8

PENGAMATAN ZONA HAMBAT MINYAK ATISIRI BAWANG PUTIH, CENGKEH DAN JINTAN HITAM TERHADAP PERTUMBUHAN Staphylococcus aureus;

PENELITIAN IN VITROSKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi tugas dan melengkapi

syarat guna memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi

Oleh:

AMIRAH FAHIMAH BINTI AHMAD TARMIZINIM : 070600183FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN2011

Fakultas Kedokteran Gigi

Departemen Biologi Oral

Tahun 2011

Amirah Fahimah

Pengamatan Zona Hambat Minyak Atsiri Bawang Putih, Cengkeh dan Jintan Hitam Tehadap Pertumbuhan Staphylococcus aureusX + 62 halaman

Minyak atsiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam mempunyai daya hambat terhadap Staphylococcus aureus. Minyak atsiri bawang putih memiliki senyawa aktif allicin yang akan menghambat sintesis RNA dan DNA sel. Minyak atisiri cengkeh memiliki senyawa aktif eugenol yang dapat merusak langsung membran sel bakteri. Thymoquinone merupakan bahan aktif dalam minyak atsiri jintan hitam manghambat sintesa protein dan menyebabkan gangguan fungsi sel. Tujuan penelitian untuk melihat perbedaan daya hambat minyak atsiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam terhadap Stapylococcus aureus.

Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorium dengan desain Posttest Only Control Group Design. Sampel digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus dari stamp yang diisolasi dari denture stomatitis. Uji daya hambat ini menggunakan teknik Disc Diffusion Test dengan bahan coba minyak atsiri bawang putih, minyak atsiri cengkeh, minyak atsiri jintan hitam dan aquades, etanol 96% sebagai kontrol. Minyak atsiri dibuat dengan metode punyulingan uap dan air dan setiap bahan coba dilakukan 7 kali pengulangan. Zona hambat terbentuk diukur dengan kaliper. Data dianalisa dengan uji Oneway ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Komparasi Ganda.

Hasil pengukuran menunjukkan rata-rata zona hambat aquades 0 mm, etanol 96% adalah 13,894 mm, minyak atsiri bawang putih 10,950 mm, minyak atsiri cengkeh 14,784 mm dan minyak atsiri jintan hitam 11,944 mm. Hasil pengamatan rata-rata zona hambat setiap bahan coba kecuali aquades, mempunyai daya hambat terhadap Staphylococcus aureus dengan kemampuan yang berbeda.

Hasil uji analisis Oneway ANOVA dan Komparasi Ganda menunjukkan terdapat perbedaan bermakna (P 15

4 . ( n 1 ) > 15

n 1 > 3, 75

n > 4, 75 ~ 5

Jumlah sampel (n) yang didapat adalah 5, tetapi boleh ditambahkan 2-3 sampel, sehingga sampel yang digunakan dalam penelitian ini masing-masing dilakukan pengulangan 7 kali pada kelompok I sehingga V.4.3 Variabel Penelitian

4.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas untuk penelitian ini adalah seperti berikut :

a. Aquades sebagai kontrol negatif

b. Etanol 96% sebagai kontrol positif

c. Minyak atsiri bawang putih

d. Minyak atsiri cengkeh

e. Minyak atsiri jintan hitam

4.3.1 Variabel Tergantung

Variabel tergantung untuk penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dengan metode pengukuran diameter zona hambat pada masing-masing perlakuan.

4.3.3 Variabel Terkendali

a. Media untuk menumbuhkan Staphylococcus aureus yaitu MHA.b. Suhu yang digunakan untuk menumbuhkan Staphylococcus aureus 37C dalam inkubator.c. Waktu yang digunakan untuk menumbuhkan atau pembiakan Staphylococcus aureus yaitu 24 jam.d. Teknik pengisolasian dan pengkulturan.e. Penggunaan alat, media pertumbuhan dan bahan percobaan yang steril.f. Keterampilan operator dalam pelaksanaan penelitian dan didampingi asisten laboratorium. 4.3.4 Variabel Tidak Terkendali

Variabel tidak terkendali untuk penelitian ini adalah asal bawang putih, cengkeh dan jintan hitam (geografis) berhubungan dengan tanah, curah hujan dan lingkungan sekitar tanaman.

4.4 Definisi Operational

a. Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas berupa larutan minyak yang diperoleh dari penyulingan air dan uap.

b. Minyak atsiri bawang putih adalah minyak yang dihasilkan dari bawang putih melalui proses penyulingan air dan uap.

c. Minyak atsiri cengkeh minyak yang dihasilkan dari bunga cengkeh melalui proses penyulingan air dan uap.

d. Minyak atsiri jintan hitam yang dihasilkan dari biji jintan hitam melalui proses penyulingan air dan uap.

e. Etanol 96% adalah alkohol dengan perbandingan 96% komposisi etanol dan 4% komposisi air. Disebut juga etil alkohol 96%, termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C2H2OH.

f. Aquades adalah air hasil dari penyulingan, kandungannya murni H2O.

g. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram-positif yang bersifat aerob dan anaerobik fakultatif, yang muncul sebagai cluster seperti anggur, dan sering dijumpai pada kulit manusia terutama pada membrane mukosa, nares anterior dan perineum. Staphylococcus aureus adalah bakteri yang diperoleh dari stamp yang diisolasi dari Denture stomatitish. Diameter zona hambat adalah diameter daerah dimana bakteri tidak tumbuh pada media Mueller Hinton Agar yang ditandai dengan daerah bening yang dapat diukur dengan kaliper satuan millimeter (mm).

4.5 Alat dan Bahan Penelitian 4.5.1 Alat Penelitian a. Disk kosong

b. Inkubator

c. Oven

d. Kaliper digital

e. Pipet volume

f. Ose

g. Alat sebar

h. Autoklaf

i. Pinset

j. Cawan petri

k. Lampu spiritus

4.5.2 Bahan Penelitiana. Bawang Putih 8 kg

b. Cengkeh 500 gr

c. Jintan Hitam 5 kg

d. Aquades

e. Mueller Hinton Agar (MHA)

f. Etanol 96%

g. Stamp bakteri S. aureus yang diisolasi dari Denture stomatitis

4.6 Tempat dan Waktu Penelitian

4.6.1 Tempat Penelitian

a. Laboratorium Biologi Oral FKG USU

b. Laboratorium Polimer FMIPA USU4.6.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian adalah 3 bulan (April - Juni 2011)4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data

4.7.1 Pembuatan MediaMedia MHA dibuat dengan cara melarutkan 38% Mueller Hinton (Oxoid) ke dalam akuades. Larutan tersebut dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100 oC. Kemudian dimasukkan ke dalam erlenmayer flask dan masing-masing tabung ditutup alumunium foil. Media yang akan digunakan sebelumnya disterilisasi terlebih dahulu dengan otoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media didiamkan di laminar (clean bench) aseptik sampai media membeku. Apabila media sudah membeku, media disimpan dalam kulkas.

4.7.2 Pembuatan Minyak Atsiri Bawang Putih, Cengkeh dan Jintan Hitam Minyak atsiri bahan coba dibuat melalui punyulingan air dan uap. Pada proses ini, uap air yang didih akan dilewatkan melalui campuran bahan coba. Uap ini akan menguapkan minyak dan membawanya dalam bentuk suspensi, ke dalam kondensor. Di sini uap akan terpisah kembali menjadi air dan minyak setelah 1 jam minyak dipisahkan menggunakan corong pisah.

4.7.3 Uji Efektifitas Antibakteri dengan Metode Difusi Agar

Alat-alat dan bahan disediakan, kemudian lakukan penelitian dengan menggunakan 35 cakram kosong direndam dalam 5 wadah yang berbeda yang masing-masing berisi 1 cc untuk setiap bahan coba selama 60 menit.

Kultur Staphylococcus aureus diambil dua kali dengan ose bulat dan di letakkan pada MHA lalu dilakukan goresan (streak) secara rapat-rapat pada permukaan MHA kemudian dirata dengan menggunakan alat sebar. Setelah rendaman berlansung selama 60 menit, disk dikeluarkan dan diletakkan pada media MHA lalu ditekan.

Media pada disk kemudian diberi label nomor 1 hingga 5 sesuai dengan kelompok perlakuan. Setelah selesai, piring petri dimasukkan kedalam inkubator dengan suhu 37C selama 24 jam. Setelah 24 jam, piring petri dikeluarkan dari inkubator dan dilihat daya hambat yang terjadi pada setiap disk.

Daya hambat kemudiannya diukur dengan menggunakan kaliper digital dengan menggunakan rumus ( horizontal + vertikal ) dibagi dua dengan perhitungan dimasukkan dalam tabel.

4.7.4 Cara Pengukuran Zona Hambat

Diameter Zona Hambat = ( Vertikal + Horizontal ) 2

4.7.5 Uji Statistik

Data dari setiap perlakuan dianalisa secara statistik dengan tingkat kemaknaan ( = 0,05), dengan memakai uji statistik:

1. Uji One Way ANOVA, untuk melihat perbedaan daya hambat bakteri pada semua kelompok perlakuan.

2. Uji komparasi ganda/Least Significant Differences (LSD), untuk melihat perbedaan daya hambat bakteri antar kelompok.

Jika uji ANOVA memberikan hasil yang signifikan dilanjutkan dengan uji LSD.

BAB 5

HASIL PENELITIAN

Setelah perletakan semua bahan coba yaitu aquades, etanol 96%, minyak atisiri bawang putih, minyak atsiri cengkeh dan minyak atsiri jintan hitam dilakukan pengamatan setelah 24 jam untuk melihat zona bening di sekitar cakram. Zona bening merupakan daerah dimana pertumbuhan Staphylococcus aureus dihambat oleh bahan coba. Masing-masing bahan coba dilakukan tujuh kali pengulangan. (Gambar 14) Pengamatan dilakukan terhadap seluruh pengulangan dari bahan coba pada waktu yang bersamaan.

Hasil penelitian menunjukkan terdapat zona hambat pada bahan coba minyak atsiri bawang putih, minyak atsiri cengkeh, minyak atsiri jintan hitam dan etanol, sedangkan aquades tidak menunjukkan daya hambat terhadap Staphylococcus aureus. Tabel 4 menunjukkan rata-rata zona hambat dan standard deviasi bahan coba aquades, etanol 96%, minyak atisiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam.

Tabel 4. Perbedaan rata-rata zona hambat aquades, etanol 96%, minyak atisiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam.

KelompokPerlakuann (mm) (mm) SDP

IAquades (kontrol)70.00000.0000 0,00000,0001*

IIEtanol 96% (kontrol)713.894313.8943 0,43408

IIIMinyak atsiri bawang putih710.950010.9500 0,12000

IVMinyak atsiri cengkeh714.784314.7843 0,17587

VMinyak atsiri jintan hitam711.944311.9443 0,39522

* Terdapat perbedaan yang bermakna pada P < 0,05Dari tabel 4 dapat dibaca hasil penelitian bahwa dari tujuh kali pengulangan bahan coba etanol 96% diameter 13,894 mm, minyak atsiri bawang putih 10,950 mm, minyak atsiri cengkeh 14,784 mm dan minyak atsiri jintan hitam 11,944 mm. Ternyata yang paling tinggi zona hambat adalah minyak atsiri cengkeh terhadap Staphylococcus aureus.Uji ANNOVA one way (tabel 4) dapat dilihat bahwa P adalah 0,0001. Hal ini berarti, terdapat perbedaan yang bermakna (P < 0,05) diantara minyak atsiri bawang putih, cengkeh, jintan hitam, etanol 96% dan aquades . Untuk mengetahui perbedaan rata-rata zona hambat diantara masing-masing bahan coba dapat dilihat dari uji komparasi ganda (LSD).

Diagram 1. Hasil diameter zona hambat aquades, etanol 96%, minyak atisiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam

Uji Komparasi Ganda (LSD) menunjukkan semua kelompok perlakuan apabila dibandingkan satu sama lain mempunyai perbedaan yang bermakna karena nilai P adalah 0,0001 (Tabel 5). Hal ini terdapat perbedaan yang bermakna (P < 0,05) rata-rata zona hambat antar masing-masing kelompok perlakuan yaitu aquades, etanol 96%, minyak atisiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam. Hasil penelitian ini menunjukkan hipotesis diterima yaitu terdapat perbedaan zona hambat antara minyak atsiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam terhadap Staphylococcus aureus.

Tabel 5. Hasil uji komparasi ganda (LSD)

KelompokPerbandinganP

I

(Aquades)II (Etanol 96%)0,0001*

III (Bawang putih)

IV (Cengkeh)

V (Jintan hitam)

II

(Etanol 96%)I (Aquades)

III (Bawang putih)

IV (Cengkeh)

V (Jintan hitam)

III

(Bawang putih)I (Aquades)

II (Etanol 96%)

IV (Cengkeh)

V (Jintan hitam)

IV

(Cengkeh)I (Aquades)

II (Etanol 96%)

III (Bawang putih)

V (Jintan hitam)

V

(Jintan hitam)I (Aquades)

II (Etanol 96%)

III (Bawang putih)

IV (Cengkeh)

BAB 6

PEMBAHASAN

Penelitian yang dilakukan sediaan minyak atisiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam bertujuan untuk membuktikan adanya zona hambat terhadap Staphylococcus aureus dan memperlihatkan perbedaan daya hambat antara minyak atsiri bawang putih, minyak atsiri cengkeh dan minyak atsiri jintan hitam, sebagai kontrol adalah aquades dan etanol 96%. Dalam penelitian ini dilakukan uji sensitivitas dengan menggunakan teknik disc diffusion test. Perbedaan daya hambat bahan coba dilihat dari besarnya diameter zona hambat yang terbentuk disekitar disk berisi bahan coba yang diamati pada media Mueller Hinton Agar (MHA) yang telah diinokulasi oleh Staphylococcus aureus diisolasi dari stamp denture stomatitis. Pengukuran zona hambat dilakukan setelah 24 jam, media yang telah diisi minyak atsiri dikeluarkan dari inkubator kemudian diukur zona hambat dengan menggunakan kaliper digital dengan ketelitian 0,01 mm. Zona hambat merupakan daerah dimana terdapat zona bening disekeliling disk yang menunjukkan ada daya hambat antara bahan coba dari setiap kelompok perlakuan. Dalam penelitian ini pembuatan minyak atsiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam dilakukan dengan menggunakan metode penyulingan air dan uap. Metode ini lebih sering dilakukan karena cara pengaplikasian mudah untuk memperoleh minyak atsiri, lebih murah dan konstruksi alatnya sederhana.

Berdasarkan hasil penelitian,rata-rata zona hambat bahan coba aquades 0 mm, etanol 96% 13,894 mm, minyak atsiri bawang putih10,950 mm, cengkeh 14,784 mm dan jintan hitam 11,944 mm (Tabel 1). Hal ini menunjukkan hasil rata-rata zona hambat yang terbesar adalah bahan coba dari kelompok perlakuan IV yang mengandung minyak atsiri cengkeh yaitu 14,784 mm. Rata-rata zona hambat etanol 96% merupakan kontrol positif adalah 13,894 mm dan aqua sebagai kontrol negatif menunjukkan tidak terdapat zona hambat sama sekali. Dari hasil penelitian ini dapat dijelaskan Ho ditolak karena P < 0,05.

Dilihat dari hasil penelitian, bahan coba dari etanol 96%, minyak atsiri bawang putih, cengkeh dan jintan hitam mempunyai daya hambat terhadap Staphylococcus aureus dengan kemampuan yang berbeda. Zat aktif yang terdapat dalam bahan coba bawang putih, cengkeh dan jintan hitam masing-masing adalah allicin, eugenol dan thymoquinone bahan aktif ini ternyata dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus. Senyawa allicin merupakan senyawa aktif dalam minyak atisiri bawang putih yang mudah terurai menjadi sulfur dan mudah rusak pada suhu yang panas. Allicin menunjukkan aktivitas antibakteri dengan menghambat secara lengkap dan langsung dari sintesis RNA meskipun sebagian sintesis DNA dan protein juga dihambat. Ini menunjukkan bahwa RNA adalah target utama dari fungsi allicin. Perbedaan dalam struktur strain bakteri juga memainkan peran dalam kerentanan terhadap daya hambat dari minyak atsiri bawang putih. Membran sel Staphylococcus aureus mengandung lipid hanya 2% yang akan mempengaruhi permeabilitas terhadap minyak atsiri bawang putih.31 Penelitian Novita (2008) sediaan bawang putih dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus. Hasil penelitiannya menunjukkan rata-rata diameter zona hambat pada jus bawang putih 2gr/ml (15,19 mm) dan jus bawang putih 1gr/ml (8,62 mm). Sementara rata-rata diameter zona hambat bahan coba sediaan ekstrak bawang putih 2gr/ml adalah 6,44 mm dan pada sediaan 1 gr/ml ekstrak bawang putih tidak mununjukkan adanya zona hambat. Rata-rata diameter zona hambat minyak atsiri bawang putih adalah 10,95 mm. Ini menunjukkan terdapat perbedaan zona hambat antara minyak atsiri, jus dan ekstrak dari sediaan bawang putih. Jus bawang putih menunjukkan hasil rata-rata zona hambat yang tertinggi bila dibandingkan dengan jenis bahan sediaan yang lain. Hal ini mungkin disebabkan kandungan allicin yang berbeda dengan cara penyediaan yang berbeda karena allicin bersifat volatil dan merupakan senyawa yang kurang stabil, adanya pengaruh air panas, oksigen udara, dan lingkungan basa, mudah sekali terdekomposisi menjadi senyawa yang lain seperti dialil sulfida.7 Penelitian Syed Abdul Rahman (2010) minyak atsiri cengkeh adalah efektif terhadap Staphylococcus aureus karena efek antimikroba cengkeh oleh eugenol dan eugenol asetate yang terkandung dalam minyak tersebut.10 Menurut Babu (2011) mendapati minyak atsiri bawang putih dan cengkeh mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus dengan merusak langsung membran sel bakteri menyebabkan pengurangan sintesa protein sehingga terjadi gangguan pada fungsi sel bakteri selanjutnya mengalami lisis. Selain itu, hasilnya juga memperlihatkan zona hambat cengkeh menunjukkan diameter yang lebih besar yaitu 25,00 mm bila dibandingkan dengan zona hambat minyak atsiri bawang putih yaitu 19,00 mm. Hal ini menunjukkan cengkeh mempunyai daya hambat yang lebih tinggi dari bawang putih terhadap Staphylococcus aureus. Dari penelitian penulis menunjukkan rata-rata diameter zona hambat minyak atsiri bawang putih adalah 10,95 mm dan rata-rata diameter zona hambat minyak atsiri cengkeh 14,78 mm. Hal ini mungkin disebabkan karena cara penyediaan minyak atsiri yang berbeda. Cara penyediaan minyak atsiri yang berbeda boleh menyebabkan jumlah kandungan bahan aktif minyak atsiri berbeda. Penelitian Babu menunjukkan zona hambat yang lebih tinggi dari penelitian penulis karena Babu menggunakan minyak atsiri dari pabrik sedangkan penelitian penulis mempergunakan bahan coba dan alat serdahana.11Sahabat Saeed (2008) dalam penelitiannya menyatakan, minyak cengkeh ditemukan aktif terhadap bakteri gram positif foodborne yang ditularkan melalui makanan contohnya Staphylococcus aureus dan bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli. Selanjutnya, bahan aktif cengkeh (eugenol) memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mutans, Candida albicans, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Selain eugenol terdapat bahan aktif lain yang terkandung dalam minyak atsiri cengkeh yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri seperti biflorin, kaempferol, rhamnocitrin, myricetin, gallic acid, ellagic acid dan oleanoic acid.32

Hasil Penelitian Mashadian (2005) menunjukkan bahwa ekstrak jintan hitam memiliki antimikroba yang aktif terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus juga menunjukkan efek anticestodal dan antiinflamatory.33 Penelitian Zuridah (2008) minyak atsiri jintan hitam mempunyai daya hambat terhadap beberapa bakteri seperti Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa. Rata-rata daya hambat Staphylococcus aureus mencatatkan nilai tertinggi dibandingkan dengan bakteri gram negatif yang lain yaitu 25,00 mm dan yang paling rendah daya hambat adalah Escherichia coli yaitu 10,00 mm.34 Menurut Mohd Tariq Salman (2008) thymoquinone merupakan bahan aktif dalam minyak atsiri jintan hitam menunjukkan daya hambat yang signifikan dari pertumbuhan berbagai jenis bakteri. Thymoquinone menghambat sumber radikal bebas, dan diketahui mempunyai asam amino nukleofilik yang terdapat di dalam protein akan menyebabkan inaktivasi protein serta hilangnya fungsi sel. Gangguan metabolisme bakteri menyebabkan kebutuhan energi tidak tercukupi sehingga mengakibatkan rusaknya sel bakteri secara permanen, selanjutnya sel bakteri lisis.12Berdasarkan hasil uji Anova (Tabel 1) yang diperoleh terdapat perbedaan bermakna (P