Aumentano i rischi di diffusione dei patogeni

mediante seme infetto: le piante orticole da foglia

come esempio

M.L. Gullino, G. Gilardi e A. Garibaldi

Centro di Competenza per l’innovazione in campo ambientale (AGROINNOVA)

8 marzo 2012, Incontri Fitoiatrici, Torino

Patogeni trasmessi per seme Molti patogeni si conservano da un ciclo colturale

all’altro per mezzo del seme e vengono definiti “patogeni portati da seme”. Il seme rappresenta per questi patogeni un mezzo di diffusione spesso assai efficiente nell’ambito delle coltivazioni. Basta spesso un seme infetto ogni 10.000 per osservare gravi danni alle piante. Inoltre, il seme stesso, in relazione agli scambi commerciali (e a quelli a scopo di studio e ricerca) di cui è oggetto, può permettere a specie patogene, e alle loro eventuali varianti, di raggiungere aree nuove anche molto lontane da quelle di origine.

Diffusione di patogeni mediante seme

Malattie fungine: Basilico Cicoria Endivia Lattuga Rucola

coltivata Rucola

selvatica Spinacio Valerianella

Tracheofusariosi 1989 2010 2009 2002 2002 2002 1978* 2003 Verticilliosi 1987 2007 2005* Alterazioni da Phoma spp.

2006* 1966

Alternariosi 2010 1968 1968 1968 2011 2011 1991* Peronospora 2004 1863 2004 1967 1966 Cladosporiosi 1922 Septoriosi 1996 1996 1951 Antracnosi 1995 1895 1895 1895 2007* Marciumi da Phytophthora

2010 2010*

* Non segnalato in Italia.

Diffusione di patogeni mediante seme

Basilico Cicoria Lattuga Rucola coltivata

Rucola selvatic

a

Spinacio Valerianella

Batteriosi causate da: Erwinia carotovora

1977 1969

Acidovorax valerianellae

2003*

Pseudomonas spp.

1986 1969 1969 1969

Xanthomonas campestris pv. vitians

1969

Xanthomonas campestris pv. raphani

2005

* Non segnalato in Italia.

Esempi di trasmissione di patogeni mediante seme

Coltura Patogeno Percentuale di

semi infetti Lattuga Fusarium oxysporum f.sp. lactucae 0,1 %

Verticillium dahliae 66-90% Botrytis cinerea 30% Pseudomonas cichorii * Xanthomonas campestris pv. vitians 1-18% Microdochium panattonianum *

Rucola Fusarium oxysporum 0,1% Valerianella Phoma valerianellae 0,6 - 15%.

Acidovorax valerianellae 0,1-0,9% Endivia e cicoria Alternaria cichorii 0,6-13,75%

Microdochium panattonianum * Spinacio Fusarium oxysporum f.sp. spinaceae *

Peronospora farinosa f.sp. spinaciae razza 1,2,3,4

0,3-2,9%

Cladosporium variabile 1,8%

Stemphylium botryosum ** 1-95% Verticillium dahliae** 0,3-84,8%

Tracheofusariosi della lattuga

Fusarium oxysporum f.sp lactucae

Come si è spostata la tracheofusariosi della lattuga

Fusarium wilt of lettuce

Giappone (1967) California U.S.A. (1993) Taiwan (1998) Italia (2002) Arizona U.S.A. (2003) Portogallo (2005)

Fusarium wilt of rocket Alcuni esempi di

patogeni importati

Tracheofusariosi di rucola coltivata e selvatica.

Gli agenti della malattia sono trasmessi per seme.

La malattia è stata osservata a partire dal 2002 in Lombardia.

In campo i primi sintomo sono osservabili su Eruca vesicaria a partire da temperature del terreno di 15°C.

TRACHEOFUSARIOSI DELLA RUCOLA

Sintomi su rucola coltivata (Eruca vesicaria) e selvatica (Diplotaxis sp.).

E’ confermata la trasmissione del patogeno mediante seme.

Basilico: patogeni importati

Peronospora belbharii agente della peronospora

Fusarium oxysporum f.sp. basilici agente della

tracheofusariosi

Alternariosi del basilico causata da Alternaria alternata

Trattamento dei semi Contaminazione da Alternaria

Disinfezione (ipoclorito di sodio 1%) Da 0 al 12% -- Da 0,25 al 26%

Sono stati analizzati undici campioni di semi di basilico della tipologia ‘Genovese gigante’ commerciali. Il saggio è stato effettuato in vitro su PDA impiegando 400 semi per lotto, disinfettati in una soluzione di ipoclorito di sodio (1%) o utilizzati tal quale. Tutti i campioni sono risultati contaminati da funghi del genere Alternaria, risultati patogeni.

In alcuni casi sono sufficienti percentuali assai basse di semi infetti per permettere la rapida diffusione della malattia in aree geografiche diverse. Ad esempio nel caso della Phoma valerianellae percentuali dell’1-2% di semi infetti possono provocare danni elevati. In altri casi, come in quello delle tracheofusariosi i danni evidenti si manifestano dopo 2-3 colture della stessa specie nel terreno che si è infettato utilizzando semi contaminati

Un nuovo servizio per le imprese Nel 2011 è stato avviato un nuovo Laboratorio

che si occupa di sanità del materiale di propagazione.

Le analisi fitosanitarie di funghi fitoparassiti di

materiale di moltiplicazione di piante da frutto e orticole sono accreditate dalla Regione Piemonte.

Perché un nuovo laboratorio?

• Per sfruttare l’esperienza maturata negli ultimi anni con progetti di ricerca europei;

• Per fornire un nuovo servizio alle imprese; • Per restare aggiornati sui nuovi problemi; • Per acquisire nuove risorse; • Per creare opportunità di lavoro ai giovani; …

Le attività del Laboratorio

Il laboratorio, che opera in stretta collaborazione con le imprese, si occupa di diagnosi e di caratterizzazione dei patogeni trasmessi per seme nonché della messa a punto di tecniche di concia dei semi con metodi chimici, fisici e biologici e di assistenza tecnica.

Diagnosi Per quanto riguarda la diagnosi,

il laboratorio è in grado di utilizzare tecniche tradizionali e molecolari, arrivando, nel caso di nuovi patogeni, a caratterizzarli e a definire tecniche diagnostiche che ne consentano non solo il riconoscimento, ma anche la quantificazione.

Diagnostica • Metodi tradizionali • Metodi molecolari (ibridazioni acidi nucleici, PCR,

real time PCR, DNA array,…) Non ci sono metodi molecolari recepiti dalla normativa,

ma la letteratura si sta sempre più arricchendo di applicazioni che, se pur non ancora validate, presto offriranno possibilità applicative rapide e affidabili.

Future applicazioni prevedono l’uso di biosensori, che sfruttano reazioni biologiche per individuare l’organismo target e che sono già utilizzati in diagnostica clinica.

Codice Campione

cv Numero di isolati di P. valerianellae su

1000 semi

Pre-trattamento con ipoclorito di

sodio 1%

47/co Cambrai 61 No 130/co Cambrai 63 No 310 Trophy 150 No 310 Trophy 101 Si 313 Palace 46 No 313 Palace 40 Si 130CR Ljublianski 6 No 130CR Ljublianski 0 Si 353PS Juwallon 18 No 353PS Juwallon 10 Si

Metodi diagnostici: saggio biologico per il riconoscimento di Phoma valerianellae da seme

PDA + S

Contaminazione dei semi da P. valerianellae compresa tra 0,6% e 15%

Metodi diagnostici: primer specifico per il riconoscimento di P. valerianellae da seme

Tr. ipoclorito di Na non trattato

Una coppia di oligonucleotidi, entrambi della lunghezza di 18 bp, è stata disegnata (prodotto di amplificazione 496-bp): Pv-FOR (5’-GGCTTTGCCTGCCATCTC-3’) e Pv-REV (5’-GACGTCGTCGTCTGGTTG-3’).

Una PCR effettuata sul DNA estratto da funghi appartenenti al genere Phoma (P. betae, P. heteromorphospora, P. exigua) ha mostrato che la coppia di primer è altamente specifica quando sono utilizzate specifiche condizioni di temperatura (Tm=59°C).

Rilevate infezioni dei semi dell’ordine dello 0,6%

Le formae speciales di Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum: fungo anamorfo terricolo. Ceppi patogeni raggruppati in formae speciales sulla base della loro specificità d’ospite. Descritte circa 100 formae speciales diverse. Alcune formae speciales sono state ulteriormente suddivise in razze sulla base delle cultivar colpite.

Specie Famiglia Forma specialis Basilico Lamiaceae basilici Lattuga Asteracee lactucae Valerianella Valerianaceae raphani Rucola Brassicaceae raphani Catalogna Asteraceae Indivia Asteraceae

Alcuni ortaggi a foglia

Le formae speciales: le regioni IGS

Formae speciales: saggi di patogenicità su diverse specie di ospiti Razze fisiologiche: saggi di patogenicità su diverse cultivar di una singola specie vegetale Saggi biologici efficaci ma laboriosi e tempi lunghi Spaziatori intergenici – IGS (tra due unità ripetute): 1 - Analisi RFLP 2 - Analisi delle sequenze

Inter retrotransposon amplified polymorphism: IRAP

- Ceppi italiani identici a FOL proveniente da Taiwan (razza 1)

- Trasmissione del fungi attraverso materiale infetto proveniente dall’Asia

Ceppi italiani Ceppi stranieri

Razza 1 di F. oxysporum f.sp. lactucae (FOL)

Fusarium oxysporum f.sp. basilici

Amplificazione ottenuta mediante impiego di primer SCAR specifici per F. oxysporum f.sp. basilici: BIK1 e BIK2, BIK3 e BIK4, BIK1 e BIK4

Profilo RAPD con il primer OPB-08 5 FOB, FO ff.spp. dianthi, canariensis, radicis-lycopersici, gladioli, cyclaminis, lycopersici, melonis, lilii, pisi, tulipae, e isolati non patogeni

PSA1F/PSA2R

PSA3F/PSA4R

13 isolati batterici da kiwi. I primi 7 pozzetti sono gli isolati ottenuti da foglia, gli altri 6 da ramo.

Le amplificazioni con le coppie di primer PsaF1-PsaR2 e Psa3F-Psa4R hanno generato due amplificati di 280 bp e 175 bp in 60 dei 92 campioni analizzati.

Identificazione di Pseudomonas syringae pv actinidiae

Concia Per quanto riguarda la concia,

l’esperienza acquisita nell’ambito di progetti europei e nazionali che hanno riguardato la messa a punto di trattamenti di concia con mezzi chimici, fisici e/o biologici su semi di cereali e orticole consente di sviluppare rapidamente metodologie adeguate e adatte alle diverse situazioni.

Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di

pisello In prove condotte in ambiente protetto in vaso e su bancale attraverso concia umida o secca di seme naturalmente infetto (tasso di infezione: 20%) sono stati saggiati i seguenti trattamenti, valutando % di emergenza, incidenza e indice di malattia:

• impiego di acqua calda, vapore aerato, elettroni;

• uso di formulati commerciali a base di 4 microorganismi (Bacillus subtilis, Pseudomonas chlororaphis, Fusarium oxysporum e Streptomyces griseoviridis);

• applicazione di isolati di microrganismi selezionati per la loro capacità antagonistica;

• concia con estratto di timo e farina di crucifere;

• impiego di induttori di resistenza.

Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di

pisello Trattamento fisico Parametri Efficacia

Acqua calda 48 °C 10 min

+

Vapore aerato 74 °C 90 % U.R. 2

min

+

Elettroni 140 kV 12 kGy

+

Efficacia:

+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)

++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico

+ effetto non apprezzabile

Metodi alternativi di concia per il

contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello

Efficacia:

+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)

++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico

+ effetto non apprezzabile

Microrganismo (formulato) Dose/10 g seme Efficacia

Bacillus subtilis (FZB 24) 100 mg +

Streptomyces griseoviridis (Mycostop)

50 mg

+

Fusarium oxysporum 251/2 100 mg +

Bacillus subtilis (MBI 600) 100 mg

+

Bacillus subtilis (Serenade) 100 mg +

Pseudomonas chlororaphis (BA 2552)

300 μl +

Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello

Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico; + effetto non apprezzabile

Microrganismo/estratto Dose/ concentrazione

Efficacia

Pseudomonas spp. (6 ceppi) 1x108 UFC/ml + Bacillus spp. (2 ceppi) 1x108 UFC/ml + Serratia plymuthica 1x108 UFC/ml + Curtobacterium sp. 1x108 UFC/ml + Pichia guilliermondii 1x108 UFC/ml + Burckholderia sp. 1x108 UFC/ml + Trichoderma viride 1x106 UFC/ml + Fusarium oxysporum antagonista 1x106 UFC/ml + Clonostachys rosea IK726 1x109 UFC/g ++ Tillecur (farina brassicacee) 20 % + Olio di timo 0,1 % +++

Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello

Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico; + effetto non apprezzabile

Induttore di resistenza (p.a.)

Dose/concentrazione Efficacia

Chitoplant (chitosano) 0,5% +

Acido salicilico 10 mg/l + Acido jasmonico 1 mg/l + Comcat (steroide vegetale) 0,5 mg/l +

Bion (acibenzolar S-metile) 0,1 mg/l +

Milsana (estratto di Reynoutria sachalinensis)

1% +

Kendal (8% estratto di Medicago sativa, 15,5% K2O)

0,1% +

Efficacia dell’impiego di microrganismi e diversi fungicidi in trattamenti di concia del seme di lattuga nei confronti della tracheofusariosi

Trattamento° Dose /g seme Efficacia°° Bacillus subtilis (Serenade WP) 0,01 mg + Bacillus subtilis (FZB24) 0,01 mg ± Bacillus subtilis (MB1 600) 0,01 mg ± Streptomyces griseoviridis (Micostop) 0,002 mg ± Fusarium oxysporum 251/2 1x107 CFU* + Pseudomonas chlororaphis (Cedomon) 0,3 mg ± Fusarium oxysporum MSA 35 1x107 CFU ++ Mancozeb (Mazeb 80) 4,8 mg ++++ Tiram (Pomarsol 50) 1,5 mg + Testimone inoculato non trattato - ± Testimone sano - ++++

°(±) efficacia rispetto al testimone 0-20%; (+) efficacia rispetto al testimone 21-40%; (++) efficacia rispetto al testimone 41-60%; (+++) efficacia rispetto al testimone 61-80%; (++++) efficacia rispetto al testimone 81-100%;

Assistenza tecnica

Il laboratorio è, inoltre, in grado di svolgere assistenza tecnica sviluppando protocolli per trattamenti di concia di semi e di materiale di moltiplicazione con mezzi fisici, biologici e naturali e svolge, infine, attività di formazione, organizzando corsi di aggiornamento per tecnici e funzionari dei servizi fitosanitari

Conclusioni

Il nuovo laboratorio è stato progettato e

concepito come Centro per condurre ricerche avanzate e come servizio alle imprese. Questo nuovo servizio va ad aggiungersi al Centro di Saggio per la sperimentazione di agrofarmaci e al Laboratorio di Diagnostica fitopatologica.

… ad Agroinnova coltiviamo il futuro!

Finanziamento della Regione Piemonte (P.O.R. - F.E.S.R. 2007/2013 Polo di Innovazione agro-alimentare) - progetto SEVARDIA “Selezione varietale e diagnostica avanzata per la produzione di basilico di qualità in Piemonte e per la valorizzazione del prodotto trasformato (pesto)”.