. Imunološki blastinose mijeloidne i monocitne biljege, a citogenet-ski je ~esta t(6;9)(p23;q14) promjena(1-10,11).

ALLMy+ - citomorfološki nediferencirane ili ne-zrele limfocitne stanice (citokemijski i imuno-loški MPO negativne, te tako|er MPO negativneu elektronskom mikroskopu, Sudan negativne,negativne ili slabo pozitivne za nespecifi~nu este-razu), a imunološki se nalaze mijeloi~ni i limfo-citni biljezi (1,5-9,11).

Dio autora u miješanim leukemijama razli-kuje AML ili ALL s koekspresijom biljega suprot-ne loze i “prave” miješane ili bifenotipske ALprema kriterijima koje su predloìli Buccheri isuradnici (15).

Akutne nediferencirane leukemije - ALmati~nih stanicaU punktatima koštane srì i perifernoj krvi

nalaze se citomorfološki nezreli, nediferenciraniblasti, te citokemijski MPO i Sudan negativni,negativni ili za nespecifi~nu esterazu slabo pozi-tivni blasti i imunološki CD45 pozitivni blasti.Biljezi CD7, CD9, CD34, CD38, CD71, HLA-DR iTdT mogu biti pozitivni u blastima, ali blasti neizraàvaju izraàj linijski specifi~nih biljega (6).

ALL su se nekad klasificirale prema cito-morfološkim i citokemijskim zna~ajkama. Ako sucitomorfološki nediferencirani blasti ili limfo-blasti bili PAS+(MPO–, Sudan– i ANAE–) klasifi-cirale su se kao ALL, a ako su bile PAS–(MPO–,Sudan– i ANAE–), klasificirale su se kao nedife-rencirane AL. Kada su limfoblasti PAS pozitivni,reakcija je obi~no izrazita i u obliku ve}ih gra-nula. Korelacija citomorfoloških, citokemijskih iimunoloških zna~ajki blasta pokazala je da jePAS pozitivno samo 50% ALL, te da PAS tako|ermoè biti pozitivan i u AML (1-4, 8,9). Zato se da-nas ALL klasificiraju prema imunofenotipu (2):

a) ALL B stani~ne loze (pro-B; CD10+ - “com-mon”; pre-B i B)

b) ALL T stani~ne loze (pre-T i T)

c) Ph+ pozitivne ALL (naj~eš}e pre-B i “com-mon” ALL) - limfoblastna transformacijakroni~ne mijeloi~ne leukemije

Podjela ALL prema WHO prikazana je u tabli-ci 5 (11).

ALL se prema FAB-klasifikaciji dijele na te-melju citomorfoloških zna~ajki ve}ine blasta na L1,L2 i L3. Do 10% leukemijskih stanica moè serazlikovati od ve}eg dijela blasta. Citomorfološkorazlikovanje L1 i L2 ima malenu prognosti~kuvrijednost za klini~ki tijek bolesti jer nema jasnepovezanosti s imunološkim podtipovima ALL (oko30% “common” ALL su L1 i oko 70% su L2). L1 je~eš}i nalaz u djece, a L2 u odraslih. L3 se cito-morfološki jasno razlikuje od L1 i L2 uz izrazitukorelaciju s imunološkim tipom B-ALL (1-4,11).

S l i k a 9. AML-M8 - brojni nezreli mijeloblasti upunktatu koštane srì; (MGG, (1000)

F i g u r e 9. AML-M8 - immature myeloblasts in bonemarrow

S l i k a 10. AML-M8 - toluidin-pozitivni blasti i sta-nice bazofilne granulocitopoeze u punk-tatu koštane srì; (toluidin, (1000)

F i g u r e 10. AML-M8- toluidine positive myeloblastsand cells of basophilic granulopoesis inbone marrow.

Akutne miješane leukemije (WHO-akut-ne bifenotipske leukemije)Skupina AL u kojima blasti izraàvaju i mi-

jeloi~ne i limfocitne biljege, a prema citomor-fološkom nalazu mogu se podijeliti u dva podtipa:

AMLly+ - citomorfološki mijeloi~ne stanice, aimunološki se nalaze mijeloidni i limfoidni biljezi



ALL-L1 (WHO-ALL)Nalaze se ve}inom mali limfoblasti s okru-

glom jezgrom i ~esto su vidljivi maleni “nabori” ujezgri. Struktura kromatina je nje`na i homo-gena. Nukleoli se ne nalaze ili su slabo uo~ljivi.Citoplazma je bazofilna s tek pokojom vakuolom

i obi~no vrlo oskudna (tek tanak rub oko jezgre)(slika 11) (1-4,11).

ALL-L2 (WHO-ALL)Limfoblasti su ve}i i razli~iti po veli~ini i obli-

ku. U jezgri su istaknuti nukleoli. Blasti imaju

T a b l i c a 4. Citokemijske osobine podtipova AL

T a b l e 4. Cytochemical characteristics of ALL

AMLALL

M0 M1 M2 M3 M4 M5a M5b M6 M7 M8

MPO 0 + ++ ++ + -/+ -/+ +/-* - -/+* -

Sudan 0 + ++ ++ + -/+ -/+ +/-* - -/+* -

NE - -/+* -/+* +/- ++ ++ ++ -/+* + - -/+

PAS - -/+* -/+* -/+* -/+ +/- +/- + + +/- +/-

toluidin - - - - - - - - - + -

*tek ponekad pozitivni ili negativni blasti; ++ izrazito pozitivni blasti;

MPO-mijeloperoksidaza; NE-nespecifi~na esteraza

T a b l i c a 5. Podjela ALL prema WHO

T a b l e 5. WHO classification of ALL

1) Prekursorske B-stani~ne ALL s citogenetskimpodskupinama,

a) t(9;22)(q34;q11); BCR/ABL

b) t(v;11q23); preustroj MLL

c) t(1;19)(q23;p13); E2A/PBX1

d) t(12;21)(p12;q22); ETV/CBFa

2) Prekursorske T-stani~ne ALL

3) Akutna leukemija Burkittovih stanica

S l i k a 11. ALL-L1 - mali jednoliki limfoblasti upunktatu koštane srì; (MGG, (1000)

F i g u r e 11. ALL-L1 - uniform small lymphoblastsin bone marrow.

S l i k a 12. ALL-L2 - limfoblasti nejednake veli~ines razli~ito obilnom citoplazmom; punk-tat koštane srì, (MGG, (1000)

F i g u r e 12. ALL-L2 - heterogenous lymphoblasts,small and large with different amount ofcytoplasm in bone marrow.

razli~itu koli~inu citoplazme, mogu se na}i i ma-lobrojne citoplazmatske vakuole, a postoje i vari-jacije u obojenosti citoplazme (slika 12) (1-4,11)

ALL-L3 (WHO - ALL Burkittovih stanica)êsto se nalaze veliki limfoblasti s okruglom

jezgrom i nešto tamnijim kromatinom jezgre iistaknutim nukleolima. Citoplazma je izrazitobazofilna i vakuolizirana (slika 13) (1-4,11).



CITOMORFOLOŠKO OTKRIVANJEMINIMALNE OSTATNE BOLEST

Cilj po~etnog lije~enja (uvodne terapije cito-staticima) bolesnika s AL je posti}i remisiju bo-lesti. Citomorfološki kriterij remisije bolesti jeoporavak hematopoeze i nalaz od 5% i manje

blasta u koštanoj srì, bez blasta u razmazu peri-ferne krvi. Jasno je da se samo na temelju cito-morfologije blasta ne moè zaklju~iti radi li se oregeneraciji normalne hematopoeze sa skreta-njem prema mla|im oblicima ili su, nakon po~et-ne terapije, u koštanoj srì zaostale malobrojnezlo}udne hematopoetske stanice (minimalna os-tatna bolest-engl, MRD). Samo u dva tipa AL,AML-M3 i ALL-L3, na temelju specifi~nog izgle-da zlo}udnih hematopoetskih stanica moè sepretpostaviti da postoji MRD. Prednost u otkri-vanju i pra}enju MRD imaju citogenetske (engl,fluorescence in situ hybridization, FISH) i mole-kularne tehnike (posebice, polimerazna lan~anareakcija, engl. PCR) koje nalaze citogenetske imolekularne promjene u zlo}udnim stanicama.Tako|er, imunološko otkrivanje MRD temelji sena nalazu neuobi~ajenih “leukemijskih” kombi-nacija biljega i pozitivnom nalazu fuzijskih pro-teina, npr. PML proteina u AML-M3 i E2A/PBX1proteina u ALL s t(1;19). Razina osjetljivosti ovihmetoda je izrazito velika i kre}e se od 10–4 do 10–6

otkrivanja zlo}udnih hematopoetskih stanica(16-19).

Kombinacijom citomorfologije s imunološkim,citogenetskim i PCR tehnikama pove}ava se irazina osjetljivosti citomorfološkog prepoznava-nja zlo}udnih hematopoetskih stanica. Neki odtih (relativno novih) metodoloških pristupa jošuvijek traè svoju punu primjenu u laborato-rijskoj dijagnostici.

S l i k a 13. ALL-L3 - limfoblasti s bazofilnom i va-kuoliziranom citoplazmom (LiB); punk-tat koštane srì, (MGG, (1000)

F i g u r e 13. ALL-L3. lymphoblasts with pronouncedbasophilia nad vacuolization of cyto-plasm.

CYTOMORPHOLOGICAL DIAGNOSIS OF ACUTE LEUKEMIA ANDCYTOMOPRHOLOGICAL DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE

SUMMARY – The aim of this work was to describe cytomorphological characteristics of acute leukemia (AL), and tocompare old FAB classification with the new World Health Organization classification of AL. The onset of AL iscaused by malignant transformation of stem hematopoietic cell. Leukemic cells express cytomorphological, cy-tochemical, immunological, cytogenetic and molecular characteristics and changes which are the basis for diagno-sis and classification of AL. According to FAB and WHO classification, AL are divided in two main groups: acutemyelobastic leukemias (AML) and acute lymphoblastic leukemias (ALL). Determination of 20% and more blasts inbone marrow is the cytomorphological criterion for AL diagnosis according to WHO. WHO AL classification (i.e.according to all leukemic cell characteristics and certain clinical findings) is very important not only because of theexact choice of certain cytostatic therapy which is different for different subtypes of AL but also for the prognosis ofthe disease. Also, recognition of certain immunologic, cytogenetic and molecular changes in acute phase of diseaseis the basis for detection and follow up of minimal residual disease (MRD) and the understanding of causes ofmalignant transformation. Combination of cytomorphology with the mentioned diagnostic approaches increasesthe sensitivity of cytomorphological detection of MRD. However, this methodologic approach is not yet applied inroutine laboratory practice.

Key words: acute myelobastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, minimal residual disease

LITERATURA:

11. Mufti GJ, Flandrin G, Shaefer HE, Sandberg AA,Kanfer EJ. An atlas of malignant haematology, cytology,histology and cytogenetics. London: Martin Dunitz Ltd,The Livery House, 1996: 1-134.

12. Bartl R, Thomas L. Acute leukemias. U: Thomas L, ur.Clinical laboratory diagnostics, 1998:521-6.

13. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G,Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposals for classifica-



tion of acute leukemias. British Journal of Haematol1976, 33:451-8.

14. Bennett, JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G,Galton DAG, Gralnick HR, et al. Proposed revised crite-ria for the classification of acute myeloid leukemia. AnnIntern Med 1985, 103: 626-9.

15. Goasguen JE, Bennett JM. Classifications of acute my-eloid leukemia. Clin Lab Med 1990,10:661-81.

16. Behm FG. Diagnosis of childhood acute myeloid leuke-mia. Clin Lab Med 1999, 19:187-237.

17. Elghetany MT, MacCallum JM, Davey FR. The use ofcytochemical procedures in the diagnosis and manage-ment of acute and chronic myeloid leukemia. Clin LabMed 1990, 10:707-19.

18. Batini} D. Flow-cytometric immunophenotyping ofacute leukemia. Bone Marrow Transplant 1989, 4(Suppl 3): 13-5

19. Cheson BD, Cassileth PA, Head DR, Schiffer CA,Bennett JM, Bloomfield CD, et al. Report of the NCI-sponsored workshop on definitions of diagnosis and re-sponse in acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 1990, 8:813-9.

10. Heim S, Mitelman F. Cytogenetic analysis in the diagno-sis of acute leukemia. Cancer 1992, 70:1701-9.

11. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, et al. The World Health Or-ganization classification of neoplastic diseases of thehaematopoietic and lymphoid tissues: report of theClinical Advisory Committee Meeting, Airlie House, Vir-ginia, November 1997. Hematol J 2000, 1: 53-66.

12. Park S, Picard F, Dreyfus F. Erythroleukemia: a needfor a new definition. Leukemia 2002, 16: 1399-401.

13. Laurencet FM, Chapuis B, Roux-Lombard P, Dayer JM,Beris P. Malignant histiocytosis in the leukaemic stage:a new entity (M5c-AML) in the FAB classification? Leu-kemia 1994, 8: 502-6.

14. Mazzella FM, Alvares C, Kowal-Vern A, SchumacherHR. The acute erythroleukemias. Clin Lab Med 2000,20: 119-36.

15. Buccheri V, Matutes E, Dyer MIS, Catovsky D. Lineagecommitment in biphenotypic acute leukemia. Leukemia1993; 7: 919-27.

16. Campana D, Pui CH. Detection of minimal residual dis-ease in acute leukemia: methodologic advances andclinical significance. Blood 1995, 85:1416-34.

17. Biondi A, Rambaldi A, Pandolfi PP, Rossi V, Giudici G,Alcalay M, et al. Molecular monitoring of the myl/re-tinoic acid receptor-a fusion gene in acute promyelocyticleukemia by polymerase chain reaction. Blood 1992,80:492-7.

18. Su~i} M, Boban D, Markovi}-Glamo~ak M, U`arevi} B,Zadro R, Petrove~ki M, et al. Double immunoenzymaticAPAAP staining for the detection of leukemia associatedimmunophenotypes. J Hematother Stem Cell Res 1999,8: 635-43.

19. Gjadrov-Kuve`di} K, Su~i} M, Boban D, Markovi}-Glamo~ak M, Ries S, Stavljeni}-Rukavina A, Labar B.PCR in situ u dijagnostici akutnih leukemija. Lije~Vjesn 2000, 122: 222-5.

citomorfoloŠka dijagnoza akutnih leukemija i...

Documents