Ciclodereplicación

TeóricoNº1

•  ¿Quéesunvirus?•  ¿Eltamañoeslaprincipalcaracterís>caquedefineunvirus?

•  ¿Porquéunvirusesunparasitointracelularobligado?

•  ¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?•  ¿Losvirussonmicroorganismovivos?•  ¿Queotrasaplicaciones>enenlosvirus?

¿Quéesunvirus?

Descubrimientodelosvirus:TMVMaye r , I v a no f s k y , yBeijerinck (1886-1903):organismosmás pequeñosque bacterias -agentesdefinidosporeltamañodeporo de los filtros deChamberland- que nopueden v e r s e e n e lmicroscopio de campoclaro,ypuedenmul>plicarsolamente en células vivasotejidos plantadetabaco

enfermatrituradodehojasenfermas

filtracióndelextractodehojas

filtradodehojasenfermasplantasana

plantaenferma

¿Quéesunvirus?Definición

“Virusesareen>>eswhosegenomesareelementsofnucleicacidthatreplicateinsidelivingcellsusingthecellularsynthe>cmachineryandcausingthesynthesisofspecializedelementsthatcantransfertheviralgenometoothercells.”S.E.Luria,J.E.Darnell,D.Bal>more,andA.Campbell(1978)

EstructuracristalográficadeTMVTMVestáformadoporunacedenadeRNAenvueltaporunacubiertaproteicacompuestapor2130copiasdeunaproteínadeenvolturapequeña.

microgreaselectrónicasdeTMV

cristalesdeTMV

Losprimerosvirusanimales

•  1898-LoeffleryFroschaislaronelvirusdeahosa

•  1901-WalterReeddescubrióelvirusdelafiebreamarillayconfirmólahipótesisdeCarlosJuanFinlayacercadelatransmisiónatravésdemosquitosvectores

•  1911–PeytonRousdescubrióquelosviruspuedencausarcancer

Caracterizacióndeparlculasviralesmediantemicroscopíaelectrónica

bacteriófagoT4noenvueltocomplejo

virusdelmosaicodeltabacohelicoidalnoenvuelto

virusdelaestoma>>svesicularenvuelto

rotavirusicosaédriconoenvuelto

Virusconsimetríahelicoidal

161/3copiasdelaproteínadecápsideporvueltadehélice

Virusconsimetríaicosahédrica

(A)Losvirusicosahédricosmássimplescon>enen3subunidadesporcarayentotal60subunidadesdecápside.(B)Lascápsidesicosahédricasseensamblanapar>rdepentámerosdesubunidadesindividualesqueformanlosvér>cesdelicosahedro.(CyD)Enicosahedrosmásgrandes,cadaunadelascarastriangularessedivideentriangúlosmáspequeños.Lassubunidadesenlosvér>cesestánorganizadasenpentámeros,ylasdemássubunidadesestánorganizadasenhexámeros(hexones).(E)Lasinteraccionesentresubunidadesenpentámerosyhexonesadyacentessonequivalentes(porejemplo,lasinteraccionescabeza-cabezasonmuysimilaresentodalacápside,independientementedequeocurranentrepentámerosyhexonesoentrehexonesyhexones).

¿Eltamañoeslaprincipalcaracterís>caquedefineunvirus?

Diámetrode750nm≠viruscomo“agentesfiltrables”GenomadeDNAde1.2millonesdebasesquecodificapara979proteínas-  aminoaciltRNAsintetasas,

reparacióndelDNAyhomólogosdegenescelularesquenoseencuentranenotrosgenomasvirales

-  proteínassinsimilitudconproteínasdeotrosgenomas

UngrupodegenesencomúnentreMimivirusyMegavirus(otrovirusgiganteevolu>vamentedistante)sugierequeambosvirusprovienendeunancestrocelularcomúnyevolucionaronperdiendogenes

¿Porquéunvirusesunparasitointracelularobligado?

Elcicloviralocurreendosetapas:1.  etapaextracelular=virión2.  etapademul>plicaciónenuncélula

infectada=genomaviral

Lacaracterís>caquedefinealosvirusesquedependendenestrictamentedeunhospedadorvivoparareplicar

virus célulainfectadauniónyentrada

traducción

replicacion

ensamblado

salida

¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?

Lapandemiadeinfluenzaen1918provocómásmuertesquela1ªGuerraMundialLahistorianaturaldelaviruela>enemásde2000añosysedeclaróerradicadaen1977ElHIVinfectómásde70millonesdepersonasdesdeelcomienzodelaepidemiaysees>maque~0,8%delapoblaciónadulta(15-49años)viveconHIV

¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?

Losvirusestánentodaspartes!•  Losvirussonlasen>dadesmásabundantesenlabiosfera

–  LabiomasadevirusqueinfectanbacteriasennuestroplanetaesmilvecesmásgrandequeladetodosloselefantesenlaTierra

–  Losviruscomprendenel94%delasparlculasquecon>enenácidosnucleicosenlosocéanosyson15vecesmásabundantesqueBacteriayArchaea

–  Elnúmerodecélulasenunapersonapromedio(~1013células)es10vecesmáschicoqueelnúmerodebacteriasy100vecesmáschicoqueelnúmerodeparlculasdevirus

•  Losvirusinfectantodoslosseresvivosincluyendoinsectos,plantas,bacteriasyhastaotrosvirus

ElvirusSputnikinfectalasfábricasviralesysecuestralamaquinariademimivirusenelcitoplasmadelasamebasinfectadasparareplicar.Lascélulasco-infectadasconSputnikproducenmenosmimivirusyparlculasdefec>vasquehacenqueelvirusseamenosinfec>vo.

mamavirusvirussatéliteSputnik

¿Porquéenfermamos?

Concentracióndeparlculasviralesinfec>vasInteracciónconcélulassuscep.blesypermisivasenelsi>odeinvasiónEfectodelamul>plicaciónviralenlacélulahospedadoraRespuestaan>viralypropagacióndelvirus

¿Losvirussonmicroorganismovivos?

life.noun1c:anorganismicstatecharacterizedbycapacityformetabolism,growth,reac>ontos>muli,andreproduc>on"Life."Merriam-Webster.com.Merriam-Webster,n.d.Web“Losvirussonen>dadesestrictamenteintracelularesypotencialmentepatógenasconunafaseinfecciosa,y(1)poseenunsolo>podeácidonucleico,(2)semul>plicanenlaformadesumaterialgené>co,(3)nosoncapacesdecrecerydividirseporfisiónbinaria,(4)noposeensistemasquegeneranenergía.”Lwoff(1957)

¿Queotrasaplicaciones>enenlosvirus?

•  Virusenestudiosdebiologíacelularymolecular•  Virusenterapiagénicaysuaplicaciónalamedicinahumanayveterinaria

(terapiadelcáncer).•  Terapiaconbacteriofagosparacontroldebacteriaspatogénicas•  Nanotecnología(paraintroducirpequeñassecuenciasgenómicas

modificadasalgenomadelacélulahospedadora)•  Viruscomoarmasbiológicasobioterrorismo•  Virusenagricultura(modificacionesgenomicasmediantevectoresvirales

ylaobtenciondeplantasyanimalestransgénicosmásproduc>vos).•  VirusosubunidadescomoVacunas•  Vacunasosubunidadescomovacunasparaprevenirelcáncer(virusde

hepa>>sBypapillomavirusparaprevenirelcancerdehigadoydecuellouterino,respec>vamente).

•  Viruscomocontrolbiológicodepestesenlaagricultura

TaxonomíaLaclasificacióndelosvirusempleacuatrocaracterís>cas:1.elácidonucleicoenlaparlculaviral(DNAoRNA)2.simetríadelacubiertaproteica(cápside)3.presenciaoausenciademembranalipídica(envoltura)4.dimensionesdelaparlculaylacápside

LaclasificacióndelosvirusreconoceSIETEórdenes1.  Caudovirales:bacteriófagosdedsDNA(3familias)2.  Herpesvirales:virusgrandesdeeucariotasdedsDNA(3familias)3.  Ligamenvirales:virusdearqueasdedsDNAlineal(2familias)4.  Mononegavirales:virusdeplantasyanimalesdessRNAnosegmentadoyde

polaridadnega>va(5familias)5.  Nidovirales:virusdevertebradosdessRNAdepolaridadpositva(4familias)6.  Picornavirales:viruspequeñosdeplantas,insectosyanimalesdessRNAde

polaridadposi>va(5familias)7.  Tymovirales:virusdeplantasdessRNAmonopar>to(4familias)

82familiasnoasignadasaningúnorden:Arenaviridae,Baculoviridae,Flaviviridae,Mimiviridae,Poxviridae,Retroviridae

Taxonomía

virusdeRNA

virusdeDNA

Losviruspresentanunaincreíblediversidaddetamañosyformas

h|p://viralzone.expasy.org/

MorfologíayevolucióndelosvirionesUnconjuntocomúndeformassimplesdanlugaraunamul>tuddeestructurascomplejas•  Losdiseñoscompar>dospor

losvirusqueinfectanlostresdominioscelularessonsimples

•  Formasavanzadasderivandeversionesmássimples

•  Lasformasfilamentosasseex>endenhaciaBacteriayArchaea

•  Formasesféricasseex>endenhaciaBacteriayEukarya

•  Launidaddeformasesféricasydecabeza-colaestántambiénapoyadasporsimilitudesestructurales

Nasiretal.(2015)Ann.N.Y.Acad.Sci.1341:61-74

ElsistemadeBal>more•  Losvirusseagrupanporel>podegenoma•  TodoslosvirusconvergenenlasíntesisdeunmRNAqueesdecodificadoporlamaquinaria

delhuésped

Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed

Relacionesentreel>poderepliconviralyelrangodehuésped

LosvirusdeRNAestánausentesenarqueaysonrarosenbacteriasLosvertebradoshospedannumerososvirusdeRNAyretrovirusLosvirusdedsDNAsonrarosenplantasylosvirusdedsDNAsonabundantesenhongosLosretrovirusestánintegradosenelgenomadeeucariotasmul>celularesyestáncompletamenteausentesenlosgenomasmicrobianosNohayviruscapacesdecruzarlasbarrerasentredominiosNasir et al. (2014) Frontiers Microbiology 5: 194

CiclodereplicaciónLareplicaciónviralpuededescribirseenelcontextodetrespropiedadesfundamentales:1.  Todoslosgenomasviralesestánempaquetadosen

parlculasquemedianlatransmisiónentrehospedadores2.  Elgenomacon>enelainformaciónparainiciary

completaruncicloinfec>voenunacélulasuscepKbleypermisiva.Elcicloinfec>voincluyeadsorciónyentrada,decodificacióndelainformacióndelgenoma,replicacióndelgenoma,yensambladoyliberacióndelaprogenieviral

3.  Lainfecciónviraldeunhospedadorseestablecedemanerataldeasegurarlapropagaciónenlapoblación

RutasdesíntesisdemRNAdevirusRNA

Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed

Elgenoma+ssRNAdepicornavirus

virusnoenvueltoesféricode30nmlacápsideicosaédricarodeaelgenomadeRNA

ssRNA(+)7,1-8,9kbunúnicoORFcodificaunapoliproteínaextremo5´unidoalaproteínaviralVPgIRESycoladepoli(A)

Elgenoma+ssRNAdeflavivirus

virusenvueltoesféricode~50nmproteínasdeenvolturaenunarregloconsimetría>poicosaédrica

ssRNA(+)10-11kbunúnicoORFcodificaunapoliproteínaqueesprocesadoporproteasascelularesyvirales5’capy3’estrucutrado

Replicacióndepicornavirusyflavivirus

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ElgenomadeRNAesinfec>voysirvedemRNAparalatraduccióndelasproteínasviralesydemoldeparalasíntesisdeRNAan>genómico

Elgenoma-ssRNAdeorthomixovirusvirusenvueltoesféricode80-120nmdediámetroHAyNAformanespículasinsertadasenlamembranaM2,M1yNEP8segmentosdessRNA(-)asociadosaNPyalcomplejodelatranscriptasaviral

8segmentosdessRNA(-)deentre890y2340ntcodificanpara11proteínas-  splicingalterna.vodelos

mRNAsdeMPyNS-  leakyscanningdelmRNAde

PB1

Elgenoma–ssRNAdefilovirusvirusenvueltofilamentosode970nmdelargoGPyproteínadematriznucleocápsidecilíndricapolimerasaLunidaalgenomadessRNA(-)

ssRNA(-)de18-19kbcodificapara7proteínasRdRpviral-  transcribecadaunodelosgenes-  cappingypoliadenilacióndemRNA

Replicacióndevirus-ssRNA

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Retrovirusvirusenvueltoesféricode80-100nm

doscopiasdessRNA(+)asociadasalaRTviral

proteínasestructuralesyenzimas

ssRNA(+)de9,75kbconcapypoli(A)provirus-  DNAintegrado-  moldeparalatranscripciónde

mRNAgenómico-  splicingincompletoy

completo

Replicaciónderetrovirus

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RutasdesíntesisdemRNAdevirusDNA

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ElgenomadsDNAcirculardepapillomavirus

viruspequeño,noenvuelto,icosaédricode60nmcápsideydsDNAasociadoahistonascelulares

dsDNAcircularde8kbproteínastempranas(noestrucutralesregulatorias,E1-E7)ytardías(estrucutrales,L1yL2)seexpresanmediantesplicingalterna>vo

Replicacióndepapilomavirus

Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed

Hospedadoresparaelcul>vodevirus

animalesdelaboratorio

huevosembrionados

célulasencul>volineasycul>vosprimarios

Animalesdelaboratorio

•  Huéspednaturaloanimalesdelaboratoriocomoconejos,ratones,ratasyhamsters

•  Lainfecciónexperimentaldeanimalesdelaboratorioesesencialparaestudiarlapatogénesisdelasinfeccionesvirales

Huevosembrionados

•  Enelhuevoembrionadounavariedaddetejidosdiferenciadospuedeservirdesustratosparaelcrecimientodeviruscomoorthomyxovirus,paramyxovirus,rhabdovirus,togavirus,herpesvirus,ypoxvirus

•  Eselmétodomáscomunmenteu>lizadoparacrecerelvirusinfluenzaenellaboratorioyparalaproduccióndevacunas

InfeccióndelíneascelularesEfectocitopá>co•  cambiosmorfológicosinducidos

porlainfecciónquesereconocenenelmicroscopioóp>co:sincicios,placasdelisis,etc.

•  cuerposdeinclusión

Hemadsorción•  adsorciónespecíficadeglóbulosrojos

acélulasinfectadas>medidaindirectadelasínteisdeproteínasvirales

A549

noinf virussarampión

BSC4

0

noinf vaccinia

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notodoslosviruscrecenenlíneascelulares…

Elcrecimientodepapillomavirusencul>vorequieredelacoplamientodelaregulacióndelaexpresióndegenesviralesconelestadodediferenciacióndelacélulablanco,queestáasociadoalaarquitectura3Ddelaepidermisquesepierdeencélulasencul>vo.Lareplicacióndelplásmidoocurreencélulasdelepitelioescamosobasal.Enquera>nocitosdiferenciados(dondenohaysíntesisdeDNAcelular)hayreplicaciónvegeta>vaysíntesisdeDNAviralconproducciónac>vadeviriones.

Moody(2010)NatureReviewsCancer

notodoslosviruscrecenenlíneascelulares…

•  ElcrecimientodeHCVencul>vosedesarrollóapar>rdeldescubrimientodeunacepaaltamenteinfec>va(JFH-1)

•  ElgenomadelacepaJFH-1oquimerasdelasgenesnoestructuralesdeJFH-1ygenesestructuralesdeotrosgenomasreplicaneficientementeencélulasHuh-7yproducenprogenieviralinfecciosatantoencélualsencul>vocomoenmodelosanimales

Ensayoscuan>ta>vos

cuan>ficacióndelnúmerototaldeparlculasvirales

hemaglu>nación,recuentodeparlculasporEM,medicionesdeDO,métodosinmunológicos

EnsayosNsicos

medicióndelainfec>vidad

diluciónlímite,ensayosdeformacióndeplacas,formacióndefocos

Ensayosbiológicos

Ensayodeformacióndeplacas•  Sebasaenlacapacidadde

unaparlculaviralindividualdepropagarlainfeccióndelacélulainfectadainicialmentealascélulasvecinasformandounáreadeefectocitopá>covisiblemacroscópicamenteenunamonocapadecélulas

•  Elnúmerodeunidadesinfecciosasenunpocilloesdirectamenteproporcionalaladilucióndelvirus

Eficienciadeplaqueo

Larelaciónentreparlculasyunidadesformadorasdeplacas(UFP)esaltaparalamayoríadelosvirusanimales-  presenciadeparlculasno

infec>vas(genomasconmutacionesletalesodañadosdurantelapreparacióndelstock)

-  notodoslosvirusenunstocklograncompletarunciclodereplicación

Hemaglu>naciónDetectalasíntesisdeproteínasviralesencélulasinfectadasmediantelaadsorcióndeeritrocitosasusuperficieSevisualizacomoáreasquese>ñendecolorrojoluegodelaexposicióndecélulasinfectadasapreparacionesdeeritrocitosDeteccióndelainfecciónconvirusqueno>enenefectocitopá>co

Comparacióndelaeficienciadeensayoscuan>ta>vos

nosepuedeasumirunacorrelaciónentreensayos

-¿quépropiedadsemide?númerodeparlculas≠infec>vidad-¿cuáleslasensibilidaddelensayo?recuentodirectodeparlculas≠hemaglu>nación

¿Quéotrasu>lidades>eneelensayodeformacióndeplacasdelisis?

AnálisisdevirusmutantesEfectodemutacionesqueinterfierenenlareplicacióndelvirusdeldengue

AnálisisdecompuestosanKviralesInhibicióndelapropagacióndelvirusvaccinia

Mul>plicidaddeinfección(moi)•  Midelacan>dadpromediodevirusqueseagregaporcélulaenuna

infección•  Seexpresausandounamedidacuan>ta>vadelltuloviral

SiseinfectaunculKvodecélulasaunamoi=1¿cadaunadelascélulasrecibeunvirus?ElnúmerodevirusquerecibecadacélulaaunadeterminadamoisigueunadistribucióndePoissonConunamoi=3seinfectanel99%delascélulasencul>vo

Curvadecrecimientoenunpaso

•  cursotemporaldelareplicaciónviral•  rendimientodevirusporcélulaenunaúnicarondadeinfección

•  ámoiàunciclodereplicación•  âmoiàmúl>plesrondasdereplicación

Ciné>casdereplicacióndevirusdeDNAyRNA

LascurvasdevirusdeDNAmuestranfaseslargasdelatenciaysíntesisParavirusdeRNAelciclosecompletaen<12hsParavirusquemaduranporbrotaciónaniveldelamembranaplasmá>canosedetectavirusintracelularinfeccioso

Propiedadesesencialesdelosvirus①  Losvirussonmáspequeñosquebacteriasypasanatravésde

filtrosquenopermitenelpasajedebacterias②  losvirussólopuedenreplicardentrodecélulashospedadoras③  losviruspuedenestarcompuestossólodeproteínasyácidos

nucleicos④  elácidonucleicoquecomponemuchosvirusesRNA⑤  elácidonucleicodelosviruscon>enetodasuinformación

gené>ca⑥  duranteunaetapadesureplicaciónlosviruspuedenexis>rsólo

comosuácidonucleico⑦  losvirusdependendelmetabolismodelacélulahospedadoraque

proveelaenergíaylosmaterialesnecesariosparasureplicación