DRAGO BELO

PRAKTIKUM IZ BIOKEMIJE

(skripta)

veljaa, 2014.

http://www.periodni.com/gallery/polarimetar.pnghttp://www.periodni.com/gallery/preuzimanje_slike.php?name=water.png

PREDGOVOR

Svjedoci smo vrlo intenzivnog razvoja tehnika molekularne biologije koja nam omoguuju razumijevanje kemijske osnove ivota. Poznavanje kemijske osnove ivota i naina graenja velikih molekula kako u biljnom i ivotinjskom svijetu (od jednostavnih kemijskih pretea) vano je za razumijevanje ivota na Zemlji. Naime, potrebno je rasvijetliti koji dio stanice sintetizira velike molekule u vodenom mediju, na tjelesnoj temperaturi i u neutralnoj sredini. Odgovor lei u efikasnim katalizatorima u ivim stanicama koji ubrzavaju kemijske reakcije od deset do nekoliko tisua puta. Ti katalizatori se zovu enzimi. Poznato je da u stanici ima i do nekoliko tisua enzima. to je zajedniko svim enzimima? Oni pripadaju grupi spojeva koji se nazivaju proteini, koji su graeni od dugih lanaca aminokiselina. Enzimi se u stanici nalaze u trodimenzionalnom obliku i to su polimerne makromolekule. Imajui u vidu gore navedeno, dolazimo do zakljuka da bi se rasvijetlile mnoge reakcije u stanci pomau nam razne tehnike molekularne biologije i biokemije.

Prilikom izbora tehnika i naina rada s odreenim aparaturama, rukovodio sam se mojim dosadanjim iskustvom rada u laboratoriju. Znam da se sa svim ovim tehnikama studenti nee uspjeti upoznati tijekom rada u laboratoriju pri odreenim modulima. Trudio sam se upoznati studente i s tehnikama koje e im moda koristiti u buduem radu.

Prije svakog upoznavanja s vjebama u laboratoriju u okviru svakog poglavlja pokazao sam dio teoretskog dijela koji su studenti nauili tijekom predavanja, ali namjera je bila da imaju mali podsjetnik. I na kraju odreene cjeline postavio sam neka pitanja i probleme.

U Osijeku, 10. 02. 2014.

Drago Belo

SADRAJ:

1. Vodene otopine ..1

1. 1. Izraavanje koncentracija otopina....1

1. 2. Slabe kiseline i baze.......5

1. 3. Razrjeivanje pufera...18

1. 4. Ionska jakost pufera............19

2. Aminokiseline........23

2. 1. Nomenklatura aminokiselina........28

2. 2. Fizikalno kemijska svojstva aminokiselina....28

2. 3. Kemijske reakcije aminokiselina.............34

2. 3. 1. Reakcije amino i karboksilne skupine ........34

3. Proteini.......39

3. 1. Struktura, funkcija i svojstva proteina........43

3. 2. Principi izoliranja i analitika.........51

3. 3. Kemijske reakcije proteina..52

3. 4. Izoliranje proteina iz biolokog materijala...........57

3. 5. Odreivanje koncentracije proteina u biolokom materijalu...........59

3. 6. Eksperimentalne metode u biokemiji.............62

3. 6. 1. Gel elektroforeza.............62

3. 6. 2. Kromatografske metode..........66

3. 7. Optike i fotometrijske metode.....71

3. 7. 1. Metode koje se zasnivaju na interakciji molekula sa

elektromagnetnim zraenjem.........73

3. 7. 2. Lamber-Beerov zakon.......76

3. 8. Metode koje se zasnivaju na sedimentaciji; Ultracentrifuga......86

3. 8. 1. Analitika ultracentifuga.....90

3. 8. 2. Preparativno centrifugiranje.....90

3. 8. 3. Zadaci i problemi.......................................................................................................................94

4. Enzimi..............99

4. 1. Enzimi kao bioloki katalizatori........102

4. 2. Termodinamika i kinetika.....104

4.3. Brzina reakcije i teorija sudara...106

4. 3. 1. Teorija ukupne brzine reakcije.... 107

4. 4. Glavne karakteristike enzima kao katalizatora..........110

4. 5. Kinetika kemijskih reakcija..........112

4. 5. 1. Osnovni principi kemijske kinetike.......112

4. 5. 2. Kinetika enzimskih reakcija....116

4. 5. 3. Osnovne jednadbe u kinetici enzimskih reakcija....................................................117

4. 5. 3. 1. Znaenje konstante KM....................................................................................................121

4. 5. 3. 2. Karakteristike Michaelis-Menten-ove jednadbe...............................................122

4. 5. 3. 3. Grafiko prikazivanje Michaelis-Menten-ove jednadbe..................................123

4. 6. Utjecaj temperature na brzinu reakcije..............................................................................125

4. 7. Utjecaj ostalih imbenika na brzinu reakcije...................................................................127

4. 7.1. Utjecaj inhibitora na brzinu enzimske reakcije....127

4. 7. 2. Utjecaj pH na aktivnost enzima.136

4. 7. 3. Utjecaj temeperature na brzinu katalizirane reakcije enzimima.141

5. Svojstva nekih enzima................................................................................................................142

5. 1. Amilaza............................................................................................................................................142

5. 1. 1. Odreivanje ukupne aktivnosti amilaze........................................................................144

5. 1. 2. Ispitivanje utjecaja pH na aktivnost amilaze...............................................................146

5. 2. Ispitivanje aktivnosti invertaze....................................................................................... ......148

5. 3. Ispitivanje utjecaja razliitih faktora na aktivnost enzima........................................152

5. 3. 1. Ispitivanje utjecaja duljine vremena provoenja reakcijenana aktivnost

ureaze..................................................................................................... ......................................156

5. 3. 2. Ispitivanje utjecaja toplinskog faktora na aktivnost ureaze.................................157

5. 3. 3. Ispitivanje utjecaja Na+ i PO43- na aktivnost ureaze.................................................158

5. 3. 4. Ispitivanje utjecaja aktivatora i inhibitora na aktivnost ureaze.........................159

5. 3. 5. Ispitivanje utjecaja pH na aktivnost ureaze.................................................................160

6. Literatura............................................................................................................................. ..............162

1

1. U V O D

Za rad u biokemijskom laboratoriju koriste se razliite otopine i iz tih razloga je potrebno poznavati

izraavanje njihove koncentracije. Tako da emo na poetku prikazati mali podsjetnik iz izraavanja

koncentracija otopine.

1. 1. IZRAAVANJE KONCENTRACIJA OTOPINA

Molaritet (M) predstavlja broj molova otopljene tvari u jednoj litri otopine. Meunarodni sustav

jedinica (SI) preporuuje izraavanje volumena u m3. Prema tome, 1 litra = 10-3 m3 (po definiciji 1 L = 1

dm3, 1 ml = 10-6 m3 = 1cm3). Molaritet se esto koristi kao alternativni nain izraavanja koncentracije.

Koncentracije razrijeenih otopina esto se izraavaju u manjim jedinicama:

mmol/l (milimol/litri) = 10-3 M

mol/l (mikromolarna/l) = 10-6 M

nmol/l (nanomolarna/l) = 10-9 M

Aktivitet () je stvarna (efektivna) koncentracija iona u otopini:

http://www.google.hr/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=AdHYlzk8MnLTCM&tbnid=cYPpa1mXHS7dUM:&ved=&url=http://magaza.hammaddeler.com/Potasyum-Antimon-III-Oksit-Tartarat-Trihidrat-250-gr-1080920250,PR-32081.html&ei=h1OsUt60DIbmywO84oGQDA&bvm=bv.57967247,d.bGQ&psig=AFQjCNEfPL36CXppUxryjrz87m3ANGlw2w&ust=1387111687553374

2

M

gdje predstavlja koeficijent aktiviteta koji ovisi o naboju i koncentraciji iona i ukupne ionske jakosti.

Vrijednosti za koeficijente aktiviteta nekih iona prikazani su u Tablici 1.

Ionska jakost ( I ) otopine mjera je jakosti elektrinog polja koje daju ioni u otopini. Ionska jakost

jednaka je polovini zbroja produkata koncentracije (M) i kvadrata naboja (z) svakog iona u otopini.

Ionska jakost I2

1 izraava se na sljedei nain:

22

1

2

1ii zMI

gdje je Mi molaritet, a zi naboj i-tog iona.

Tablica 1. Koeficijenti aktiviteta nekih iona u otopini

ION KONCENTRACIJA

0,001 M 0,01M 0,1 M

H* 0,975 0,933 0,860

OH- 0,975 0,925 0,805

Acetat - 0,975 0,928 0,820

H2PO4- 0,975 0,928 0,744

HPO42- 0,903 0,740 0,445

PO43- 0,796 0,505 0,160

Citrat - 0,975 0,926 0,810

Citrat 2- 0,903 0,741 0,450

HCO3- 0,975 0,928 0,820

CO32- 0,903 0,742 0,445

Molalitet (m) predstavlja broj molova otopljene tvari u 1 000 g otapala i koristi se u nekim fizikalno---

kemijskim izraunavanjima (npr. krioskopiji i ebulioskopiji). Kod razrijeenih otopina molalitet i

molaritet su praktino isti.

3

Teinski postotak (w/w) broj je grama otopljene tvari u 100 g otapala (%/w).

Teinsko/volumni postotak (w/v) broj je grama otopljene tvari u 100 ml (cm3) otapala (%/v).

Masena koncentracija () jednaka je omjeru mase (mA) otopljene tvari i volumena (V) otopine. SI

jedinica za masenu koncentraciju jest kg m-3, ali se u laboratoriju ee upotrebljava g dm-3 koja ima

istu brojanu vrijednost.

=

Postotak zasienja predstavlja koncentraciju soli u otopini izraenu kao postotak od zasiene otopine

te otopine na odreenoj temperaturi. Proteini se esto izoliraju diferencijalnim taloenjem pomou

neutralnih soli (tvz. isoljavanjem). Najee se upotrebljava (NH4)2SO4 zbog svoje velike topivosti u

vodi. Koliina (NH4)2SO4 potrebna za pripremanje otopine odreenog postotka zasienja moe se

izraunati (dolje primjer) ili se pronai u biokemijskim tablicama (vidi Tablicu 2).

P r i m j e r :

Specifini je volumen krutog (NH4)2SO4 je 0,565 ml/g. Topljivost (NH4)2SO4 je 700 g/1 000 g H2O.

Potrebno je izraunati:

a) koncentraciju (NH4)2SO4 u zasienoj otopini na 0o C,

b) koliinu krutog (NH4)2SO4 koju treba dodati u 500 ml otopine 40% zasienja,

(na 0oC) da bi se dobilo 60% zasienje.

Volumen zasiene otopine (NH4)2SO4 na 0oC je 1 000 ml + 706 x 0,565 ml = 1 399 ml

Masena koncentracija (NH4)SO4 u ovoj otopini je lg505,0

1399

706

Molaritet zasiene otopine je Mmasamol

82,314,132

505

.

505

Mogue je izvesti izraz

2

12

285,01

505

s

sst

U ovom je izrazu t = teina krutog (NH4)SO4 koju treba dodati na 1000 ml otopine ije je poetno

zasienje s1, da bi se postiglo zasienje s2 (0s11; 0s21). Faktor 505 u brojniku predstavlja

4

koncentraciju (u g/l) 100% zasiene otopine, a faktor 0,285 u nazivniku predstavlja produkt iz

specifinog volumena i koncentracije zasiene otopine: (0,565 ml/g) x (0,505 g/ml).

Iz naprijed navedenog proizilazi ml

g

l

gt

5009,608,121

6,0285,01

4,06,0505

Tablica 2. Tablica za podeavanje koncentracije otopine (NH4)2SO4 na temperaturi 250C

eljeno zasienje amonijevog sulfata; % pri 00C

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Poetno zasienje

Masa (g) (NH4)2SO4 koju treba dodati u 100 cm3 otopine radi postizanja eljenog zasienja

0 10,7 13,6 16,6 19,7 22,9 26,2 29,5 33,1 36,6 40,4 44,2 48,3 52,3 56,7 61,1 65,9 70,7

5 8,0 10,9 13,9 16,8 20,0 23,2 26,6 30,0 33,6 37,3 41,1 45,0 49,1 53,3 57,8 62,4 67,1

10 5,4 8,2 11,1 14,1 17,1 20,3 23,6 27,0 30,5 34,2 37,9 41,8 45,8 50,0 54,5 58,9 63,6

15 2,6 5,5 8,3 11,3 14,3 17,4 20,7 24,0 27,5 31,0 34,8 38,6 42,6 46,6 51,0 55,5 60,0

20 0 2,7 5,6 8,4 11,5 14,5 17,7 21,0 24,4 28,0 31,6 35,4 39,2 43,3 47,6 51,9 56,5

25 0 2,7 5,7 8,5 11,7 14,8 18,2 21,4 24,8 28,4 32,1 36,0 40,1 44,2 48,5 52,9

30 0 2,8 5,7 8,7 11,9 15,0 18,4 21,7 25,3 28,9 32,8 36,7 40,8 45,1 49,5

35 0 2,8 5,8 8,8 12,0 15,3 18,7 22,1 25,8 29,5 33,4 37,4 41,6 45,9

40 0 2,9 5,9 9,0 12,2 15,5 19,0 22,5 26,2 30,0 34,0 38,1 42,4

45 0 2,9 6,0 9,1 12,5 15,8 19,3 22,9 26,7 30,6 34,7 38,8

50 0 3,0 6,1 9,3 12,7 16,1 19,7 23,3 27,2 31,2 35,3

55 0 3,0 6,2 9,4 12,9 16,3 20,0 23,8 27,7 31,7

60 0 3,1 6,3 9,6 13,1 16,6 20,4 24,2 28,3

65 0 3,1 6,4 9,8 13,4 17,0 20,8 24,7

70 0 3,2 6,6 10,0 13,6 17,3 21,2

75 0 3,2 6,7 10,2 13,9 17,6

80 0 3,3 6,8 10,4 14,1

85 0 3,4 6,9 10,6

90 0 3,4 7,1

95 0 3,5

100 0

5

1. 2. SLABE KISELINE I BAZE

Da bi mogli razumjeti ponaanje slabih kiselina i baza u vodenoj otopini, potrebno je razumjeti osobine

i ponaanje veine biomolekula. Veliki broj malih metabolita kao i dijelova biopolimera kiseline su ili

baze. Svojstva velikih molekula potjeu od njihovog naboja na odreenom pH fizioloke otopine.

Stabilnost prirodne (nativne) konformacije makromolekula ovisi o kemijskoj grai i svojstvima

makromolekule pri fiziolokom pH u stanici. Mnoge laboratorijske tehnike i metode za izoliranje i

ispitivanje ovih tvari zasnivaju se na njihovim kemijskim svojstvima.

A) DEFINICIJA KISELINA I BAZA

Prema Luisovoj teoriji, kiselina se moe definirati kao tvar koja moe otpustiti protone, a baza kao

tvar koja moe primiti protone. U vodenoj otopini ovaj se proces moe prikazati na sljedei nain:

HA + H2 O A- + H3O+

A1 B2 B1 A2

[H3O+] = [A-] = X

[HA] = c(HA) - X

K(HA) = X2/c(HA) - X

X2 + K(HA)*X - K(HA)*c(HA) = 0

gdje su A1 i A2 meusobno konjugirani par kiselina, a B1 i B2 meusobno konjugirani par baza. HA je

kiselina jer predaje proton. A- je baza jer moe primiti proton, npr. u reakciji u kojoj H2O igra ulogu

kiseline:

A- + H2O AH + OH-

B1 A2 A1 B2

[H3O+]

6

Svaka kiselina ili baza moe se karakterizirati svojom konstantom disocijacije (Ka ). Za slabu kiselinu bit

e:

KA H O

H O HAa'

3

2

K

A H O

HAa

3

Konstanta disocijacije slabe kiseline u pravilu mnogo je vea od ionskog produkta vode. Prema tome,

zanemariv je doprinos disocijacije vode koncentraciji hidronij iona i to je razlog zato se Ka moe

prikazati na dva naina, ali najee se koristi drugi nain izraunavanja.

Za konjugiranu bazu:

KHA OH

A H Ob'

2

K

HA OH

Ab

Kakav je odnos izmeu ovih dviju konstanti? Ako ih pomnoimo dobit emo:

K KH O A

HA

HA OH

AH O OHa b

3

314

10 (ionski produkt H2O)

odnosno:

pK pKa b 14

Isti odnos vrijedi i za slabu bazu i njenu konjugiranu kiselinu:

7

K KB H O

BH

BH OH

Btj pK pKa b a b

3 1410 14.

U gornjim jednadbama primijenjen je uobiajen nain izraunavanja: pH H log .

P r i m j e r :

CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+ pKa = 4,76

pKa + pKb = 14

CH3COO- + H2O CH3COOH + OH- pKb = 9,24

H2CO3 + H2O HCO3- + H3O+ pKa1 = 6,10

HCO3- + H2O H2CO3 + OH- pKb1 = 7,90

HCO3- + H2O CO2- + H3O+ pKa2 = 10,25

CO32- + H2O HCO3- + OH- pKb1 = 3,75

NH3 + H2O NH4+ + OH- pKb = 4,70

NH4+ + H2O NH3 + H3O+ pKa = 9,30

CH3NH2 +H2O CH3NH3+ + OH- pKb = 3,36

CH3NH3+ + H2O CH3NH2 + H3O+ pKa = 10,64

Slabe kiseline i baze u vodenim otopinama nisu potpuno disocirane. Na primjer, kod kiselina je jedan

dio u AH a drugi u A- obliku. Postotak disociranog oblika u odnosu na ukupnu koliinu kiseline ili baze

8

naziva se stupnjem disocijacije. Odnos disociranog i nedisociranog oblika ovisi o Ka i o pH (koncentraciji

H3O+ iona). Ako se logaritmira jednadba za Ka i preuredi dobit e se jednadba:

KH O A

HAK H O

A

HAa a

3

3log log log

log log logH O KA

HAa3

pH pKA

HAa

log

Za slabe baze moe se izvesti analogan izraz:

pH pK

B

BHa

log

Ova jednadba se naziva Henderson-Hasselbachova jednadba i u biokemiji se mnogo primjenjuje.

B) TITRACIJA SLABE KISELINE

Kada se slaba kiselina titrira jakom bazom, dobit e se krivulja kao na Slici 1., pri emu se pH u svakom

trenutku titracije moe izraunati iz Henderson-Hasselbach-ove jednadbe. Prije poetka titracije pH

e odgovarati pH kiseline:

9

Iz

K

H O A

HAa

3

proizilazi da je pH pK p HAa 1

2

Kada je kiselina djelomino utroena, pH ovisi o odnosu koncentracija ostatka kiseline i nastale soli,

ija koncentracija odgovara koncentraciji dodane baze:

pH pKA

HAa

log

Kada je 1

2kiseline istitrirana, koncentracija soli jednaka je koncentraciji kiseline pa pH jeste jednako

pKa:

S obzirom da je A HA tada je pH = pKa.

U ovom dijelu pH vrlo malo se mijenja s dodatkom baze (puferska sredina). Kada se cijela kiselina

potroi, pH e biti lunat zbog hidrolize nastale soli:

KOH HA

Ab

pOH pK p Ab 1

2 pH pOH 14

10

Slika 1. Krivulja titracije slabe kiseline sa jakom bazom

C) LABORATORIJSKI PUFERI

Pojam pufer je grka rije koja oznaava odupiranje promjeni. U kemiji se puferom naziva otopina

slabe kiseline i njene soli (ili otopina slabe baze i njene soli) koja ima osobinu da sprjeava velike

promjene pH pri dodatku manjih koliina H+ ili OH- iona.1 Poznavanje pufera je za svakog biokemiara

potrebno, kako zbog razumijevanja osnovnih biokemijskih procesa, tako i zbog rutinske primjene u

laboratoriju.

Naime, stanice nekog organizma odupiru se veim promjenama pH i njihovoj vanjskoj okolini. Kao to

je poznato, stanini procesi su vrlo osjetljivi na promjenu pH medija i radi toga pH medija vrlo paljivo

1 U daljnjem tekstu pisat emo H+ umjesto H3O+ itd.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60

pH

VOLUMEN DODANE BAZE

TITRACIJA SLABE KISELINE JAKOM BAZOM

TOKA EKVIVALENCIJE

11

je izreguliran. Unutarstanini procesi zbivaju se pri neutralnom pH ili vrlo blizu neutralnom pH, jer pri

tome pH metaboliki procesi teku maksimalnom brzinom. Izuzetak su enzim lizozim koji pripada

skupini hidrolaza posjeduje maksimalnu aktivnost u podruju pH = 5,00, a pH eluanog soka je negdje

oko 1,5, jer pri tom pH je maksimalna aktivnost pepsina.

U biolokim je sustavima vrlo bitna konstantnost pH, zbog toga su puferi jako bitni kako bi se mogli

oduprijeti promjeni pH poslije nastanka metabolikih produkata kao to su mlijena kiselina ili

amonijske baze. Najbolji puferski sustavi koji se nalaze u staninoj tekuini su fosfati, bikarbonati,

aminokiseline i proteini. pH se regulira razdiobom na tvari prisutne u stanici ili izmjenom iona kroz

polupropusnu membranu. U stanici se nalaze molekule, kao npr. proteini, koje sadre ionizacijske

grupe koje se nalaze u odreenim ionizacijskim stanjima koja su vana, kako za konformaciju proteina

tako i njihovu bioloku aktivnost. Pojedini su proteini izuzetno osjetljivi na promjenu pH, jer i vrlo mala

promjena uvjetuje njihovu bioloku aktivnost. Tako npr. kod hemoglobina, ija je primarna funkcija da

vri transport O2 od plua do tkiva, produkti disanja CO2 i H+ omoguuju olakano oslobaanje kisika.

Za prouavanje metabolikih procesa in vitro uvjetima potrebno je koristiti puferske sustave.

Namjerna promjena pH koristi se u analitikim studijama, a ovisi o sadraju grupa u molekuli, kao npr.

aminokiselina, proteina i nukleinskih kiselina prilikom provedbe elektroforeze ili ionsko-izmjenjivake

kromatografije. Puferske otopine se odupiru promjeni koncentracije vodikovih iona dodatkom kiselina

ili baza. Veliinu puferskog djelovanja nazivamo kapacitet pufera ( ) , a to je mjera za koliinu jake

baze koja je potrebna da bi se pH promijenio za jednu jedinicu:

pHddb

(1)

gdje je d(pH) porast pH koji rezultira dodatkom db baze u cm3.

Mijeanjem otopine slabe kiseline i njene soli, kao npr. otopina octene kiseline i otopina natrijevog

acetata (po Brnstad-ovoj i Louis-ovoj teoriji) mijeanje je slabe kiseline i njene konjugirane baze pri

emi se dobije puferska otopina, otopina koja zadrava priblino konstantan pH. Konjugirani par

kiselina-baza, koji u stvari ini neki pufer, odgovoran za odravanje konstantnog pH puferske otopine.

12

Djelovanje pufera kod dodatka kiseline ili baze moe se prikazati na sljedeim primjerima. Acetatni

pufer neutralizirat e se dodatkom kiseline na taj nain to e vodikove ione vezati bazna komponenta,

tj. acetatni anion.

CH3 COO- + H+> CH3COOH

Dodatkom baze neutralizirat e kisela komponenta pufera, tj. vodikov ion iz octene kiseline.

CH3 COOH + OH- > CH3COO - + H2O

Jasno je da kapacitet pufera ovisi o dijelu kiseline i njene konjugirane baze, a maksimalan je kada je

jednaka pH = pKa. Kapacitet pufera ovisi o ukupnoj koncentraciji kiseline i njene soli te njihovom

relativnom odnosu. Najee koritene koncentracije kiseline i njene soli obino su reda veliine 0,05

do 0,20 M, a openito je najbolji puferski kapacitet unutar pH = pKa 1. Ovaj je kriterij zgodno znati

za pufere koji se koriste u istraivanjima. Postoje i odreena pravila koja se mogu sumirati:

1. koristiti odgovarajui pufer u odgovarajuem pH podruju radi to boljeg puferskog

kapaciteta,

2. potrebito je da su to istije, koritene kemikalije

3. ako je mogue, da su vodene otopine nepropusne kroz bioloke membrane,

4. koristiti pufere gdje su enzimi stabilni,

5. koristiti pufere koji su to manje obogaeni s drugim komponentama,

6. poeljno je da nije toksian, koriteni pufer

7. potrebito je da je topljiv, koriteni oblik kationa

8. poeljno je da pufer ne apsorbira u vidljivom i ultraljubiastom podruju.

Iz gore navedenoga nije teko donijeti zakljuak kako svi koriteni puferi ne sadre eljena svojstva.

Tako su npr. fosfati polivalentni kationi i esto su metaboliti, dok je Tris toksian, a posjeduje i

inhibitorska svojstva. Meutim, brojni dipolni puferi tipa HEPES i PIPES ispunjavaju gotovo sve

potrebno i vrlo esto se koriste za medije kulture tkiva koji jo sadre otopine bikarbonata i fosfata.

Najee koriteni puferi su prikazani u Tablici 3.

13

Tablica 3. Najee koriteni puferi

NAZIV KEMIKALIJE STRUKTURA pKa Pirofosfat

1,52 2,36 6,60 9,25

Malat

1.92 6,23

Fosfatna kiselina

2,12 7,21

12,32

Glicin 2,34 9,78

Ftalna kiselina

2,95 5,41

Limunska kiselina

3,09 4,75 5,41

Glicilglicin

3,06 8,13

Mravlja kiselina 3,77 Octena kiselina 4,76 Piridin

5,14

MES

6,15

PIPES

6,8

HEPES

7,55

TRIS 8,10 TRICIN

8,15

BICIN

8,35

Borna kiselina

9,23

Hidrogenkarbonat 10,3

Trietilamin (TEA)

10,65

14

Koriteni laboratorijski puferi trebaju imati najvei puferski kapacitet u ispitivanom podruju.

Ionizacijska stanja pufera ovise o dobivenom pH (tj. koliinom mijeanja slabih kiselina i njihovih soli)

i vrijednosti konstante disocijacije. Za slabe kiseline jednadba konstante disocijacije glasi:

RCOOH RCOO- + H+ (2)

kiselina konjugirana baza

a jednadba konstante disocijacije glasi:

RCOOH

HRCOOKa

(3)

Za slabe baze, kao npr. amini, jednadba glasi:

RNH2 + H2O RNH3+ + OH- (4)

baza konjugirana baza

a jednadba konstante disocijacije glasi:

OHRNH

OHRNHKb

22

3

ili izraz za aK vrijednost konjugirane kiseline glasi:

RNH

HRNHKa

2

15

Produkt baiKK za slabe baze jednak je wK , tj. ionski produkt vode.

Imajui u vidu da je aK vrijednost numeriki mala, u praksi se mnogo ee koristi apK , a poznato

je da je aa KpK 10log . Zbroj pK vrijednosti slabih baza i konjugiranih kiselina dobije se izraz

.14 ba pKpK pH pufera moe se izraunati Henderson-Hasselbach-ovom jednadbom. Za slabe

kiseline vrijedi oblik:

baza

kiselina

akonjugiranpKpH a 10log ili

oblik

oblik

nineionuzira

ioniziranipKpH a 10log

Kod slabih baza jednadbe za neionizirane oblike i konjugirane kiseline bit:

kiselinaakonjugiran

bazapKpH a 10log ili

oblik

oblik

ionizirani

nineionizirapKpH a 10log

Ope je poznato ako slaba kiselina prevladava u neioniziranom obliku (npr. COOH grupa), pri niskoj

pH vrijednosti dok pri visokom pH prevladavat e ionizirani oblik slabe kiseline (npr. COO- grupa).

Tono suprotno za slabe baze pri niskom pH prevladavat e ( npr. NH3+) konjugirana kiselina, dok kod

visokog pH prevladat e neionizirana (NH2) slaba baza. Ovakva je osjetljivost pufera vana kod

fiziolokih otopina. Poznavanje svojstava pufera vano je u istraivanju u in vitro uvjetima kod

koritenja tehnika elektroforeze i ionskoizmjenjivake kromatografije.

16

U otopini slabe kiseline i njene soli, pH otopine po Henderson-Hasselbach-ovoj jednadbi e ovisiti o

pKa kiseline i odnosa koncentracija soli i kiseline:

pH pKsoli

kiselinea log

Ako uzmemo da koncentracija HA odgovara koliini kiseline, a koncentracija A- koliini soli u puferu,

suma njihovih koncentracija naziva se molaritet pufera. Tako na primjer u 0,2 M acetatnom puferu

suma koncentracija octene kiseline i acetatnih iona je 0,2 M. Mala koliina H+ iona koja se doda u

otopinu pufera neutralizira se nastajanjem odgovarajue koliine kiseline HA, i obrnuto, OH- se

neutralizira u reakciji sa HA. Kako se pri ovome mijenja odnos

A

HA

i pH e se malo promijeniti.

Sposobnost pufera da se odupre promjeni pH bit e najvea kada je pH = pKa iako je dio u kojoj jedna

kiselina ili baza mogu biti puferi vea i iznosi pKa 1 (pogledaj krivulju titracije slabe kiseline). U Tablici

2. prikazane su pKa vrijednosti nekih kiselina i baza koje se koriste kao komponente pufera. Za pufere

pri kiselom pH uzimat e se tvari sa pKa 7, a za pufere u baznoj pH tvari sa pKa 7.

Sposobnost pufera da se odupire promjeni pH ovisi o njegovom kapacitetu. Mjera za kapacitet pufera

je promjena pH ovisno o koliini dodanih H+ ili OH- iona. Kapacitet se pufera definira kao ona koliina

H+ ili OH- iona koju treba dodati da se pH pufera promjeni za 1; prema tome u kiselom i u baznom

smjeru e biti jednako samo u puferima kod kojih je pH = pKa. Prema tome kapacitet pufera ovisi o pH

(radi odnosa prema pKa) i o koncetraciji komponenti pufera (0,2 M pufer ima vei kapacitet od 0,1 M

pufera). Ovakvo razmatranje moe se primijeniti i na slabe baze to emo uoiti iz sljedeeg primjera.

Primjer:

Reakcija katalizirana enzimom izvodi se u 0,2 M Tris puferu (pKa = 8,1) na pH = 7,8. Kao rezultat reakcije

nastaje 0,3 mol /l H+ iona. Potrebno je:

a) napisati jednadbu reakcije kojom ovaj pufer najmanje mijenja pH

b) odrediti koncetraciju Tris+ i Triso na poetku i na kraju reakcije

c) odrediti pH pufera na kraju reakcije. Koliki bi bio pH kada bi se reakcija provodila bez

pufera?

17

d) kako bi priredili 1 dm3 ovog pufera polazei od Tris i koncentrirane HCl?

e) u kojem se dijelu pH Tris moe upotrijebiti kao pufer? Koliki je kapacitet ovog pufera?

Tris je komercijalni naziv za trihidroksimetil aminometan. Hidroksilne skupine poveavaju topivost

ovog amina u vodi.

a) Reakcije Tris baze sa H+ i OH- ionima:

(HOCH2)3CNH2 + H+ (HOCH2)3CNH3+ (HOCH2)3CNH3+ + OH- (HOCH2)3CNH2

Triso Tris+ Tris+ Triso

b)

pH pKTris

Trisa

o

log

7 8 81. . log

Tris

Tris

o

5.03,0log Tris

Tris o

S obzirom da je Tris Triso = 0,2 proizlazi da je Tris M 0133. i Tris Mo 0 067. na poetku

reakcije. Na kraju reakcije je H M 0030. te je zbog toga Tris M 0163. i Tris Mo 0 037. ,

c)

456,7167.0

037.0log1,8 pH

Bez pufera: 52,103,0log pH

Znai, pH pufera se smanjio sa 7,8 na 7,5, a bez pufera bi bio 1,5. Do tako niskog pH reakcija se sigurno

ne bi odvijala, jer bi se enzim prije toga inaktivirao.

d) Izvae se 0,2 M (31,4 g) Tris

18

e) priredi 0,067 M HCl (2,68 g koncentriranog HCl, dopuni do 1 dm3 sa destiliranom H2O).

S obzirom da pH ovisi o odnosu Tris

Tris

o

pH se u ovom sluaju nee promijeniti.

f) pH pKa 1 81 1. 7.1 pH 9.1

6 8 81. . log

Tris

Tris

o

Tris

Tris

o

0 05.

Tris M 0190.

Tris Triso 002.

Smanjenjem pH za 1 ( 7.8 6.8 ) Tris poveava se sa 0.133 M na 0.190 M to odgovara

H M 0057. (kapacitetu u kiselom dijelu).

Na isti nain moemo izvesti za kapacitet ovog pufera u baznom dijelu (pH sa 7.8 8.8) koji e

odgovarati OH M 0051. .

1. 3. RAZRJEIVANJE PUFERA

Prema Henderson-Hasselbach-ovoj jednadbi pH pufera ovisi samo o pKa i odnosu koncentracija

kiseline i njene konjugirane baze, to bi trebalo znaiti da se pri razrjeivanju pufera (dodakom H2O)

pH ne bi trebao mijenjati. Meutim, prilikom velikog razrjeivanja, tj. smanjenju koncentracije

kiseline i njene baze. pH pufera se ipak malo promijeni. Do ovoga dolazi iz vie razloga. Naime,

koeficijenti aktiviteta prilikom razrijeivanja pribliavaju se jedinici, a i stupanj disocijacije kiseline ili

njene konjugirane baze poveava se, to dovodi do male promjene pH pufera. Potrebno je brinuti

prilikom velikog razrjeivanja i uzeti u obzir i koncentraciju H+ iona iz vode.

19

1. 4. IONSKA JAKOST PUFERA

Prilikom ispitivanja utjecaja pH na neku reakciju potrebno je provjeriti jesu li puferi jednake ionske

jakosti, jer kao to je poznato ionska jakost moe imati utjecaja na enzimsku reakciju. Puferi razliitog

sastava pa ak i puferi istog sastava na razliitim pH imaju razliitu ionsku jakost. U sluaju potrebe da

se izjednai ionska jakost to se postie dodatkom potrebne koliine neke neutralne soli kao to je npr.

NaCl.

Primjer:

Koji pufer ima veu ionsku jakost: 0,5 M Tris pufer (pH 7,5) ili 0,05 M fosfatni pufer istog pH? Kako

bismo izjednaili ionsku jakost ovih pufera?

Iz Tablice 2. u dodatku oitamo da je pKa za Tris 8,1, a za H3PO4 pKa1 = 2,12, pKa2 = 7,21 i pKa3 = 12,32.

Koeficijente aktiviteta oitamo u Tablici 1.

Prvo emo izraunati koncentracije Tris+ i fosfatnih iona. Ako nam je poznata ukupna koncentracija

iona koja iznosi 0,05 M, moemo izraunati koncentracije Tris odnosno fosfatnih iona. Ako znamo da

je koncentracija Cl- iona jednaka koncentraciji Tris+ iona, a koncentracija K+ iona je dva puta vea od

koncentracije fosfatnih iona prema jednadbi na stranici 2. izraunamo ionsku jakost .

Tris:

Tris

Tris olog1,85,7 Fosfat:

4242

2

4

2

4log2,75,7POHPOH

HPOHPO

MTris 04,0

42

2

4

88,0

64,0log2,75,7

POH

HPO

MCl 04,0 MHPO 37,024

22 112

1

2

1 ClTrisI MPOH 013,042

04,004,02

1

2

1I MMxK 087,0013,037,02

20

222 1087,01013,02037,02

1

2

1xxxI

124,02

1I

Da bi se ionska jakost izjednaila potrebno je dodati 0,084 M NaCl u 1 dm3 Tris pufera. Prilikom dodatka

NaCl pH e se malo izmjeniti (obzirom da ionska jakost utjee na koeficijent aktiviteta) i zato je

potrebno ponovo podesiti pH.

Tablica 4. pKa vrijednosti za ope bioloke pufere

Trivijalni naziv Ime pufera pKa na 250C

Pirofosfat (pKa1) 0,85

Oksalat (pKa1) 1,19

Glicerofosfat (pKa1) 1,47

EDTA (pKa1) Etilendiamin tetraoctena kiselina 1,70

Histidin (pKa1) 1,82

Pirofosfat (pKa2) 1,96

Maleat (pKa1) 2,00

Benzenheksakarbonat (pKa1) 2,08

Fosfat (pKa1) 2,12

Brucin tetrahidrat (pKa1) 2,30

Benzen pentakarbonat (pKa1) 2,34

Glicin (pKa1) 2,34

Benzen 1,2,4,5-tetrakarbonat (pKa1) 2,43

Benzen heksakarbonat (pKa2) 2,46

EDTA (pKa2) Etilendiamin tetraoctena kiselina 2,60

Malonat (pKa1) 2,85

Ftalat (pKa1) 2,90

21

Benzen pentakarbonat (pKa2) 2,95

Salicilat 2,98

Benzen 1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 2,98

PIPES (pKa3) 1,4-piperazin-(etansulfonska kiselina) 3,00

Tartart (pKa1) 3,02

Fumarat (pKa1) 3,03

Citrat (pKa1) 3,06

Ciklopentan tetra-1,2,3,4-karboksilat (pKa1) 3,07

o-ftalat (pKa1) 3,10

Benzen 1,2,4,5-tetrakarboksilat (pKa1) 3,13

Benzen 1,3,5-trikarboksilat (pKa1) 3,16

Benzenheksakarboksilat (pKa1) 3,24

Dimetilmalonat (pKa1) 3,29

Mandelat 3,36

Butan 1,2,3,4-tetrakarboksilat (pKa1) 3,36

Malitat (pKa1) 3,40

1,1 cikolheksandikarbonat (pKa1) 3,52

2-metilpropan-1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 3,53

Hipurat (pKa1) 3,64

Propan-1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 3,67

Formiat (pKa1) 3,75

3,3-dimetilglutarat (pKa1) 3,79

1,1-ciklopentandiacetat (3,3-tetrametilglutarna kiselina) (pKa1) 3,82

Itakonitat (pKa1) 3,84

Laktat 3,86

Benzenpentakarboksilat (pKa1) 3,94

Benzen-1,3,5-trikarboksilat (pKa1) 3,98

Barbiturat 3,98

Askobtat (pKa1) 4,10

22

2,2-dimetilsukcinat (pKa1) 4,11

Sukcinat (pKa1) 4,19

Benzoat 4,20

Oksalat (pKa2) 4,21

Sukcinat (pKa1) 4,21

Citrat (pKa2) 4,76

Acetat 4,76

Piridin 5,23

Citrat (pKa3) 5,40

Sukcinat (pKa2) 5,64

MES 2-(N-Morfolino)etansulfonska kiselina 6,15

Kakodilat Dimetillaurinska kiselina 6,27

Karbonat (pKa1) 6,35

BIS-Tris Bis-(2-hidroksietil)iminotris(hidroskimetil)metan 6,46

ADA N-2-acetamidoiminooctena kiselina 6,59

PIPES Piperazin-N,N'-bis(2-etansulfonska kiselina) 6,76

Pirofosfat 0,85

Oksalat 1,19

Glicerofosfat 1,47

EDTA Etilendiamino tetraoctena kiselina 1,70

Tartarat 3,02

Fumarat 3,03

Glicilglicin 3,0

23

2. AMINOKISELINE

Kako bismo definirali to su aminokiseline? Poznato je iz organske kemije da su to organske kiseline

kojima je na -ugljikovom atomu H-atom zamijenjen NH2-grupom. Prirodne aminokiseline su, osim

malog broja izuzetaka, uglavnom -aminokiseline, pa im pripada i opa formula:

One su sastavni dio proteina, ali se mogu nalaziti i u slobodnom stanju u tjelesnim tekuinama i tkivu

gdje ine rezervoar slobodnih aminokiselina (aminokiselinski "pool"). Aminokiseline slue u prvom

redu za biosintezu proteina, te takoer mogu posluiti i za biosintezu mnogih drugih biokemijski vanih

supstanci , kao npr: porfirina, nukleinskih baza, alkaloida, i dr.

Do danas je iz prirodnih produkata izolirano vie stotina aminokiselina. Meutim, hidrolizom prirodnih

proteina dobije se uglavnom 20 aminokiselina koje se danas nazivaju osnovnim aminokiselinama.

Klasifikacija aminokiselina moe se provesti na vie naina. S gledita proteinske kemije aminokiseline

se dijele prema polarnosti R-ostatka pri pH 6 do 7 (to predstavlja pH unutarstanine tekuine u

organizmu) na etiri skupine:

1) nepolarne

2) polarne nenabijene (neutralne)

3) polarne negativno nabijene (kisele)

4) polarne pozitivno nabijene (bazne)

U Tablicama 5., 6. i 7. prikazane su strukturne formule aminokiselina, njihovi nazivi te troslovne i

jednoslovne oznake.

http://www.periodni.com/gallery/alanine.png

24

Tablica 5. Nepolarne aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

GLICIN Gly G

ALANIN Ala A

VALIN Val V

LEUCIN Leu L

IZOLEUCIN Ile I

FENILALANIN Phe F

TRIPTOFAN Trp W

METIONIN Met M

25

PROLIN Pro P

Tablica 6. Polarne, ali nenabijene aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

SERIN Ser

S

TREONIN Thr T

CISTEIN Cys C

TIROZIN Tyr T

ASPARAGIN Asn N

GLUTAMIN Gln Q

26

Tablica 7. Polarne(kiselo i bazino nabijene) aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

ASPARAGINSKA KISELINA

Asp

D

GLUTAMINSKA KISELINA

Glu E

LIZIN Lys K

ARGININ Arg R

HISTIDIN His H

27

Prema kemijskoj strukturi, aminokiseline se mogu podijeliti u tri skupine i to:

a) alifatske - Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Lys, Arg, Asp, Asn,Glu, Gln,

b) aromatske - Phe, Tyr, Trp,

c) heterociklike - Pro, His, Trp

Prema Dakin-u aminokiseline se, glede razgradnje ugljikovodinog R-ostatka, mogu podijeliti u dvije

skupine i to:

a) glukogene, tj. one koje se pri nedostatku ugljikohidrata u prehrani

prevode u eere preko oksalacetata i fosfoenolpiruvata (glukoneogeneza); u ovu skupinu ubrajamo:

Gly, Ser, Ala, Thr, Val, Asp, Glu, Arg, Pro, Hyp (hidroksiprolin)

b) ketogene, tj. one koje grade "ketonska tijela" (aceton, -ketomaslanu

kiselinu); u ovu skupinu ubrajamo: Leu, Tyr i Phe.

Trp i Lys ne pripadaju ni jednoj od navedenih dviju skupine.

I na kraju, aminokiseline se dijele na esencijalne (bitne, nezamjenjive) i neesencijalne. Neesencijale su

one koje ljudski organizam kao i sisavci mogu sami sintetizirati, a esencijalne su one koje se moraju

unositi putem hrane. Poznato je da samo biljke i mikroorganizmi mogu sintetizirati sve aminokiseline,

dok ivotinjski organizmi, pa tako i ljudi sintetiziraja samo 12-14 aminokiselina. Preostale

aminokiseline ivotinje i ljudi ne mogu biosintetizirati ili ih sporo sintetiziraju pa se moraju unositi

putem hrane kako ne bi dolo do poremeaja u metabolizmu.

Prema Rose-u za ljudski organizam esencijalne aminokiseline su:

Val, Ile, Leu, Thr, Met, Lys, Phe, Trp

a za mlade organizme u razvoju, uz gore navedene esencijalne su i: Arg i His.

28

2. 1. NOMENKLATURA AMINOKISELINA

U biokemiji se uglavnom upotrebljavaju trivijalna imena aminokiselina koja su esto dobivena od

naziva prirodnih spojeva biljnog i ivotinjskog podrijetlo iz kojih su izolirane, pa tako npr. Asp od

asparagusa, Gln i Glu od glutena, Ser od grke rijei serous-svila, Tyr od grke rijei tyros-sir, Trp

dobiven hidrolizom proteina pomou tripsina.

Imena nekih aminokiselina potjeu i od strukture bliskih spojeva, kao npr. Val od valerijanske kiseline,

Thr od treoze, Pro od pirolidina i td.

Osim Trp, Asp i Glu imana svih aminokiselina zavravaju na in, acil ostaci aminokiselina na il (seril,

glutamil, alanil itd).

2.2. FIZIKALNO-KEMIJSKA SVOJSTVA AMINOKISELINA

Kada su u krutom stanju ili se nalaze otopljene u polarnom otapalu, aminokiseline egzistiraju u

energijom siromanom stanju, tj. kao dipoli (zwitter) ioni:

Ovo objanjava njihovu visoku toku talita s obzirom da su aminokiseline kristalni spojevi i to su

njihove karakteristine veliine. Dipolna struktura je takoer uzrok teoj topljivosti aminokiselina u

nepolarnim otapalima kao i njihovo karakteristino ponaanje u kiselim i baznim otapalima. Dokaz o

postojanju dipolarne strukture nalazimo u Raman-ovim i IR-spektrima, u kojima nedostaju

karakteristine vrpce za NH2- i COOH-grupu, nego se pojavljuju vrpce za -NH3+ i COO-.

Topljivost aminokiselina. Sve aminokiseline, osim malih izuzetaka (Asp, Glu, His, Tyr, Cy-S-S-Cy) dobro

su topive u vodi, amonijaku i drugim polarnim otapalima, a u nepolarnim i u slabo polarnim kao to su

metanol, etanol i aceton slabo su topive. Uzrok ovome je injenica da je prijelaz nenabijene molekule

29

aminokiseline (I) u dipolarni ion (II) vezan s koliinom energije od 44,0 do 51,5 kJ/molu, pa je i

ravnotea pomjerena gotovo potpuno prema energetski siromanijoj dipolarnoj strukturi (II).

Topljivost aminokiselina ovisi svakako i o prirodi R-ostataka aminokiselina (hidrofilni boni ostatci

poveavaju topljivost u vodi). Najmanju topljivost u vodi pokazuju aminokiseline kod izoelektrine

toke (pI).

KISELO BAZNA SVOJSTVA AMINOKISELINA

Svaka aminokiselina moe se u vodenoj otopini ponaati i kao baza i kao kiselina, tj. kao proton donor

ili proton akceptor, to ovisi o pH otopine. Npr. glicin se kod vrlo niskog pH ponaa kao diprotonska

kiselina, to znai da za vrijeme potpune titracije bazom moe otpustiti dva protona:

Ionizacijska sposobnost pojedinih grupa odreena je njihovim pK vrijednostima. pK predstavlja onu

pH vrijednost kod koje su u otopini prisutne ekvimolarne koncentracije proton donora i proton

akceptora. Tako e alanin imati dvije pK vrijednosti:

pK1 = pH kod kojeg je

i

pK2 = pH kod kojeg je

H2N CH COOH

R

+NH3 CH

R

COO-

I II

30

Slika 2. Krivulja titracije glicina i jednostavnih aminokiselina

Eksperimentalno odreivanje pK1 i pK2 vrijednosti provodi se titriranjem potpuno protoniranog oblika

aminokiseline do dviju ravnotea koje su uoljive, jer dodatkom OH iona uzrokuje najmanju promjenu

pH vrijednosti, to je vidljivo na slikama 2., 3., i 4.

COOH

CH2

COO-

CH2H3N+

H3N+

COO-

CH2H2N

31

Slika 3. Krivulja titracije glutaminske kiseline

2

4

6

8

10

12

14

1.0 2.03.0

ekvivalentno dodavanje OH-

pH

pK1 izoelektrinatoka

pK2

pK3

32

Slika 4. Krivulja titracije lizina

2

4

6

8

10

12

14

1.0 2.03.0

ekvivalentno dodavanje OH-

pH

pK1

pK2 izoelektrinatoka

pK3

33

Izoelektina toka aminokiseline (pI) zapravo je onaj pH kod kojeg aminokiselina postoji u obliku

dipolnog iona. To znai da aminokiseline sa samo dvije ionizirajue grupe imaju u otopini kod pI sljedei

dominantni oblik:

Izoelektrina toka za alanin 02,62

69,934,2

AlapI

VJEBA:

Za vjebu je potrebno:

1. otopina aminokiseline

2. Erlenmayer tikvica

3. pH metar

4. 0,2 M NaOH

5. 0,2 M HCl

6. bireta od 25 cm3

Nain provoenja vjebe:

Otopina uzorka. U 100 ml dvostruko destilirane H2O otopljeno je 300 mg aminokiseline. Uzorak

otopljene aminokiseline nalazi se u obliku dipolarnog iona. Alikvot od 40 cm3 uzorka, titrirati uz

kombiniranu elektrodu pH-metra s 0,2 M NaOH. NaOH se dodaje iz birete. Baza se dodaje u malim

obrocima, kako bi grafiki prikaz titracije sadravao to vie eksperimentalnih toaka. Drugi alikvot od

40 cm3 otopljene aminokiseline titrira se iz birete s 0,2 M HCl. Nakon svakog dodatka baze odnosno

kiseline uzorak treba dobro promjeati i onda oitati pH vrijednost. Na temelju grafikog prikaza

ovisnosti pH o potroenim cm3 kiseline odnosno baze treba pretpostaviti o kojoj se aminokiselini radi;

odrediti pK vrijednost funkcionalnih grupa, koje u toku titracije mijenjaju naboj; izraunati

izoelektrinu toku te aminokiseline i pH kod kojeg aminokiselina sadri najvei broj nabijenih grupa.

Iz utroka kiseline ili baze u pojedinim fazama titracije, pokuajte izraunati molekulsku masu titrirane

aminokiseline!

34

2. 3. KEMIJSKE REAKCIJE AMINOKISELINA

2. 3. 1. REAKCIJE AMINO I KARBOKSILNE SKUPINE

REAKCIJA S NINHIDRINOM

Ninhidrin (3-ketohidrinden) reagira sa svim -aminokiselinama na pH izmeu 4 i 8 dajui ljubiasto

obojen spoj. Na isti nain reagiraju primarni amini i amonijak uz razliku da se kod ovih reakcija ne

oslobaa CO2. Prolin i hidroksiprolin u reakciji s ninhidrinom daju kompleks utog obojenja.

Reakcija je jako osjetljiva i pogodna za detekciju aminokiselina kromatografskom metodom kao i za

njihovo kvantitativno odreivanje.

Slika 5. Reakcija aminokiselina s ninhidrinom

R - CH - COOH +

NH 2

O

O

OH

OH

NINHIDRIN

(oksidativna

dezaminacija)

R - C - H + NH 3 + CO 2 +

O

OH H

O

O

HIDRINDANTIN

OH

OH

O

O

+ NH 3 +

O

O

HO

H

N

O

O

+ 3 H2O

RUHEMANN-OVO LJUBIASTO

35

VJEBA:

Materijal i metoda:

Otopina aminokiselina (0,1% otopina)

Otopina ninhidrina (0,1 0,2%) svjee pripremljena, a prireuje se tako da se 5 g ninhidrina, 0,5 g

CdCl2, 25 ml dest. H2O, 25 ml octene kiseline dopuni acetonom do 500 ml.

Izvedba vjebe:

Izrezati trake filter papira irine 1,5 2 cm . Grafitnom olovkom oznai se start na koji se nanese 0,05

ml nepoznatog uzorka i 0,1 i 0,05 ml poznate koncentracije aminokiselina. Traka filter papira se osui

u struji toplog zraka i provue kroz otopinu ninhidrinskog reagensa, prosui na zraku, potom se sui u

suioniku 10 min. na 800C. Nakon suenja obojeni dijelovi se isijeku, prenesu u epruvetu u kojoj se

nalazi 10 ml metanola (pipetira se klipnom pipetom). Na sobnoj se temperaturi ostavi 1,5 2 sata. Po

isteku vremena otopina se prenese u kivetu i na kolorimetru se oita apsorbancija (zeleni filter).

Kolorimetar se badari s metanolom.

Cilj vjebe:

Nacrtati badarnu krivulju i odrediti nepoznatu koncentaciju u uzorku aminokiselina.

REAKCIJA NINHIDRINA S PROLINOM

Slika 6. Reakcija ninhidrina sa prolinom

O

O

OH

OH+ NH

COOH

C N

O

O-

++ CO2

uti kompleks

Dt

36

GRAENJE KOMPLEKSA S TEKIM METALIMA

Aminokiseline s ionima metala daju komplekse kelatnog tipa. Najpoznatiji su plavi kompleksi sa Cu2+

koji dobro kristaliziraju, te se kod pojedinih aminokiselina razlikuju po topivosti, pa se na taj nain

mogu upotrijebiti za odvajanje aminokiselina.

Slika 7. Reakcija graenja kompleksa s metalnim ionom

REAKCIJE NA SLOBODNE AMINOGRUPE

REAKCIJA SA HNO2

Aminokiseline koje imaju slobodnu NH2 grupu reagiraju s nitritnom kiselinom kao primarni amini

oslobaajui N2 koji se moe volumetrijski mjeriti na tome je zasnovana Van Slyke-ova metoda

kvantitativnog odreivanja aminokiselina.

Cu

OH2

OH2

HN CH

C

O

CH2 CH2

CH2

O

O

C

CH NH

CH2 CH2

CH2

O

Bis-DL-prolinato-bakar (II) dihidrat

37

REAKCIJA SA FORMALDEHIDOM

Proteinski lanac je takav da u njemu R-aminokiselinski ostatci imaju slobodnu NH2-grupu. NH2 grupa

moe reagirati s formaldehidom dajui pri tome mono i dimetilol-derivate ime se blokira NH2--

- grupa, te slobodne karboksilne grupe mogu reagirati s bazom. Titriranjem s bazom mogue je

odrediti koliko u peptidnom lancu postoji slobodnih karboksilnih skupina.

R-CH-COOH + HCOH R-CH-COOHHCOH R-CH-COOH

NNH2 NH-CH2OH

CH2OH

CH2OH

38

3. PROTEINI

Proteini su polimerne makromolekule, graene od aminokiselina koje su meusobno povezane

peptidnim vezama. Peptidna veza nastaje povezivanjem karboksilne skupine jedne aminokiseline s

amino skupinom druge aminokiseline :

Peptidna veza posjeduje svojstva koja su veoma znaajna za prostorni raspored molekula proteina.

1. ona postoji u dva rezonantna (mezomerna) oblika

2. planarna je, tj. svi atomi peptidne veze nalaze se u jednoj ravnini

Slika 8. Peptidna veza; preuzeta od : Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of

Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

H2N CH

R1

COOH + HNH CH COOH- H2O

R2

H2N CH CO NH CH COOH

R1 R2peptidna veza

C N

O

H

C

O-

N+

H

39

3. sposobnost graenja vodikovih veza. Ako se atom vodika priblii na udaljenost od 0,28 nm

slobodnom elektronskom paru, hidroksilnoj, amino, karboksilnoj skupini ili molekuli vode,

nastat e vodikova veza. Poznato je da energija vodikovih veza iznosi 10

1 kovalentne

veze. S obzirom da u molekuli proteina postoji velik broj vodikovih veza, prema tome to

je znaajna energija koja stabilizira prostorni raspored proteina. Sposobnost stvaranja

vodikovih veza u proteinima imaju dvije peptidne veza koje se nau jedna iznad druge i to

izmeu amino skupine jedne i karbonilne skupine druge peptidne veze.

Slika 9. Osnovne veliine peptidne veze; preuzeta od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The

Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Proteini su izuzetno heterogena skupina spojeva, iako su graeni samo od 20 razliitih aminokiselina.

Razlikuju se po veliini molekula, sastavu i slijedu aminokiselina, prostornom rasporedu peptidnog

lanca, komponentama koje nisu aminokiseline i dr.

Predloeno je vie naina klasifikacije proteina; po jednoj mogu se podijeliti u dvije skupine:

1. proteini koji sadre samo aminokiseline to su jednostavni;

2. proteini koji osim aminokiselina imaju i druge komponente (prostetike skupine) to su

sloeni proteini.

40

Jednostavni proteini meusobno se razlikuju po topljivosti i mogu se podijeliti na sljedei nain:

PROTEINI TOPLJIVOST NAENI U PRIRODI

ALBUMINI Topljivi u vodi i razrijeenim

vodenim otopinama soli

gotovo u svim organizmima.

GLOBULINI

a) euglobulini

b) pseudoglobulin

Teko topljivi u vodi; topljivi u

razrijeenim otopinama soli.

Netopljivi u 50% (NH4)2SO4.

Djelomino topljivi u vodi;

topljivi u razrijeenim

otopinama soli. Netopljivi u

50% (NH4)SO4

gotovo u svim organizmima.

gotovo u svim organizmima.

PROLAMINI Netopljivi u vodi. Topljivi u 50-

90% etanolu.

u biljkama.

GLUTELINI

Netopljivi u vodi, razrijeenim

otopinama soli i u 50-90%

etanolu. Topljivi u razblaenim

kiselinama i bazama.

u biljkama.

SKLEROPROTEINI

a) kolageni

b) keratini

Netopljivi u veini otapala.

Topljivi u razrijeenim

kiselinama. Pri kljuanju vode

ovi proteini elatiniziraju i

poslije toga su topljivi u vodi.

Topljivi u vodenim otopinama

KHSO4 i otopinama tioglikolne

kiseline.

vezivno tkivo, osobito

hrskavica.

u kosi, koi i noktima.

41

Jednostavni proteini koji se razlikuju od navedenih po aminokiselinskom sastavu i po biolokom

materijalu, a u koje ubrajamo:

PROTEINI TOPLJIVOST NAENI U PRIRODI

PROTAMINI

Mala veliina molekula,

molekulska masa priblino

5000.

u spermi.

HISTONI

Bogati su bazinim

aminokiselinama.

u jezgri stanice.

Sloeni proteini su podijeljeni prema prostetikim skupinama na sljedei nain:

PROTEINI PROSTETIKA GRUPA NAENI U PRIRODI

(PRIMJER)

NUKLEOPROTEINI Nukleinske kiseline jezgra

LIPOPROTEINI

Fosfolipidi, glikolipidi i

kolesterol

membrane stanice, krvne

stanice, hilomikroni, HDL,

VLDL, LDL

GLIKOPROTEINI ugljikohidrati membrane stanice

KROMOPROTEINI

pigmenti, npr. hem,

nikotinamid, adenin-

dinukleotid

hemoglobin, citokromi,

mnoge dehidrogenaze

METALOPROTEINI npr. Zn2+, Fe2+ alkohol dehidrogenaza

42

Prema obliku proteini su podijeljeni u dvije osnove skupine: fibrinalni i globularni. Fibrinalni proteini

su izdueni vlaknasti lanci spojeni raznim tipovima veza, a oblikuju vrlo stabilnu netopljivu molekulu.

Tipian primjer ove skupine proteina su keratin, miozin i kolagen. Molekule globularnih proteina su

priblino elipsoidnog oblika. Ovoj skupini pripadaju bioloki aktivni proteini, kao to su protutijela i

enzimi.

3. 1. STRUKTURA, FUNKCIJA I SVOJSTVA PROTEINA

Molekule proteina su veoma sloene. Dugi polipeptidni lanac koji nastaje povezivanjem nekoliko

stotina aminokiselina, moe imati raznolik prostorni raspored. Prostorni raspored aminokiselinskih

bonih ogranaka nekog proteina predstavlja konformaciju toga proteina. Prostorna struktura nekog

polipeptidnog lanca obuhvaa pojmove sekundarne i tercijarne strukture proteina, koji, pored

primarne i kvaternarne strukture, ini osnovne strukturne nivoe molekula proteina.

Polipeptidni lanac posjeduje samo dva stupnja slobodnog okretanja na -ugljikovom atomu po

aminokiselinskom ostatku, i to: kut izmeu C - N atoma je os , a kut izmeu C - C je os . Ovi kutovi

definiraju udaljenost izmeu dviju strana (peptidnih veza) (Slika 10.).

Slika 10. Peptidna veza i mogunosti rotacije na -ugljikovom atomu. Preuzeto od: Richard E.

Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Primarna struktura oznaava redoslijed (sekvenciju) aminokiselina u polipeptidnom lancu (Slika 11).

43

Slika 11. Aminokiselinski sastav govee ribonukleaze; disulfidne veze su oznaene. Preuzeto od:

Lubert Stryer, Biokemija, kolska knjiga, 1991.

Sekundarna struktura predstavlja strukturu glavnog dijela polipeptidnog lanca koji su prostorno

ureeni na odreen pravilan nain, tako da gdje god je mogue nagradi najvei broj vodikovih veza. U

ovaj oblik strukture ubrajamo spiralnu strukturu ili - uzvojnicu te nabranu plou (engl. pleated sheet)

ili -strukturu, kao i strukturu kolagena.

- uzvojnica (heliks) konformacijski je oblik gdje je dio polipeptidnog lanca uvijen u obliku spirale, a

hod jednog uzvoja iznosi 3,6 aminokiselinskih ostataka. Ovaj konformacijski oblik stabiliziran je

vodikovim vezama izmeu susjednih atoma peptidne veze. Ako se u polipeptidnom lancu nae

aminokiselina prolin, nastupaju odstupanja u strukturi -uzvojnice.

44

Slika 12. Definiranje promjera heliksa p i broj aminokiselinskih ostataka po jednom okretu heliksa n.

Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and

Row, Publishers, 1969

Kod -nabrane strukture (ploe), da bi polipeptidni lanci mogli tvoriti vodikove veze izmeu dva

paralelna dijela istog polipeptidnog lanca, potrebno je da se priblie jedan drugome tako, da se amino

grupa peptidne veze nae nasuprot karbonilne grupe peptidne veze na udaljenosti od 0,28 nm.

Meutim, kada je Pauling pokuao prirediti takav model, utvrdio je da nema dovoljno prostora za

bone ostatke aminokiselina, pa je izvrio korekciju tako, da je nabrao ravninu u kojoj se nalaze

meusobno povezani peptidni lanci. Time je postigao da se boni ostatci aminokiselina nalaze gotovo

okomito u odnosu na ravninu nabiranja.

45

Slika 13. Vodikove veze unutar antiparalelnih -ploa. Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin

Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Izmeu dvije nabrane -ploe peptidne veze tvore vodikove veze izmeu razliitih dijelova

polipeptidnog lanca.

Slika 14. Polipeptidni lanac u nabranoj ploi: Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The

Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

46

Slika 15. Dva paralelna peptidna lanca u -nabranoj strukturi. Preuzeto od: Richard E. Dickenson and

Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Slika 16. Pakiranje u svili alanina s jedne strane i glicina s druge strane u lancima -nabrane ploe.

Udaljenost izmeu dviju ploa je razliita i iznosi 5,7 i 3,5 . Preuzeto od: Richard E. Dickenson and

Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

47

Kolagen je linearni fibrinalni protein koji ubrajamo u supersekundarnu strukturu, i ini osnovu u grai

vezivnog tkiva koe i kostiju s velikom otpornou na istezanje. Aminokiselinskom analizom utvreno

je da se kolagen sastoji od glicina, alanina, prolina i hidroksiprolina. Aminokiselinski sastav peptidnog

lanca kolagena, u kojem svaka trea aminokiselina je prolin ili hidroksiprolin prilikom poprimanja

prostornog oblika, rotacija kod prolina nije u potpunosti slobodna, jer prolin je sekundarni amid, a

poznato je da rotacija na -ugljikovom atomu prolina nije u potpunosti slobodan radi sterikih smetnji,

kao kod ostalih aminokiselina. Radi toga strmija je heliksna struktura lanca u poreenju s -heliksom

u kojem je uspon od 0,286 nm. Meusobno su povezana tri spiralna lanca vodikovim vezama dajui

osnovnu jedinicu, tzv. tropokolagen. Temelj ine strme spirale iji je promjer 1,4 nm, a duina 280 nm.

Molekule tropokolagena poredane su jedna do druge i jedna iznad druge tako da su pomaknute za

41 duine ostavljajui mali prostor koji je vidljiv pod elektronskim mikroskopom kao svjetlije i tamnije

pruge.

Slika 17. Kolagen. Preuzeto od: https://encrypted

tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTBYQAryUKZ0WDGA8elA0sZ6TYw2nXM_czbyD1aPxb961W

mDOsHQA

https://encrypted/

48

Kolagen je glavni vlaknasti protein koe, kostiju, tetiva, hrskavice i zuba. Taj izvanstanini protein

tapiasta je molekula duga oko 300 nm i promjera 1,5 nm. Sastoji se od tri polipeptidna lanca, od koji

svaki sadri gotovo 1 000 aminokiselina. Nema vodikovih veza du lanca. Pirolidinski prstenovi

uklanjaju se jedan drugome kad polipeptidni lanac poprima oblik uzvojnice koja ima priblino tri

aminokiseline po okretu. Unutranjost trolanane uzvojnice vrlo je zbijena, to uvjetuje da glicin bude

prisutan na svakome treem poloaju. Aminokiselinski ostatci s obje strane glicina smjeteni su na

vanjskoj strani, gdje ima dovoljno mjesta za glomazne prstenove prolina i hidroksiprolina.

Tercijarna struktura predstavlja konformaciju itavog polipeptidnog lanca, specifinu za svaki protein.

Tercijarnu strukturu stabiliziraju razliiti tipovi veza. Tako je npr. dugi polipeptidni lanac globularne

molekule proteina uvijen, a takav prostorni raspored stabiliziran je nekovalentnim interakcijama

izmeu bonih ogranaka aminokiselina u polipeptidnom lancu. U nekovalentne interakcije spadaju

vodikove veze, ionske interakcije, hidrofobne interakcije, te Van der Wallsove sile.

Bazine lizin i arginin, te kisele dikarbonske aminokiseline koje se nalaze u polipeptidnom lancu tvore

ionske veze; cistein je izvor SH-skupine koji sudjeluje u graenju disulfidne veze, dok hidrofobne veze

nastaju kada se aromatski i alifatski aminokiselinski ostatci priblie na dovoljnu udaljenost.

Slika 18. Molekula mioglobina. Preuzeto od: http://www.phattimes.com/myoglobin/images/fig1.jpg

http://www.phattimes.com/myoglobin/images/fig1.jpg

49

Kvarterna struktura predstavlja povezivanje vie polipeptidnih lanaca koji grade odreenu molekulu

proteina. Tako npr. hemoglobin (Slika 19.) sadri etiri podjedinica (graen je od dvije i dvije

podjedinice).

U prirodnoj sredini molekula proteina je u takvom konformacijskom obliku koji osigurava maksimalnu

bioloku aktivnost u nativnom stanju. To je obino struktura u kojoj postoji najvei broj interakcija,

vodikovih i disulfidnih veza. Potrebno je napomenuti da se prilikom izoliranja proteina izvjestan broj

ovih veza esto naruava, odnosno nestaje, pa se struktura molekula u konformacijskom smislu

mijenja; odnosno protein se denaturira.

Slika 19. Molekula hemoglobina. Preuzeto od:

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html

50

3. 2. PRINCIPI IZOLIRANJA I ANALITIKA

Proteine nije jednostavno dobiti u istom stanju, osobito globularne, koji se u biolokom materijalu

nalaze u stanicama. Uvjeti u kojima se provodi izoliranje proteina trebali bi biti takvi da se izbjegne

denaturacija (pH, temperatura, otapalo i dr.). Proteini mogu djelovanjem razliitih kemijskih spojeva

izgubiti svoju bioloku funkciju. Ova pojava se zove denaturacija, a moe biti izazvana povienom

temperaturom (iznad 40 - 50C), zraenjem, mehanikim faktorima, solima tekih metala ili

djelovanjem jakih kiselina i baza. Denaturacija je posljedica kidanja tercijarnih i sekundarnih,

nekovalentnih veza u molekuli proteina, usljed ega dolazi do odmotavanja polipeptidnog lanca

globularnih proteina i odmatanja -uzvojnice. Spojevi kao to su urea i gvanidin, koji imaju veliki

afinitet prema stvaranju vodikovih veza, esto izazivaju denaturaciju proteina ako su prisutni u veim

koncentracijama. Ovi spojevi naruavaju sekundarnu strukturu proteina, to se koristi u

eksperimentalnom radu. Mnogi proteini su osjetljivi na promjenu oksido-redukcijskog potencijala

okoline. Uzrok tome moe biti prije svega oksidacija sulfhidrilnih grupa ili redukcija disulfidnih veza.

Tako je neke proteine mogue proistiti i ispitati jedino u reducirajuim uvjetima (u prisutnosti

glutationa, -merkaptoetanola i sl.).

Eksperimentalni kriteriji kojima se mjeri stupanj denaturacije smanjena su topljivost, poveanje

reaktivnosti aminokiselinskih ostataka peptidnog lanca, gubitak bioloke aktivnosti, promjene oblika i

veliine koje se odreuju promjenom viskoziteta i sedimentacijskog koeficijenta, promjene u

apsorpcijskom i fluorescentnom spektru i promjene ORD (optike rotacijske disperzije).

Globularni proteini se obino izoliraju i odvajaju jedni od drugih na osnovi razliite topljivosti. Na

topljivost proteina utjeu razliiti imbenici, to su ionska jakost otapala, pH, temperatura i dielektrina

konstanta otapala.

Izoelektina toka proteina je teoretski ona vrijednost pH pri kojoj je ukupni naboj svih grupa koje

mogu disocirati (karboksilna, amino, imido, gvanidinio, hidroksilna i tiolna) jednaka nuli. Povrina

proteina uvijek ima izvjesni elektrini naboj na koji utjee pH, prisutnost elektrolita, otapalo (naroito

voda). Meutim, na odreenom pH ukupni neto naboj jednak je zbroju pozitivnih i negativnih naboja

i mnoge molekule se mogu agregirati i time e postati netopljive. Pozitivni i negativni naboji proteina

privlae ione suprotnih naboja.

Topljivost nekih proteina se mijenja iznad 40oC, topljivost drugih proteina se iznad te temperature

poveava, a neki su u tim uvjetima manje topljivi. Iznad 40oC veina proteina poinju se denaturirati,

51

osim nekih izuzetaka. Denaturacija je gotovo kod veine proteina potpuna iznad 60oC, kada je i

topljivost potpuno smanjena.

Proteine je mogue odvojiti i tako da se jedan denaturira (ako postoji specifina osjetljivost na neke

reagense), a drugi ostanu u nativnom stanju. Tako se moe za denaturaciju i uklanjanje neeljenih

proteina koristiti paljivo zagrijavanje otopine iz koje se izoliraju i odvajaju pojedini proteini.

Ribonukleza je stabilna na 90oC, dok se veina drugih proteina na toj temeperaturi denaturira. Paljiva

kontrola pH takoer se moe koristiti za denaturaciju neeljenih proteina.

Odvajanje proteina iz smjese, proiavanje, kao i identifikacija, mogua je na osnovi razlike u veliini

molekula (dijaliza, molekulsko prosijavanje), u elektrinom naboju (ionoizmjenjivaka

kromatografija, preparativna elektroforeza), molekulskoj masi (ultracentrifugiranje), apsorpciji.

Kromatografske su metode koje se vrlo esto koriste apsorpcijska i ionoizmjenjivaka kromatografija,

te afinitetna kromatografija.

Ne postoji jedna jedinstvena metoda za karakterizaciju i proiavanje proteina; provjeravanje istoe

vri se usporeivanjem razliitih postupaka.

3. 3. KEMIJSKE REAKCIJE PROTEINA

Proteini su, s obzirom da aminokiseline posjeduju aminokiselinski R-ostatak, vrlo reaktivne molekule i

mogu stupiti u mnogobrojne reakcije koje nisu karakteristine za sam protein, ve za odreenu

funkcionalnu skupinu R-ostataka aminokiselina. Reakcija koja je karakteristina za peptidnu vezu je

biuretska reakcija koja slui za kvantitativno i kvalitativno odreivanje proteina. Reakcija je zasnovana

na injenici da biuret koji se dobije zagrijavanjem 2 mola uree i u reakciji sa otopinom bakar sulfata

(0,25% CuSO4) u bazinoj sredini tvori ljubiasto obojen kompleks (Slika 20.).

52

Biuretska reakcija za kvalitativno dokazivanje proteina u otopini moe se koristi i kao kvantitativna

spektrofotometrijska metoda. Ona se zasniva na ve opisanom svojstvu bakrenog iona (Cu2+) da s

donorima elektronskih parova, kao ligandima, stvara kompleksni spoj intenzivno plave boje. Na slici

20. je prikazano kako bakarni ion reagira s duikom iz biuree u kojima je atom duik donor elektrona.

To svojstvo je primijenjeno i u osnovi reakcije biureta s bakrenim ionom (Slika 20.), a na njemu se

zasniva i metoda za kvantitativno odreivanje proteina u otopin, jer se amino-duik iz peptidne veze

(-CO-NH-) proteina koordinacijski vee za ion bakra (Slika 20.) ba kao i kod biuree. Dakle,

koncentracija stvorenog kompleksa, pa i intenzitet njegove boje u otopini, proporcionalan je broju

peptidnih veza, tj. koliini proteina.

Ova reakcija je reproduktivna, pa je potrebna relativno velika koliina proteina (1 do 20 mg). Radi

osjetljivosti (5 g proteina) u uporabi je Folin-Ciocalteu reagens po metodi Lowry-a, ali intenzitet

obojenja je srazmjeran koliini proteina u otopini, s obzirom da boja ne potie samo od biuretskog

kompleksa, nego i od redukcije soli fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline (koje se nalaze u

reagensu). Prigodom mjerenja apsorbanci potrebno je uvijek badariti aparat prema sljepoj probi (tj.

probi gdje nema proteina, a ostale otopine su dodane). Na ovaj nain se izmjerena apsorbanca potjee

samo od biuretskog kompleksa. Reagens je vrlo pogodan za praenje promjene koncentracije proteina

u otopini izoliranog proteina.

2 NH2 C NH2

O NH2

CO

NH

C

NH2

O

D t

53

Slika 20. Reakcija biuree sa bakrenim ionima i reakcija peptidne veze s bakrenim ionima.

KSANTOPROTEINSKA REAKCIJA

Ksantoproteinska reakcija je karakteristina za prisustvo aromatskih aminokiselina (Phe, Tyr i Trp).

Zagrijavanjem proteinske otopine s koncentriranom HNO3 dolazi do nitriranja benzenovog prstena i

taloenja utog taloga koji prelazi u naranastu boju dodatkom amonijaka.

Cu2+

NH2

C O

NH

C

NH2

O

OH-Cu2+

NH2

CO

NH

C

NH2

OO

NH2

C

NH

O C

NH2

CH2 - CH - COOH

NH2

OH OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+ HNO3

NO

O

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+ NH3

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

NONH4O

nitrotirozin

54

MILLON-OVA REAKCIJA

Zagrijavanjem proteina s Millon-ovim reagensom (smjesa ivinog nitrita i nitrata u suviku HNO3)

dolazi do nastanka crvenog taloga ako protein sadri tirozinski ostatak.

GLIOKSILNA ILI ADAMKIEWICH-EVA REAKCIJA

Proteini koji sadre triptofan kao aminokiselinski ostatak daju s glioksilnom kiselinom uz dodatak

koncentrirane H2SO4 ljubiastu ili purpurnu boju.

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+

conc. H2SO4

Hg

NaNO2

crveni talog

NO

OHg

NH

CH2

CH-NH2

COOH

+C

O

H

C HO

+

NH

CH2

CH-NH2

COOH

H2O

NH NHC

C

H

O

H

CH2

CH-NH2

COOH

CH2

CH-NH2

COOH

55

SAKAGUCHI-EVA REAKCIJA

Sakaguchi-eva reakcija je karakteristina za gvanidino skupinu arginina. Reakcija se sastoji u sljedeem

pod utjecajem -naftola u bazinom mediju sa NaOCl (natij hipoklorit) na slobodnu gvanidino skupinu

aminokiseline arginin dolazi do razvijanja crvene otopine. To je kvantitativni dokaz da u proteinu ima

aminokiseline arginina.

CISTEINSKA REAKCIJA

U otopini proteina koja sadri cistein prilikom zagrijavanja sa svjee pripremljenim Pb(OH)2 dolazi do

izdvajanja crnog taloga.

CNH2NHNH - CH2 - CH2 - CH2 - CH - COOH

NH2

+

OH

NaOCl

ON

O

C

NH

NH

CH2

CH2

CH2

CH - NH2

COOH

56

3. 4. IZOLIRANJE PROTEINA IZ BIOLOKOG MATERIJALA

IZOLIRANJE OVALBUMINA IZ BJELANJKA JAJETA

Albumini su proteini biljnog i ivotinjskog podrijetla, dobro su toplivi u vodi i drugim polarnim

otapalima, a reverzibilno se taloe u koncentriranim neutralnim otopinama soli u izoelektrinoj toki.

Ovalbumin je glavni sastojak bjelanjka jajeta (64%). U kristalnom obliku izolirao ga je Hofmeister 1890.

godine. Molekulska masa ovalbumina iznosi 45 000 Da, a to je molekula okruglog kompaktnog oblika.

Reagensi:

1. bjelanjak jajeta

2. zasiena otopina (NH4)2SO4

3. 5% otopina CH3COOH

4. gaza

Postupak :

Potrebno je odvojiti bjelanjak od umanjka. Nakon odvajanja bjelanjka pristupi se odreivanju

volumena bjelanjka jajeta, te se doda 10% od utvrenog volumena 5% CH3COOH, uz mijeanje smjese.

Potom se filtrira kroz gazu. Tijekom filtriranja potrebno je snanije mijeati staklenim tapiem kako

bi se razbile membrane. Po zavretku filtriranja, filtratu se doda jednaki volumen zasiene otopine

(NH4)2SO4 pri emu dolazi do taloenja globulina. Nakon 30 60 minuta nastali talog odvoji se

centrifugiranjem. Na ovakav nain se izdvoji ovomucin, glikoprotein koji daje viskozitet bjelanjku.

Dobiveni supernatant zasiti se s prakastim (NH4)2SO4 (8,5 g na 100 cm3) pri temperaturi od 20 do 220C,

pri emu dolazi do taloenja albumina u obliku taloga. (NH4)2SO4 dodaje se polako i uz mijeanje, sve

dok se precipitat koji se javlja ne pone otapati.

57

Dobiveni talog odvoji se centrifugiranjem, potom se prenese u au koja je potopljena u led i otopi u

manjoj koliini destilirane vode (1-2 ml) . U otopinu se zatim dodaje mijeanjem u kapima 5% otopina

CH3COOH do pH 4,7. Ukoliko se tijekom dodavanja CH3COOH pojavi talog, potrebno ga je odvojiti

filtriranjem. Poslije podeavanja pH, u malim se obrocima dodaje zasiena otopina (NH4)2SO4 do

pojave zamuenja, potom se ostavi na temperaturi 0 20C nekoliko sati. Albumin e se iskristalizirati

u obliku igliastih kristala.

Otopina ovalbumina se potom filtrira i talog otopi u tono odreenom volumenu H2O kako bi se poslije

mogla odrediti koncentracija proteina. Koncentracija proteina se odreuje metodom po Lowry-u. (koja

je opisana kod odreivanja koncentracije proteina na stranici 58..)

IZOLIRANJE PROTEINA IZ PENINOG BRANA

Iz peninoga brana mogu se izolirati proteini koji su topljivi u 70% etanolu -glijadini. Prije nego to

se pristupi izolaciji proteina potrebno je iz brana izdvojiti krob.

Reagensi:

1. 15 g peninog brana

2. 70% etanol

3. 0,05 M HCl

4. 0,1 M HCl

5. gaza

6. otopina J2

Nain izoliranja je sljedei: dva sloja gaze poloe se na dno ae i na njih se prenese 15 g peninoga

brana i malo vode; mijea se sa staklenim tapiem dok se ne stvori talog u obliku gustog tijesta.

Zatim se skupe krajevi gaze i talog ispire u hladnoj tekuoj vodi kako bi se izdvojio krob. Poslije

ispiranja kroba talog postaje ljepljiv. Pri kraju ispiranja taloga potrebno je vodu ispitati s jodom da li

58

se isprao krob. U prosjeku je potrebno ispirati oko 20-tak minuta da bi se isprao krob. Potrebno je

da talog ostane cijelo vrijeme vlaan.

Zatim se pripremi 20 ml toplog 70% etanola, a talog se isijee na komadie i stavi u suspenziju vruega

alkohola. Dobivena smjesa zagrijava se 10 minuta tako da kljua (upotrebljava se uspravno hladilo).

Dekantiranjem se odvoji alkoholna otopina. Ekstrakcija se ponavlja s 10 cm3 kljualog 70% etanola, na

isti nain. Alkoholni ekstrakti se spoje.

Alkoholna otopina sadri glijadin, koji se uva da bi se kasnije odredila koncentracija proteina.

Koncentracija se odreuje metodom po Lowry-u.

Talog koji je ostao neotopljen u etanolu jeste sirovi gluten. Proiavanje sirovog glutena moe se

izvriti na sljedei nain: mijeanje se vri u porculanskoj zdjelici s odreenom koliinom 0,05 M NaOH

da se dobro otopi i filtrira kroz nabrani filter papir. Filtrat koji se dobije slui za odreivanje

koncentracije proteina po Lowry-u.

3. 5. ODREIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA U BIOLOKIM UZORCIMA

Referenca za Lowryevu metodu: Lowry, O. H., Rosenbrouh, N. J. Lewis Farr A. and Randall, R. J. (1951)

Protein measurement with the folinphenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265

Reagensi:

1. Alkalni bakreni reagens

Otopina A : 2% Na2CO3 u 0,1 M NaOH (za 100 ml potrebno je 2 g Na2CO3 i 0,4 g NaOH)

Otopina B : 0,5% CuSO4 *5H2O u 1% K, Na-tartaratu. Priprema se svjei.

2. Alkalna otopina

U 50 ml otopine A doda se 1 ml otopine B. Otopina se priprema neposredno prije analize. Izrauna se

potrebni volumen reagensa u gore navedenom omjeru.

59

3. Standardna otopina BSA

Koristi se govei serum albumina (BSA) koncentracije 0,2 mg/ml. Standard se podijeli u manje volmene

(alikvote) od 0,5 ml i zamrzne.

4. Folin-Ciocalteuov reagens

Komercijalni Folin-Ciocalteuov reagens razrijedi se dodatkom destilirane vode u odnosu 1: 1 i to

neposredno prije uporabe. Otopina Folin-Ciocalteuovog reagensa je natrij tungstat i natrij molibdat u

fosfatnoj i kloridnoj kiselini.

5. Standardna otopina proteina

Otopina goveeg seruma albumina (BSA) koncentracije 0,2 mg/ml.

Badarni dijagram:

Proba st. ot. BSA

cm 3

Koliina proteina (g)

1

2

3

4

0,025

0,050

0,075

0,100

5

10

15

20

Paraleno se radi slijepa proba u koju se umjesto standarda ili uzorka pipetira 0,1 ml destilirane vode.

6. Postupak odreivanja

U otpipetirani odreeni volumen uzorka (0,1 cm3), standarda i slijepe probe doda se 5 ml alkalne

otopine, smjesa se dobro promijea na vortexu, te stoji na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon toga

doda se 0,5 ml Folinovog reagensa originalni reagens se neposredno prije uporabe razrijedi

destiliranom vodom u omjeru 1:1). Nakon temeljitog mijeanja uzorci stoje 30 minuta na sobnoj

temperaturi, te im se mjeri apsorbancija na valnoj duini od 540 nm.

60

ODREIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO BREDFORD-U

Referenca za Bradfordovu metodu: Bradford M. (1976), Anal. Biochemistry, 248-254

Metoda se zasniva na reakciji proteina sa bojom Coomassie Brilliiant Blue G-250 (CBB) u kiselom

mediju. CBB reagira prvenstveno sa bazinim i aromatskim bonim ograncima aminokiselina (Arg, Lys,

His, Tyr, Trp i Phe). U reakciji dolazi do stvaranja kompleksa protein:boja. Boja s proteinom vee se

hidrofobnim reakcijama i ionskim vezama, to stabilizira boju u anionskom obliku i dolazi do promjene

boje iz smee u plavu. Pri tome se apsorpcijski maksimum boje pomjera s 465 nm na 595 nm. Ova

metoda u velikoj je upotrebi zbog jednostavnosti, brzine i veeg opsega proporcionalnosti intenziteta

obojenja i koncentracije proteina.

Slobodna aminokiselina, peptid i protein niske molekularne mase ne boje se s Coomassie reagensom.

Openito masa peptida i proteina mora biti najmanje 3 000 Daltona da se moe odreivati s ovim

reagensom. U nekim primjenama to moe biti prednost. Na primjer, Coomassie proteinski test je

koriten za mjerenje " visoke molekulske mase proteina " tijekom fermentacije u industriji piva .

Reagensi:

1. Bradfordov reagens: 60 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 otopiti u 1 dm3 3% otopine

perklorne kiseline (HClO) i otopinu profiltrirati preko filter papira kako bi uklonili neotopljenu

boju,

2. Osnovna otopina BSA ((BSA)= 1 mg/cm3. Pripremiti po 100 l otopine standardnog niza

prema sljedeoj shemi:

Standardni niz S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 g proteina 0 10 20 30 40 50 60

Postupak odreivanja:

Istovremeno se priprema u epruvetama standardni niz prema gore prikazanoj shemi (ukupni

volumen+ destilirana voda iznosiu 100 l) i uzorci nepoznate koncentracije proteina. U 100 l otopine

proteina (koja sadri do 20 g proteina) doda se 2 cm3 Bradford-ovog reagensa i poslije 20---

61

-30 minuta izmjeri se apsorbancija na 595 nm. Ako dolazi do taloenja, potrebno je pripremiti novu

razrijeenu otopinu uzorka.

Na osnovu izvrenog mjerenja priredi se badarna krivulja u Excel program i izrauna linearna regresija

da bi se dobila proraunska formula. Proraunska formula koristi se za izraun koliine nepoznatog

proteina.

3. 6. EKSPERIMENTALNE METODE U BIOKEMIJI

3. 6. 1. GEL ELEKTROFOREZA

Elektroforeza na gelu je metoda izuzetnih mogunosti za odvajanje i analizu proteina, nukleinskih

kiselina, te drugih molekula s nabojem. Elekroforetskim postupkom se molekule s nabojem pokreu

prema naprijed kroz porozni gel pomou elektrinog polja ostvarenog u puferu koji proima gel, pri

emu se molekule odvajaju zahvaljujui svojoj razliitoj elektroforetskoj pokretljivosti. Variranja

koncentracije i vrste gela i pufera omoguuju odvajanje molekula, ne samo na osnovi razlike naboja,

ve takoer i razlike u molekulskoj masi, izoelektrinoj toki, te biospecifinom afinitetu. Tehnika je

brza i prikladna.

PRINCIP RAZDVAJANJA PROTEINA ELEKTROFOREZOM NA AGAROZI I

POLIAKRILAMIDNOM GELU

Elektroforeza na gelu agaroze prvenstveno razdvaja proteine s obzirom na njihov naboj. Gel formira

poroznu mreu koja slui kao stabilizirajui medij za pufere, ije su pore dovoljno velike da neometano

propuste i najvee proteinske molekule. U veini sluajeva pH pufera se podeava tako da proteini

koji se odvajaju nose isti naboj, ali se meusobno razlikuju po gustoi tog naboja. Kada se ovaj sustav

62

podvrgne djelovanju elektrinog polja, proteini putuju prema suprotno nabijenoj elektrodi. to je vei

omjer njihova naboja prema molekulskoj masi, to se bre kreu. Tako se analizirani uzorak na osnovi

gustoe naboja moe separirati u seriju odvojenih vrpci, koje najee ostaju u gelu, te se identificiraju

bojanjem ili nekim drugim postupkom. Mogue je razdvojene proteine ponovo prevesti u otopinu tako

da se dijelovi gela s vrpcama koje nas zanimaju izreu i otope u prikladnom mediju.

Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu slina je elektroforezi u agarozi, a od nje se razlikuje po tome

to su pore ovoga gela dovoljno malene da uspore vee proteine, usljed ega se striktna separacija

gustoom naboja modificira efektom prosijavanja. Usljed toga se odvajanje usporava, ali se poveava

rezolucija (separacija) proteina sline gustoe naboja. Tako se npr. serum razdvaja u priblino 5 vrpci

na agarozi, a na poliakrilamodnom gelu u priblino 20 vrpci.

Ovi najjednostavniji oblici elektroforeze usavreni su sljedeim postupcima:

1. Elektroforeza u gradijentu - najoptimalniji i najsavreniji oblik separacije,

2. Elektroforeza u prisustvu detergenta (npr. SDS - natrijdodecil sulfat) - odvajanje je

iskljuivo na osnovi razlike u veliini molekula, te moe posluiti za odreivanje

molekulske mase razdvojenih molekula,

3. Elektroforetsko odvajanje proteina na osnovi razlike u izoelektrinoj toki (izoelektrino

fokusiranje),

4. Dvodimenzionalna elektroforeza,

5. Imunoelektroforeza i afinitetna elektroforeza (odvajanje na osnovi bio-specifinog

afiniteta),

6. Rocket imunoelektroforeza (omoguuje kvantitativno odreivanje proteina nakon

njihova razdvajanja u gelu koji sadri nepokretna antitijela),

7. Dvodimenzionalna imunoelektroforeza (takoer mogue kvantitativno odreivanje

komponenti u smjesi proteina).

63

POLIMERIZACIJA POLIAKRILAMIDNOG GELA

Poliakrilamidni gel nastaje kao produkt polimerizacije akrilamidnog monomera pomou slobodnih

radikala uz popreno povezivanje s ko-monomerom N,N-metil-bis-akrilamidom. Variranjem

koncentracije monomera i komonomera, jednako kao i variranjem stupnja polimerizacije (duina

lanca) omogueno je formiranje poliakrilamidnih gelova sa irim rasponom veliine pora. Raspon

veliine pora koje tako nastaju moe se prilagoditi da bi se optimiziralo odvajanje.

Reakcije polimerizacije zapoinju katalitikim redoks sustavom koji osigurava slobodne radikale.

Najee koriten katalitiko-inicijatorski sustav koristi tercijarni amin, TEMED (N,N,N,N-

tetramatiletilamin) kao katalizator, te kao inicijator amonijev persulfat, koji osigurava slobodne

kisikove radikale. Drugi uvelike koriten izvor slobodnih radikala je fotorazgradnja riboflavina koju

prati reoksidacija leukoflavina i nastajanje slobodnih radikala. Sustav za polimerizaciju koji ine

riboflavin-UV svjetlo ima prednost onda kada je poeljna mala ionska jakost gelova (kao npr. u

izoelektrinom fokusiranju) budui da je djelotvoran i pri vrlo niskim koncentracijama (

64

Slika 21. Elektroferogram u poliakrilamidnom gelu

Na Slici 21. prikazana je SDS gel elektroforeza u 10% poliakrilamidnom gelu su proteini obojeni

Comassie brilliant blue bojom. U prvi utor naneseni su standardi proteina molekulske mase od 66, 45,

35, 24, 18 i 9 kDa. U ostale utore su nanesene razliite frakcije proteina izoliranih iz kvaevih stanica.

Ovim postupkom mogue je odrediti priblinu molekulsku masu nepoznatih proteina.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=hr&langpair=en|hr&rurl=translate.google.hr&u=http://en.wikipedia.org/wiki/File:Coomassie3.jpg&usg=ALkJrhiQj5szSeGAP3Y60IlJPKZ547exbQ

65

3. 6. 2. KROMATOGRAFSKE METODE

Molekulski detalji biokemijskih procesa nisu u potpunosti rasvijetljeni sve dok se molekule ne

izoliraju i karakteriziraju. Dananje tehnike razdvajanja i identifikacije vrlo su efikasne i mono

sredstvo za dobivanje istih biomolekula.

Danas se u preparativnoj i analitikoj biokemiji upotrebljava mnotvo kromatografskih metoda. To su

gotovo uvijek kromatografije na koloni, kojima stacionarna faza (punilo kolone) moe biti razliitog

tipa po emu se i razlikuju pojedine kromatografske metode. Aparatura za kromatografiju obino se

sastoji od jednoga ili vie spremnika za eluense, pumpe, kromatografske kolone s odreenim

punjenjem, detektora s pisaem i sakupljaem frakcija s epruvetama. U pojednostavljenom obliku

moe se izostaviti pumpa, pa protok ovisi samo o hidrostatskom tlaku, te detektor, pa se koncentracija

mjeri naknadno u sakupljanim frakcijama. Danas se esto upotrebljava visokotlana kromatografija,

u kojoj pumpa daje tlak od stotinu i vie kPa. Ogromna prednost visokotlane kromatografije je

neposredno vea brzina rada i bolje razluivanje. Detektori, koje danas upotrebljavaju biokemiari u

kromatografskim aparaturama, najee su detektori apsorbancije u ultravioletnom podruju

(pogodno za nukleinske kiseline i proteine), a rjee detektori indeksa loma, vodljivosti i dr. U

sakupljanim frakcijama mogu se naknadno obaviti ova ista mjerenja, a mogu se (obino u malim

dijelovima skupljenih frakcija) proizvesti razne kolorimetrijske reakcije, mjeriti aktivnost enzima ili

neka druga bioloka aktivnost.

Navest emo tipove kromatografije, koji se najee upotrebljavaju u biokemiji.

1. Kromatografija na ionskim izmjenjivaima vrlo esto se upotrebljava, jer su i bioloke

makromolekule u pravilu nabijene. Kolone se obino najee pune supstituiranim celulozama:

dietilaminoetil celuloza (DEAE-celuloza) slabi je anionski izmjenjiva, a fosfoceluloza i

karboksimetilceluloza su slabi kationski izmjenjivai. Primjera radi, DEAE-celuloza e kod

neutralnog pH vezati kisele proteine, i to jae, to je protein kiseliji, dok e bazini proteini proi

kroz kolonu. Vezani kiseli proteini mogu se postupno eluirati, bilo promjenom pH, bilo poveanjem

ionske jakosti eluensa.

66

Slika 22. Shematski prikaz ionskoizmjenjivake kromatografije. Preuzeto od:

http://www.intechopen.com/books/ion-exchange-technologies/nitrogen-isotope-separation-

by-ion-exchange-chromatography

Afinitetna kromatografija je vrlo rasprostranjena metoda za izolaciju mnogih proteina, posebice

enzima, a zasniva se na velikom afinitetu proteina prema pojedinim malim molekulama. Tako se na

prikladan nosa, kojim se napuni kolona, moe kovalentno vezati glukoza. Kada se kroz kolonu

proputa smjesa proteina, na koloni e se zadrati samo oni proteini, koji specifino veu glukozu.

Ostali se proteini eluiraju prikladnim puferom. Proteini vezani na glukozu na nosau otputaju se s

kolone tako da se primjeni eluens sa veom koncentracijom glukoze. Naime,