aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1
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VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte I
Testes imunológicos
Baseiam-se em reacções antigénio-anticorpo:
Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante
a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antigénio.
Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de
induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2
Anticorpo
Cadeias de glicoproteícas :
Cadeias leves
Cadeias pesadas
Região constante – local de activaçãode outros elementos dos S. Imune;
Região variável – local de ligação aoantigénio
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 3
Anticorpo
Tipos de anticorpos
PoliclonaisObtidos a partir de diferentesclones de células;
MonoclonaisObtidos a partir de um únicoclone de plasmócitos
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Classes de anticorpos no Homem
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Imunoglobulinas Características
IgG Principal Ig séricaEnvolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA Presente no soro, secreções e mucosasTem funções de opsonização.
IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando comoreceptor de antigénios.Funções pouco definidas.
IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos eeosinófilos.Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.
Antigénio
Epítopo
Região do antigénio que reage com o anticorpo
Possibilidade de reacções cruzadas
Pequenas alterações na estrutura do antigénio,
entre outras factores, podem afectar
profundamente a ligação com o anticorpo
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Aplicabilidade
Papel importante:
Tipo de amostra varia consoante o
que estamos a pesquisar
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Diagnóstico
Monitorização
Tratamento
Técnicas de Imunologia
Reacções Imunoenzimáticas
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)
ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)
Imunoflurescência
Imunocromatografia
ImunoHisto/Citoquímica
Análise Proteínas: Western Blot
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Reacções Imunoenzimáticas
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ELISA
Permite determinar a concentraçãodo analito
Calcular curva de calibração –interpolar a concentração damolécula a quantificar
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Baseia-se numa reacção imunoenzimatica com detecção final emespectrofotometria
Tipos de ELISA
Sandwich
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1. Poços revestidos com anticorpo especifico
2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
Tipos de ELISA
Indirecto
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1. Poços revestidos com antigénio especifico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
Tipos de ELISA
Competitivo
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1. Ac especificos incubam com a amostra
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag
3. Ac secundário
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
Quantomaior aconcentração de analitomenor aabsorvância
ELISA
Método automatizado
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ELFA
Permite fazer um análise quantitativa
Curva de calibração
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Reacção imunoenzimatica com detecção final em fluorescência.
ELFA
Teste, geralmente, automatizado onde é
necessário:
Um cone sensibilizado com Ag,
serve, tanto de fase sólida como
sistema de pipetagem
Uma barrete que contem os
reagentes necessários para a
realização da técnica
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Imunoflurescência
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Imunoflurescência
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Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos
O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência
A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência
Fluorocromos mais usados
Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)
Rodamina
Imunoflurescência
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Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-
quantitativa
Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
Tipos de Imunoflourecênca
Directa
Indirecta
Anti-complemento
Imunoflurescência Indirecta
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Etapas
▫ Fixação (quando queremos
pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);
▫ Ac primário
▫ Ac Secundário (marcado com um
fluorocromo);
▫ Reagente de contraste
Imunofluorescência anti-complemento
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Etapas
▫ Inactivação do complemento endógeno
▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo
▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado
▫ Ac conjugado que se liga ao complemento
▫ Detecção por microscopia de fluorescência
Imunofluorescência
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Resultados
Permite localizar o analito
EX: Membrana celular
Análise com o corante de contraste
Imunofluorescência
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Resultados
Pesquisa de anticorpos: resultado positivo
(fluorescência verde)
Pesquisa de anticorpos: resultado negativo
Imunocromatografia
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Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 25
Teste qualitativo
Detecção antigénios virais ou anticorpos
Rápido e simples
Fase móvel: amostra diluida
Fase sólida: membrana revestida
Imunocromatografia
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Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C
Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex
Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveisdevido às partículas de látex
ImunoHisto/Citoquímica
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ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 28
Imunologia e citologia ou histologia
Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,proteínas)
Diferenças de expressão de proteínas
Localização celular do antigénio
Método qualitativo (maior parte dos casos)
Quantificação relativa
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 29
Método directo
Ac primário marcado enzimaticamente reage directamentecom o antigénio
Método Indirecto
Ac primário que se liga ao antigénio
Ac secundário marcado enzimaticamente
Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 30
Principio do método
PO+ H2O2+ Dador de electrões PO+ H2O2+ precipitado
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 31
Passos importantes
Fixação (sol. Alcoólica)
Permeabilizar (detergente)
Ac primário
Ac secundário conjugado
Substrato com agente cromogénio
Corante de contraste
Imunohistoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 32
Imunohistoquímica
Imunocitoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 33
Imunocitoquímica
Análise Proteínas
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 34
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 35
SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 36
Blotting
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 37
Detecção
1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 38
Aplicação
VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte I