Doktori (Ph.D.) értekezés

A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel

Készítette Tamásné Nyitrai Erzsébet Cecília

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola

Dr.Erdei Anna

Kísérletes növénybiológia PhD program Dr. Szigeti Zoltán

Témavezetı Dr. Bedı Zoltán, akadémikus

igazgató MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár

MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár 2009

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS........................................................................................................................1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ...............................................................................................2 2.1 A búza jellemzése ................................................................................................................2

2.1.1 A búza eredete és fontossága ......................................................................................2 2.1.2 Mag- és szemtermések fehérjéi, különös tekintettel a búza tartalékfehérjéire ...........2 2.1.3 A búza tartalékfehérje összetétel és a minıség kapcsolata.........................................9 2.1.4. Tészta- és lisztminısítésre alkalmas módszerek......................................................14

2.2 Az amarantusz jellemzése..................................................................................................15 2.2.1 Az amarantusz tartalékfehérjék csoportosítása és frakcionálásuk ............................15 2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele..............................................20 2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése.............................................................................21

2.3 A táplálkozástani minıség javításának lehetıségei ...........................................................22 2.3.1 Táplálkozástani minıség javítása hagyományos nemesítéssel .................................23 2.3.2 Táplálkozástani minıség javítása géntechnológiai módszerrel ................................26

2.4 A búza genetikai módosítása .............................................................................................31 2.4.1 A növényregeneráció és az azt befolyásoló tényezık hatása a transzformációra.....32 2.4.2 A búza transzformációja ...........................................................................................35

3. CÉLKIT ŐZÉSEK ..............................................................................................................42 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .........................................................................................43 4.1 Növényregenerációs kísérletek ..........................................................................................43

4.1.1 Növényi anyagok ......................................................................................................43 4.1.2 Éretlen embriók szövettenyésztése ...........................................................................43 4.1.3 Statisztikai elemzés...................................................................................................44

4.2 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................44 4.2.1 Növényi anyagok ......................................................................................................44 4.2.2 Növényi szövet elıkészítése bombázáshoz ..............................................................44 4.2.3 Transzgénikus növények elıállítása .........................................................................45

4.3 A transzgénikus jelölt növények nukleinsav szintő vizsgálatai.........................................47 4.3.1 Genomi DNS izolálása..............................................................................................47 4.3.2 PCR-reakció..............................................................................................................47 4.3.3 Southern-blot analízis ...............................................................................................48 4.3.4 RT-PCR reakció........................................................................................................49

4.4 A transzgénikus növények fehérje szintő vizsgálatai ........................................................50 4.4.1 A marker/riporter gének aktivitásának tesztelése .....................................................50 4.4.2 A transzgén (ama1) expresszió igazolása Western-blot analízissel .........................51 4.4.3 A szemtermés fizikai vizsgálatai ..............................................................................52 4.4.4 Liszt vizsgálatok .......................................................................................................52 4.4.5 A búzalisztbıl készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata ....................54

5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ............................................................................56 5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz..............................56

5.1.1 A hajtásregeneráló táptalaj összetétel hatása a növényregenerációra.......................57 5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra ............59 5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra ..............................62 5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj

összetétel együttes hatása a növényregenerációra ....................................................64 5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz .......................66 5.3 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................69

5.3.1 Transzgénikus búzanövények elıállítása és tesztelése .............................................69

5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása.................................................................75 5.3.3 Transzgénikus búza lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele .........77 5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analzíse ....................................................85 5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai ............................88

6. ÖSSZEFOGLALÁS...........................................................................................................96 7. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................102 8. FÜGGELÉK .....................................................................................................................122

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BAP - benzil-amino-purin

BD - tésztaellágyulás (Resistance Break Down)

CTAB – cetil-trimetil-ammónium-bromid

Cys - cisztein aminosav

DDT – maximális tésztaellenállásig eltelt idı, dagasztási idıszükséglet (Dough Development

Time)

DTT – ditiotreitol

GUS - glükuronidáz enzim

HMW -GS - nagy molekulatömegő glutenin (High Molecular Weight Glutenin Subunit)

HPLC - nagy nyomású folyadék kromatográfia (High Pressure Liquid Chromatography)

IAA - indolecetsav

LMW -GS - kis molekulatömegő glutenin (Low Molecular Weight Glutenin Subunit)

Lys – lizin aminosav

NAA – naftilecetsav

PAT - foszfinotricin-acetiltranszferáz enzim

PCR - polimeráz láncreakció

RT-PCR - reverz transzkriptáz PCR

PPT - foszfinotricin

PR - maximális tésztaellenállás (Peak Resistance)

PVDF - polivinilidén-difluorid

RP-HPLC - fordított fázisú HPLC (Reverse Phase - HPLC)

SDS - Nátrium-dodecil-szulfát

SDS-PAGE - Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis

SE-HPLC - méretkizárásos HPLC (Size Exclusion- HPLC)

ST – a tészta stabilitása a mikro-Valorigráfon kapott görbén (Stability)

TCA - triklórecetsav

UPP% - oldhatatlan polimer fehérje frakció (Unextractable Polymer Protein)

VU – valorigráfos unit

1

1. BEVEZETÉS

A Föld népességének folyamatos növekedése olyan fenntartható, új mezıgazdasági

technológiai fejlesztéseket igényel, melyek lehetıvé teszik az évenkénti élelmiszer-elıállítás

közel 50%-os növekedését a következı 30-40 évben (OECD, 2000).

Az emberi és az állati táplálkozásban ısidıktıl fogva a gabonafélék nagy szerepet játszanak.

Ma is az emberiség mintegy 50%-ának biztosítja a kalória igényét, míg 45%-ának a fı fehérje

forrását. A gabonafélék szemtermésének úgynevezett tartalékfehérjéi, melyek az

endospermiumban raktározódnak, az összes fehérjének több mint felét teszik ki.

Táplálkozástani értéküket a bennük lévı esszenciális aminosavak nem megfelelı mennyisége

és aránya korlátozza. Az esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo

nem szintetizálódnak, így a táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló

mennyiségben van jelen, a többi is csak ennek arányában szívódik fel, s a maradék kiürül a

szervezetbıl. Emiatt az állati takarmányok táplálkozástani értékét olyan fehérjék, ill. adalékok

bekeverésével javítják, mely a limitáló esszenciális aminosavakat (fıként lizin) a szokásosnál

nagyobb arányban tartalmazzák. Ez a fehérje azonban vagy nagyon drága, vagy nem áll

megfelelı mennyiségben rendelkezésre. A gabonafélék táplálkozástani értékének javítását

több módon érhetı el: hagyományos nemesítéssel (szelekció), molekuláris nemesítéssel

(mutagenézis vagy molekuláris markerezés segítette nemesítés) és géntechnológiai úton. A

kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság csoport megjelenítésére a gabonafélék

szemtermésében az egyik lehetséges megközelítés a transzgénikus módszert is alkalmazó

nemesítés.

A búzanövény (Triticum aestivum L.) minıségét meghatározó tulajdonságok célzott módon

történı megváltoztatásáról elıször Vasil és mtsai. (1992) számoltak be. A genetikai

transzformáció elınye, hogy a kiválasztott gén/gének bejuttatása az egyedek sejtmagjába a

gének által hordozott információ hozzáadódását jelenti a genetikai információ halmazhoz, ami

lehetıvé teszi a „szülı” kiváló tulajdonságainak megtartása mellett egy specifikus gén által

kódolt új, egy adott felhasználási szempontból jobb tulajdonság beépítését. Munkánkban a

búza táplálkozástani értékének javításához az amarantusz (Amaranthus hypochondriacus)

egyik tartalékfehérje génjét (megfelelı szabályozó genetikai elemekkel kiegészítve)

biolisztikus módszerrel jutattuk be a búza genetikai állományába, melyrıl fehérje csak az

endospermium szövetben expresszálódott.

2

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1 A búza jellemzése

2.1.1 A búza eredete és fontossága

A búza az emberiség legfontosabb kultúrnövénye. Egyszikő kalászos gabonanövény, mely a

számos termesztett fajt tartalmazó pázsitfőfélék (Poaceae (Gramineae)) családjának Triticeae

nemzetségébe tartozik. A búzafajok lehetnek di-, tetra- és hexaploidok (Feldman és mtsai.,

1995). A termesztett búza kialakulásának elsı lépése a diploid Triticum urartu (Au genom) és

a diploid Aegilops speltoides (B genom) spontán keresztezıdése volt valószínőleg több tízezer

évvel ezelıtt a Közép Keleten (Vasil, 2007). A létrejött vad emmer búza, a T turgidum ssp.

dicoccoides már tetraploid (2n = 4x = 28, AABB). A további hibridizációk és domesztikáció

során jöttek létre a termesztett emmer (T. turgidum ssp. dicoccon) és a durum búzák (T.

turgidum ssp. durum) korai formáia. Az allohexaploid kenyérbúza (Triticum aestivum L.) (2n

= 6x = 42, AABBDD) az emmer búza és az Aegilops tauschii (2n = 2x = 14, DD)

keresztezıdése során alakult ki a Kaszpi síkságon i.e. 8000 körül (Vasil, 2007). A három

homeológ genom mindegyike hét pár kromoszómát tartalmaz.

Legnagyobb mennyiségben ma is a kenyérbúzát („közönséges” búza) (Triticum aestivum L.)

termesztik, mert valamennyi gabonaféle között egyedülálló abban a tulajdonságában, hogy

lisztjének fehérjéi sikérképzésre alkalmasak. Ennek következtében ırleményébıl laza

állományú, könnyen emészthetı sütıipari termékek készíthetık (Gianibelli és mtsai., 2001).

Lisztjének tészta-kialakítási képessége miatt a búza az emberi táplálkozás egyik legfontosabb

fehérjeforrása.

2.1.2 Mag- és szemtermések fehérjéi, különös tekintettel a búza tartalékfehérjéire

2.1.2.1 A mag- és szemtermések fehérjéi csoportosítása

A mag- és szemtermések jelentıs gazdasági és táplálkozásbeli szerepét a bennük felhalmozott

nagy mennyiségő tartalék tápanyagok (fehérjék, keményítı és lipidek) adják. A terméseket és

annak egyes részeit az ipar is sokféleképpen hasznosítja, mert a bennük lévı sajátos

tulajdonságú fehérjék a különbözı magvak és szemek tömegének akár 40%-át is kiteszik. A

magfehérjék tudományos vizsgálata a XVIII. század végén kezdıdött, és fıleg a fehérjék

oldhatóság szerinti osztályozását jelentette. Az elsı, mai tudományos igényeknek is

megfelelı, szisztematikus jellemzést T.B. Osborne végezte, s eredményeit 1924-ben

3

publikálta elıször. Nevezéktana a növényi fehérjéket négy csoportba sorolja: albuminok,

globulinok, prolaminok és glutelinek.

Az albumin fehérjék vízben oldódnak és hı hatására koagulálódnak. A fıleg kétszikő

növényekre jellemzı tartalékfehérjék szedimentációs állandója 2S, és többnyire a 11-12S

globulinokkal együtt fordulnak elı. Albumin fehérjék egyszikő növényekben, így

gabonafélékben is találhatók. A 2S albumin fehérjék fontos képviselıi az árpa és búza

hidrolitikus enzimeinek inhibitorai (α–amiláz vagy tripszin inhibitorok, szerin proteázok). Az

α–amiláz inhibitor fehérjék a teljes albuminfrakció kétharmadát teszik ki a búzában (Wrigley

és Bietz, 1988). Fıként, ha nem kizárólag, a keményítıben gazdag endospermiumban

találhatók (Altpeter és mtsai., 1999). A durum búza α–amiláz inhibitorai a glutén fehérjéihez

hidrofób kötéssel kapcsolódnak, s befolyásolják a belıle készült tészta kialakulását és annak

tulajdonságait. A búza és kukorica nem specifikus lipid transzfer fehérjéi tipikus 2S albumin

szerkezetőek (Pons és mtsai., 2003; Boutrot és mtsai., 2005). A búza „HMW és LMW

albumin”-jai polimerizációra képes β–amiláz fehérjék, melyek oldhatatlan, enzimatikusan

aktív komplexek (Rothfus és Kennel, 1970). Az enzimet három méretben azonosították (60,

63 és 65 kDa). A fehérjék monomer, vagy diszulfid híddal összekötött polimer formában

vannak jelen az endospermiumban (Gupta és mtsai., 1991a). Kimutattak diszulfid hidat β–

amiláz és LMW glutenin alegységek között is (Perutto és mtsai., 1996). Az „HMW- és LMW

albuminok” mennyiségét a termesztés körülményei (pl. kén hozzáférhetıség) erısen

befolyásolják (McRitchie és Gupta, 1993).

A híg vizes sóoldatban oldható globulin fehérjék fıleg a kétszikő növények magvaiban

találhatók, de mennyiségük számottevı a rizs és a zab szemtermésében is. A többi

gabonafélében nem jelentıs komponensek. Az endospermium fehérjetartalmának kb. 5%-át

adják (Singh és mtsai., 1991). Az érett búzaszemben 7S és a 11S globulinok találhatók,

melyek központi régiója β–hordó formájú, s hozzá két kevésbé konzervált szekvencia

motívum kapcsolódik (Dunwell és mtsai., 2004). A búza, az árpa és a zab 7S globulinjai

fıként az embrió és az aleuronréteg fı tartalékfehérjéi, a búza endospermiumban nincs 7S

globulin fehérje (Burgess és Shewry, 1986). A búza egyik 60 kDa endospermium fehérjéje

keresztreakciót adott a zab 11S globulin antitestjével. A fehérje redukáló szer jelenlétében 40

és 20 kDa polipeptidekre disszociált. A késıbb jellemzett triticin alegységek (legumin-típusú

búzafehérjék) diszulfid hidakkal dimereket, tetramereket és egyéb oligomereket alkotnak, s a

búza endospermium fehérje mátrixában elkülönült fázisban találhatók (Bechtel és mtsai.,

1991). A fehérjék repetitív régiója lizinben viszonylag gazdag (3 mol%).

4

A vizes alkoholban (50-70%) oldható prolamin fehérjék a gabonafélék legfontosabb és

legnagyobb mennyiségben lévı raktározott fehérjéi, bár a rizsben és a zabban csak kis

mennyiségben fordulnak elı. A búza prolamin fehérjéi a gliadinok, mely fehérjék legfeljebb

intramolekuláris diszulfid hidakkal rendelkeznek.

Az extrahálás után visszamaradó, semleges oldatban nem, de gyenge sav- és lúgban oldódó

fehérjék frakciója a glutelinek csoportja. E fehérjék neve búzában gluteninek. A frakció

fehérjéi összetételüket és szerkezetüket tekintve a prolaminok közé sorolhatók (Shewry és

mtsai., 1999). A glutenin fehérjék polimerizálódásra képesek, oldhatóságukat az

intermolekuláris diszulfid hidak (S-S típusú kötések) révén kialakuló polimer mérete

korlátozza. Redukció után (alegységekre bontás) oldatba vihetık vizes alkohollal (etanol és

propanol). A felszabaduló alegységek mobilitásuk alapján (SDS-poliakrilamid

gélelektroforézis) két csoportba sorolhatók: nagy molekulatömegő (HMW-GS) és kis

molekulatömegő (LMW-GS) glutenin alegységfehérjék. A búza prolamin típusú (gliadin és

glutenin) tartalékfehérjéit részletesen külön fejezetben tárgyaljuk (2.1.2.2 fejezet).

A különbözı polipeptidek alkotta Osborne frakciók átfedést mutatnak az oldhatóságban,

emiatt a magfehérjék modern besorolásának kritériuma ma már a fehérjék növényben

betöltött funkciója és szerkezete, valamint aminosav összetétele.

A tartalékfehérjék a legtöbb növénynél a szaporítószervekben halmozódnak fel, de kisebb

mennyiségben a vegetatív részekben is raktározódnak. Funkciójuk a nitrogén és kén atomok,

valamint szénvázak biztosítása a csíranövény számára. A gabonafélék legfontosabb és

legnagyobb mennyiségben reprezentált tartalékfehérjéi a prolaminok, míg a kétszikőek

tartalékfehérjéi az albuminok és globulinok. A gabonafélék szemtermésében a raktározott-

vagy tartalékfehérjék a szem összes fehérjéinek közel háromnegyedét teszik ki, s az

endospermiumban találhatók. A Triticeae nemzetségbe tartozó árpa, búza és rozs rokonságát

kiválóan demonstrálják tartalékfehérjéik, melyek különbözı típusai nagyfokú hasonlóságot

mutatnak egymás között (Shewry és mtsai., 1995). Specifikus biológiai aktivitásuk eddig nem

ismert. A búza tartalékfehérjéit külön fejezetben ismertetjük (2.1.2.2).

A nagyon eltérı tulajdonságú szerkezeti és metabolikus fehérjék minden Osborne

frakcióban megtalálhatók kis mennyiségben (teljes fehérjére vonatkoztatva). Minıségükben

nagyon fontos, az egyedfejlıdésben elengedhetetlen funkciójú molekulák. A gabonák

albumin és globulin frakciói a lizin fı forrásai. Az árpa lizinben gazdag β-amiláz enzime nem

csupán csírázáskor fontos, de nagy szerepet játszik, mint tartalékfehérje is.

A védı fehérjék a mag- és szemtermések fontos, nagy mennyiségben lévı fehérjéi, hiszen a

termések nem csupán az ember és az állatok számára jelentenek fontos táplálékot, hanem a

5

kórokozóknak és a rágcsálóknak is. Némelyiküket rezisztens fehérjének (PR, Pathogenesis

Related) hívják, noha legtöbbjük biológiai aktivitását még in vivo nem igazolták. Van köztük

olyan is, mely tartalékfehérje szerepet is betölt, mint pl. az árpa szerpin-típusú proteináz

inhibitora (protein Z).

2.1.2.2 A búza tartalékfehérjéi és másodlagos szerkezetük

A búzaliszt felhasználása szempontjából az endospermium fehérjéi a legfontosabbak, amit az

is alátámaszt, hogy a búza tartalékfehérjéit már 1745-ben tanulmányozták (Beccari). A

modern búzafajták többsége prolamin fehérje összetételükre nézve egységes és fajtára

jellemzı, de a tájfajták, mint például a régi magyar búzafajták (pl. a Bánkúti 1201), erıs

variabilitást mutatnak (Bedı és mtsai., 1995). A fehérje összetétel mind kvalitatív, mind

kvantitatív aspektusai a genetikai determináltságon felül a környezeti, élettani és agronómiai

hatásoknak is függvénye. A kenyérbúzában kétdimenziós gélelektroforézis módszerrel több

száz tartalékfehérje különböztethetı meg, de az egyes búzafajták prolamin fehérjéinek száma

eltérı. Hagyományosan (oldhatóság alkohol-víz elegyben) két azonos mennyiségben

megtalálható csoportba sorolhatók: oldható gliadin (monomer), és nem oldható glutenin

(polimer) fehérjék. Ma a nevük prolaminok (Shewry és mtsai., 1999), melyet nagy prolin és

glutamin aminosav tartalmuk miatt kaptak. A búza tartalékfehérjék többféleképpen

csoportosíthatók és csoportosították is az idık folyamán, de a legújabb, a molekulák

szerkezeti tulajdonságai alapján történı csoportosítás (monomer és polimerizációra képes

fehérjék) azt jelzi, hogy e fehérjék a búzalisztbıl készült tészta egyes funkcionális

tulajdonságainak kialakításában speciális szerepet töltenek be. A tartalékfehérjék kovalens és

nem kovalens kötéseken keresztül, a kenyértészta tulajdonságait elsısorban meghatározó,

nagyon bonyolult fehérje mátrixot hoznak létre (Hamer és van Vliet, 2000). A

viszkoelasztikus tulajdonságú kenyértészta két fontos reológiai jellemzıje a nyújthatóság és a

rugalmasság. A gliadin típusú fehérjéket a sikér nyújthatóságáért (Bushuk és Tkachuk, 1991),

míg a glutenin alegységfehérjéket elsısorban a sikér rugalmasságáért tartják felelısnek.

A kromatográfiás technika megjelenése, a genetikai vizsgálatok és a polipeptideket kódoló

gének megismerése új nomenklatúrához vezetett (Shewry és mtsai., 1999). Az aminosav

szekvencia és összetétel alapján a búza prolamin fehérjéit három osztályba sorolják: i) a

kéntartalmú aminosavakban szegény prolaminok, ii) a kéntartalmú aminosavakban gazdag és

iii) a nagy molekulatömegő (HMW) prolaminok csoportjába (2.3 táblázat). A csoportokon

belül további kisebb csoportok különböztethetık meg. Az „új” és a hagyományos (Osborne

féle) osztályozás között az oldhatóság és a polimerizációs hajlam szintjén van kapcsolat.

6

2.3 táblázat A búza tartalékfehérjék csoportosítása és nevezéktana Shewry és mtsai. (1999) szerint

A búza tartalékfehérjéi Osborne féle osztályozás

gliadinok gluteninek

funkcionális osztályozás

monomer prolaminok polimer prolaminok

ω-gliadin α/β-gliadin γ-gliadin LMW

glutenin HMW

glutenin

molekuláris osztályozás

kén-szegény prolamin

kén-gazdag prolamin HMW

prolamin A kén-szegény prolamin fehérjék a teljes prolamin frakció kb. 10%-át teszik ki. Régi nevük

ω-gliadin, molekulatömegük 30-80 kDa. A molekulák metionin aminosav tartalma kisebb,

mint 0,1%, cisztein aminosavakat kis számban, vagy egyáltalán nem tartalmaznak, így

általában monomerek. Lehetnek azonban fehérje polimerláncok terminátor molekulái is

(Masci és mtsai., 1993; Tamás és mtsai., 1998). Az egy cisztein aminosav tartalmú fehérjék

diszulfid híddal kapcsolódnak a glutenin polimerhez, emiatt az LMW glutenin

alegységfehérjék D csoportjába (is) sorolják (Masci és mtsai., 1993). Az ω-gliadin fehérjék

szerkezetét rövid N- és C-terminális szakasz által közrefogott nagy kiterjedéső, erısen

repetitív régió jellemez. Szokatlan másodlagos szerkezetét (laza spirál) béta-fordított-

fordulások (beta-reverse turns) és poli-L-prolin II (poly-L-proline II) hélixek keveréke adja

(Tatham és Shewry, 1995). A 70 nm hosszú molekula merev csavarmenetes spirál (worm-like

coil) (I’Anson és mtsai., 1992).

A kén-gazdag prolamin fehérjék a frakció fı komponensei (a teljes prolamin frakció 70-

80%-a). Molekuláikban 6-8 cisztein aminosav van molekulánként (2-3 mol%),

molekulatömegük 30-50 kDa. A csoportot a búza α/β- és γ-gliadinjai (monomerek), és a

polimerizálódásra képes LMW glutenin alegységfehérjék alkotják. Mindhárom csoport

fehérjéi hasonló aminosav szekvenciájúak, hosszú, nem repetitív C-terminális doménnel, és

rövid N-terminális repetitív doménnel rendelkezik. A C-terminális domén három hasonló

szekvenciájú régióra osztható (A, B és C régiók). A γ-típusú kén-gazdag prolaminok C-

terminális doménjében nyolc, konzervatív elhelyezkedéső SH csoport van, s csak

intramolekuláris diszulfid hidakat alakítanak ki (monomerek). A páratlan számú ciszteint

tartalmazó néhány kén-gazdag fehérje molekula szintén beépülhet a glutenin polimerbe

(Shewry és Tatham, 1997). Ezek a kötött γ-gliadinok képezik az LMW glutenin

alegységfehérjék C csoportját. Az α-típusú kén-gazdag prolamin fehérjék csak búzában

található meg. Legtöbbjük monomer, a C-terminális domén hat cisztein aminosava csak

7

molekulán belüli diszulfid hidakat hoz létre. A glutenin frakcióból izolált, egy ciszteinnel

rendelkezı fehérjék az LMW glutenin alegységfehérjék C csoportjába is sorolhatók.

A polimerizációra képes kén-gazdag prolamin fehérjék (LMW glutenin alegységfehérjék)

diszulfid hidakkal stabilizált polimereikbıl izolálhatók. Hat konzervált helyzető cisztein

aminosavuk intramolekuláris diszulfid hidakat képez, s a két (nagyon ritkán egy) extra

cisztein aminosav kovalens kötést alakít ki a molekulák között. A csoport fehérjéit további két

alcsoportba sorolják. Az egyikbe az LMWi, LMWm és LMWs fehérjék tartoznak, nevük a

fehérje elsı aminosavát jelzi (i, izoleucin, m, metionin, s, szerin). A másik csoport három

fehérjéje az α- és γ-gliadin fehérjékhez hasonló szekvenciájú (Gianibelli és mtsai., 2001).

A HMW prolamin fehérjék a teljes prolamin frakció 6-10%-át adják. Fıleg hatalmas

mérető, diszulfid hidak stabilizálta polimer molekulák. Molekulatömegük meghaladja a 20

millió Da-t (a természetben elıforduló legnagyobb fehérjemolekulák) (Wrigley, 1996). Régi

nevük HMW glutenin alegységfehérjék. Molekulatömegük és génjeik alapján az

alegységfehérjéket két típusba sorolják: nagyobb molekulatömegő (83-88 kDa) x-típusú, és

kisebb mérető (67-74 kDa) y-típusú alegységfehérjék (Payne és mtsai., 1984). A hexaploid

kenyérbúza fajták endospermiumában 3, 4, vagy 5 HMW glutenin alegységfehérje található.

A Dx, Dy és Bx alegységfehérjék minden búzafajtában jelen vannak, de az Ay

alegységfehérje nem két svéd búzafajta kivételével (Margiotta és mtsai., 1996). A tetraploid

búzában 1, 2, vagy 3 HMW glutenin alegységfehérje, míg a diploid búzákban egy, vagy két

alegységfehérje expresszálódik. Másodlagos szerkezetüket a molekula középsı részén egy

nagymérető, ismétlıdı aminosav szekvenciákat tartalmazó domén jellemzi, amit két rövid,

nem ismétlıdı szekvenciákból álló terminális régió fog közre. A fehérje molekulák méretbeli

változatosságát a központi repetitív domén eltérı hossza eredményezi. Minden alegység

repetitív doménje hat és kilenc aminosavból álló szekvencia egységeket tartalmaz, de az x-

típusú fehérjékben megfigyelték egy tripeptidbıl álló szakasz ismétlıdését is. A cisztein

aminosavak száma a búza HMW prolamin fehérjékben 4 és 7 között változik, egy részük

molekulán belüli, a többi molekulák közötti diszulfid kötés kialakításában vesz részt. A C-

terminálison egy cisztein aminosav van, de az N-terminális részben három (x-típusú HMW

fehérje) vagy öt (y-típusú HMW fehérje) cisztein aminosav található. Minden y-típusú

alegység repetitív régiója a C-terminális felıli végen tartalmaz egy cisztein aminosavat

(Anderson és mtsai., 1989), míg az 1Dx5 alegység repetitív régiójában az extra cisztein az N-

terminális felıli végen van. Az ismétlıdı szekvenciákat tartalmazó domén szabályos spirált

képez, aminek alapját béta-fordított-fordulások adják. A pálcika formájú szerkezet sokkal

szorosabb, mint a kén-szegény prolamin fehérjék repetitív régiójáé, mert poli-L-prolin

8

szerkezeti elemek nem szakítják meg. Az N- és C-terminális régiók konformációja α-hélixben

gazdag. A HMW prolamin fehérjék a legrészletesebben tanulmányozott és funkcionális

hatásukban értett fehérjék (Shewry és mtsai., 1995; Gras és mtsai., 2001; Wieser, 2007).

Viszonylag kis részarányuk ellenére szerepük rendkívül fontos, mivel a kenyértészta

rugalmasságát és ezen keresztül sütıipari minıségét befolyásolják. A polimer elmélet alapján

(Singh és McRitchie, 2001) az erısen polimerizált glutenin egy bonyolult polimer térháló,

melyben polimer-kémiai és reológiai viselkedés szempontjából is fontos szerep jut a lineáris

láncok „összegabalyodásának”.

2.1.2.3 A búzaszem anatómiai részei, fehérjetartalma és aminosav összetétele

Legfontosabb kenyérgabonánk szemtermése, a búzaszem anatómiailag három fı részbıl áll: a

liszttest (endospermium), a csíra (embrió) és a három rétegő héj, melynek legbelsı rétege az

aleuronréteg (Pomeranz, 1988). A búzaszem tömege legnagyobb részét az endospermium adja

(80-85%), míg az embrió a szem 2-3%-át teszi ki. A külsı héj alatt (2,5%) a maghéj található

(5-6%), s a keményítıben gazdag endospermiumot az aleuronréteg (7-9%) fedi be. A

búzaszem teljes fehérjetartalma 75%-a az endospermiumban, kb. 14%-a az aleuronrétegben,

kb. 7%-a az embrióban és kb. 4%-a a héjakban található (Shewry, 2007). Az endospermium,

melynek összetevıi a szemtermés ırlése és az ırlemény szitálása után a lisztben találhatók,

túlnyomórészt keményítıbıl áll (80-85%). Fehérjetartalma 8-15% között változik, amit a

búza genotípusa és a termesztés körülményei befolyásolnak.

A búzaszembıl ırölt különbözı malmi lisztfrakciók egymástól eltérı fehérjetartalmúak és

fehérje összetételőek a búzaszem egyes anatómiai részei eltérı fehérjetartalma és –összetétele

miatt. A keményítıben gazdag endospermium a búzaszem teljes fehérje mennyiségének

körülbelül háromnegyedét adja annak ellenére, hogy fehérje koncentrációja viszonylag

alacsony (Shewry, 2007). Az endospermium prolamin fehérjéi aminosav összetételét magas

glutamin (35,2%) és prolin (12,9%), valamint alacsony bázikus aminosav tartalom jellemzi

(arginin 3,6% és lizin 2,1%) (Jensen és Martens, 1983). Ezzel szemben mind az embrió, mind

az aleuronréteg fehérjéi kevés prolin és glutamin aminosavat tartalmaznak. Az

aleuronrétegben az arginin aminosav (11,1%), az embrióban az aszparagin aminosav (10,4%)

mennyisége viszonylag nagy (Jensen and Martens, 1983).

A búzaliszt egyes Osborne frakcióit alkotó fehérjék aminosav összetétele is eltér egymástól,

az eltérés fajtánként változik (Shewry és mtsai., 1999). Az albuminok és globulinok fehérjéi

jóval több lizin, aszparaginsav, treonin, alanin és valin aminosavat tartalmaznak, mint a

prolaminok gliadin és glutenin fehérje frakciói, de a glutaminsav és glutamin tartalmuk

9

kisebb. A globulin fehérjék prolin tartalma a legkisebb, míg a lizin tartalma a legmagasabb. A

búza endospermiumban raktározott prolamin fehérjéi nagy százalékban tartalmaznak prolin

és glutamin aminosavakat, innen kapták nevüket is. Mennyiségük 30-70 mol% között változik

az egyes molekulákban. E fehérjékben nagy koncentrációban találhatók glicin, fenilalanin,

tirozin és szerin aminosavak is. Töltéssel rendelkezı aminosavakban nagyon szegények, így a

molekulák töltése alacsony bármilyen pH érték mellett is. Általában az alacsony lizin,

triptofán, metionin, hisztidin és aszparagin aminosav tartalom is jellemzı.

2.1.2.4 A búza tartalékfehérjék szintézise

Klasszikus és molekuláris genetikai vizsgálatok alapján a búza prolamin típusú

tartalékfehérjéi az 1-es és 6-os homeológ kromoszóma csoport komplex lókuszain,

géncsaládokban kódoltak (Payne és mtsai., 1984). A tartalékfehérjék expressziója kontrollált

módon történik, koordinációja transzkripciós szinten valósul meg. Az mRNS-ek a növény

fejlıdésének adott szakaszában és specifikus szöveteiben jelennek meg. A fehérjék szintézise

térben és idıben jól meghatározott, amit szövetspecifikus promóter irányít. A szintézis

kizárólag csak a keményítıben gazdag endospermiumban játszódik le a megporzást követı

hatodik és harmincadik nap között (Grimwade és mtsai., 1996; Gupta és mtsai., 1996). A

tartalékfehérjék szekréciós fehérjék, melyek szignál peptiddel együtt szintetizálódnak, ami

segíti a fehérjék transzlokációját az endoplazmatikus retikulum (ER) lumenébe. A lumenben a

fehérje elveszíti a többnyire 20 aminosavból álló N-terminális végét, majd felveszi megfelelı

konformációját, s ezen a helyen történik a diszulfid hidak elsıdleges kialakulása is. A

megfelelı szerkezet kialakulása után minden prolamin fehérje molekula úgynevezett fehérje

testecskében raktározódik az endospermiumban (lásd Kermode és Bewley összefoglalója,

1999). A szem érése során a fehérje testek dezintegrálódnak. A közöttük lévı teret kitölti az

egyre nagyobb mennyiségő keményítı, a határmembránok szétszakadnak és az érett, száraz

szövetben egy folytonos fehérje mátrix alakul ki, melyben keményítı szemcsék „ülnek”.

2.1.3 A búza tartalékfehérje összetétel és a minıség kapcsolata

A búzalisztbıl dagasztott tészta különbözı végtermékek elıállítására való alkalmasságát

jellemzı minıség komplex fogalom, melyet a búzaszem fizikai- és kémiai tulajdonságai

együttesen határoznak meg. A táplálkozástani minıséget fıként az endospermiumban

található szénhidrátok, rostok, vitaminok, ásványi anyagok, valamint fehérjék mennyisége és

kémiai összetétele befolyásolja, míg a fehérjék táplálkozástani értékét az esszenciális

aminosav összetételük határozza meg (Shewry, 2007). (Lásd 2.3 fejezet).

10

A sütıipari termékek gyártása szempontjából a tészta minıségét a tartalékfehérje gének

expressziója során keletkezett fehérjék, azok szerkezete, valamint a fehérjék egymás közötti

és az egyéb komponensekkel (lipidekkel, szénhidrátokkal) kialakított kölcsönhatásai

befolyásolják (Bushuk, 1998; Shewry és mtsai., 1999). A búza tartalékfehérjéire jellemzı

egyedi tulajdonság, hogy víz és dagasztás hatására a hidratálódott fehérjékbıl egy stabil

térhálós szerkezet, a sikér alakul ki. A tészta kb. 10%-át kitevı sikér közel 80%-a (száraz

anyagra nézve) fehérje, a többi része fıként keményítıbıl és lipidekbıl áll. E molekulák is a

hidratált komplex szerves részét képezik. A lipidek és a lipid-fehérje komplexek meghatározó

szerepet játszanak a dagasztás, a kelesztés és a sütés során kialakuló gáz-víz és gáz-olaj

határfelületek stabilizálásában (Marion és Dubreil, 1998). A sikérmátrix szabályozza a

lipoprotein filmek által stabilizált gázbuborékok tágulását is. A viszkoelasztikus sikérmátrix

rugalmassága és nyújthatósága a fehérje összetételtıl függ, ami meghatározza a tészta

funkcionális tulajdonságait és a belıle készíthetı termékek minıségét. Lehetıvé teszi, hogy a

búza lisztjébıl kenyeret és különbözı lisztesipari terméket készíthessünk (Gianibelli és mtsai.,

2001). A sikér tartalékfehérjéi a szerkezet kialakításában két módon vesznek részt: a

polimerizálódásra képes molekulák (glutenin fehérjealegységek) diszulfid hidakon keresztül

óriás mérető polimereket hoznak létre; a monomer fehérje molekulák (gliadin) másodlagos

kötéseket (hidrogén hidak, hidrofób kölcsönhatások) alakítanak ki egymással és a fehérje

hálózat glutenin polimer molekuláival. Így funkcionális tulajdonságaik is eltérıek. A glutenin

fehérjék a tészta rugalmasságát, a gliadin fehérjék a tészta formálhatóságát és nyújthatóságát

biztosítják (Bushuk és Tkachuk, 1991).

A tészta minıségével, különbözı végtermékek elıállítására való felhasználhatóságával

kapcsolatos elırejelzéshez a búzaliszt funkcionális tulajdonságaival szoros összefüggést

mutató paramétereket határoznak meg: a liszt fehérjetartalma, polimer/monomer fehérje

arány, a HMW/LMW glutenin alegységfehérjék aránya, az x- és az y- típusú HMW glutenin

alegységfehérjék aránya és a polimer fehérjék méreteloszlása. Ezen paramétereket (a

fehérjetartalom kivételével) modern kromatográfiás technikákkal [méretkizárásos (SE) és

fordított fázisú (RP) nagy nyomású folyadék kromatográfia (HPLC)] határozzák meg. Az

egyes paraméterek változásának hatásait a tészta funkcionális tulajdonságaira tésztaminısítési

módszerekkel tanulmányozták (2.1.4 fejezet). A tartalékfehérjék szerkezete és funkciója

közötti összefüggések keresésében számos kutatócsoport vett részt. (McRitchie és mtsai.,

1987, 1991, 1993; Gupta és mtsai., 1989, 1992, 1994, 1995; Békés és mtsai., 1993, 1994a,b,

1995, 2000, 2003; Békés és Gras, 1994; Gupta és McRitchie, 1994; Uthayakumaran és mtsai.,

1997, 1998, 1999, 2000, 2001; Butow és mtsai., 2003a,b). Munkájukban in vivo (transzgé-

11

nikus búzafajták vizsgálata) és in vitro (rekonstrukció, addíció és inkorporáció) módszereket

használtak. Kezdetben a búza tartalékfehérje összetételét jellemzı paraméterek hatását a

tészta funkcionális tulajdonságaira búza populációk eltérı fehérjetartalmú és -összetételő

fajtáin vizsgálták (Gupta és mtsai., 1991b; Cornish, és mtsai., 1998). Statisztikai módszereket

is használva erıs pozitív korrelációt állapítottak meg a teljes fehérjetartalom, a glutenin

alegységfehérjék mennyisége és a belıle készített tészták tulajdonságai között. A HMW

glutenin alegységfehérjék kulcsszerepét a tésztaerısségre gyakorolt hatásukban Barro és

mtsai. (1997) in vivo kísérletekben (transzgénikus búzák tesztelése) is bizonyították.

Dagasztási kísérleteikkel egyértelmően igazolták a Glu1-Ax1 és a Glu1-Dx5 gének pozitív

hatását. A tészta erısség javulását a dagasztási idıszükséglet (DDT) és az úgynevezett

maximális dagasztási ellenállás (PR) növekedése jelezte. A legelsı in vitro módszert, az

úgynevezett rekonstrukciós vizsgálatot, amikor a liszt különbözı mérető tartalékfehérje

frakcióit izolálják, majd visszaadagolják a lisztbe a dagasztási kísérletek során, elıször

McRitchie (1987) alkalmazta. A módszert továbbfejlesztve szisztematikus adagolással (csak a

vizsgált paraméter változik, a többi állandó) a fehérjetartalom, valamint a tartalékfehérje

molekulák méretének és méreteloszlásának egymástól független hatását Uthayakumaran és

mtsai. (1999) tanulmányozták. Megállapították, hogy a fehérjetartalom emelése állandó

glutenin/gliadin fehérje arány (polimer/monomer arány, ami a molekulatömeg méreteloszlás

ill. fehérje méret jellemzıje is) fenntartása mellett bizonyos dagasztási paraméterek

növekedését eredményezi: dagasztási idıszükséglet, maximális dagasztási ellenállás,

nyújthatóság és cipótérfogat. Állandó fehérjetartalom mellett a glutenin/gliadin arány

növelése a dagasztási idıszükségletet, a maximális ellenállást és a cipótérfogatot növelte, de a

tészta nyújthatósága és az ellágyulás mértéke csökkent (Uthayakumaran és mtsai., 1999).

Azonos glutenin/gliadin arány esetében (változatlan fehérjetartalom mellett) a polimer frakció

HMW/LMW-GS aránya határozhatja meg szignifikánsan a tészta erısséget és nyújthatóságot

(Gupta és mtsai., 1989, 1995). Az alacsonyabb HMW/LMW alegységfehérje aránnyal

rendelkezı fajtákat vizsgálva már Lawrence és Shepherd (1980) is kisebb tésztaerısséget és

nagyobb nyújthatóságot figyelt meg. A fehérjealegység arány módosítása a tésztában az x- és

y-típusú HMW glutenin alegységek arányának szisztematikus változtatásával is lehetséges

(Butow és mtsai., 2003a), miközben fenntartható az azonos értékő fehérjetartalom,

glutenin/gliadin illetve HMW/LMW alegység arány. Az egyedi polipeptidek relatív aránya

szintén meghatározhatja a minıségi jellemzıket.

Az addíciós és inkorporációs elvő in vitro kísérletek, valamint az elmúlt néhány évben a

funkcionális tulajdonságok vizsgálatára kialakított új technikák lehetıvé tették kis

12

mennyiségő (5-10 mg) búza tartalékfehérje hatásának a vizsgálatát. Az egyes

fehérjék/polipeptidek izolálása búzalisztbıl idıigényes, nehézkes és sokszor nem valósítható

meg. Erre lehet megoldás a fehérjék búzafehérje-mentes rendszerben történı termeltetése (pl.

heterogén expresszió az E. coli-ban), mely megkönnyíti a fehérje tisztítást és izolálást (Tamás

és mtsai., 1998; Tamás és Shewry, 2006).

Az addíciós kísérletekkel bizonyították, többek között, a gliadin fehérjék abszolút

mennyisége és a glutenin/gliadin arány változtatásának pozitív hatását a tészta

nyújthatóságára (Wieser és mtsai., 1994; Schropp és Wieser, 1996, Uthayakumaran és mtsai.,

2001). Az egy gliadin fehérjének tulajdonított hatásban valószínőleg a többi gliadin vagy

LMW glutenin fehérjének is szerepe van. Ez magyarázhatja, hogy a gliadin fehérjék

arányának növelésével megemelkedett cipótérfogatot is tapasztaltak (Weegels és mtsai.,

1994), holott a liszthez adagolt gliadin fehérjék általában gyengébb és kevésbé stabil tésztát

eredményeznek (Fido és mtsai., 1997; Uthayakumaran és mtsai., 1999). Ezek a dagasztási idı

és a maximális rezisztencia csökkenésében illetve az ellágyulás mértéke és a nyújthatóság

növekedésében nyilvánultak meg. Uthayakumaran és mtsai. (2001) az egyes gliadin fehérje

molekulák nyújthatóságra gyakorolt hatását nem a molekulamérettel, hanem növekvı

hidrofóbicitásukkal (ω-, α/β- és γ-gliadin fehérjék) találták összefüggınek. Számos kutatás

bizonyítja, hogy az LMW glutenin alegységek is szignifikánsan összefüggésbe hozhatók a

kenyér és a durum búzalisztbıl készült tészta minıségével, elsısorban a stabilitásával és

nyújthatóságával (Gupta és mtsai., 1989, 1994; Ruiz és Carrillo, 1993; Sissons és mtsai.,

1998; Lee és mtsai., 1999a).

A tartalékfehérjék polimer hálózatba történı beépítése, a tésztára alkalmazott megfelelıen

beállított redukciós-oxidációs módszer (kémiai inkorporációs technika, Békés és mtsai.,

1994b) lehetıvé teszi, hogy a különbözı allél-variációk hatását kísérletekben is

tanulmányozzuk anélkül, hogy egyéb genetikai különbségek befolyásolnák azt. Az egyéni

HMW glutenin fehérjealegységek (pl. az 1Bx7 HMW-GS) inkorporációja jobb dagasztási

tulajdonságokkal rendelkezı erısebb tésztát eredményezett (nagyobb dagasztási idı és nagy

dagasztási ellenállás). Békés és mtsai. (1995) igazolták, hogy a Dx5, és/vagy Dy10

alegységfehérjék inkorporációja egy null–Glu-D1 típusú mutáns növény lisztjébe nagyobb

mértékben növelte a tészta erısségét, mint az azonos mennyiségő Dx2, és/vagy Dy12

fehérjék. A 2, 12, 5 és 10 HMW glutenin alegységfehérjék külön-külön történı

inkorporációjának hatása kisebb volt, mint az alegység párok esetében (2+12 vagy 5+10)

(Békés és mtsai., 1995). Inkorporációs vizsgálatokkal bizonyították az egyes HMW glutenin

alegységfehérjék nem csak minıségének, de mennyiségének funkcionális tulajdonságokra

13

gyakorolt fontosságát is (Schropp és mtsai., 1995; Schropp és Weiser, 1996; Sapirstein és Fu,

1996). Az inkorporációval beépített polipeptidek mérete is fontos paraméter. A nagyobb

mérető glutenin alegységfehérje nagyobb tészta kialakulási idıt eredményez (Veraverbeke és

mtsai., 1998; Tamás és mtsai., 2002). Nı a dagasztási idı értéke LMW-GS beépítésének

hatására is, bár a hatás kevésbe jelentıs, mint a HMW glutenin alegységfehérjék esetében

(Lee és mtsai., 1999a). Ha az LMW glutenin alegységfehérjéket egy, kettı vagy mindhárom

Glu-3-ban hiányos búzafajtákba inkorporálják, nı a tészta erısség, bár kisebb mértékben,

mint HMW alegységfehérjék hatására (Gupta és mtsai., 1995).

A búza sütıipari tulajdonságait in vivo olyan fajták létrehozásával javíthatjuk, melyek a

HMW-GS fehérjéket új kombinációban tartalmazzák, vagy az egyes gének nagyobb

kópiaszámban történı beépítésével növelhetjük a jó minıséghez kapcsolódó fehérjék

mennyiségét. A genetikai transzformáció lehetıvé teszi az élelmiszerek termelésében vagy

az ipari folyamatokban nem kedvezı fehérjék géncsendesítés általi kiütését (Maruta és mtsai.,

2001), de más fajtákból származó vagy mesterségesen szintetizált új gének is bejuttathatók a

búzába. Több munkacsoport sikeresen transzformált búzát HMW-GS alegységekkel (Altpeter

és mtsai., 1996a; Blechl és Anderson, 1996; Barro és mtsai., 1997; Alvarez és mtsai., 2000).

Barro és mtsai. (2003) az 1Dx5 és 1Ax1 HMW-GS fehérjék funkcionális tulajdonságokra

gyakorolt hatását vizsgálták transzgénikus búzában. Az 1Ax1 alegység transzgénikus

expresszáltatása szignifikánsan javította a sikér és a tészta sütıipari minıségét. Az 1Dx5

alegységfehérjét kódoló gén kópiaszámának és az expresszálódott fehérje mennyiségének

növelése a transzgénikus búzában olyan erıs tésztát adott, hogy annak dagasztása

hagyományos módon nem volt lehetséges (Barro és mtsai., 1997). A HMW 1Ax1 és az 1Dx5

alegység génekkel transzformált durum búza 2 g Mixográfos dagasztási vizsgálatai szerint az

alegységek expressziója erısebb és stabilabb tésztát eredményezett, bizonyítva, hogy a

transzformálás alkalmas a durum búza lisztjébıl készült tészta tulajdonságainak módosítására

(He és mtsai., 1999). León és mtsai. (2009) kereskedelmi forgalomban lévı búzafajtába

épített 1Ax1, 1Dx5 és 1Dy10 HMW-GS fehérje gének hatását vizsgálták a transzgénikus

búzalisztbıl készült tészta dagasztási- és funkcionális tulajdonságaira.

Számos kutatás bizonyítja, hogy LMW glutenin alegységfehérjék termeltetése transzgénikus

kenyér és a durum búzában is összefüggésbe hozhatók a kenyér és a durum búzalisztbıl

készült tészta minıségének változásával, elsısorban a stabilitásában és nyújthatóságában

(Masci és mtsai., 2003; Tosi és mtsai., 2004, 2005). Megállapították, hogy a jelölt LMW-GS

fehérjék beépülnek a sikérmátrixba, de kevésbé drasztikusan növelik a fehérje térháló méretét,

mint a HMW-GS alegység fehérjék beépítése (He és mtsai., 1999; Popineau és mtsai., 2001;

14

Vasil és mtsai., 2001). Emiatt hatásuk kevésbé erıteljes a tészta egyes dagasztási

paramétereire, s így lehetıvé teszi azok finomszabályozását.

2.1.4. Tészta- és lisztminısítésre alkalmas módszerek

A kenyérsütésre alkalmas lisztet a sikérmennyiség és –minıség, valamint a végtermék

minıségének vizsgálatával jellemezhetjük. A sikér minıségét közvetlen (reológiai

tulajdonságok mérése) és közvetett módszerekkel jellemezzük. A közvetett módszerek közül a

tészta-labdapróba (AACC Method 56-50) és a Zeleny szedimentációs teszt (AACC Method

56-61A) a legelterjedtebbek. A szedimentációs teszt a liszt poliszacharidjainak és fehérjéinek

duzzadási tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, amely többek között hatással

lehet a vizsgált genotípus lisztjébıl készült tészta erısségére és a várható kenyértérfogatra

(Halverson és Zeleny, 1988).

A reológiai sajátságok mérése a lisztbıl víz hozzáadásával készült tészta dagasztási

paramétereinek meghatározásával történik. A laboratóriumi dagasztók (mixerek) a dagasztás

során fellépı, a tészta kialakulása közben folyamatosan változó ellenállást regisztrálják.

Világviszonylatban kétféle mérési módszer van használatban, melyek alapvetıen a dagasztás

által közvetített energia mennyiségében, vagyis a dagasztás intenzitásában, illetve a dagasztó-

lapát kialításában különböznek egymástól. Az eredetileg magyar szabadalomként kidolgozott

z-karú laboratóriumi dagasztók (Farinográf és Valorigráf) mellett az álló és mozgó tőkkel

operáló Mixográf a két általánosan használt típus. A Farinográf és a Valorigráf két ellentétes

irányban és eltérı sebességgel forgó z-karból és a hozzátartozó csészébıl álló dagasztó

berendezések. A kirajzolt görbe (valorigram) tájékoztat a reológiai tulajdonságokban

bekövetkezett változásokról (F1 ábra).

2.1.4.1 A mikro-módszerek

A fajták nemesítési folyamatainak kezdeti szakasza, a genetikai módosítás lehetıségeinek

tanulmányozása, illetve a változások molekuláris szinten történı magyarázatához szükséges

vizsgálatok olyan kutatási területek, ahol a minta korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre.

A hagyományos mőszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékek, valamint mikro-

módszerek alkalmazása lehetıvé teszik, hogy néhány grammnyi liszt minıségi paramétereit,

illetve a paramétereknek néhány mg tisztított fehérjekomponens adagolása hatására

bekövetkezett változásait követni tudjuk (Békés és mtsai., 2003).

A mőszerek méretcsökkentés fejlesztésének eredménye volt a 10g-Farinográf, a 2g-Mixográf,

a mikro-Extenzográf, a mikro-Valorigráf, a mikro malom és a mikro-sütési eljárások, melyek

15

segítségével korábban nehézségekbe ütközı kísérletek is elvégezhetık (Békés és mtsai., 2000;

Gras és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai., 2004). A mikro-Valorigráffal (mikro z-arm mixer)

elért eredmények hasonlóak a hagyományos készülék eredményeihez (Tömösközi és mtsai.,

2000). A készülékkel felvett görbe (alapgörbe, 4.2 ábra) karakterisztikája megegyezik a

hagyományos valorigraméval.

2.2 Az amarantusz jellemzése

2.2.1 Az amarantusz tartalékfehérjék csoportosítása és frakcionálásuk

Az amarantusz (Amaranthus), amit amarant és amaránt néven is ismernek Magyarországon, a

disznóparéjfélék, Amaranthaceae családjába tartozik, s nincs közeli rokonságban a főfélékkel

(Gramineae). Ennek ellenére apró-szemcsés, pelyvás toktermése miatt gyakran pszeudo

cereáliának nevezik, és az egyéb gabonafélék közé sorolják. Tavaszi vetéső, gyors

növekedéső, nagy terméshozamú kétszikő növény ıshazája Peru és Mexikó. Már az inkák is

fogyasztották a mai növények ısét, erıt adó és az egészségre jótékony hatása miatt. Ma

három nemesített amarantusz fajt termelnek Északnyugat-, Közép- és Dél-Amerikában. Ezek

az Amaranthus (A.) caudatus, A. curentus és az A. hypochondriacus. Az A. hypochondriacus

(Piros disznóparéj vagy Hercegtoll) (2.1 ábra), fıleg Peru északnyugati és középsı régiójában

terjedt el, de az utóbbi évtizedekben komoly érdeklıdést mutatnak iránta Európában és

Ázsiában is.

2.1 ábra Az Amaranthus hypochondriacus növény (Piros disznóparéj vagy Hercegtoll) és pelyvás toktermése

Az amarantusz fajok fehérjetartalma (13-19% száraz magra vonatkoztatva) a gabonákéhoz

viszonyítva magas. Legalacsonyabb fehérjetartalmú az A. curentus (13,2-18,2%), míg az A.

caudatus 17,6-18,4% és az A. hypochondriacus 17,9% fehérjét tartalmaz. Kiegyensúlyozott

aminosav tartamú tartalékfehérjéik miatt potenciális fehérjeforrások lehetnek a fejlıdı

16

országok számára (Barba de la Rosa és mtsai., 1992; Marcone, 1999; Romero-Zepeda és

Paredes-López, 1996; Segura-Nieto és mtsai., 1994, 1999). Több szerzı a XXI. század

élelmiszer gabonájaként emlegeti (Lehman, 1996; Chaturvedi és mtsai., 1997; Guzmán-

Maldonadó és Paredes-López, 1998).

Tartalékfehérjéik ellentétben a búza tartalékfehérjéivel nem prolamin, hanem fıleg albumin

és globulin, valamint glutelin típusúak. Mindössze 0,9-2% prolamin fehérjét tartalmaznak

(Barba de la Rosa és mtsai., 1992). Fehérje összetételük vizsgálatakor többnyire hexánnal

zsírtalanított, zúzott magokból, alapvetıen kétféleképpen nyerik ki az albumin és globulin

fehérjéket. Az egyik eljárás elıbb vízzel az albumin, majd sóoldattal a globulin fehérjéket

oldja ki (Bressani és Garcia-Vela, 1990; Segura-Nieto és mtsai., 1992). A másik megoldás

szerint a két frakciót együtt extrahálják sóoldattal. Az oldatot ezután alacsony ionerısségő

oldattal vagy vízzel szemben dializálva a globulinok kicsapódnak, míg az albuminok oldatban

maradnak (Barba de la Rosa és mtsai., 1992; Soriano-Santos és mtsai., 1992). E két

frakcionálási módnak köszönhetıen egyes szerzık az Osborne féle albumin frakciót is

globulinnak hívják (pl. Segura-Nieto és mtsai., 1992 és 1994; Marcone, 1999; Shewry és

mtsai., 1999). A 2S globulin (régi nevén albumin) fehérje frakció a kétszikőekre jellemzı,

melyek fehérjéi legtöbbször heterodimer formában vannak jelen. A két polipeptidet diszulfid

híd(ak) köti(k) össze (Shewry és mtsai., 1999). A különbözı extrahálási eljárások majdnem

mindegyike szerint az albuminok és globulinok együttesen az amarantusz magok

fehérjetartalmának legnagyobb részét adják (39,5-82,0%) mindhárom amarantusz fajban. A

magfehérjék kevesebb, mint 20%-át a globulinok, a legnagyobb mennyiségét (20-65%) az

albuminok teszik ki (Segura-Nieto és mtsai., összefoglalója, 1999).

A magfehérjék többsége tartalékfehérje szerepet tölt be, azaz C-, N- és S- forrás a csírázó

növény számára (Fukiyama, 1991). Éppen ezért meglepı, hogy az amarantusz fajok

legnagyobb mennyiségben jelenlévı fehérjéi albumin típusúak, hiszen e fehérjék általában

biológiailag aktív fehérjék más növényekben (Higgins, 1984). Ennek egyik magyarázata

lehet, hogy néhány biológiailag aktív amarant albumin fehérje tartalékfehérje szerepet is

betölt hasonlóan a búza 2S albuminjaihoz (McRitchie és Gupta, 1993). Az amarant albumin

frakció polipeptidjei méretükben nagyon heterogének, legnagyobb mennyiségben a kismérető

komponensek vannak jelen. A fı tömeget az 1,4S-2S szedimentációs állandójú fehérjék adják

(4-9 kDa), de találtak 4,6S értékő fehérjéket is (Shewry és mtsai., 1999).

17

2.2.1.1 Az Amaranthus hypochondriacus tartalékfehérjéinek jellemzése

Segura-Nieto és mtsai. (1992, 1994) az A. hypochondriacus teljes kiırléső lisztjébıl az

albumin és globulin fehérjéket híg só oldattal extrahálták és kétdimenziós elektroforézis

módszerrel (SDS-PAGE) vizsgálták. A polipeptidek mind méretben, mind izoelektromos

pontjuk értékében nagyon eltérıek voltak, hasonlóan a pillangósok 7S és 11S globulinjaihoz.

Az elektroforetikus képet nem befolyásolta, hogy a mintákat zsírtalanították-e vagy sem. Az

elvégzett szedimentációs vizsgálatok alapján az A. hypochondriacus globulinjait három

frakcióra bontották: az 1,2-2S, a 8-10S és a 12,7-13S szedimentációs állandójú

globulinokra. A fı tömeget adó, alacsony szedimentációs értékő (1,2-2S) frakció az Osborne-

féle albumin frakció, mely megfelelhet a búza, a rozs és a borsó hasonló szedimentációs

értékő 2-3S albuminjainak (McRitchie és Gupta, 1993). Ezek a fehérjék glikozilációjukban és

antigén hatásukban hasonlóak a vicilinekhez (7-8S frakció) (Segura-Nieto és mtsai., 1999).

Még ma is tudományos bizonyításra vár, hogy ezek vajon valódi, kész fehérjék vagy csak

degradációs termékek. A három különbözı szedimentációs állandójú frakció (1,2-2S, 8-10S

és 12,7-13S) SDS-PAGE elemzésének eredményei alapján Segura-Nieto és mtsai. (1992 és

1994) a polipeptideket 5 csoportba sorolták. Az elsı csoporthoz az 50-75kDa tömegő, 7S-

típusú globulinok tartoznak, melyek létezését Marcone (1999) megerısítette. A másodikba és

a harmadikba a 11S-típusú globulinok savas (30-37,5 kDa) és bázikus (18-27,5 kDa)

alegységeit sorolták. A negyedik és az ötödik csoport az alacsony molekulatömegő

polipeptidek csoportjai (14-17 és 18-30 kDa). Ezek az ún. 1,4-1,9S és a 4,6S szedimentációs

állandójú frakciók, melyek megfelelnek a korábban néhány gabonafélében, ill. a borsóban és a

szójában 2-3S értékkel jellemzett frakcióknak (Shewry és mtsai., 1999). További vizsgálatok

szükségesek annak megállapítására, hogy a különbözı polipeptidek vajon mely gén termékei,

és melyik polipeptid ment keresztül poszt-transzlációs módosításon (proteolitikus érési

folyamat, glikoziláció) és melyik degradálódott.

Vasco-Méndez és Paredes-López (1995) az A. hypochondriacus (Mercado fajta) ırölt magjait

zsírtalanítás után az Osborne féle négy frakcióra választották szét a Barba de la Rosa és

mtsai. (1992) által módosított eljárás szerint. Az egyes frakciók fehérjetartalmát mikro-

Kjeldahl módszerrel mérték (5,85 fehérjefaktor). Legkisebb a mennyisége (7,2%) a prolamin

fehérjéknek, míg az albumin, globulin és glutelin fehérjék mennyisége nagyon közel esik

egymáshoz (28,2%, 21,9% és 29,2%). Az egyes frakciókat β-merkaptoetanollal (2-ME)

redukálva gélelektroforézis módszerrel vizsgálták. Eredményeik megerısítették korábbi

megfigyelésüket, mely szerint az amarantusz néhány glutelin alegység fehérjéje hasonlít sok

kétszikő és egyszikő növény (rizs és zab) globulin fehérjéihez. A globulin és glutelin fehérjék

18

további savas frakcionálása után immunológiai vizsgálatokkal is igazolták, hogy határozott

szerkezeti hasonlóság mutatkozik a két frakció fehérjéi között, valamint mindkét frakció

legumin-típusú fehérjéket tartalmaz. Utóbbit azzal magyarázták, hogy határozott

immunológiai affinitást mutattak a rizs (savas glutelin alegység) és a zab (globulin)

poliklonális antitestjeivel szemben. Kétdimenziós gélelektroforézissel azt is kimutatták, hogy

a 32 kDa glutelin sáv hat savas, különbözı izoelektromos ponttal jellemezhetı (pI 5,7-6,3)

fehérje alegység keveréke. Közülük négy keresztreakciót adott az amarantusz savas globulin

al-frakcióit kimutató antitestjével.

Romero-Zepeda és Paredes-López (1996) az A. hypochondriacus (Mercado fajta) zúzott

magjaiból nem csak a teljes globulinfrakciót nyerték ki, hanem annak egy részébıl szelektív

kicsapással izolálták az amarantint is. Az amarantin az A. hypochondriacus 11S

szedimentációs állandójú tartalékfehérjéje. Vizsgálataikban gélelektroforézis, gél filtrációs

kromatográfia és ultracentrifugás módszerek segítségével megállapították, hogy a kinyert

amarantin nagy tisztaságú. A globulin frakció a teljes fehérje 20,5%-át, míg az izolált

amarantin a 18,6%-át adta, így a globulinokat fıként az amarantin alkotja. Munkáikban

egyértelmő bizonyítást nyert az is, hogy az amarantin 389 kDa molekulatömegő és az erısen

konzervatív 11S-típusú globulin fehérjék szupercsaládjába tartozik, mely fehérjék

asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat tartalmazó alegységek

aggregátumai. Az aggregátumok létezését Segura-Nieto és mtsai. (1999) is megerısítették.

Chen és Paredes-López (1997) az A. hypochondriacus másik fajtájából (waxy fajta) két

különbözı ionerısségő extraháló szerrel az amarantin két heterogén formáját izolálták

(330 kDa és 400 kDa). SDS-PAGE analízissel kimutatták, hogy redukció elıtt a legfıbb sáv

az 50-52 kDa volt, míg redukció után két új sáv jelent meg (32-34 kDa és 22-24 kDa). Ez

tipikus jellemzıje a 11S globulinoknak, melyek egyetlen prekurzor molekulaként

szintetizálódnak, majd késıbb proteázok hasítják a 27-37 kDa savas alegységgé és a 20-24

kDa bázikus polipeptiddé, melyeket diszulfid híd (hidak) köt(nek) össze. A redukált

frakcióban is megjelenı 50-52 kDa molekulatömegő amarantin egy poszttranszlációs érési

folyamat alól ’megmenekült’ fehérje lehet (Barba de la Rosa és mtsai., 1996).

Egy 59,4 kDa rekombináns amarantin fehérjét Osuna-Castro és mtsai. (2000) E. coli

heterológ fehérjeszintetizáló rendszerben expresszáltattak. A munkájukhoz használt cDNS-t

Barba de la Rosa és mtsai. (1996) klónozták és jellemezték. A nagy mennyiségben

termeltetett fehérjét kromatográfiás módszerekkel tisztították, majd megállapították, hogy

elektromos-, felületi-, immunológiai-, biológiai- és funkcionális tulajdonságai hasonlóak a

natív fehérje tulajdonságaihoz. In vitro refolding vizsgálatokban igazolták a molekula helyes

19

konformációját is. További kísérletek szükségesek azonban ahhoz, hogy szisztematikusan

megváltoztatott szerkezető fehérjéket helyes másodlagos és harmadlagos szerkezettel képesek

legyenek heterológ rendszerben nagy mennyiségben elıállítani. Az így szerzett tudás

közelebb vihet a jó táplálkozástani értékő fehérjék transzgénikus növényekben való korrekt

termeltetéséhez. Az amarantin fehérje génjét rizs glutelin-1 promótere segítségével sikeresen

expresszáltatták transzgénikus kukoricában, ami fehérjetartalom növekedést (6-32%),

valamint esszenciális aminosav tartalom (lizin 18% és triptofán 22%) növekedést

eredményezett (Rascón-Cruz és mtsai., 2004) (lásd még 2.3.2.1/lizin fejezet).

Martínez és mtsai. (1997) az A. hypochondriacus kereskedelmi forgalomban lévı fajtájából

vízzel az albumin 1 frakciót, a maradékból foszfát-pufferrel pedig a globulin frakciót

extrahálták Konishi és mtsai. (1991) szerint. Az ırlemény maradékát tovább extrahálva

vízzel, majd abból a savas kicsapással nyert csapadékot vízben feloldva kapták az albumin 2

frakciót, míg híg vizes β-merkapto-etanolban oldva az albumin 2M frakciót. A frakciókat

elemezve megállapították, hogy az albumin 2 frakció egy erısen polimerizálódott polipeptid

komplex. Molekulatömege 300±10 kDa és diszulfid hidak stabilizálják. Fıként 52, 54 és 56

kDa alegységekbıl áll. Az 52 és 56 kDa alegységek két részre bonthatók (31-38 és 19-23

kDa), melyeket diszulfid hidak kötnek össze. Az 54 kDa alegység diszulfid hidakkal

összekapcsolt aggregátumot alkot a két kisebb résszel (31-38 és 19-23 kDa). A jellemzés

szerint úgy tőnik, hogy az albumin 2 szerkezetét tekintve olyan, mint a 11S globulinok vagy

más néven amarantin fehérje, csak tartalmaz egy extra 54 kDa polipeptidet, s hajlamosabb a

polimerizációra. Mivel ezt a polipeptidet csak a nagy molekulatömegő aggregátumban találták

meg, valószínősíthetı, hogy polimerizáció indukáló szerepe van az aggregátum képzésben. Ez

megerısíti Vasco-Méndez és Paredes-López (1995) eredményeit, miszerint nagyfokú

homológia van az amarantusz globulin és glutelin fehérjéi között és az amarantusz

tartalékfehérjék fıként globulin típusúak. A fehérjék a magon belül különbözı

aggregátumokban, különbözı konformációban vannak jelen, mely magyarázatot ad eltérı

oldhatóságukra és eltérı extrahálhatóságukra. Ezek alapján a szerzık a globulin fehérjéket

három csoportra osztották. Az elsı csoportba a 7S és a 11S globulinokat sorolják, míg további

két globulin csoportot alkotnak az erısen polimerizálódott globulin fehérjék (albumin 2) és az

amarant glutelin fehérjék. Mindez jó korrelációban van Fukuyima (1991) tartalékfehérje

csoportosítási módszerével, mely a fehérjéket kódoló gének szerkezetének hasonlóságán

alapul. További szekvencia elemzések és genetikai eredetvizsgálatok szükségesek azonban,

hogy egyértelmően jóváhagyható legyen az amarantusz tartalékfehérjék ilyen besorolása.

20

Az amarant tartalékfehérjéi asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat

tartalmazó alegységek aggregátumai, amiket nem csupán kémiai kötés (diszulfid hidak),

hanem gyenge, másodlagos kötıerık tartanak össze. Ezt az asszociációs/disszociációs

képességet különbözı savas és bázikus pH értékeken turbiditást mérı módszerekkel

vizsgálták (Segura-Nieto és mtsai., 1999). A pH változásának hatására megváltozott az egyes

fehérje alegységek felületi töltéseloszlása, izoelektromos pontja és hidrofóbicitása. Ez sokszor

az oligomerek disszociációját eredményezte monomerekre, azaz változás következett be a

harmadlagos szerkezetben is. Ennek következtében elképzelhetı, hogy a molekulák illetve

molekula aggregátumok/asszociátumok alakja nem mindig gömb, s ez meghamisítja a

gélfiltrációs molekulatömeg meghatározás eredményét. Valószínőleg ennek tulajdonítható,

hogy egymással nem korreláló molekulatömeg- és szedimentációs állandó értékeket kaptak az

egyes fehérjefrakciókra különbözı extraháló szerek használatakor például Martínez és mtsai.

(1997) is. A felületi töltésbeli különbségek miatti elektroforetikus mintázat megváltozását a

szója 7S globulinjainál is megfigyelték (Gorinstein és mtsai., 1999).

Az A. hypochondriacus 35 kDa molekulatömegő, albumin típusú fehérjével (AmA1)

kapcsolatos eddigi ismereteket a 2.2.3. fejezetben ismertetjük.

2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele

Az amarantusz növények magvai nem csupán jóval magasabb fehérjetartalmúak de

gazdagabbak esszenciális aminosavakban is. Az albumin és globulin fehérjék könnyen

emészthetı, nagy táplálkozástani értéket képviselnek, ugyanúgy, mint a maximum 20%-ot

kitevı híg lúgos oldatban oldódó glutelin fehérjék (Paredes-López és mtsai 1988). A

mindössze néhány százaléknyi prolamin frakció fehérjei esszenciális aminosavakban

szegények. Noha a magfehérje frakciók aminosav összetétele nagymértékben függ a globulin

frakció extrahálási körülményeitıl, minden vizsgálati módszer eredménye jelentıs mértékő

eltérést mutat a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetételétıl. Az A. hypochondriacus

magfehérjéi pl. több szerzı által bizonyítottan esszenciális aminosavakban gazdagok (Segura-

Nieto és mtsai., összefoglalója 1999). A zúzott magok lizin tartalma 3,7-7,6%, mely jóval

magasabb, mint ami gabonafélék szemtermésében található (pl. zab 2,8%, búza 2,8%) (Shoup

és mtsai., 1966). A kéntartalmú aminosavak mennyisége is nagyobb (3,1-7,1%), mint a

pillangósok magfehérjéié (1,3-2,8%) és a búzaszemé (1,2-2,3%). Arginin tartalmuk 9,2-

12,3%, mely általában a pillangósokra jellemzı (borsó 12,3%), míg a búzaliszté csak 2,9-

4,7% (Shoup és mtsai., 1966). A gabonákéhoz hasonló magas aszparaginsav/aszparagin és

glutaminsav/glutamin tartalom az amarant magfehérjék tartalékfehérje jellegét bizonyítja.

21

Argininben, lizinben és kén tartalmú aminosavakban gazdag fehérjéi miatt az amarantusz

növények magvai ígéretes forrásai nagy táplálkozástani értékő fehérje géneknek, melyek

felhasználhatók a géntechnológia úton történı nemesítésben.

2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése

Az A. hypochondriacus egyik albumin típusú tartalékfehérjéjének cDNS-ét Raina és Datta

(1992) klónozták. Az ama1 gén az AmA1 jelő, 35 kDa molekulatömegő fehérjét kódolja. A

polipeptid aminosav szekvenciáját (Függelék II. ábra) és az egyes aminosavak

molekulatömegét figyelembe véve, az AmA1 fehérje a WHO által is fontosnak tartott

esszenciális aminosavak közül 7,7% lizint, 7,0% tirozint és 5,4% treonint tartalmaz (2.2.1

táblázat), s ezért nagy táplálkozástani értéket képvisel. Mindemellett nagyon fontos

hangsúlyozni, hogy ez az albumin típusú fehérje, ellentétben a Brazil dió 2S albuminjával,

allergenitásra utaló aminosav szekvenciákat nem tartalmaz. A fehérje nem allergén voltát

egyértelmően bizonyítják a Chakraborty és mtsai. (2000) által végzett nagyérzékenységő

allergia teszt negatív eredményei, valamint az a tény, hogy az amarantuszok lisztjébıl

Mexikóban, Közép- és Dél-Amerikában évszázadok óta készítenek kovásztalan kenyeret, de

használják ıket élelmiszerek adalékaiként is minden negatív tünet nélkül.

2.2.1 táblázat Esszenciális aminosavak mennyisége az A. hypochondriacus mag teljes fehérje frakciójában, az AmA1 fehérjében és a WHO ajánlás (Raina és Datta, 1992).

1Az AmA1 fehérje aminosav összetételét a szerzık a szekvencia adatokból kalkulálták az adott aminosav molekulatömegének figyelembe vételével.

aminosav mennyiség, % aminosav

teljes fehérje 1AmA1 fehérje WHO ajánlás Trp

Met/Cys Thr Ile Val Lys

Phe/Tyr Leu

1,4 4,4 2,9 3,0 3,6 5,0 6,4 4,7

3,6 3,9 5,4 6,1 5,2 7,7

6,7/7,0 9,2

1,0 3,5 4,0 4,0 5,0 5,5 6,0 7,0

Az AmA1 fehérje négy izomer formában van jelen a magban. Az egyik izomerhez készített

antitest a másik hárommal is keresztreakciót adott. A legnagyobb (1,2kb) klón cDNS-e

egyetlen fı ORF-et tartalmaz, mely egy 304 aminosavból álló polipeptidet kódol. A klónt

hibridszelekciós transzlációval és immun-precipitációval azonosították. Az immun-precipitált

termék mérete megegyezett az érett fehérje méretével. A fejlıdı mag RNS és fehérje

22

vizsgálata azt mutatta, hogy az Ama1 fehérje szintézise a korai embriógenezisben kezdıdik és

mennyisége a félig érett magban éri el a maximumot. A gén expressziója mag specifikus, a

fehérje vagy annak RNS-e más növényi szövetben nem mutatható ki. Az érett mag még egy

év után is tartalmaz AmA1 mRNS-t, ugyan kissé csökkent mennyiségben. Csírázáskor az

AmA1 fehérje mennyisége nem azonnal csökken le nullára, de harmadik napra, amikor a mag

teljesen szétesik, a fehérje is eltőnik. A késleltetett lebomlás azt sugallja, hogy a fehérje a

citoszolban van és proteolitikus enzim szerepét is betöltheti. Higgins és mtsai. (1987)

borsóban találtak egy albumin típusú tartalékfehérjét, mely raktározási szerepe mellett

proteolitikus enzim funkciót is ellát, és mint ilyen a sejt szétesésének utolsó fázisáig nem

juthat ki a citoszolba. Ez a lokalizáció azonban nem zárja ki a magspecifitást, hiszen az csak a

gén mőködését szabályozó promóter és enhanszer elemek szekvenciájától függ.

Az A. hypochondriacus nagy táplálkozástani értékő AmA1 fehérjéjének génjét már elınyösen

használták géntechnológia úton történı nemesítésben (Chakraborty és mtsai., 2000).

(Részletes ismertetését lásd a 2.3.2.1 fejezetben.)

2.3 A táplálkozástani minıség javításának lehetıségei

A fejlett országok lakosságának tápláléka a gabonák mellett hüvelyesek magjaiból, húsból,

zöldségekbıl és gyümölcsökbıl is áll, s ez a változatos táplálkozás biztosítja a megfelelı

ásványi anyag- és fehérjeszükségletet. A fejlıdı országok lakossága számára azonban sokszor

egyetlen gabonaféle, a rizs vagy a kukorica, jelenti a fı fehérje- és energia bevitelt. Különösen

az ırölt gabona magvak nem csupán egyes aminosavakban (pl. lizinben), de A-vitaminban,

folsavban, vasban, cinkben és szelénben is szegények (Christou és Twyman, 2004). Így a

világ népességének kb. egyharmada szenved a fejlıdésüket meghatározó vitaminok,

nyomelemek és fehérjék hiányától. Ezért a gabona magvak fehérjetartalma és annak aminosav

összetétele különösen fontos számukra. Hasonlóan odafigyelést igényel a fehérjetartalom

(mennyiség és minıség) beállítása az állatok takarmányának elkészítésekor is, különösen a

gyors növekedéső szárnyasoknál és sertéseknél. (Shewry, 2007).

A táplálkozástani érték javításának nagyon sok módja ismert és alkalmazott a világban (Zhu

és mtsai., 2007).

A hagyományos nemesítés és különösen ennek együttes alkalmazása a molekuláris nemesítési

módszerekkel (pl. mutagenézis vagy molekuláris markerezés) fontos lehetıség a

táplálkozástani minıség javítására. A jó tulajdonságért felelıs fajták megkeresése és elınyös

23

tulajdonságaik beépítése elit fajtákba azonban hosszadalmas és csak a szülık

tulajdonságainak kombinálásával valósítható meg. A kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság

csoport megjelenítésére a gabonafélék szemtermésében ma az egyik lehetséges megközelítés

a transzgénikus módszert is alkalmazó nemesítés (Shewry és Jones, 2005).

2.3.1 Táplálkozástani minıség javítása hagyományos nemesítéssel

2.3.1.1 Szelekció magas fehérjetartalomra

A gabona magvak fehérjetartalma a termesztés körülményeitıl és a használt tápanyagoktól

függıen igen tág határok között változik. Száraz tömegre vonatkoztatva a rizs fehérjetartalma

5,8-7,7% (Champagne és mtsai., 2004), az árpáé 8-15% (Shewry, 1993), a kukoricáé 9-11%

(Zuber és Darrach, 1987).

Az elsı minıségjavítási lépéseket fajon belüli magas fehérjetartalmú fajták megkeresése

jelentette. A legelsı, évekig tartó szelekciós kísérletben Dudley és mtsai. (1974) több

kukoricafajta 70 generációját vizsgálva 4,4-26,6% fehérjetartalmú törzseket találtak. A

késıbbiekben a legtöbb kísérletet árpára és búzára végezték. Az árpa magfehérjéinek

genetikai hátterérıl Ullrich adott kiváló összefoglalót (2002).

Az USDA világra kiterjedı búzakollekciójában lévı 12600 búzatörzs fehérjetartalmát Vogel

és mtsai. (1978) 7-22% közöttinek találták. Vizsgálataik szerint a magas fehérjetartalomért

kb. egyharmad részben a genetikai háttér a felelıs. A két legmagasabb fehérjetartalmú, Atlas

66 és Nap Hal fajtát (17 és 18% teljes ırleményben) késıbb keresztezték egymással, de külön

is használták hagyományos nemesítésben jobb táplálkozástani minıség és agronómiai

tulajdonságok elérésére (Shewry, 2007). A késıbbiekben több búzafajtából izoláltak magas

fehérjetartalomért felelıs géneket, és alkalmazták a hagyományos nemesítésben (Olmos és

mtsai., 2003; Distelfeld és mtsai., 2004, 2006). A kísérletekben QTL és RFLP markerezési

módszereket használtak azonosítási célra. Uauy és mtsai. (2006) kimutatták, hogy a Gpc-B1

gén, ami egy transzkripciós faktort kódol, felgyorsítja az öregedést, és ezáltal nitrogént és

ásványokat (cink, vas) szállít a levélbıl a fejlıdı búzaszembe. Ez a gén kb. a genetikai

variációk 70%-ért felelıs. Fenti sikerek ellenére nagyon nehéz magas fehérjetartalomra

szelektálni, mert a valószínőleg többgénes befolyásoltság mellett erıs a környezeti hatás is. A

fı probléma azonban az, hogy növekvı fehérjetartalom mellett általában csökken a búza

terméshozama (Simmonds összefoglalója, 1995). Emiatt ez a módszer nem valószínő, hogy

sikeres lesz kereskedelmi forgalomban lévı búzák esetén.

24

2.3.1.2 Szelekció emelt esszenciális aminosav tartalomra

A gabonafélék esszenciális aminosav tartalma

A fehérjék táplálkozástani értékét az esszenciális aminosav összetételük határozza meg. Az

esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo nem szintetizálódnak, így a

táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló mennyiségben van jelen, a

többi sem szívódik fel és kiürül a szervezetbıl. Tíz szigorúan esszenciális aminosavat

ismerünk: lizin, izoleucin, leucin, fenilalanin, tirozin, treonin, triptofán, valin, hisztidin és

metionin. Sokszor a ciszteint is idesorolják, mert kizárólag csak metioninból szintetizálódik,

és azzal együtt biztosítja a szervezet kénigényét. A fenilalanin és a tirozin aromás karakterük

miatt fontosak. A növekedésben lévı gyermekek esszenciális aminosav igénye magasabb,

mint a felnıtteké. A gyorsabb növekedéső állatok tenyésztéséhez is több aminosav szükséges.

A különbözı gabonafélék esszenciális aminosav összetétele g aminosav/100g fehérje (%)

mértékegységgel kifejezve a 2.3.1 táblázatban látható.

2.3.1. táblázat A gabonafélék esszenciális aminosav összetétele (%) és a FAO ajánlás Búza árpa zab rozs rizs kukorica FAO ajánlás aminosav

szem Liszt szem dara szem dara liszt gyermek felnıtt His 2,3 2,2 2,3 2,2 2,2 2,4 2,7 2,6 1,6 Ile 3,7 3,6 3,7 3,9 3,5 3,8 3,6 4,6 1,3 Leu 6,8 6,7 7,0 7,4 6,2 8,2 12,5 9,3 1,9 Lys 2,8 2,2 3,5 4,2 3,4 3,7 2,7 6,6 1,6 Cys 2,3 2,5 2,3 1,6 1,9 1,6 1,6 Met 1,2 1,3 1,7 2,5 1,4 2,1 1,9

4,2 1,7

Phe 4,7 4,8 5,2 5,3 4,5 4,8 5,0 Tyr 1,7 1,5 2,9 3,1 1,9 2,5 3,8

7,2 1,9

Thr 2,9 2,6 3,6 3,3 3,3 3,4 3,7 4,3 0,9 Trp 1,1 1,1 1,9 - 1,1 1,3 0,6 1,7 0,5 Val 4,4 4,1 4,9 5,3 4,8 5,8 4,8 5,5 1,3

Forrás 1 1 2 3 4 4 4 5 5 1Az értékek Shoup és mtsai., által publikált adatok (1966) átlagai. A triptofán értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 2Az értékek Newman és McGuire (1985) által publikált adatok átlagai. 3Az értékek Robbins és mtsai. (1971) által publikált adatok átlagai. 4Az értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 5FAO/WHO/UNU (1985)

A limitáló aminosav minden gabonafélénél a lizin, mennyisége fajonként változik. Legtöbb a

zab- és a rizs darában található (4,2 és 3,7%), a legkevesebb a kukorica- és a búzalisztben (2,7

és 2,2%). A gabonafélék a többi aminosav tartalmukban is különböznek, de a kukorica

alacsony triptofán tartalma (0,6%) a legszembetőnıbb. A búza aminosav összetételét a teljes

szemre és az endospermiumból ırölt lisztre is megadják, hiszen ırléskor a magasabb

25

esszenciális aminosav tartalmú aleuron réteget és az embriót elveszítjük. A búzalisztben

különösen a lizin aminosav kevés (2,2%), míg a teljes szemre vonatkoztatva kis

mennyiségben jelenlévı aleuron réteg és az embrió lizin tartalma magas (4,8 és 8,3%) (Jensen

és Martens, 1983). A zab- és a rizsszemek endospermiumának legumin-típusú tartalékfehérje

frakciói több lizint tartalmaznak és így a teljes szemek is, mint a többi gabonaféle fıként

prolamin-típusú tartalékfehérjéi (Jensen és Martens, 1983). Mivel a gabonafélék prolamin

fehérjéire az alacsony esszenciális aminosav tartalom a jellemzı, a gabona magvak

táplálkozástani minısége a prolamin frakció arányának változtatásával módosítható (Shewry,

2007). Általánosan igaz, hogy a kisebb mérető gabonaszem (kisebb endospermium) magasabb

esszenciális aminosav tartalmú, de ez a liszt összetételét nem befolyásolja. Ha

nitrogéntartalmú mőtrágyázással növeljük a gabonaszem teljes N-tartalmát, az az

endospermium megnövekedett fehérjetartalmában, a prolamin típusú fehérjék mennyiségének

növekedésében fog megnyilvánulni. Emiatt a lizinben gazdag anatómiai részek aránya

csökken, s vele együtt a szem lizin tartalma és így táplálkozástani értéke is. Kirkman és mtsai.

(1982) árpánál, míg Mossé és Huet (1990) a legumin-típusú tartalékfehérjékkel rendelkezı

zabnál is igazolták ezt a feltevést. Így a gabonatermesztésben alkalmazott mőtrágyázás

mértéke egy kompromisszum eredménye a nagy terméshozam és a magas táplálkozástani

érték között (Shewry, 2007).

Szelekció emelt lizin tartalomra

A legelsı lizinben gazdag (69%-kal több lizin, mint átlagos szemben) természetes mutáns

gabonát, („opaque-2” kukorica) magas lisztkihozatalú törzsek elemzésekor találták meg

(Mertz és mtsai., 1964). Munck és mtsai. (1970) az árpaszemek festékmegkötı képességét

vizsgálták szelekciós munkájukban. Az emelt lizin tartalmú természetes mutáns kukoricát,

kölest és árpát, melyeket több ezer fajta közül válogattak ki, kémiai (etilin-imin, nátrium-azid,

etilmetán-szulfonát) és fizikai (gamma-sugárzás, gyors neutronok, forró neutronok)

mutagenézisnek vetették alá. Vizsgálataik szerint (Gibbon és Larkins, 2005) a mutációért

felelıs gének azonos módon fejtették ki hatásukat, azaz a magas lizin tartalom a lizinben

szegény prolamin frakció szintézisének visszaszorulásából, a lizinben gazdag fehérje frakciók

túltermelésébıl és a szabad lizin mennyiségének növekedésébıl adódott. Ez azonban negatív

hatással is járt. Mindhárom gabona mutáns utódai csökkent terméshozamúak voltak, sıt a

kukorica és kölesszemek puhábbak is lettek. A magas lizin tartalomért felelıs géneket

(opaque-2, hl, lys3a) még nem sikerült kereskedelmi forgalomban lévı kölesbe és árpába

hagyományos nemesítéssel bejuttatni (Oria és mtsai., 2000). Prasanna és mtsai. (2001) a

magas lizin tartalmú kukorica törzsek közül a normális endospermiummal rendelkezıket

26

választották ki. Megállapították, hogy ezek a törzsek a magas lizin tartalomért felelıs gén

(opaque-2) mellett a keményítı szintézisét szupresszáló, módosító (mo) gént is tartalmaznak,

s a normális endospermium textúrát ennek tulajdonították. Biokémiai vizsgálataik szerint

ebben a kukorica fajtában (Quality Protein Maize, Kiváló Fehérjeminıségő Kukorica) a 22

kDa molekulatömegő α-zein mennyisége lecsökkent, de megemelkedett a 27 kDa-os γ-zein

mennyisége. Ez a fehérje valószínőleg térhálót képez a keményítı granulátumok körül, s így

módosítja a keményítıben gazdag endospermium struktúráját (Dannenhoffer és mtsai., 1995).

A Kiváló Fehérjeminıségő Kukoricafajtát ma Latin Amerika, Afrika és Ázsia több

országában, valamint Ausztráliában emberi táplálékként és állati takarmányként is termesztik

(Prasanna és mtsai., 2001). Crow és Kermicle (2002) az USA-ban hasonló jó táplálkozástani

értékő opaque-2 kukorica fajtákat állítottak elı magas terméshozammal, de ezek kicsi

szemkeménységük miatt csak állati takarmánynak alkalmasak.

Szelekció emelt metionin tartalomra

A metionin bioszintézise aszparaginsavból indul ki, mint a lizin és treonin aminosavaké.

Utóbbiak a szintézis enzimeit negatív visszacsatolással szabályozzák (Galili, 1995), így a

kukoricaszemek lizin és treonin tartalmú táptalajon nem képesek csírázni. Phillips és mtsai.

(1981) a kor ismereteit meghaladva, 200 kukoricaszemet lizin és treonin tartalmú táptalajon

gyökereztettek. Az egyetlen túlélı növény magvai magas metionin tartalmúak, 30-70% δ-

zeint tartalmaztak. A fehérjében több mint, 20 mol% lizin volt, s felületéhez nagy mennyiségő

metionin aminosav kapcsolódott (Phillips és McClure, 1985). Hagyományos nemesítéssel

azonban e jó tulajdonságot nem tudták átvinni újabb fajtákba.

2.3.2 Táplálkozástani minıség javítása géntechnológiai módszerrel

Attól függıen, hogy szerves vagy szervetlen anyagban szeretnénk feldúsítani a növény

termését, más-más transzgénikus megközelítést szükséges választani. A szerves molekulákat

(aminosavak, zsírsavak és vitaminok) a növény képes szintetizálni, így azok anyagcsere

folyamatait kell befolyásolni. A szintézisút átalakításának három célja van: a növény által

termelt anyag szintézisének fokozása, a versengı molekula szintézisének visszaszorítása és új

anyag termeltetése (Capell és Christou, 2004).

Az ásványi anyagokat a növény a talajból veszi fel. A növénybe beépített tápanyag

mennyisége ezért a sók felvételére, szállítására és akkumulálására a növényben meglévı

biokémiai folyamatok szabályozásával (Zhu és mtsai., 2007), illetve a növényi tápanyag

hozzáférhetıségének javításával növelhetı (Shewry és Jones, 2005).

27

2.3.2.1 Esszenciális aminosavak mennyiségének növelése

Lizinben gazdag fehérjék mennyiségének növelése

A magas lizin tartalmú természetes mutáns árpa, a Hiproly, négy lizinben gazdag enzim

fehérjét tartalmaz. Ezek a β-amiláz, a szerpin proteináz inhibitor és két kimotripszin inhibitor

fehérje (CI-1 és CI-2). A CI-2 fehérjét molekuláris módszerekkel úgy alakították át, hogy a 83

aminosavból 14 lizint tartalmazzon négy helyett (Roesler és Rao, 1999, 2000), de a fehérjét

még nem expresszáltatták transzgénikus növényben. A kevésbé helyettesített formát (7 lizin),

O’Kennedy és mtsai. (2006) kölesbe transzformálták, de az eredményekrıl eddig még nem

számoltak be. Zhao és mtsai. (2003) az árpa 12 lizint tartalmazó hordotionin fehérjéjét

(HT12), kölesben expresszáltatták, s a magok teljes lizin tartalma 50%-kal nıtt meg. A

burgonya pollen lizinben gazdag fehérjéje génjét (40 lizin/240 aminosav, 16,7 mol%) Yu és

mtsai. (2004) kukoricába juttatták be, s ennek következtében a magfehérjék lizin mennyisége

50%-kal nıtt meg. Gondot okoz azonban, hogy e fehérje biológiai szerepérıl szinte semmit

nem tudunk. Wu és mtsai. (2003) transzgénikus rizsben a lizint szállító tRNS-t nagy

mennyiségben termeltették, aminek következtében a fehérjékben egyes aminosavak

(glutaminsav, glutamin és aszparagin) részben lizinre cserélıdtek. Ezzel a fehérjére nem

specifikus módszerrel a transzgénikus rizsszem lizin tartalma 0,9%-kal nıtt. A lizinben

gazdag kukoricamutánsok jellemzıje a kisebb terméshozam mellett a zein fehérje

mennyiségének csökkenése is. Ezt kihasználva két kutatócsoport is állított elı transzgénikus

kukoricát az α-zeinek (22 és 19 kDa) szintézisének szabályozásával, az ún. RNS interferencia

technika alkalmazásával (Segal és mtsai., 2003; Huang és mtsai., 2004). A kukoricaszemek

lizin tartalma 15-20%-kal emelkedett, de még így sem érték el a természetes mutánsokét (pl.

opaque-2). Az α-zein fehérjék (különösen a 22 kDa α-zein) expressziójának csökkentése

lehetıvé tette emelt lizin tartalmú kukorica elıállítását. Huang és mtsai. (2006) e módszerrel

transzgénikus kukoricában mindkét α-zein tartalékfehérje termelését csökkentették. Hatására

2,83%-ról 5,62%-ra emelkedett a kukorica szemtermésben a lizin, és 0,69%-ról 1,22%-ra a

triptofán aminosav tartalma.

Rascón-Cruz és mtsai. (2004) transzgénikus kukoricában magas fehérjetartalom növekedést

értek el (6-32%), amikor az A. hypochondriacus 11S globulin fehérjéjét (amarantin)

expresszáltatták rizs glutelin-1 promótere segítségével. A lizin aminosav mennyisége 18%-

kal, a triptofáné 22%-kal nıtt a vadtipusú kukoricáéhoz képest (0,34% és 0,09% teljes

ırleményben). A nagymértékő fehérje expressziót valószínőleg a transzgén magas kópia

száma (10 vagy több) és az alkalmazott szövetspecifikus promóter nagy hatékonysága

indokolja az adott célszövetben. Chakraborty és mtsai. (2000) egy másik amarantusz fehérje

28

(AmA1, albumin típusú tartalékfehérje) génjét expresszáltatták burgonyában. A keményítı

bioszintézisben résztvevı enzim (GBSS, granule-bound starch synthase) szövetspecifikus

promóterének használatával a transzgénikus növény gumójában a fehérjetartalom 35-45%-kal

nıtt. Ez a nagy változás talán azzal is magyarázható, hogy a kontroll növény gumóinak

fehérjetartalma rendkívül alacsony (1,15%). A módosítás több esszenciális aminosav

mennyiségének jelentıs növekedését eredményezte, a lizin mennyisége ötszörösére, a

cisztein, metionin és tirozin mennyisége hétszeresére nıtt a nem transzformált növényben

mért adatokhoz képest.

Metioninban gazdag fehérjék mennyiségének növelése

A legelsı metioninban gazdag kukoricát a 10kDa δ-zein tartalékfehérje túltermeltetésével

érték el (Kleese és mtsai, 1991). Noha a transzgénikus kukorica néhány szemtermése 30%-kal

több metionint tartalmazott, mint a vadtípus, a szerzık nem tudtak egyértelmő összefüggést

kimutatni a transzgén jelenléte, valamint a δ-zein akkumuláció és a metionin tartalom

növekedése között. Késıbb megállapították, hogy a túltermeltetendı fehérje szintézise poszt-

transzkripcionálisan szabályozott egy másik kromoszómán található fehérje faktor által. E

szabályozás eliminálásával sikerült a természetes mutánshoz hasonló kukoricát elıállítani,

mely állatkísérletekben ugyanolyan tömegnövekedést adott, mint amikor metionin aminosavat

adagoltak a takarmányhoz (Lai és Messing, 2002).

Metioninban gazdag napraforgó 2S albumin tartalékfehérje gén rizsbe transzformálásáról

Hagan és mtsai. (2003) számoltak be, míg szezámmag 2S albumin génnel Lee és mtsai.

(2005) állítottak elı transzgénikus rizst. Az elsı kísérletben a szemek metionin tartalma nıtt

ugyan, de a cisztein mennyisége 15%-kal csökkent. Így a kén mennyisége változatlan maradt

a magban, csak a kéneloszlás változott. Eszerint a metionin tartalom javítását célzó kísérletek

eredményét a magvak kénellátása korlátozza. A szezámmag albumin génjét oleosin és glutelin

promóterekkel irányítva sikerült transzformálással mind a rizsszemek korpájában, mind az

endospermiumban a kéntartalmú aminosavak mennyiségét 25-75%-kal növelni. A

kéntartalom részletes elemzésérıl, a kén eloszlásáról a rizsszemen belül és a táplálkozástani

érték változásáról nem áll rendelkezésre információ.

A 2S fehérjét expresszáló transzgénikus gabonafélék ugyan magasabb metionin aminosav

tartalmúak, de ezek a fehérjék többnyire allergén tulajdonsággal rendelkeznek. A Brazil dió

transzgénikus szójában expresszáltatott metioninban gazdag 2S albumin fehérjéje

bizonyítottan allergiás reakciókat váltott ki (Melo és mtsai., 1994; Nordlee és mtsai., 1996).

Emiatt nem valószínő, hogy a közeljövıben metioninban gazdag 2S albumin fehérje

használatát engedélyezni fogják gabonafélék transzformációjában, mely kísérletek emberi

29

táplálkozást céloznak meg. Ez azonban nem a transzformáció módszerének káros voltát

jelenti, hanem sokkal inkább azt bizonyítja, hogy az engedélyezı szervek az emberi

biztonságra és egészségre nézve nagyon körültekintıen járnak el (Shewry, 2007).

Szabad aminosavak mennyiségének növelése

A lizinben gazdag mutáns kukoricák vizsgálatakor kiderült, hogy a magasabb aminosav

tartalomért a szabad, fehérjébe be nem épült, aminosavak is felelısek. A gabona magvak

általában kis mennyiségben tartalmaznak szabad aminosavakat, s mennyiségük csak akkor nı,

ha a fehérjék szintézise korlátozott, pl. árpában a kénhiány miatt (Shewry és mtsai., 1983). Az

alacsony szabad aminosav szintet a növény az aminosav szintézisben résztvevı enzimek

szabad aminosav általi gátlása révén (negatív visszacsatolás) tartja fenn, mely egy komplex

szabályozási rendszer (Galili összefoglalói, 1995 és 2002). Falco és mtsai. (1995) E. coli

eredető, feedback érzéketlen, enzimeket (AK, DHDPS) kódoló génekkel transzformáltak

repcét és szóját. Hatására a szabad lizin tartalom repcében duplájára, míg szójában

ötszörösére nıtt. Az elsı kereskedelmi forgalomba került (2006) magas lizin tartalmú

transzgénikus kukoricát a Monsanto cég ezzel a technikával állította elı Corynebacterium-ból

származó, visszacsatolásra nem érzékeny DHDPS gén és a kukorica globulin-1 promótere

használatával. Ezzel a módszerrel rizs szabad triptofán tartalmát a vadtípuséhoz képest 55-

431-szeresére növelték meg (Wakasa és mtsai., 2006).

Noha sikerült már elıállítani megváltoztatott fehérje összetételő búzát, ami jobb funkcionális

tulajdonsággal bír, mint a vadtípusú búza, még senki sem számolt be javított táplálkozástani

értékő búzáról.

2.3.2.2 Telítetlen zsírsavak, vitaminok, ásványi anyagok, szénhidrátok és rostok

mennyiségének növelése

A telítetlen zsírsavak szerepe fontos és változatos a növények anyagcsere folyamataiban, jó

hatásúak a szív és érrendszeri megbetegedésekkel szemben, gyulladás gátlók, valamint

vérnyomás szabályozó szerepük is ismert. Mennyiségüket transzformációval Arabidopsis-

ban, szójában és olajos magvakban növelték (Qi és mtsai., 2004; Kinney és mtsai., 2004; Wu

és mtsai., 2005) a 18 szénatomos telítetlen zsírsavak és nagyon hosszú láncú többszörösen

telítetlen zsírsavak (ω-3 és ω-6) bioszintézise kulcsenzimeinek túltermeltetésével.

Vitamin és folsav tartalom növelése

Az A-vitamin hiányban szenvedık száma, különösen a fejlıdı országokban magas. A WHO

1995-ös jelentése szerint az A-vitamin hiánya felelıs évente 2 millió gyermek haláláért és a

túlélı gyermekek vakságáért. Az A-vitamin prekurzor molekulája, a β-karotin, a legtöbb

30

növényben megtalálható, belıle az emberi szervezet A-vitamint szintetizál, így hiánya

könnyen kiküszöbölhetı. A gabonafélék nem tartalmaznak β-karotint, s a szintéziséhez

szükséges 3 enzimet sem. Ye és mtsai. (2000) elsı kísérletükben csak egy-egy enzimet

expresszáltattak, majd késıbb a rizsszemek endospermiumába két sárganárcisz fitoin szintáz

enzimet és egy Erwinia uredovora fitoin szintázt kódoló gént juttattak be transzformálással.

Ezzel a teljes A-vitamin szintézis folyamatot rekonstruálták. A transzgénikus rizsszemek a

nagymennyiségő β-karotin miatt (15 µg/1 g szem) sárga, narancssárga színőek, ezért az új

rizsfajta az „Aranyszemő rizs” nevet kapta (Golden Rice). Késıbb kukoricát, krumplit,

karfiolt és paradicsomot is transzformáltak hasonló módszerrel (Paine és mtsai., 2005;

Ducreux és mtsai., 2005; Lu és mtsai., 2006). A transzgénikus sárga burgonya β-karotin

tartalma olyan magas (47 µg/1 g gumó), hogy egyetlen adag elfogyasztása (25 dkg) a napi A-

vitaminszükséglet felét biztosítja.

Az E-vitamin nem egyetlen molekula, hanem 8 hidrofób molekula egysége, közülük az α-

tokoferol a leghatásosabb a növények telítetlen zsírsavai védelmében. Hiánya emberben

leromláshoz, vesebajhoz és terméketlenséghez vezet. Transzgénikus megközelítésekben a

teljes vitamin mennyiségét vagy az α/β-tokoferol arányát növelik γ/δ-tokoferolhoz képest

(Shintani és Della-Penna, 1998; Van Eenennaam és mtsai., 2003).

A C-vitamin fontos elektron donor, enzim kofaktor és antioxidáns, hiánya skorbuthoz vezet.

Növényekben legalább három szintézis út ismeretes, így nagyon sok megközelítés kínálkozik

mennyiségének növelésére (Zhu és mtsai. összefoglalója, 2007). A legtöbb transzgénikus

kísérlet a C-vitamin bioszintézis enzimek túltermeltetését célozta meg.

A folsav hiánya sok betegséggel összefügg. Legnagyobb problémát a korai terhességben

okozza (spina bifida, azaz nyitott gerinc csatorna) ha a kismamák nem jutnak elegendı friss

zöldséghez (Geisel, 2003). A folsav három precurzor molekula asszociátuma. A szintézis út

módosításával Diaz de la Garza és mtsai. (2007) transzgénikus paradicsomot állítottak elı,

melynek termésében a folsav mennyisége a vad típusúéhoz képest 20 szorosára nıtt. Napi

100g paradicsom elfogyasztása biztosítja egy felnıtt vitamin szükségletét (400 µg).

Ásványi anyag tartalom növelése

Az ásványi anyagokat a növények nem szintetizálják, hanem a talajból veszik fel. A

transzgénikus stratégiák fıként a vas és a cink mennyiségének növelését célozták meg két

módon: az ásványi anyag felvétel fokozása és szállítása a fogyasztásra használt növényi

részekbe, a biológiai hozzáférhetıség javítása (White és Broadley, 2005). A mioinozitol-

hexakis-foszfátok (IP6) a gabona magvak foszfáttartalmának 70%-át adják és ásványi ionokat

(Ca2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+ és Zn2+) biztosítanak nagy mennyiségben a növény számára. Az

31

állatok és az emberek nem rendelkeznek fitáz enzimmel, a fitátot lebontani nem tudják. A

fitátok lebontása érdekében gomba eredető (Aspergillus niger) fitáz enzimet kódoló génnel

transzformáltak gabonaféléket, köztük búzát is (Brinch-Pedersen és mtsai., 2000, 2003; Lucca

és mtsai., 2001). Késıbb hıstabil fitázok génjét alkalmazták a transzformációs kazettákban,

hogy az enzimek a gabona feldolgozása, fızése során a magas hımérsékletén ne bomoljanak

le (Lucca és mtsai., 2001; Brinch-Pedersen és mtsai., 2002, 2006). A szója vaskötı fehérjéjét

(ferritin) Lucca és mtsai. (2001) rizsbe jutatták be, s a vastartalom két-háromszorosára nıtt

meg. Hasonló módon a búzaszem vastartalma is növelhetı lesz (Shewry és Jones, 2005).

Szénhidrátok és rostanyagok mennyiségének növelése

A búzaliszt kb. 70% keményítıt és 2-3% sejtfal poliszacharidot tartalmaz, melyek nagy

hatással vannak az emberi táplálkozásra. A keményítıt két polimer alkotja. Az amilóz

kevésbé emészthetı, mint az amilopektin, így az amilózban gazdag búza táplálkozástani

rostok forrása, ami jó hatással van az emésztı rendszer mőködésére, s feltehetıen csökkenti a

szívbetegség, gyomor- és vastagbél rák, valamint a cukorbetegség kialakulásának esélyét is

(Regina és mtsai., 2008). A keményítı bioszintéziséért felelıs enzimek közül két enzim

(SBEIIa, SBEIIb) expressziójának szabályozása RNS interferenciával a búzaszem amilóz és

amilopektin arányát megnövelte (több mint 70% amilóz) (Regina és mtsai., 2006). A gabona

magvak aleuron rétege és endospermiuma sejtjei vastag sejtfalát alkotó poliszacharidok

(arabinoxilánok, β–glükánok), mennyisége és azok aránya fajonként eltérı. A bioszintézis

enzimek megismerése és modell kísérletek elvezethetnek a sejtfal összetételének elıre

meghatározott módon történı változtathatóságához (Burton és mtsai., 2006; Vasil, 2007).

2.4 A búza genetikai módosítása

A hagyományos növénynemesítési módszereken túl a növények genetikai állományának

megváltoztatása lehetséges géntechnológia úton is, melyet növényi transzformációnak, az

így elıállított szervezeteket pedig Genetikailag Módosított (GM) növényeknek nevezzük.

Az elsı transzgénikus növényeket az 1980-as évek elején állították elı, amit megalapozott a

szövettenyésztés, a növényregeneráció és a molekuláris biológia módszertani fejlıdése.

Legfontosabb hatása a rekombináns DNS technikának volt. A kezdeti, pusztán a módszer

fejlesztésére és a transzgénikus növények tulajdonságainak jellemzésére szolgáló

alapkutatásokat követıen a figyelem a GM növények mezıgazdasági termelésbe való

bevonása felé fordult. Az elsı generációs GM növények agronómiai célokat szolgáltak, azaz

32

növényi kártevıknek (gomba-, vírus-, baktérium- és rovar rezisztens), illetve növényvédı

szereknek ellenálló növényeket hoztak létre. Különbözı rezisztencia génekkel növelték a

növény ellenállóságát gombák (Pellegrineschi és mtsai., 2000), rovarok (Altpeter és mtsai.,

1999; Stoger és mtsai., 1999), vírusok (Karunarate és mtsai., 1996) ellen, vagy gyomirtó

szerekkel (DeBlock és mtsai., 1997) szemben. Az abiotikus stresszel (vízhiány, Abebe és

mtsai., 2003; magas sókoncentráció, Huang és mtsai., 2006) szembeni ellenállóság

géntechnológiai úton történı növelésére is számos sikeres példa ismert az irodalomban búza

és más gabonafélék esetében (lásd Vasil összefoglalója, 2007).

A második generációs fejlesztések már az élelmiszer feldolgozóipar igényeit is szolgáló, ill.

az élelmiszerrel szemben támasztott új táplálkozás élettani szempontok kielégítésére is

irányultak. Kedvezıbb fehérje-összetétellel (Blechl és Anderson, 1996; Barro és mtsai., 1997;

Rakszegi és mtsai., 2005; Tosi és mtsai., 2004) és beltartalmi értékekkel (Regina és mtsai.,

2006) rendelkezı, elınyösebb zsírsavtartalmú (Edlin és mtsai., 2000) transzgénikus növények

elıállítására összpontosítanak a kutatások.

A harmadik generációs GM növények fejlesztése nem mezıgazdasági, vagy táplálkozástani

célokat szolgál, hanem azt vizsgálja milyen módon lehet a növényt, mint biofermentort,

alkalmazni enzimek, szerves molekulák elıállítására és gyógyszeripari intermedierek és

hatóanyagok, vakcinák termeltetésére. Ilyen alkalmazásokról búza esetében jelenleg még

nincsenek publikált adatok, de ehetı vakcinát a szemtermés endospermiumában termelı GM

rizsrıl már beszámoltak (Oszvald és mtsai., 2007).

2.4.1 A növényregenerációt befolyásoló tényezık és hatásuk a transzformációra

Minden növényi transzformáció elsıdleges követelménye, hogy jól regenerálódó

szövettenyészetbıl induljon ki, álljon rendelkezésre jól mőködı in vitro növény-sejt-növény

rendszer (Shewry és Jones, 2005). A sejt- és szövettenyészetek a növényi biotechnológia

alappillérei, melyek a vegetatív és generatív sejtek, szövetek, szervek és embriók in vitro

tenyésztését jelentik kontrollált körülmények között. Szövettenyésztési módszerekkel a

növények minden része, szerve, szövete, sejtje megfelelı feltételek és sterilitás esetén

mesterségesen életben tarthatók és tenyészthetık (Tulecke, 1953). Elméletileg minden

növényi sejtbıl teljes növény regenerálható, mert a növény minden sejtje totipotens,

rendelkezik a teljes genetikai állománnyal.

A magasabb rendő növények szervei már differenciálódott sejteket tartalmaznak ezért elıször

sejtosztódáson keresztül történı dedifferenciálódásukat kell indukálni és fenntartani. Erre

általánosan használt vegyületek a növényi hormonok. A módosítást követı

33

növényregeneráció lehetséges útjai a szomatikus embriógenezis és az organogenézis (in vitro

merisztéma- és szervdifferenciálódás). A merisztémák differenciálódása a morfogenézis

leggyakoribb útja, melynek során a jelen lévı hormonoktól függıen alakul ki a szerv típusa,

azaz a morfogenézis iránya. (Dudits és Heszky, 2003).

A géntechnológiai beavatkozás célpontja legtöbbször a különbözı növényi részek

hormonkezelésével dedifferenciálódásra késztetett szövetekbıl keletkezett kallusz. Újabb in

vitro hormonkezelésre a transzformált totipotens sejtbıl osztódáson és differenciálódáson

keresztül (redifferenciálódás) növény fejlıdik. Organogenézisnél a kallusz több sejtjének

közremőködésével gyökér és/vagy hajtás fejlıdik a hormonkeverék citokinin/auxin arányától

függıen. Ekkor, függetlenül attól, hogy elıbb gyökér vagy hajtás fejlıdik, mozaikos növényt

kaphatunk. Szomatikus embriógenezisnél az új növény a kallusz egyetlen totipotens sejtjébıl

embriószerő képzıdményen keresztül fejlıdik ki. Ha a transzformált sejt szomatikus

embriógenézissel fejlıdik tovább, akkor a géntechnológiával módosított növény minden sejtje

hordozza az idegen DNS-molekulát. Így alapvetıen embriógenézis indukálása a cél a

szövettenyésztés optimális körülményeinek kidolgozásakor (Shewry és Jones, 2005).

A búza kallusz regenerálódó képessége mennyiségi jelleg, az ezért felelıs gének különbözı

kromoszómákon helyezkednek el a genomban (Ben Amer és mtsai., 1997). A regenerációs

kísérletekben gyakran felmerülı probléma a regenerálódó képesség, vagy a termıképesség

elvesztése és a rendellenes fenotípusok (albinizmus, mozaikosság) gyakori megjelenése

(Gordon-Kamm és mtsai., 1999). A regenerálódó képesség, és így a transzformáció

hatékonysága is, nagymértékben függ a kallusz képzésére felhasznált növényi résztıl, a

növényregenerációban alkalmazott táptalajok összetételétıl és a szövettenyésztés

körülményeitıl, de a növény genotípusa is befolyásolja (Potrykus, 1990).

A genotípus elsıdleges faktor a gabonafélék sikeres transzformációjában. Intenzíven

fejlesztik az agronómiailag fontos nemesítési vonalakra és a kereskedelmi forgalomban levı

fajtákra is hatékony regenerációs módszereket (Iser és mtsai., 1999; Zhang és mtsai., 1999).

Tesztelték számos kereskedelmi forgalomban levı búzafajta kalluszindukciós képességét, és

sikerült növelni néhány fajtánál a növényregeneráció hatékonyságát (Fennell és mtsai., 1996;

Machii és mtsai., 1998; Barro és mtsai., 1999).

Regenerálható búza szövetkultúra többféle növényi rész felhasználásával is létrehozható.

Ilyen növényi rész az érett és az éretlen embrió, az izolált szkutellum, az éretlen virágzat

(Rasco-Gaunt és Barceló, 1999), az éretlen levél, a mezocotyl, a hajtáscsúcs merisztéma

(Zhang és mtsai., 1999), a koleoptilcsúcs és a gyökér. Jelenleg éretlen embrióból kiindulva

34

érik el a legjobb eredményeket. Sikeresen regeneráltak növényeket búza sejtszuszpenziós

kultúráiból elıállított protoplasztokból is (Ahmed és Sági 1993, Pauk és Szarka 1991).

A növényi transzformációhoz felnevelt kiindulási növény, a donor növény kora is jelentısen

befolyásolja a géntranszformáció nélküli és transzformáció utáni in vitro növényregeneráció

hatékonyságát. Pastori és munkatársai (2001) 12-14 nappal virágzás utáni kalászok éretlen

embrióiból kimetszett szkutellumok transzformációja esetén 7-14% hatékonysággal

transzformáltak tavaszi búzát. A körülbelül 60 napos búzanövények belsı hormonösszetétele

ekkor a legalkalmasabb a már differenciálódott szövetek dedifferenciálódására, majd

redifferenciálódására. A paraméter fontosságát a búzafajta több törzsére kapott

eredményeikkel Pellegrineschi és munkatársai (2002) is megerısítették.

Számos tanulmány foglalkozik az in vitro szövettenyésztés körülményei közül a kallusz- és

embrióindukcióra, valamint a növényregenerációra használt táptalajok összetételével (Rasco-

Gaunt és mtsai., 1999a; Zhang és mtsai., 1999). Az MS (Murashige és Skoog, 1962) és ennek

változatai a leggyakrabban használt táptalajok a gabonafélék szövettenyésztésében. A

dedifferenciálódás, azaz a kalluszképzıdés indukálására rendszerint az auxin hatású 2,4-

diklórfenoxi-ecetsavat (2,4D) használják, esetenként kiegészítve kis mennyiségő citokininnel.

A képzıdött kalluszokból a hajtásokat általában nagyobb citokinin koncentrációt alkalmazva,

auxinnal vagy a nélkül regenerálják (Barro és mtsai., 1998). A táptalajban 5-10 mg/l zeatin

pozitív hatással van a regenerációra (Barro és mtsai., 1999; Sparks és Jones, 2004). A gyökér

regenerálása hormonmentes táptalajon történik. Cukrok és cukoralkoholok nagy

koncentrációban vagy a különbözı fémion kiegészítık (pl. ezüst) jelenléte a táptalajban

növelik a kenyérbúza növényregenerációs hatékonyságát (Zhang és mtsai., 1999; Sparks és

Jones, 2004), ami azt bizonyítja, hogy ezek a komponensek csökkentik a növényi szövetek

érzékenységét a transzformációnál bekövetkezı sérülésekkel szemben (Rasco-Gaunt és

mtsai., 1999a). Más tanulmányok a különbözı szénforrások (Zhang és mtsai., 1999) és a

szövettenyésztés idıtartamának hatásáról számoltak be (Takumi és Shimada, 1996). Fontos

szerepe van még a regeneráció hatékonyságára a hımérsékletnek és a fényintenzitásnak is. A

szövettenyésztés hımérsékleti tartománya általában 20 és 30°C között van. A búzanövény

hımérséklet- és fényigénye is változik fejlıdése közben mind in vivo, mind in vitro

körülmények között. Míg a kalluszok sötétben fejlıdnek jobban, addig a kis fényintenzitás

(1000 lx, 90 nmol m-2 s-1) a redifferenciálódásnak kedvez (Tamás és mtsai., 2000).

A növényi transzformáció tárgyalásakor megkerülhetetlen a szomaklonális variabilitás,

mely az in vitro tenyésztett sejtekben lejátszódó folyamatok eredménye. A szomaklonális

variabilitás kialakulására több hipotézis létezik. A fenotípusosan is megjelenı genetikai

35

változásokat a DNS replikációja közben bekövetkezı hibák, a gének inaktiválódása,

transzpozíciója, valamint az alkalmazott szövettenyésztés aránytalan hosszúsága

eredményezheti (Maheshwari és mtsai., 1995). Ezért a szövettenyésztés különbözı fázisait a

lehetı legrövidebbre kell csökkenteni.

2.4.2 A búza transzformációja

2.4.2.1 Transzformációs rendszerek

A génbeviteli rendszerek között két klasszikus transzformációs technikát különböztetünk

meg, a közvetlen és a közvetett eljárásokat (Kohli és mtsai., 2003).

A közvetett transzformációs technikák az idegen gén beviteléhez vírus, illetve bakteriális

eredető vektorokat használnak. Az elmúlt évtizedben a gabonafélék esetében is rutinszerővé

vált közvetett génbeviteli módszer a kétszikőek transzformációjához gyakran használt

agrobaktérium közvetítette T-DNS átvitel (Komari és Kubo, 1999). A talajlakó

Agrobacterium tumefaciens és az A. rhizogenes prokarióta mikroorganizmusok (Gram-

negatív baktériumok) képesek genetikailag módosítani a növényi sejteket. Fertızéskor a

sebzés helyén az A. tumefaciens a gyökér golyvásodását elıidézı, tumor-indukáló

plazmidjának (Ti plazmid), illetve az A. rhizogenes hajszálgyökér-indukáló plazmidjának (Ri

plazmid) egy darabja (transzfer DNS, vagy T-DNS) be tud épülni a növény genetikai

állományába. A T-DNS-t körülvevı határszekvenciák által közrefogott bármely DNS darab

hatékonyan bejut és integrálódik a növény genetikai állományába. A technika, mellyel nagy

mérető DNS fragmentumokat is lehet integrálni kis kópiaszámban a növény kromoszómájába,

kezdetben csak kétszikőeknél volt sikeres. A 90-es években már rizs (Hiei és mtsai., 1994),

kukorica (Ishida és mtsai., 1996), árpa (Tingay és mtsai., 1997) és búza (Cheng és mtsai.,

1997) stabil transzformánsairól is beszámoltak. Az agrobaktérium közvetítette búza

transzformációt befolyásoló paramétereket több kutatócsoport vizsgálta (Xia és mtsai., 1999;

Amoah és mtsai., 2001; Weir és mtsai., 2001; Jones és mtsai., 2005). A módszer

hatékonysága búza esetében megközelíti a 10%-ot több virulencia gént tartalmazó „helper”

plazmidot hordozó AGL1 baktérium törzs használatával (Wu és mtsai., 2007), de a búza

transzformáció hatékony alkalmazása (>1%) csak néhány kivételesen jól regenerálódó

genotípusra korlátozódik (Bobwhite, Cadenza, Fielder, Veery-5, Florida). A viszonylag

nagyszámú publikáció, valamint Jones és munkatársainak több tucat búzafajta sikeres

transzformálása (személyes közlemény) ellenére egyelıre vitatott, hogy e transzformációs

módszer búzánál helyettesítheti-e a biolisztikus módszert (Vasil, 2007).

36

A közvetlen transzformáció elsı eljárása a polietilén-glikolos (PEG) módszer volt, mellyel

számos hátránya ellenére sikerrel transzformáltak búzát is (Lörz és mtsai., 1985). A módszer

gyenge pontja, hogy a protoplaszt regenerálódó képessége nagyon alacsony, így csak néhány

genotípus használható a transzformációhoz. A sejtszuszpenziós kultúrák könnyen elveszítik

csírázó képességüket, és idıvel akkumulálják a genetikai rendellenességeket (szomaklonális

variáció). Jelentısebb eredményeket a gabonafélék közül csak kukoricával és rizzsel értek el

(Golovkin és mtsai., 1993; Barceló és Lazzeri, 1998). Sejt és szövet elektroporációjánál a

DNS nagyfeszültségő elektromos impulzusok hatására jut be a sejtekbe. A módszer

valamennyi gabonafélére mőködik, azonban a transzformáció hatékonysága csak kukoricánál

és rizsnél elfogadható mértékő (Laursen és mtsai., 1994; Xu és Li 1994). Az

elektroporációban a célobjektum rendszerint a megtermékenyített petesejt, a kallusz, az

éretlen embrió vagy az éretlen virágzat. He és mtsai. (2001) transzformált növényeket

állítottak elı tritordeum (búza-árpa hibrid) éretlen virágzatából nyert szövet

elektroporációjával. Egy kevésbé jelentıs közvetlen génbeviteli eljárásban szilicium-karbid

(SiC) tőket használtak a transzformáláshoz. A módszert elıször szuszpenziós kultúrákon

tanulmányozták (Frame et al. 1994), majd késıbb búzaembriót és embrióból származó

kalluszt is transzformáltak ezzel a technikával (Serik et al. 1996; Petolino et al. 2000). A

módszer egyszerő, mégsem terjedt el, mert az embriogén szuszpenzió elıállítása nehéz és

idıigényes feladat, a mikroszkopikus SiC tők pedig veszélyt jelentenek a kísérletet végzı

egészségére. A gyors és hatékony mikroinjektálásos technikát exogén DNS búzasejtmagba

és zigótába juttatására fejlesztették ki (Pónya és mtsai., 1999). A módszer egy mechanikus

feltárást és egy nagy frekvenciájú váltakozó árammal végzett protoplaszt rögzítést foglal

magába. A módszer óránként 15 injektálást tesz lehetıvé, és a bejuttatott gének szignifikánsan

magasabb tranziens expressziót mutattak (46-52% petesejtre és zigótára külön-külön), mint

amit eddig növényi protoplasztoknál megfigyeltek.

A génágyús, vagy más néven biolisztikus módszer a búza transzformálására napjainkban

vitathatatlanul a legelterjedtebb közvetlen génbeviteli rendszer. Az elsı sikeres kísérlet óta

(Vasil és mtsai., 1992) számos laboratóriumban alkalmazzák a búza genetikai állományának

módosítására különbözı eredető búza kalluszból és szövetbıl kiindulva. A módszert Sanford

1988-ban fejlesztette ki. Alapja, hogy nagynyomású gáz juttatja a mikromérető hordozókra

felvitt DNS-t az intakt sejtekbe, szövetekbe. A Jenes és munkatársai által (1996) kifejlesztett

és szabadalmaztatott olcsó, hatékony génágyú, a Genebooster, nagynyomású nitrogén gázzal

mőanyag lövedéket gyorsít fel, majd a megfékezett lövedék üregében elhelyezett DNS-sel

bevont aranyszemcse repül be a célszövetbe. Ma búzára leginkább a hélium gázzal mőködı

37

génpuskát (PDS1000/He, BioRad) használják. A kézi részecskeágyú (Chaure és mtsai., 2000)

lehetıvé teszi transzgén átvitelét az intakt növény szöveteibe, akár az üvegházban, vagy a

szántóföldön is. A biolisztikus technika jelenleg a legmegbízhatóbb és a leghatékonyabb

módszer termékeny, transzgénikus egyszikő növények elıállítására (Barro és mtsai., 1997;

Rasco-Gaunt és mtsai., 2001; Jones és mtsai., 2005; Vasil, 2007; Dwivedi és mtsai., 2008).

Gabonaféléknél a DNS-t a növényi részekbe néhány órával (Barro és mtsai., 1997;

Pellegrineschi és mtsai., 2002) vagy 2-8 nappal izolálás után juttatják be (Vasil és mtsai.,

1992; Pastori és mtsai., 2001; Sparks és Jones 2004). Utóbbi esetben kalluszokat

transzformálnak. A transzgén expresszióját befolyásolják a biolisztikus eljárás fizikai és

kémiai paraméterei. Lényeges az aranyszemcse mérete (0,4-1,2 µm) és mennyisége (29-235

µg/lövés), a mikro-hordozóra felvitt DNS oldat összetétele. Az oldat általában 2,5-20 µg

plazmidot vagy lineáris DNS-t, 8-16 mM spermidint és 0,2-1,9 M Ca2+ iont tartalmaz. A

génpuska mőködési paraméterei közül fontos a He-gáz nyomása [4,5-7,6 MPa (650-1100

psi)], a vákuum a kamrában [711 Hgmm (27-28 inchesHg)] és a lövési távolság (2,5-5,5 cm).

Az említett paraméterek optimalizálásáról több tanulmány is beszámolt (Rasco-Gaunt és

mtsai., 1999a; Harwood és mtsai., 2000).

A búza biolisztikus transzformáció hatékonysága általában 1% körül van (Altpeter és

mtsai., 1996b), bár néhány genotípusnál 4-17%-ot is elértek (Xia és mtsai., 1999; Pastori és

mtsai., 2001; Rasco-Gaunt és mtsai., 2001). A sikeres, bizonyított transzformációknál sokszor

komoly probléma a transzgén instabilitása (Barro mtsai., 1998; Cannell mtsai., 1998,) és a

géncsendesítésnek nevezett részleges génexpresszió (Blechl et al. 1998, Alvarez et al. 2000).

Az idegen gén integrációs mechanizmusa az agrobaktérium közvetítette transzformáció és a

közvetlen DNS beviteli technikáknál sem teljesen ismert. Az integráció helye és a transzgén

lókusz szerkezete jelentıs változatosságot mutathat a független transzgénikus vonalakban,

ami hatással lehet a génexpresszió szintjére és stabilitására. A géncsendesítés oka legtöbbször

a promóter metilációja, de okozhatja a beépülési hely módosulása is (Howarth és mtsai.,

2005). Biolisztikus transzformációval elıállított búzáknál stabil öröklıdésrıl többkópiás és

több helyre történı génbeépülés esetén is beszámoltak (Rooke és mtsai., 2003). Az eredmény

azért jelentıs, mert kotranszformációban a több helyre való beépülés biztosíthatja a transzgén

szegregációját, ami a marker gén kiesését, s csak a hasznos gén megmaradását

eredményezheti. Az utóbbi idık eredményei alapján úgy tőnik, hogy a biolisztikus

transzformációs módszer elınyösebb búza esetében (Vasil, 2007). Egy kópiás génbeépülésrıl

és magas szintő génexpresszióról számoltak be Altpeter és mtsai. (2005a). Az új

agrobaktériumos transzformációs technikák esetében is megfigyeltek több kópiás és a T-

38

DNS-nél nagyobb mérető DNS fragmentum beépülését (Wu és mtsai., 2006). Hely specifikus

beépülést célzó munkák segíthetnek a megoldásban, mint amiket pl. rizs (Hoa és mtsai., 2002)

és kukorica (Zhang és mtsai., 2003a) esetén tanulmányoztak.

2.4.2.2 A transzgén expresszió szabályozása, promóterek

Az eukarióta sejtekbıl származó promóterek teszik lehetıvé a többnyire bakteriális eredető

markergének és a különbözı élılényekbıl származó transzgének átíródását és expresszióját a

transzgénikus növény megfelelı szövetében, vagy szöveteiben. Megfelelı promóterek

kiválasztásával térben és idıben is szabályozható a transzgének megnyilvánulása.

A konstitutív promóterek a transzgénikus sejtek in vitro azonosítására használt szelekciós és

vizuális markergének folyamatos átíródását segítik a növény minden sejtjében. A növény

genetikai állományába beépíteni kívánt hasznos gén szabályozására is használnak konstitutív

promótereket, ha a növény minden szövetében és valamennyi fejlıdési állapotában magas

szintő génexpresszió elérése a cél. Gabonafélék transzformációjánál a leggyakrabban használt

konstitutív promóterek: a karfiol-mozaikvírus 35S rRNS (CaMV 35S), a rizs aktin fehérje

(Act) (Barro és mtsai., 1998) és a kukorica ubiquitin fehérje (Ubi) (Barro és mtsai., 1998;

Stoger és mtsai., 1999) génjeinek promóterei. A kukorica alkohol dehidrogenáz enzim (Adh)

és az agrobaktérium oktopin szintáz génjének (ocs) promóterébıl készült kiméra promóter, az

Emu (Chamberlain és mtsai., 1994). A génexpresszió szintje fokozható különbözı intronokkal

is, mint pl. a rizs aktin (McElroy és mtsai., 1991; Oszvald és mtsai., 2008) vagy a kukorica

adh gén (Barro és mtsai., 1998) elsı intronja. A cukornádból izolált bacilliform vírus (ScBV)

promóter szintén ígéretes konstitutív promóter (Tzafrir és mtsai., 1998).

A szövetspecifikus promóterek a transzgén kifejezıdését csak specifikus szövetekben és

azok meghatározott fejlettségi állapotában engedélyezik. A fény által szabályozott

promóterek, mint pl. a klorofill-a/b kötı fehérje (LHCP) gének promóterei a klorofillt

tartalmazó szövetekben aktívak (Baga és mtsai., 1999a). A rizs szacharóz-szintetáz génje (rss)

és a rizs tungro bacilliform vírus (RTBV) promótere a háncsszövetben történı expressziót

irányítják (Bhattacharyya-Pakrasi és mtsai., 1993). A kukoricából és a rizsbıl származó

GBSS promóterekkel a transzgénikus kukorica endospermiumában és a pollenben is

transzgén expresszió figyelhetı meg (Russell és mtsai., 1997). A búza Em (Early methionine)

fehérjék, melyek tagjai a LEA (late embryogenesys abundant) fehérje csoportnak promóterei,

embrió és aleuron specifikus fehérje expressziót mutattak árpában (Furtado és Henry, 2005).

A búza HMW glutenin tartalékfehérje alegység (1Ax1, 1Dx5) gének promóterei

endospermium specifikus expressziót eredményeznek a transzgénikus kenyérbúzában

39

(Altpeter és mtsai., 1996a; Barro és mtsai., 1997) és durum búzában is (He és mtsai., 1999). A

HMW-GS fehérjék között a Bx típusúak expresszálódnak legerısebben (Juhász és mtsai.,

2003). Oszvald és mtsai. (2008) az 1Bx17 fehérje promóterét négy különbözı, kiméra

formában készítették el. Vizsgálataikkal az endospermium specifikus kiméra promóterek

egyes elemeinek funkcióját és hatékonyságát éretlen búza endospermium tranziens

expressziójában és stabilan transzformált rizsben is igazolták.

Az indukciós promóterek a növény külsı környezetében bekövetkezı változások hatására

indítják el a transzgén expresszióját. Ilyen promóterek szabályozzák azon növényi fehérjék

génjeit, melyek a stressz káros hatását csökkentı élettani folyamatokban vesznek részt. (lásd

Potenza és mtsai. 2004 összefoglalóját). Különösen jelentıs a gabonafélék, s így a búza

esetében a hideg- és hı stressz indukálta gének promótereinek alkalmazása transzgénikus

kutatásokban (Frederico és mtsai., 2005; Meyer és mtsai., 2004).

2.4.2.3 Transzgénikus növények szelekciója

A génbevitel után a transzformált sejteket nem transzformált sejtek veszik körül. A

transzformáció döntı lépése azon sejtek szelektálása és felszaporítása, melyekben a transzgén

nem csak integrálódott a nukleáris genomba, de expresszálódik is. Az ilyen sejtek azonosítása

marker génekkel lehetséges. Ezek legtöbbször olyan gének, melyekrıl az átíródó fehérjék

ellenállóvá teszik a növényt antibiotikumokkal vagy herbicidekkel szemben. A szelekcióra

használt vegyületek a vadtípusú sejtek növekedését gátolják, vagy elpusztítják azokat, míg a

transzgénikus sejtek életképessége megmarad. A rezisztenciagének mellett léteznek egyéb

szelekciós gének is, melyeket riporter géneknek is nevezünk.

A rezisztenciagének egyik csoportja az aminoglikozid alapú antibiotikumokkal szemben

biztosít rezisztenciát. Ide tartozik többek között a kanamicin, a gentamicinB, a geneticin

(G418), a neomicin, a paromomicin és a sztreptomicin (Jelenska és mtsai., 2000). Az

aminoglikozidok baktériumölı hatása elsısorban úgy valósul meg, hogy irreverzibilisen

kötıdnek a riboszómákhoz. Különbözı enzimek, pl. az aminoglikozid-adeniltranszferáz

(AadA) és a neomicin-foszfotranszferáz (NptII) képesek inaktiválni az aminoglikozidokat.

A növényvédıszer komponensekkel szemben kialakított rezisztencia jó alternatívája az

antibiotikum rezisztencián alapuló szelekciónak. A legtöbbször használt herbicid rezisztencia

gén a bar (Basta/bialaphos resistance) ami a foszfinotricin-acetiltranszferáz (PAT) enzimet

kódolja (DeBlock és mtsai., 1995). Az enzim a foszfinotricin (PPT) alapú gyomirtó szerekkel

(Basta, Finale, Ignite, Herbiace) szemben ad toleranciát azáltal, hogy hatástalanítja azok

toxikus komponenseit (bialaphos, glufozinát). A PPT alapú szelekciót transzgénikus

40

növények azonosítására már az összes gabonaféle transzformációjánál felhasználták (Barro és

mtsai., 1998; Pauk és mtsai., 1998; Iser és mtsai., 1999; Kohli és mtsai., 1999; Rasco-Gaunt

és mtsai., 1999b). Széles körben elterjedtek, bár negatív mellékhatásaik lehetnek, mivel

gátolhatják a sejtosztódást és a differenciálódást, valamint a környezetre gyakorolt hatásuk

nem kellıen ismert (Bregitzer és mtsai., 1998). A gabonafélék transzformációjánál ritkábban

használt, herbicid rezisztencián alapuló szelekciós rendszer a glifozáttal és a szulfonilureával

szemben kialakított toleranciát mutáns enzimeket kódoló génekkel éri el (Zhang és mtsai.,

2000). Weeks (1998) ciánamid alapú herbicidet használt szelekcióra.

A rezisztenciagének mellett az úgynevezett funkcionális szelekciós géneket is sikeresen

használták gabonafélék transzformációjánál. A pozitív funkcionális szelekció (Haldrup és

mtsai., 1998) olyan stratégia, mely a transzgénikus sejteknek metabolikus elınyt ad a nem

transzformált sejtekkel szemben. Ez az új marker ártalmatlan mind a fogyasztókra, mind a

környezetre. A búza transzformációnál is használt egyik pozitív szelekciós rendszerben az E.

coli baktériumból származó foszfomannóz-izomeráz (pmi) gén a markergén (Wright és mtsai.,

2001). Az enzim a növények számára nem hasznosítható mannóz-6-foszfátot átalakítja

metabolizálható fruktóz-6-foszfáttá, így a markergént tartalmazó sejtek mannóz-6-foszfát

tartalmú táptalajon is képesek osztódni, míg a nem transzgénikus sejtek nem. A pmi gén

használatával a transzformáció hatékonysága nagyobb, mint a bar herbicid rezisztencia gén

használatakor, valamint a nem transzgénikus sejtek túlélési aránya a szelekciós táptalajon

csökken. Pozitív funkcionális marker továbbá az izopentenil-transzferáz (ipt) és a rol gén is

(Kunkel és mtsai., 1999). Az ipt gén az A. tumefaciens sejtburjánzást indukáló génjei közé

tartozik, a citokinin bioszintézis egyik enzimét kódolja. A bevitt gén hatására a transzgénikus

növényi szövet citokinin szintje növekszik, s a növény elveszíti apikális dominanciáját.

Gátlódik a gyökér képzıdése is. Az A. rhizogenes eredető rol gén az úgynevezett „hairy

roots” kialakulásáért felelıs, de a gén hatására a növény levele is megváltozik. Ráncossá

válik, megrövidülnek az internódiumok és csökken az apikális dominancia is. Az ipt, vagy a

rol génekkel a transzgénikus növények fenotípusa változik meg, így vizuálisan

megkülönböztethetık a nem transzgénikus növényektıl. Normális fenotípust csak úgy lehet

elıállítani, ha az ipt vagy a rol gént kikapcsolják, vagy rekombinációval a növény elveszíti

azt. A pozitív funkcionális szelekció mellett léteznek negatív szelekciós markerek is. Ilyen

gén a bakteriális citozin dezamináz (codA) gén, mely a nem toxikus 5-fluorcitozint az

eukarióta sejtek számára mérgezı 5-fluoruracillá alakítja át. A gén hatását és további

alkalmazhatóságát transzgénikus rizsben tanulmányozták (Dai és mtsai., 2001).

41

A szelekciós markergének jelenléte gyakran nem kívánatos a transzgénikus növényekben. Így

a figyelem azon módszerek fejlesztésére irányul, melyekkel a szelekciós markergének

eltávolíthatók a transzgénikus növényekbıl. Ez elérhetı normál szegregációval (Komari és

mtsai., 1996), de sokkal ígéretesebb a homológ rekombináció közvetítette gén kiütés (gene

knockout) módszere. Ez utóbbi megvalósítására dolgozták ki a MAT (multi-auto-

transformation) vektor rendszert. A MAT rendszer egyik változatában a kukorica

transzpozábilis elemét (AC) használják (Ebinuma és mtsai., 1997), míg a másik módszerben

az élesztı (Zygosaccharomyces rouxii) hely specifikus rekombinációs rendszerével (R/RS)

távolítják el a genomból az ipt gént (Sugita és mtsai., 1999). Az utóbbi MAT vektorral

sikeresen állítottak elı transzgénikus rizst szkutellumból (Ebinuma és Komamine, 2001). A

MAT rendszer használatával lehetıség van szelekciós markergén mentes transzgénikus

növények elıállítására egy lépésben (Ebimuma és Komamine, 2001). Növényi

transzformációnál gyakran elıfordul, hogy az idegen gén több példányban épül be a genomba.

Többek között a stabil expresszió miatt, a transzgént egy kópiában hordozó növények

elıállítása a célszerő. Az extra szekvenciákat pl. a Cre-lox helyspecifikus rekombináción

alapuló rendszerrel lehet kiiktatni a genomból. A módszerrel sikeresen alakítottak át négy

transzgén kópiát hordozó búzanövényeket egy kópiát tartalmazó transzformánsokká

(Srivastava és mtsai., 1999).

A látható markergének, vagy más néven riportergének alkalmasak az átmeneti

génexpresszió tanulmányozására, szelekciós markerként többnyire nem használják ıket. A

riportergének vizuálisan detektálható enzimaktivitással rendelkezı fehérjéket vagy színes

pigmentet, illetve fluoreszcens fehérjét kódoló gének. Ha a detektálás alsó határa elég

alacsony, a mennyiségi értékelés rendszerint már 48 órával a transzformáció után elvégezhetı.

A növényi transzformáció elsı éveiben a glükuronidáz (uidA/GUS) és a klóramfenikol-

acetiltranszferáz (CAT) enzimeket kódoló gének voltak az idegen DNS növényi sejtbe

jutásának indikátorai. Sikerrel használták gabona transzformációnál luciferáz enzim génjét is.

(Baruah-Wolff és mtsai., 1999). A medúzaeredető GFP (green fluorescent protein) egyre

gyakrabban használt riporter a növényi transzformációban. Ez a fehérje roncsolásmentesen

teszi lehetıvé a transzgénikus sejtek vizuális azonosítását fluoreszcens mikroszkóppal. A

rendszer kis toxicitású, szövettıl és genotípustól független, és széles körően használt a gabona

transzformációban (Tamás és mtsai., 1999; Stewart, 2001). A korallból származó, vörösen

fluoreszkáló fehérje génjét (pDsRed, Clontech) elıször baktériumokban használták

riporterként, de sikeresen azonosítottak vele transzgénikus dohány növényeket is (Jach és

mtsai., 2001).

42

3. CÉLKIT ŐZÉSEK

Munkánk célja a búza táplálkozástani minıségének javítása, melynek meghatározó

paramétere az endospermiumból ırölt lisztben található tartalékfehérjék aminosav összetétele.

Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetétele

jelentısen eltér az állati fehérjék aminosav összetételétıl (Dubetz és mtsai., 1979).

Esszenciális aminosav tartalmuk nagyon alacsony, ezért ezeknek a fehérjéknek

táplálkozástani értéke nem kielégítı, nem teljes. A búzalisztben jellemzıen alacsony az

arginin, hisztidin és treonin aminosavak aránya, míg a lizin tartalom nagyon alacsony (Shoup

és mtsai., 1966; Jensen és Martens, 1983). Ez annak tulajdonítható, hogy az ırlés során a

magasabb esszenciális aminosav összetételő embrió részt (8,3% lizin) és aleuronréteget (4,8%

lizin) eltávolítják. Így a liszt fehérje összetételének, azon belül aminosav összetételének

megváltoztatása jelentıs táplálkozástani érték változást eredményezhet.

Munkánkban in vitro funkcionális vizsgálatok segítségével, illetve in vivo molekuláris

biológiai módszereket felhasználva egyrészt arra szeretnénk választ kapni, hogy a búza

endospermium fehérje mátrixában expresszálódott amarantusz tartalékfehérje (AmA1)

hogyan befolyásolja a búza endospermiumból ırölt liszt fehérje- és aminosav összetételét.

Másrészt azt kívánjuk vizsgálni, hogy a búzalisztbıl készült tészta dagasztási tulajdonságai

változnak-e, és hogyan, az öt cisztein aminosavat tartalmazó heterológ fehérje génjének a

búza örökítı anyagába való beépítése és a fehérje termelıdése után.

A célkitőzés megvalósításához az alábbi konkrét célokat fogalmaztuk meg:

1A. Hatékony növényregenerációs rendszer kidolgozása különbözı búza genotípusokhoz.

1B. A kidolgozott szövettenyésztési módszer körülményeinek optimalizálása búza

transzformációhoz.

2. Amarantusz tartalékfehérje gén in vivo expresszáltatása transzgénikus búzavonalakban.

3. A transzgénikus búzanövények nukleinsav és fehérje szintő vizsgálatai.

4. Utódgenerációk felnevelése és a transzgén öröklıdés kapcsoltsági szintjének megállapítása.

5. Összefüggések keresése a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok

között.

43

4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

4.1 Növényregenerációs kísérletek

4.1.1 Növényi anyagok

Növényregenerációs kísérleteinkhez a termesztett Martonvásári ıszi búzafajták közül az Mv

Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma és két Mv Emma genotípust (eltérı HMW

glutenin alegység összetétel) használtuk donor növényként. Kísérleteinkben vizsgáltuk egy

régi magyar búzafajta, a Bánkúti 1201 három törzsének (B2, B8, B70) in vitro regenerációs

képességét is. A kicsíráztatott magokat tápkockában, 6 hétig, 4 oC-on vernalizáltuk, majd a

donornövényeket növénynevelı kamrában (Conviron), kontrollált körülmények között

kalászolásig neveltük. A kamrák hımérséklete 16/14 oC (nappal/éjjel) volt, a fényszükségletet

hideg, fehér fényt adó fénycsövekkel (200 µmol m-2 s-1), 16/8 óra (nappal/éjjel)

fotóperiódussal biztosítottuk. A biológiai stressz elkerülése érdekében a donornövényeket

kéthetente rutinszerően permeteztük. A kísérletek folyamatos növényigénye miatt minden

búzafajtát kéthetente vetettünk.

4.1.2 Éretlen embriók szövettenyésztése

Virágzás után 8-10 nappal a donornövények éretlen magjait 1,3% NaOCl vizes oldatával és

egy csepp felületaktív anyaggal sterilizáltuk, majd steril desztillált vízzel ötször öblítettük

(Larkin, 1982). A kissé áttetszı, 0,5-1 mm hosszú embriókat embriócsúccsal lefelé BEG 2

kalluszindukáló táptalajt (Függelék I. táblázat) tartalmazó Petri csészére helyeztük (30

embrió/csésze). Egy hetes sötét inkubálás után a nem csírázó, kalluszosodó embriókat friss

BEG 2 táptalajon (12-15 kallusz/csésze) további négy hétig inkubáltuk sötétben. Három

különbözı kísérleti beállításban 26±1 oC, 23±1 oC és 20±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk.

A kalluszindukció után minden kalluszt módosított MS (Murashige and Skoog, 1962)

hajtásregeneráló táptalajon (MS9, MS9N, MS92, MS92N; Függelék I. táblázat) 4-8 hétig

fényben inkubáltunk (6-7 kallusz/csésze). A kalluszokat és a fejlıdı hajtásokat alacsony

intenzitású (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus) vagy állandó magas intenzitású (50 µmol

m-2 s-1) fénnyel világítottuk meg. Kísérleteinkben a hajtásokat 26±1 oC vagy 23±1 oC

hımérsékleten regeneráltuk.

44

A regenerált hajtásokat minden kísérleti beállításban hormonmentes MS táptalajon, a

hajtásregenerációban alkalmazott körülmények között gyökereztettük. Genotípusonként

három növényt tápkockában, majd cserépben felneveltünk.

4.1.3 Statisztikai elemzés

Minden kísérleti beállításban, genotípusonként öt Petri csésze (30 embrió/csésze) embriót

preparáltunk, és a kísérletet háromszor megismételtük. A növényregeneráció hatékonyságát

százalékban adtuk meg. A regenerált növények számát nem a preparált, hanem az egy hét

után szelektált, kalluszosodó, de nem csírázó embriók számához (25-27 embrió/csésze)

viszonyítottuk. Az egyes kísérleteken belül a növényregeneráció eredményeinek értékelésére

kéttényezıs varianciaanalízist végeztünk (SPSS for Windows 10.0 statisztikai

programcsomag és Microsoft Excel).

4.2 Búza-transzformációs kísérletek

4.2.1 Növényi anyagok

Transzformációs kísérleteinkhez a termesztett Martonvásári ıszi búzafajták közül a

növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai., 2004) legjobbnak bizonyult Mv Emese

búzafajtát, valamint két tavaszi búzafajtát (Cadenza, Bobwhite 26 törzs) választottunk donor

növényként. A kicsíráztatott magokat tápkockába tettük (az ıszi Mv Emese búzafajtát ebben

az állapotban 6 hétig, 4 oC-on vernalizáltuk), majd a donornövényeket cserépbe ültetve

növénynevelı kamrában (Conviron) a 4.1.1 fejezetben leírtak szerint kontrollált körülmények

között neveltük. A kísérletek folyamatos növényigénye miatt minden búzafajtát kéthetente

vetettünk.

4.2.2 Növényi szövet elıkészítése a biolisztikus transzformációhoz

Virágzás után 12-14 nappal a donor növények éretlen szemtermését a 4.1.2 fejezetben leírtak

szerint sterilizáltuk. Az éretlen embriók embriócsúcsát mikroszkóp alatt eltávolítottuk, majd a

szkutellumokat méretük szerint három csoportba válogatva (kicsi: 0,5-1,0 mm, közepes: 0,8-

1,2 mm és nagy: 1,0-1,6 mm) külön Petri csészék közepére helyeztük (30 szkutellum/csésze).

Minden méretbıl legalább négy csészével készítettünk. A szkutellumokat módosított MS

kalluszindukciós táptalajokon (MD0,5; MD1, MD2; Függelék II. táblázat) génbelövés elıtt

36-48 óráig, 23±1 oC hımérsékleten, sötétben inkubáltuk. Kísérletenként a belövéshez 360-

45

480 szkutellumot preparáltunk, valamint a növényi anyag regenerációs képességének

ellenırzéséhez 1-1 Petri csésze bombázott és nem bombázott kontrollt készítettünk.

4.2.3 Transzgénikus növények elıállítása

Alkalmazott plazmidok

A növényregenerációs rendszer transzformációhoz történı optimalizálásakor az antibiotikum

(kanamicin) rezisztenciát biztosító pEmu-KON nevő plazmidot használtuk (Chamberlain és

mtsai., 1994).

Kotranszformációs munkánkban szelekciós marker/riporter génként a pAHC25 jelő plazmidot

használtuk, mely az uidA és a bar gént tartalmazza, s expressziójukat a kukorica ubiquitin

promótere vezérli (Christensen és Quail, 1996). A hasznos tulajdonságot kódoló transzgén az

ama1 gén (Raina és Datta, 1992) pTLZ transzformációs kazettába klónoztuk (AmA1-pTLZ).

A transzgén expresszióját nagy hatékonyságú búza endospermium specifikus promóter, az

1Bx17 HMW-GS promóter, vezérli (4.1 ábra). A plazmid DNS-eket baktérium tenyészetbıl

QIAGEN kittel preparáltuk, koncentrációjukat 1 µg/µl-re állítottuk be a további munkákhoz.

1Bx17 HMW-GS ama1 gén NOS

4.1 ábra A transzgén konstrukciója a transzformációs kazettában.

Aranyszemcsék bevonása DNS-sel

A 0,6 µm átmérıjő aranyszemcséket (Bio-Rad, Submicron Gold) Barcelo és Lazzeri (1995)

módszerét követve 96%-os koncentrációjú etanollal mostuk, szonikáltuk, majd steril

desztillált vízben szuszpendáltuk (40 mg/ml). Az 50 µl-es részletekben tárolt, 2 mg

aranytartalmú szuszpenzióhoz 5 µg plazmidot (2,5+2,5 µg) kevertünk (vortex). Az Eppendorf

csı oldalán 44 µl 3 mol/l CaCl2 oldatot és 20 µl 0,1 mol/l spermidint összekevertünk és a

szuszpenzióhoz adtuk erıs keverés közben (vortex). Három másodperc, maximális

sebességgel történı centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk a csapadékról. A DNS-sel

bevont aranyrészecskéket 150 µl etanollal mostuk, majd 3 másodpercig újra centrifugáltunk

és a felülúszót eldobtuk. Az aranyszemcséket 85 µl etanolban szuszpendáltuk, s a

felhasználásig jégen tartottuk az etanol párolgás csökkentése érdekében (maximum 1-2 óra).

Az alkohollal sterilezett makro hordozó lemezekre minden belövéshez 5 µl szuszpenziót

pipettáztunk (12 belövés/egy adag arany szuszpenzió). A bombázott kontrollokhoz az

aranytartalmú szuszpenzió megfelelı térfogatú részletét fentiek szerint kezeltük, de DNS

nélkül.

46

A belövés paraméterei

A transzformációs kazettát PDS-1000/He génágyúval (Bio-Rad) a gyártó felhasználói

utasításait követve jutattuk a növényi sejtekbe. A munkatérben 28 inch-es Hg (711,2 Hgmm)

vákuumot alkalmaztunk. A héliumot 650 psi (4,484 MPa) nyomás mellett engedtük be az

aranyrészecskéket hordozó korong fölötti térbe. A vákuum és a nyomás hatására szétrepedı

korong (hasadó lemez) és a belövendı kalluszok közötti távolságot 6 cm-re állítottuk be,

melyet a legkedvezıbb tranziens expressziós vizsgálat alapján választottunk meg (Rasco-

Gaunt és mtsai., 1999a).

Transzgénikus jelölt növények regenerációja és szelekciója

Közvetlenül belövés után a kalluszosodó szkutellumokat az eredeti és még két Petri csészén

szétterítettük és három hétig 23±1 oC hımérsékleten, kalluszindukciós táptalajon sötétben

tenyésztettük. Ezt követıen a kalluszokat hajtásregeneráló táptalajra (RZ+1/2Cu) (Függelék

II. táblázat) helyeztük és 23±1 oC hımérsékleten, alacsony intenzitású fénnyel világítottuk

meg (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra nappal/éjjel). A zöldülı kalluszokat és növénykéket a

kallusszal együtt ezután 4 mg/l foszfinotricin (PPT) tartalmú szelekciós táptalajra (RZPPT4)

(Függelék II. táblázat) helyeztük 5-6 képzıdmény/csésze sőrőséggel és még három hétig

neveltük. A bombázott és nem bombázott negatív kontroll kalluszokat illetve növénykéket

fele-fele arányban szelekció nélküli és szelekciós táptalajon tenyésztettük az alkalmazott

szelekciós nyomás erısségének vizsgálatára. Minden további szelekciós fázisban így jártunk

el. A szelekciót túlélt transzgénikus jelölt zöld növényeket további szelekció és gyökereztetés

céljából hormonmentes táptalajt (RPPT4, Függelék II. táblázat) tartalmazó Petri csészékbe,

majd steril üvegekbe helyeztük kétszer három hétre. Az Mv Emese ıszi búzafajta szelektált,

kb. 10 cm nagyságú transzgénikus jelölt növényeit szelekciós nyomás nélkül, R0 táptalajt

(Függelék II. táblázat) tartalmazó üvegekben 6 hétig vernalizáltuk. A tavaszi búzafajták

(Bobwhite és Cadenza) transzgénikus jelölt növényeit a szelekciós táptalajról közvetlenül

tápkockába, majd két hét után cserépbe ültettük és üvegházban, ill növénynevelı kamrában

kontrollált körülmények között felneveltük.

47

4.3 A transzgénikus jelölt növények nukleinsav szintő vizsgálatai

4.3.1 Genomi DNS izolálása

PCR-reakcióhoz a genomi DNS-t fitotroni kamrában nevelt háromleveles állapotú

transzgénikus jelölt növények (és utódaik) zászlósleveleibıl AquaGenomic (AG) oldattal

(MultiTarget Pharmaceuticals) izoláltuk. A levéldarabot (20 mg) 200 µl AG oldatban,

kvarchomokkal (Sigma), szobahımérsékleten dörzsöltük el. A habzást 25 µl propan-2-ol

adagolásával csökkentettük, a szuszpenziót Eppendorf csövekbe vittük át, és rövid keverés

után 65 oC-on 30 percig inkubáltuk. Négy perces centrifugálás után (13000 fordulat/perc) 100

µl felülúszót tiszta csıbe pipettáztunk, és a DNS-t 100 µl propan-2-ol hozzáadásával csaptuk

le. A centrifugálással ülepített DNS csapadékot kétszer 600 µl 70% etanollal mostuk,

szárítottuk és 80-100 µl steril TE (pH 8) oldatban 37 oC-os vízfürdıben oldottuk. A DNS

oldatok koncentrációját 260 nm-en UV spektrofotométerrel (NanoDrop) határoztuk meg.

Southern-blot analízishez a genomi DNS-t üvegházban nevelt hatleveles állapotú növények

zászlóslevelébıl (200 mg) Stacey és Isaac (1994) módszerével izoláltuk. A folyékony

nitrogénben eldörzsölt levélmintát 1 ml 2%-os CTAB (hexadecyl-trimetil-ammóniumbromid)

pufferrel (2% CTAB, 0,02 mol/l EDTA, 0,1 mol/l Tris, 1,4 mol/l nátrium-klorid, 50 mmol/l

DTT) és 100 µl kloroform:oktanol (24:1) eleggyel extraháltuk. A csöveket elıször 65 oC-on

30 percig, majd szobahımérsékleten 15 percig inkubáltuk. Fehérjementesítés céljából további

1 ml kloroform:oktanol elegy hozzáadása után óvatosan, zöldesszürke szuszpenzió

megjelenéséig rázogattuk, majd centrifugáltuk (13000 rpm, 7 perc). A felülúszót tiszta csıbe

pipettáztuk és 1 ml jégbehőtött 90%-os etanollal 4 oC-on inkubálva a DNS-t kicsaptuk. A

fázishatáron láthatóvá vált DNS szálakat Pasteur pipettával összegyőjtöttük,

etanol/nátriumacetát elegyben (76% etanol és 0,2 mol/l nátriumacetát) mostuk és szárítottuk.

A DNS-t 100-200 µl steril desztillált vízben 37 oC-on, RN-áz jelenlétében oldottuk fel. A

DNS töredezés mentességét 0,8%-os agaróz/TBE gélen megfuttatva ellenıriztük. A DNS

oldatok koncentrációját 260 nm-en UV spektrofotométerrel (NanoDrop) határoztuk meg.

4.3.2 PCR-reakció

A PPT szelektált transzgénikus jelölt T0 növényekben és utódaikban (T1, T2, T3 generáció) a

marker és riporter gének (bar és uidA) jelenlétét gén specifikus primerekkel (Sparks és Jones,

2004) PCR módszerrel vizsgáltuk. A transzgén (ama1) kimutatásához különbözı hosszúságú

terméket amplifikáló promóter-, gén- és terminátor specifikus primereket használtunk (4.1

48

táblázat). A reakciót 10 µl végtérfogatban végeztük 1x térfogatú Taq PCR puffer, 2 mM

MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,1 µM primerek, 1,25 U Go Taq polimeráz (Promega) és 80 ng

templát DNS használatával. A reakciókban 35 cikluson keresztül alkalmazott körülményeket

a 4.2 táblázat tartalmazza. A PCR-reakció után a termékeket 1,2%-os agaróz gélen

választottuk el, majd a DNS termékeket etidium-bromiddal tettük láthatóvá, s UV fényben

ellenıríztük.

4.1 táblázat PCR reakcióban használt primerek szekvenciája szelekciós bar primerek

barF barR

5’ GTCTGCACCATCGTCAACC 3’ 5’ GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 3’

riporter gus primerek gusF gusR

5’ AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC 3’ 5’ ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA 3’

transzformációs kazetta specifikus primerek

AmaF1 AmaR3

Bx17HMW3'F NosR3

5' GGAGACTCTCTACGGATAATTG 3' 5' TGGATCCCAATTCTATTATCTC 3' 5' TCCCTATAAAAGCCCATCC 3' 5’ CCGCGCGCGATAATTTATCC 3'

4.2 táblázat. PCR reakció körülményei

gén

primerpár neve kapcsolási

hımérséklet (oC)

kapcsolási idı

(sec)

elongációs lépés ideje

idı (sec)

termék mérete

(bp)

bar barF-barR 60 60 40 444

uidA gusF-gusR 60 60 40 1050

ama1 kazetta

AmaF1-R3 AmaF1-NosR3

Bx17HMW3'F-NosR3

55 55 55

20 20 30

30 242 480 1260

4.3.3 Southern-blot analízis

A CTAB módszerrel kinyert genomi DNS (20 µg) emésztését egy éjszakán át EcoRI

restrikciós enzimmel végeztük. A DNS fragmentek agaróz gélen történı elválasztását

követıen a DNS-t kapilláris módszerrel pozitív töltéső Nylon membránra transzferáltuk

(SIGMA-ALDRICH-Techware). A membrán elıhibridizálása, digoxigenin (DIG) jelölt

próbával történı hibridizálása, a mosások, a háttér blokkolása, az anti-DIG alkalikusfoszfatáz

szubsztrát reakció (1:10 000) és a kemilumineszcens detektálás a gyártó (Roche) utasításai

szerint, a cég termékeit felhasználva történt. A DIG-jelölt próbát PCR reakcióval állítottuk

49

elı, melyben dNTP használata helyett saját készítéső jelölı keveréket (2 mM dATP, 2 mM

dCTP, 2 mM dGTP, 1,3 mM dTTP, 0,7 mM DIG-11-dUTP) alkalmaztunk. A jelölt 250 bp

hosszú DNS fragment felszaporítását AmaF1-AmaR3 gén specifikus primerekkel a 4.3.2

fejezet szerinti körülmények között végeztük. Az antitest- és szubsztrát reakciót követıen a

membránhoz specifikusan hibridizált DIG-jelölt próbát hyper érzékeny röntgenfilm

(Amersham Biosciences) segítségével tettük láthatóvá.

4.3.4 RT-PCR reakció

A transzgén transzkripcióját az mRNS-en végzett RT-PCR reakcióval igazoltuk. A

transzgénikus jelölt T0 növények szemtermését (T1 mag) 20 nappal virágzás után elemeztük.

A hosszában félbevágott egyik félszem endospermiumából teljes RNS-t, majd mRNS-t

izoláltunk polyA Spin mRNA Isolation Kit (NEB) használatával a gyártó utasításait követve.

A DNS szennyezıdéstıl megtisztított mintákon iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)

segítségével cDNS-t szintetizáltunk. A kapott cDNS molekulával a transzgénre specifikus

primerekkel (AmaF1-AmaR3) PCR reakciót végeztünk a 4.3.2 fejezetben ismertetett

protokoll szerint, de a templát cDNS mennyisége itt csak 1 pg volt. A reakciótermékeket

agaróz gélen analizáltuk. T1 növények esetén az mRNS-t 17, 24 és 31 nappal virágzás után

izoláltuk a kettévágott éretlen T2 búzaszem egyik felének endospermiumából. A másik

félszemben Western-blot analízissel a fehérje expresszióját vizsgáltuk. Fenti leírás szerint

mRNS izolálást, cDNS szintézist és elemzést levél- és gyökérszövet mintákból is elvégeztük.

Kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR)

Az ama1 gén transzkripciója idıbeli változásának nyomonkövetéséhez a T2 növények éretlen

T3 szemtermésének endospermiumából (10, 17, 24 és 31 nappal a virágzás után) teljes RNS-t,

majd mRNS-t izoláltunk és a mintákban a Terzi és mtsai. (2005) által publikált módszerrel

qRT-PCR reakció segítségével határoztuk meg az átírt mRNS mennyiségét. Referenciaként a

búza tubulin fehérje génjét használtuk, melyre olyan oligonukleotidokat terveztünk, amik a

gén 3’ végének szekvenciáját ismerik fel és az amplifikált termék hossza 100 bázispárnál nem

hosszabb (Tub1F: 5’ CSTCCATCCAGGAGATGTTC 3’ és Tub1R: 5’ AGRTCGTTCA

TGTTGCTCTC 3’ úgynevezett degenerált primerek). A cDNS-t tartalmazó oldatban az ama1

gén egy rövid (97 bp) fragmentjének amplifikálásához az

AmaF2 (5’ AAGCTGCTGC GTTGTTTAG 3’) és

AmaR1 (5’ ACTCGTAAATCTCTTAATAAACC 3’) oligonukleotidokat használtuk. Az

AmaF2 primer a gén 3’ közeli végéhez kapcsolódik. A reakció során keletkezett DNS

50

mennyiségét a reakcióelegyben lévı SybrGreen floureszcenciája alapján mértük. Minden

mintát és a kontrollt is öt ismétlésben elemeztük. Kalibrációra a 17 napos mintát használtuk

50, 100, 500, 1000, 2000 és 5000-szeres hígításban. A reakcióelegy (25 µl) 12,5 µl

SYBRGreen PCR Master Mixet (Applied Biosystems), 900 nM primereket és 100 ng templát

cDNS-t tartalmazott. A mintákat a kezdeti lépésben 5 percig 50 ˚C-on inkubáltuk, majd 10

percig 95 ˚C-on denaturáltuk. Az amplifikálást 40 cikluson keresztül végeztük (95 ˚C 20 sec

és 60 ˚C 1 perc) az amplifikációs görbe felvételéhez. A PCR reakció után a mintákat 60 ˚C-ról

95 ˚C-ra lassan (0,03 ˚C/s sebességgel) felmelegítettük, miközben folyamatosan mértük a

reakcióelegy fluoreszcenciáját. Ez adja az olvadási/disszociációs görbét, amit PE Biosystems

5700 software segítségével analizáltunk.

Az amplifikációs ciklusok alatt mért fluoreszcencia adatokat az Applied Biosystems 5700

rendszer detektálta és a ∆Rn számított értékeket kirajzolta a ciklus szám függvényében.

∆Rn=(R+n)─(R─n), ahol az R+n az amplifikált termék fluoreszcencia értéke az adott idıben, az

(R─n) pedig az alapvonal (háttér) emissziója (fluoreszcencia értéke) a 6-15 ciklusok között.

Meghatároztuk a Ct értéket minden egyes vizsgált mintára és ebbıl, az általunk készített

kalibrációs egyenes segítségével, kiszámoltuk a minták kiindulási templát koncentrációját.

4.4 A transzgénikus növények fehérje szintő vizsgálatai

4.4.1 A marker/riporter gének aktivitásának tesztelése

A bar gén expressziójának igazolása PAT teszt segítségével

A PCR pozitív T0 növények T1 magjaiból genotípusonként 16 db-ot tápkockában

csíráztattunk, majd a cserépbe ültetett növényeket hat leveles állapotban PPT tartalmú,

kereskedelmi forgalomban lévı permetezıszer (FINALE, glufozinát-ammónium totális

gyomirtó szer) hígított oldatával (1 g/l) kétszer permeteztük.

Az uidA gén expressziójának igazolása GUS festéssel

A T1 magokból permetezés nélkül és permetezés után felnevelt T1 növények T2 magjait

(genotípusonként minimum 12 szem) steril desztillált vízben duzzasztottuk két órán át, majd a

csíraoldallal szemben, keresztben vékony (1-1,5 mm) szeletet vágtunk le belıle. A vékony

metszetet Eppendorf csıbe tettük, 100 µl GUS festıoldatot mértünk rá és néhány órán át,

idınként rázogatva 37 oC-on inkubáltuk. A festıoldat végsı koncentrációja: 100 mM nátrium-

foszfát puffer (pH 7,0), 10 mM EDTA, 0,8 mM kálium-ferricianid, 0,8 mM kálium-

ferrocianid, 0,1 V/V% Triton X-100 és 2 mM X-Glca (5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-

51

galakturonid, melynek 50x tömény, 1 mg/ml koncentrációjú, dimetil-formamidos oldatát

használtuk). A 24 óra után megkékült szegmensekhez tartozó növények expresszálták a GUS

enzimet. A nagyobb, csírát tartalmazó részt kicsíráztattuk és tápkockában, majd cserépben

felneveltük.

4.4.2 A transzgén (ama1) expresszió igazolása Western-blot analízissel

A fehérje expresszió bizonyítása Western-blot analízissel történt. A regenerált búzanövények

éretlen illetve érett szemterméseit a csírarész eltávolítása után dörzsmozsárban eldörzsöltük.

A teljes fehérjét 2 m/V% SDS és 100 mM DTT tartalmú 62,5 mM Tris-HCl pufferrel (pH 6,8)

extraháltuk (25 µl puffer/mg minta). Centrifugálás után (10000g, 10 oC, 15 perc) a felülúszót

összegyőjtöttük. A fehérje minták molekulaméret szerinti szétválasztását SDS poliakrilamid

gélelektroforézissel végeztük Laemmli (1970) módszerével. A fehérjeminták koncentrációját

megmértük, majd azonos (10 mg/ml) koncentrációjú oldatokat készítettünk. A mintákat 30 µl

SDS minta pufferben 4-5 percig 95 oC -os vízfürdın denaturáltuk, majd centrifugáltuk (4400

rpm, 3 perc). Az elıkészített mintákat (7-10 µl/fehérjeizolátum) és a molekulatömeg

standardot (5 µl Fermentas 20-100 kDa) 1 mm vastagságú 12% akrilamid tartalmú szeparáló

gélre vittük. Az elektroforézist két géles rendszerben, a győjtı gélben 40 mA, a szeparáló

gélben 60 mA állandó áramerısséggel végeztük.

Az elválasztott fehérjéket polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra BioRAD Trans-Blot SD

Semi-Dry Transfer Cell készülékben 130 mA állandó áramerısségen 15 percig „Towbin”

puffer segítségével transzferáltuk. Ezt követıen, a membránon lévı fehérjéket Towbin és

mtsai. (1979) leírása szerint detektáltuk. A membránt a transzfer után egy éjszakán keresztül

10% zsírmentes tejport tartalmazó TBST (Tris buffered saline with Tween 20) oldatban

áztattuk. Ezután a membránt 3x15 percig TBST oldatban mostuk, majd az elsı, AmA1

fehérjére specifikus poliklonális antitestet 1:200 hígításban tartalmazó TBST oldatban 1 órán

keresztül, szobahımérsékleten inkubáltuk. A membránt 3x15 perces mosás után (TBST oldat)

1:7000 arányban hígított alkalikus foszfatáz enzimmel konjugált másodlagos antitesttel

(Sigma) egy órán át tovább inkubáltuk. Három mosás után a membránra transzferált antigén

specifikus fehérjéket BCIP (5-bróm-4-klór-3-indolilfoszfát) és NBT (p-nitrotetrazólium-kék)

szubsztrátok segítségével tettük láthatóvá. A szubsztrátokat tartalmazó 200 µl törzsoldatot

(9,4 mg/ml BCIP és 18,75 mg/ml NBT dimetil-szulfoxidban oldva) 10 ml TMN oldatban (0,1

M Tris-HCl, pH 9,5, 0,05 M MgCl2 és 0,1 M NaCl) kevertük el.

52

4.4.3 A szemtermés fizikai vizsgálatai

A transzgénikus búzanövények T2, T3 és T4 szemtermésének keménységét a széles körben

használt standard búza vizsgálati módszer szerint (AACC 55-31) Perten SKCS 4100

készülékkel határoztuk meg. A vizsgálathoz 160-300 búzaszemet használtunk és azok alábbi

paramétereit mértük: szemátmérı (mm), ezerszemtömeg (g) és szemkeménység (keménységi

index, mértékegység nélküli szám).

4.4.4 Liszt vizsgálatok

A transzgénikus búzanövények fehérje- és aminosav összetételének, valamint funkcionális

tulajdonságainak jellemzéséhez a növények szemtermését laboratóriumi Mini-malmon

ıröltük, majd a lisztet mikro-szitán szitáltuk (METEFÉM Kft., Magyarország).

Teljes fehérjetartalom

A lisztminták fehérjetartalmát 14% nedvességtartalom mellett Kjeldahl módszerrel határoztuk

meg (N faktor 5,7).

AmA1 fehérje mennyiségi meghatározása

A transzgénikus búzában expresszálódó AmA1 fehérje relatív mennyiségét (a teljes fehérje

százalékában) indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg. A lisztmintákból a 4.4.2 fejezet

szerint extrahált teljes fehérje inkubálását, mosását, blokkolását és az antigén reakciót

(kecskében termelt anti-nyúl IgG-HRP konjugátummal, 1:7000 hígítás, PBST-ben) Kang és

mtsai. (2003) szerint végeztük. Elıhívás/színreakció után a minták abszorbanciáját Bio-Rad

készülékkel 492 nm hullámhosszon határoztuk meg, melyekbıl az alábbi egyenlettel relatív

fehérje mennyiséget számoltunk: % = (ODsample – ODneg) / (ODpos - ODneg) x 100. Pozitív

kontrollként bakteriális expresszióval termelt AmA1 fehérjét (100 ng) használtunk.

Esszenciális aminosav tartalom

A lisztminták esszenciális aminosav összetételének meghatározásához Adebowale és mtsai.

(2007) módszerét alkalmaztuk. A mintákat 110 oC -on 1% fenol tartalmú 6M HCl oldattal

hidrolizáltuk, vákuumban szárítottuk, majd dietil-etoximetilénmalonáttal kezeltük. Az amino

savakat fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) módszerrel választottuk el. Az összetételt tömeg

%-ban 100g fehérjére vonatkoztatva adtuk meg.

Méretkizárásos – HPLC (SE-HPLC)

A lisztminták polimer/monomer (glutenin/gliadin, Glu/Gli) arányát SE-HPLC kromatográfiás

módszerrel határoztuk meg Batey és mtsai. (1991) által leírt módon. A teljes fehérjefrakció

53

kinyerésekor 10 mg liszthez 1ml 0,5 m/V% SDS-foszfát puffert (pH 6,9) adtunk, majd 15

másodpercig szonikáltuk. Centrifugálás után a felülúszót 0,45 µm PVDF szőrın szőrtük. Az

analízishez Phenomenex BIOSEP-SEC 4000 oszlopot alkalmaztunk. A futtatás ideje 10 perc

(áramlási sebesség 2 ml/perc). Az alkalmazott eluens vizes acetonitril puffer volt (0,05 V/V%

trifluórecetsav vízben és 0,05 V/V% acetonitrilben). Az oszlopról eluálódott fehérjéket 214

nm hullámhosszon detektáltuk.

Az oldhatatlan polimer frakció (UPP) mennyiségének meghatározásához Gupta és

MacRitchie (1994) módszerét alkalmaztuk. A mintafeltáráshoz az elıbbi SDS/foszfát puffert

használtuk. Az extrahálás két lépésben, elıször szonikálás nélkül (oldható fehérje frakció),

majd a centrifugálás után visszamaradt csapadék szonikálásával történt (oldhatatlan fehérje

polimer frakció). A kromatográfiás elválasztás és detektálás körülményei a fentiekkel

megegyeztek. Az UPP % értéket az oldhatatlan fehérje frakció polimer mennyiségének és az

összes fehérje polimer frakció mennyiségének arányából határoztuk meg. A kromatogrammok

polimer és monomer fehérjéire jellemzı csúcsok számszerősített görbe alatti területeibıl a

polimer- és monomer fehérjék arányát, azaz a Glu/Gli arányt a Glusol+insol/Glisol+insol képlettel

számoltuk ki (Larroque és Békés, 2000).

Fordított fázisú – HPLC (RP-HPLC)

A HMW- és LMW gluteninek egymáshoz viszonyított mennyiségét Marchylo és mtsai.

(1989) módosított módszerével határoztuk meg. A gliadinokat 50 mg lisztbıl 1 ml 70 V/V%

etanollal, majd kétszer 1 ml propán-1-ol vizes oldatával (50 V/V%) extraháltuk. A

csapadékban maradt glutenin polimereket redukáltuk és a monomereket szolubilizáltuk (50

V/V% propan-1-ol, 2 M karbamid és 0,2 M Tris-HCl, pH 6,6) 100 mM DTT jelenlétében,

majd a fehérjéket 10 µl 4-vinilpiridinnel alkileztük. Centrifugálást és szőrést követıen (0,45

µm PVDF szőrın) a fıleg HMW- és LMW glutenin alegységekbıl álló szőrletet Supercosil

LC-308 (300 A, 3.5% carbon, 5 µm, 5×4.6) oszlopon választottuk el.

Statisztikai elemzések

A fenti lisztvizsgálatokat három ismétlésben végeztük el. A mérési eredmények értékelése

különbözı statisztikai módszerekkel (korrelációs számítások, variancia analízis), a

STATISTICA version 7.0 software (Statsoft Inc., USA) segítségével történt.

Mikro Zeleny szedimentációs teszt

A lisztminták szedimentációs vizsgálatát, ami a lisztek poliszacharidjainak és fehérjéinek

duzzadási tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, a Sedicom System automata

készülékkel (Lab-Intern Kft., Magyarország), mikro módszerrel végeztük Tömösközi és

mtsai. (2005) által leírt módon. Az Európában Zeleny teszt néven elterjedt módszer a hazai

54

(MSZ ISO 5529:1993) és a nemzetközi szabványok között is szerepel (ICC-Standard No.116,

AACC Method 56-61A).

A vizsgálathoz 0,4±0,001g lisztmintát mértünk a zárható mérıhengerekbe. A liszthez 6,25 ml

brómfenolkék oldatot (5 mg/l vizes oldat) adtunk, majd az automata rázókészülékkel 5 percig

rázattuk. Ezután a mintához 3,15 ml szedimentációs reagenst adagoltunk (tejsav) és 10 percig

tovább rázattuk. (Tejsav reagens készítése: 250 ml 85 V/V% tejsavat 1 literre egészítettünk ki

és 6 órán keresztül visszafolyós hőtıvel forraltuk a tejsav molekula asszociátumok

disszociáltatása céljából. A hígított tejsav 180 ml-éhez 200 ml propan-2-olt adtunk, majd 1

literre egészítettük ki, s állni hagytuk 48 óráig). A szedimentációs tejsav reagenssel történı 10

perc rázatás után a mérıhengereket függıleges helyzetben a moduláris készülék

fotométerének tartójába helyeztük. Öt perc állás után az üledék térfogatát a digitális

képfeldolgozó rendszer automatikusan leolvasta, s az eredményeket a csatlakoztatott

számítógépen tárolta. A szedimentációs index az üledék ml-ben kifejezett térfogatának

számértéke. A párhuzamos mérések átlagát szabványos eredménynek akkor fogadjuk el, ha

különbségük nem haladja meg a 0,2 ml-t.

4.4.5 A búzalisztbıl készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata

A funkcionális kísérletekhez a transzgénikus búzanövények T3 szemtermésének 90%-át Mini-

malmon ıröltük és mikro-szitán szitáltuk meg (METEFÉM Kft., Magyarország). A kontroll

vizsgálatokhoz a donor (nem transzformált) növények és a transzformációs procedúrán

átesett, de transzgénre PCR negatív búzanövények szemtermésébıl ıröltünk lisztet (null

minták). A még így is limitált mennyiségben rendelkezésünkre álló lisztmintákból készült

tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálatát mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer)

prototípusán végeztük (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai., 2004). A mérésekhez

használt liszt mennyisége 4 g volt. A vízfelvétel meghatározása egy bevezetı mérés

formájában történt (a helyes vízabszorpció a felvett görbe maximális ellenállásából (PR)

számítható, 4.2 ábra). A maximális keverési ellenállás és a vízfelvevı képesség közötti

negatív, lineáris összefüggés van (Gras és mtsai. 2000).

A mikro z-arm mixer által szolgáltatott jelek regisztrálása a Scom, a dagasztási jellemzık

meghatározása az IZARM program (CSIRO, Ausztrália) segítségével történt. A mérést

valamennyi minta esetében állandó fordulatszámon (88-89 rpm), két-három ismétlésben

végeztük. A regisztrált görbék alapján a dagasztási paramétereket az említett szoftverek

segítségével határoztuk meg. A mikro-Valorigráf és egy, a készülékkel regisztrált tipikus

alapgörbe a leolvasható reológiai paraméterek értelmezésével a 4.2 ábrán látható.

55

4.2 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, sec). PR: maximális

tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, sec). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a

maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance) (VU x sec).

A mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) állandó fordulatszámon, a tengelyen ébredı erıvel

arányos és a motor teljesítményében bekövetkezı áramerısség-változást méri. A vízadagolás

pillanatától kezdıdıen, egy kaotikus szakasz után, a görbe növekvı tendenciája jelzi a

tésztaképzıdés megindulását. A vízadagolástól a maximális konzisztencia eléréséig eltelt idı

a minta dagasztási szükséglete (DDT, dough development time) míg a regisztrált maximális

ellenállásérték (PR, peak resistance) az úgynevezett maximális konzisztencia. Ha a dagasztást

folytatjuk a maximális ellenállás értéke csökken. Ez a hosszabb-rövidebb ideig tartó plató a

tészta stabilitását (ST) jellemzi (D’Appolonia és Kunerth, 1984). Az ellágyulás (BD, break

down) mértéke, vagyis a konzisztencia-csökkenés meredeksége az úgynevezett tolerancia

indexet adja meg.

DDT

56

5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz

Minden sikeres növényi transzformációs módszer elsıdleges követelménye, hogy jól

regenerálódó szövettenyészetbıl induljon ki, hogy rendelkezésre álljon jól mőködı in vitro

növény-sejt-növény rendszer. A kontrollált körülmények között tartott sejt- és

szövettenyészetek a növényi biotechnológia és a géntechnológia alappillérei. A búza genetikai

állományának módosítása, azaz transzformálása leggyakrabban az éretlen embriókból nyert

kalluszok belövésével vagy fertızésével kezdıdik. Ezekbıl a kalluszokból kell aztán növényt

regenerálni és felnevelni úgy, hogy azok tartalmazzák a transzgént. Függetlenül attól, hogy a

transzgént tartalmazó sejteket a nem transzformált sejtek közül milyen módszerrel válogatjuk

ki (szelekció), a legfontosabb az, hogy képesek legyünk belövés nélkül is nagyszámú növényt

regenerálni. Ezért kísérleteinkben elıször azt teszteltük, hogy a kiválasztott magyar ıszi

búzafajták (Mv Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, két Mv Emma genotípus és a

Bánkúti 1201 búzafajta három törzse: B2, B8, B70) éretlen embriói hogyan kalluszosíthatók,

valamint a képzıdött kalluszokból milyen körülmények között lehet a legtöbb növényt

regenerálni. A búzafajták regenerációs képességét a korábban Hartog tavaszi búzára

kidolgozott és búza transzformációban sikeresen mőködı (Tamás és mtsai., 1999)

regenerációs rendszerünket használva teszteltük. Ez a növényregenerációs rendszer a Larkin

(1982) által publikált módszeren alapul. A teszt kísérletben a szövettenyésztés egymást

követı három fázisában (kalluszindukció, hajtásregeneráció és gyökérregeneráció) egyaránt

26±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk, mert a szövettenyésztés hımérsékleti tartománya az

irodalom szerint általában 20-30 oC közötti, s mindhárom szakaszban azonos érték. A

hımérsékleti optimum fajonként változik (Chalupa, 1987). A donor növények kalászait 8-10

nappal virágzás után győjtöttük be, és a steril körülmények között preparált éretlen embriókat

BEG 2 táptalajon (Függelék I. táblázat), sötétben kalluszosítottuk. Az egy hét sötétben történı

inkubálás során hajtást adó embriókat eldobtuk, melyek aránya az eredeti embriók számához

képest mind a kilenc vizsgált búza genotípus esetén 8-10% volt. A sötétben, 5 hét alatt

képzıdött kalluszokat MS9 táptalajt tartalmazó Petri csészékben, alacsony intenzitású fénnyel

(20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus) világítottuk meg 4 héten keresztül hajtásregeneráció

céljából. A képzıdött hajtásokat hormonmentes MS táptalajon, a hajtásregenerációval azonos

körülmények között 4 hétig gyökereztettük. Kísérleteinkben ilyen körülmények között a

legnagyobb regenerációs hatékonyságot (61%) a Bánkúti 1201/B8 törzs mutatta, míg a többi

57

búzafajta regenerálhatósága nagymértékben eltért egymástól (0-15%). A teszt kísérlet

eredményeit az 5.1 összefoglaló táblázat elsı oszlopában mutatjuk be.

5.1 táblázat A hajtásregenerációban alkalmazott táptalaj összetétel és az inkubációs hımérséklet hatása a növényregenerációra.

hajtás regeneráció hatékonysága (%) 26±±±±1 °C���� 23±±±±1 °C�������� fajta/törzs

MS9 MS9N MS92 MS92N MS9 MS9N MS92 MS92N Mv Emese 12,3 6,2 34,5 29,4 37,2 35,2 96,0 90,1 Mv Emma (5+10)

0,0 0,0 18,1 13,2 20,3 27,2 81,2 78,2

Mv Emma (2+12)

0,0 0,0 18,2 11,0 26,3 32,2 88,2 81,1

Mv Magvas 5,0 2,1 21,5 17,3 47,1 34,3 78,2 73,2 Mv Martina 6,1 1,3 26,4 21,2 45,2 37,1 88,1 85,2 Mv Pálma 0,0 0,0 19,4 14,1 28,4 27,2 62,3 56,1 B1201/B2 5,4 0,0 20,2 23,4 36,0 41,4 80,2 88,1 B1201/B70 0,0 0,0 10,2 21,1 33,2 39,3 48,2 54,3 B1201/B8 61,0 18,3 30,4 28,4 39,2 58,2 86,0 93,2

átlag 10,0 3,1 22,1 19,9 34,8 36,9 78,7 77,7 ����Az embriókat, kalluszokat és hajtásokat 26±±±±1 °C-on tenyésztettük. LSD5%=7.2 ��������Az embriókat, kalluszokat és hajtásokat 23±±±±1 °C-on tenyésztettük. LSD5%=7.8 A fényszakaszban minden esetben azonos megvilágítást (20 µmol m-2 s-1) alkalmaztunk 16/8 óra fotóperiódussal.

Találtunk olyan fajtákat, mint például az Mv Emma, az Mv Pálma és a Bánkúti 1201/B70

törzs, melyek éretlen embrióiból egyetlen növény sem regenerálódott a fentebb ismertetett

körülmények között. Az Mv Emese, az Mv Magvas búzafajták és a Bánkúti 1201/B2 törzs

éretlen embriói 5-12%-os regenerációs hatékonyságot mutattak. A regeneráció átlagos

hatékonysága ebben a kísérleti beállításban mindössze 10% volt, mely nem szolgáltatott

megfelelı alapot a búza transzformációs munkák elkezdéséhez. Irodalmi adatok alapján a

sikeres búza transzformációs kísérletekben alkalmazott fajták növényregenerációs

hatékonysága 60% fölött kell legyen (Pellegrineschi és mtsai., 2002).

5.1.1 A hajtásregeneráló táptalaj összetétel hatása a növényregenerációra

A búza in vitro regenerálódó képessége elsısorban a búza genotípusától és a kallusz

képzésére felhasznált növényi rész típusától függ, de nagymértékben befolyásolják azt a

növényregenerációban alkalmazott táptalajok összetétele, valamint a szövettenyésztés

körülményei is (Potrykus, 1990). Így egy hatékony növényregenerációs rendszer kidolgozása

sokkal inkább módosításokat, mint sem teljesen új módszerek alkalmazását igényli. Adott

genotípusok és kimetszett növényi rész felhasználása mellett például módosíthatjuk az egyes

58

szövettenyésztési fázisokban használt táptalajok összetételét (hormonok, szénhidrátok,

vitaminok, mikro- és makroelemek minısége és mennyisége) (Rasco-Gaunt és mtsai., 1999a;

Zhang és mtsai., 1999), valamint a szövettenyésztés környezeti körülményeit (hımérsékleti-

és fényviszonyok) (Tamás és mtsai., 2000).

Az irodalmi adatok figyelembevételével ezért a fentiekben ismertetett kevésbé sikeres teszt

kísérlet után elıször a hajtásregeneráló táptalaj összetételét változtattuk, míg a többi

paraméteren nem módosítottunk. A három egymást követı szövettenyésztési fázisban ismét

26±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk. A kalluszok indukcióját és tenyésztését ugyanúgy a

BEG2 táptalajon, sötétben végeztük, és nem változtattunk a fényszakaszban alkalmazott

inkubáció fény- és hımérsékleti viszonyain sem. A képzıdött kalluszokat, hasonló

körülmények között neveltük, mint a teszt kísérletben a hajtások regenerációjához. Az

alkalmazott táptalajban azonban kétféle auxin valamelyikét (indolecetsav, IAA; naftilecetsav,

NAA), valamint más-más makroelem koncentrációt alkalmaztunk. A változtatás hatását a

regeneráció hatékonyságára módosított MS9-típusú táptalajon (MS9N, MS92, MS92N)

tanulmányoztuk. Ezek a táptalajok a használt auxin típusában (IAA, NAA) és az MS

makroelemek koncentrációjában tértek el egymástól. Az MS9 és MS92 táptalaj IAA-t, míg az

MS9N és MS92N ugyanolyan moláris koncentrációban NAA-t tartalmazott. A makroelemek

koncentrációja az MS9 és MS9N táptalajokban az eredeti MS táptalajoknak megfelelı volt,

de az MS92 és MS92N táptalajok az elızıkhöz képest csak a fele mennyiségben tartalmazták.

Az újabb háromféle táptalajon minden genotípus regenerációs képességét három ismétlésben

vizsgáltuk, az eredményeket az 5.1 összefoglaló táblázat 2-4 oszlopában mutatjuk be.

Vizsgálataink szerint az IAA lecserélése NAA-ra az eredeti makroelem tartalmú táptalajban

(MS9 helyett MS9N) nem javította, hanem rontotta a növényregeneráció hatékonyságát. A

kiválasztott kilenc genotípus közül öt genotípus éretlen embrióiból egyáltalán nem lehetett

növényeket regenerálni (Mv Emma búzafajta mindkét genotípusa, Mv Pálma, Bánkúti

1201/B2 és B70 törzs), s az átlagos regenerációs hatékonyság értéke 10%-ról 3%-ra csökkent.

Ugyanakkor az MS makroelemeket fele koncentrációban tartalmazó táptalajok (MS92,

MS92N) alkalmazása a hajtásregeneráló fázisban nagymértékő pozitív változást

eredményezett. Fenti paraméterek mellett minden genotípus éretlen embriói kalluszosodtak és

a kalluszok 10-35%-ából lehetett növényeket regenerálni. Ez minden genotípusnál

szignifikáns pozitív változást jelent (5% szignifikancia szinten) a makroelemeket eredeti

koncentrációban tartalmazó táptalajokkal elért eredményekhez képest. A legalacsonyabb

regenerációs hatékonyságot a Bánkúti 1201/B70 törzse mutatta (10%, MS92 táptalajon), a

legjobban pedig, az Mv Emese búzafajta éretlen embrióiból nyert kalluszok regenerálódtak

59

(35%, MS92 táptalajon). Az átlagos regenerációs hatékonyság a makroelemeket fele

koncentrációban tartalmazó táptalaj alkalmazása mellett 22% és 20% volt, melyek

szignifikánsan magasabbak, mint az eredeti MS táptalajok használatakor kapott értékek (10%

és 3%). Eredményeink jól egyeznek Constabel és Shyluk, (1994) adataival, miszerint az

ásványi sók mennyiségének csökkentése a táptalajban segíti a hajtás és a gyökér

regenerációját. He és mtsai. (1989) a búza éretlen embriók és protoplasztok embriogén

kapacitását találták magasabbnak a makroelem koncentráció alacsonyabb értéke mellett.

Az auxin típusának változtatása általában nem eredményezett szignifikáns javulást a vizsgált

ıszi magyar búzafajták növényregenerációs képességében. Két esetben azonban szignifikáns

változást kaptunk, 5.1 táblázat, 2-4 oszlop adatai. Csökkentett makroelem koncentráció

mellett az Mv Emma búzafajta egyik genotípusának (2+12 HMW-GS összetételő)

regenerációs képessége szignifikánsan magasabbnak bizonyult IAA használata mellett (MS92

táptalaj, 18%), mint NAA használatakor (MS92N táptalaj, 11%). Ugyanakkor a Bánkúti

1201/B70 törzs a NAA használata mellett (MS92N táptalaj) mutatott szignifikánsan

magasabb regenerációs képességet (10 helyett 21%). A többi genotípusra általában csak az

mondható el, hogy minden Martonvásári búzafajta az MS92 hajtásregeneráló táptalaj

használatakor, ha nem is javult szignifikánsan, de magasabb regenerációs hatékonyságot (18-

35% szemben a 11-29%-kal) mutatott. Ugyanakkor a Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta

mindhárom törzsének regenerációs hatékonysága az MS92N táptalajon volt a legjobb (21-

28% szemben a 10-30%-kal).

Annak ellenére, hogy az átlagos regenerációs hatékonyság a makroelem koncentráció

csökkentésével 3-10%-ról 20-22%-ra javult, az in vitro szövettenyésztés során több minıségi

problémát is tapasztaltunk. A sötétben indukált kalluszok mindössze egy-két százaléka volt

embriogén, azaz a kompakt kalluszok felszínén csak néhány esetben figyeltünk meg apró

fehér kinövéseket (embrioidok). A legtöbb kallusz (a kalluszok több mint fele), vagy már a

kalluszindukció alatt, vagy pedig a fényszakaszban szinte teljesen elvizesedett és/vagy

megbarnult.

5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra

A fentiekben ismertetett minıségi problémák kiküszöbölése érdekében a következı

kísérletben a szövettenyésztés mindhárom egymást követı fázisában alacsonyabb inkubációs

hımérsékletet alkalmaztunk. Az embriókat, a kalluszokat és a zöld képzıdményeket 26±1 oC

helyett ennek a kísérletnek minden szövettenyésztési fázisában 23±1 oC hımérsékleten

60

tartottuk. Kalluszindukció céljából az embriókat BEG2 táptalajon inkubáltuk, és a

hajtásregenerációban ugyanazt a négyféle táptalajt használtuk (MS9, MS9N, MS92, MS92N),

mint az elızı, magasabb hımérsékleten végrehajtott kísérletekben. A megvilágítás intenzitása

és fotóperiódusa is ugyanaz volt (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus). Kísérleteink során

megfigyeltük, hogy az alacsonyabb hımérséklet alkalmazása egyértelmően jó hatással volt a

kalluszok indukciójára. A sötét szakaszban a kalluszok lassabban fejlıdtek ugyan, de külsı

megjelenésük ígéretesebb volt (keményebb szövet, ’grízes’ felszín). Az embriogén kalluszok

száma minden genotípus esetében meghaladta a 15%-ot, és átlagosan 18-22% volt. A

szövettenyésztés mind sötét, mind fényszakaszában a kalluszok sokkal kisebb hányada

(maximum 5-6%) vizesedett el, és csökkent a barna, nekrotikus elhalást mutató kalluszok

száma is. Mindezen minıségi változások mellett, és valószínőleg hatására, az átlagos

növényregenerációs hatékonyság is javult. Míg a 26±1 oC hımérsékleten elvégzett összes

(mindenegyes genotípus és minden táptalaj alkalmazása melletti) kísérlet eredményeit

átlagolva az átlagos regenerációs képesség 13% volt, addig a 23±1 oC hımérsékleten

elvégzett összes kísérlet eredményeit átlagolva jóval magasabb értékeket kaptunk (57%) (5.1

táblázat). Mindemellett nagyon fontos hangsúlyozni, hogy a növényregeneráció hatékonysága

(20-96%) ebben a kísérleti beállításban is nagymértékben függött a genotípustól. A

legalacsonyabb regenerációs képességet (20%, MS9N táptalajon) az Mv Emma búzafajta

(5+10 genotípusa) mutatta, míg a legjobban az Mv Emese búzafajta regenerálódott (96%,

MS92 táptalajon). A genotípus mellett ezen az alacsonyabb hımérsékleten is erıteljesen

befolyásolta a kísérletbe vont búzafajták regenerációs hatékonyságát az alkalmazott táptalajok

összetétele. Az auxin típusának megváltoztatása (IAA helyett NAA) az eredeti koncentrációjú

MS táptalajok esetén (MS9 helyett MS9N) a búzafajták átlagos regenerációs képességét nem

javította (35% ill. 37%). Az egyes genotípusokra kapott regenerációs értékek közötti

különbségek azonban az mutatják, hogy míg a Martonvásári búzafajták növényregenerációja

kis mértékben romlott (28-45%-ról 27-37%-ra), kivétel ezalól az Mv Emma két genotípusa,

addig a Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének regenerációs képessége valamelyest javult az

MS9N táptalajon (33-39%-ról 39-58%-ra). A pozitív változás csak egy búzafajta esetében

(Bánkúti 1201/B8 törzs) volt szignifikáns, a növényregeneráció mértéke 39%-ról 58%-ra

emelkedett. Szignifikáns pozitív változást ezen az alacsonyabb inkubációs hımérsékleten

(23±1 oC) a makroelemek koncentrációjának felére csökkentése hozott, mely érvényes

minden genotípusra. A koncentráció csökkentése az átlagos regenerálhatóságot 35-37%-ról

78%-ra növelte. Ilyen körülmények között a legalacsonyabb regenerációs hatékonyságot

(48% MS92 táptalajon, 54% MS92N táptalajon) most is a Bánkúti 1201/B70 törzs mutatta.

61

Legeredményesebben ismét az Mv Emese búzafajta éretlen embrióiból nyert kalluszok

regenerálódtak (96%, MS92 táptalajon). Az IAA helyettesítése NAA-val, a makroelemeket

fele mennyiségben tartalmazó táptalajokban (MS92 helyett MS92N), hasonló változást

eredményezett a vizsgált búzafajták regenerációs hatékonyságában, mint az eredeti MS

koncentrációjú táptalajokban. Azt tapasztaltuk, hogy a Martonvásári búzafajták éretlen

embriói az IAA tartalmú hajtásregeneráló táptalaj (MS92) alkalmazása mellett regenerálódtak

jobban. Regenerációs hatékonyságukat 62-96% közötti értéknek találtuk, szemben az NAA-t

tartalmazó táptalajok (MS92N) használata során kapott 56-90% növényregenerációval. A

Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének éretlen embriói az NAA tartalmú táptalajon

(MS92N) regenerálódtak jobban (54-93% szemben a 48-86%-kal). Szignifikáns javulást

azonban csak a B2 törzs esetén tapasztaltunk (80% helyett 88%). A többi genotípus éretlen

embrióiból nyert kalluszok növényregenerációs képességét az alkalmazott auxin típusa nem

befolyásolta szignifikánsan, 5% szignifikancia szinten. Annak ellenére, hogy a Martonvásári

búzafajták és a Bánkúti 1201 búzafajta három törzse eltérı regenerációs képességet mutatott a

két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon, ha minden egyes vizsgált

genotípus kísérleti eredményeit figyelembe vesszük a növényregeneráció átlagos

hatékonysága közel azonos volt a két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon

(79% MS92 táptalajon és 78% MS92N táptalajon).

Ebben az alacsonyabb inkubációs hımérsékletet alkalmazó kísérleti beállításban nagyon

fontos eredményre jutottunk. Összességében azt mondhatjuk, hogy a szövettenyésztés

mindhárom fázisában 23±1 oC-ra csökkentett hımérséklet hatása szignifikáns pozitív

változást eredményezett a növényregeneráció mértékében: az átlagérték 13%-ról (26±1 oC)

57%-ra nıtt. (Az átlagértékek számításánál mindenegyes genotípusra és a

hajtásregenerációban alkalmazott minden táptalajra kapott regenerációs eredményeket

figyelembe vettük.) Ez az átlagérték azonban még mindig 60% alatt van. Ezért egy további

kísérleti beállításban az embriogén kalluszok számának növelése céljából a kalluszindukció

során még alacsonyabb (20±1 oC) hımérsékletet alkalmaztunk, míg a szövettenyésztés

késıbbi fázisaiban ugyanúgy, mint elızıekben, 23±1 oC hımérsékletet biztosítottunk. A

kalluszindukcióban BEG2 táptalajt, a hajtásregenerációban MS92 táptalajt használtunk és a

fényviszonyokon nem változtattunk. A sötétfázisban alkalmazott még alacsonyabb

hımérséklet hatására az embriogén kalluszok száma tovább nıtt (25-30%), de a regeneráció

hatékonysága nem javult, hanem 10-14%-kal volt alacsonyabb, mint azokban a kísérletekben,

amikor a kalluszindukciót 23±1 oC hımérsékleten végeztük (az eredményeket nem közöljük).

A negatív mennyiségi változások mellett megfigyeltük azt is, hogy a regenerált növények

62

nagy része nem a sötét szakaszban indukált kalluszok felületén képzıdött embrioidokból

fejlıdött tovább. Az embriószerő képzıdmények elhaltak, s a hajtáskezdemények a kalluszok

más területein jelentek meg elıször zöld foltok, majd zöld kinövések formájában. Ezeket a

megfigyeléseket figyelembe véve arra következtethetünk, hogy az alkalmazott

szövettenyésztési viszonyok között az általunk tesztelt búzafajták növényregenerációja

valószínőleg túlnyomórészt organogenézisen és nem embriógenézisen keresztül játszódik le.

A növényregeneráció hatékonyságára kapott alacsonyabb értékek és fenti megfigyeléseink

miatt a hımérséklet 23±1 oC alá csökkentését a késıbbiekben nem alkalmaztuk, mert ha a

növényeket organogenézisen keresztül regeneráljuk a kalluszokból, az mozaikossághoz

vezethet. A mozaikosságot a növényi transzformációban kerülni kell, hogy az idegen DNS-

molekulát a géntechnológiával módosított növény minden sejtje hordozhassa. Ez csak akkor

valósulhat meg, ha a szövettenyésztés optimális körülményeinek kidolgozásakor alapvetıen

embriógenézist indukálunk, hogy szomatikus embriógenézissel fejlıdhessen tovább a

transzformált sejt (Shewry és Jones, 2005).

5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra

A szövettenyésztés hajtásregeneráló fázisában alkalmazott megvilágítás spektrális összetétele,

intenzitása és fotóperiódusa egyaránt befolyásolja a kallusz sejtek differenciálódását. Noha a

kutatók nagy része ma már nem vizsgálja az optimális fejlıdéshez és differenciálódáshoz

szükséges fény minıségét és mennyiségét, ennek fontosságáról számos korai riport számolt

be (Thorpe, 1980; Hughes, 1981). Munkánk külön kísérleti beállításaiban mind a kilenc búza

genotípus kalluszainak regenerációs képességét alacsony (20 µmol m-2 s-1) 16/8 óra

fotóperiódussal, vagy magas (50 µmol m-2 s-1) intenzitású fényt állandó megvilágítással

használva vizsgáltuk. A fenti kísérletek hajtásregeneráló fázisában mindig alacsony

intenzitású megvilágítást alkalmaztunk 16/8 óra fotóperiódussal. Ekkor az inkubációs

hımérséklet csökkentése (26±1 °C-ról 23±1 °C-ra) és a felére csökkentett mennyiségő

makroelemet tartalmazó táptalajok alkalmazása (MS92, MS92N) hatására minden vizsgált

ıszi búza genotípus éretlen embrió eredető kalluszaiból nagy számú növényt regeneráltunk.

Az átlagos regenerációs képesség 20%-ról 78%-ra nıtt, a legalacsonyabb érték 48% (Bánkúti

1201/B70 törzs, MS92 táptalajon), míg a legmagasabb 96% volt (Mv Emese, MS92

táptalajon) (5.1 táblázat). A pozitív mennyiségi változások mellett azonban kísérleteinkben a

kalluszokból lassan (6-8 hét) fejlıdtek ki hajtások, az embriók preparálásának idıpontjától

számítva 11-13 hét alatt (5 hét kalluszindukció), amit 4 hét gyökérregeneráció követett. A

63

hosszú szövettenyésztési idı az irodalmi adatok szerint genetikai instabilitáshoz és nagyfokú

szomaklonális variabilitáshoz vezethet (Harvey és mtsai., 1999). Ezért a következı kísérlet

hajtásregeneráló fázisában a megvilágítás intenzitását és idıtartamát megnöveltük (50 µmol

m-2 s-1, állandó fény). Ez gyorsíthatja a kalluszok redifferenciálódását, de az alkalmazott

fényviszonyokat empirikus úton szükséges meghatározni (Thorpe, 1994). A szövettenyésztés

hımérsékletét (23±1 oC) és a hajtásregeneráló táptalajok összetételét (MS9, MS9N, MS92,

MS92N) nem változtattuk. A fényviszonyok módosítása nem vezetett egyértelmő

eredményekre. Jó hatással volt ugyan a kalluszok redifferenciálódására (már egy hét után

nagy számú zöld folt és hajtáskezdemény jelent meg), de a többnyire fodros hajtások nem

fejlıdtek növénnyé, és a kalluszok nagymértékben gyökeresedtek. A regeneráció mértéke

ezért nem volt számszerősíthetı. A negatív változásokat az NAA tartalmú táptalajon

tenyésztett kalluszokon figyeltük meg (MS9N, MS92N). Ezek aktív citokinin/auxin hormon

aránya kisebb, mint az IAA tartalmúaké (MS9, MS92), mivel az NAA azonos mól arány

esetén nagyobb bioaktivitású auxin típusú hormon, mint az IAA (Thorpe, 1994). A szerzı

szerint a főfélék in vitro hajtás regenerációja általában alacsony citokinin koncentrációt

igényel, de a citokinin/auxin hormon arány erısen függ a genotípustól is. A következı

kísérletben a citokinin/auxin hormon arányt a két NAA tartalmú táptalajban a citokinin (BAP)

abszolút mennyiségének duplájára emelésével (4,4 µM helyett 8,8 µM BAP) növeltük meg.

Hatására a kalluszok gyökeresedése csökkent, de a hajtások fodrosak maradtak, melyekbıl

növények továbbra sem fejlıdtek. Így a gyökérképzıdés visszaszorulása nem javította a

növényregeneráció mértékét. Elképzeléseink szerint ennek két oka lehetséges. Az egyik, hogy

a kísérleteink sötét fázisa után alkalmazott állandó, magasabb (50 µmol m-2 s-1) intenzitású

megvilágítás a kalluszok számára fény stresszt jelentett. A másik az lehet, hogy búzánál, mint

a legtöbb növénynél a hajtásregeneráció mértékét a külsı (táptalajban használt)

citokinin/auxin hormonarány mellett a genotípus és az alkalmazott szövettenyésztési

körülmények (táptalaj összetétel, hımérséklet- és fényviszonyok) együttes hatása befolyásolja

(Thorpe, 1994; Fischer-Iglesias és mtsai., 2001). Az okok keresése, az optimális körülmények

kidolgozása céljából az egyes paraméterek változtatásának hatását elıbb külön-külön (mint

fent), majd együttesen is vizsgáltuk (következı, 5.1.4 fejezet).

64

5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj

összetétel együttes hatása a növényregenerációra

Az elızıekben ismertetett minıségi problémák (túl hosszú szövettenyésztés, a kalluszok

erıteljes gyökeresedése és fodros hajtások képzıdése), kiküszöbölése érdekében a következı

kísérleti beállításban a szövettenyésztés egymást követı három fázisában a megvilágító fény

intenzitását valamint a hımérsékleti értékeket fokozatosan és együttesen változtattuk. A

kísérletbe vont mind a kilenc búza genotípus éretlen embrióit most is sötétben, a korábban is

alkalmazott körülmények között (BEG2 táptalaj, 23±1 oC) kalluszosítottuk. A hajtások

regenerálását csak két különbözı, az eredetihez képest fele makroelemet tartalmazó táptalajon

(MS92, MS92N) végeztük. A fény stressz elkerülése érdekében azonban a kalluszokat elıször

2 hétig alacsony intenzitású fénnyel világítottuk meg (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus)

23±1 oC hımérsékleten, majd a zöldülı kalluszokat azonos összetételő táptalajon, de állandó,

magas fényintenzitás mellett (50 µmol m-2 s-1) és magasabb hımérsékleten (26±1 oC)

tenyésztettük, míg növények nem fejlıdtek rajtuk. Ez általában még 2 hetet vett igénybe. A

hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes növelésének hatására a két különbözı

összetételő táptalajon megfigyeltük, hogy a kalluszok sokkal kevésbé gyökeresedtek, rajtuk

fodros levelek nem képzıdtek, így minden hajtáskezdemény növénnyé fejlıdhetett. Ezek a

minıségi változások a növényregeneráció hatékonyságára is pozitív hatással voltak. Az

átlagos növényregenerációs képesség az elızı kísérletben elért 78%-ról MS92N táptalajon

82%-ra, míg MS92 táptalajon 83%-ra emelkedett (5.2 táblázat). Eredményeink jól egyeznek a

Thorpe (1994) által megállapítottakkal, miszerint szinte minden in vitro tenyésztés

hatékonyságát több faktor együttes hatása befolyásolja, s ezeket empirikus úton szükséges

meghatározni.

5.2 táblázat A hajtásregeneráló táptalaj összetétel, valamint a hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes változtatásának hatása a növényregenerációra.

(LSD5%=6,7) hajtás regeneráció hatékonysága (%)

táptalaj Mv Emese

Mv Emma (5+10)

Mv Emma (2+12)

Mv Magvas

Mv Martina

Mv Pálma

B1201 (B2)

B1201 (B70)

B1201 (B8) átlag

MS92 99,9 88,3 88,5 79,2 90,3 71,1 89,4 57,2 85,5 83,3 MS92N 91,1 80,0 78,2 73,3 87,1 66,2 93,1 68,0 96,2 81,5

A fenti kísérleti körülmények között ismét az Mv Emese búzafajta éretlen embrióinak

regenerációs hatékonysága volt a legmagasabb (99,9%, MS2 táptalajon). Az alkalmazott

szövettenyésztési módszer a többi búzafajta esetében is (Mv Emma, Mv Martina, Bánkúti

65

1201/B2 és B8 törzs) 80%-nál magasabb regenerációs hatékonyságot eredményezett (88,5%,

90%, 93%, 96%) és egyetlen búzafajta sem mutatott alacsonyabb regenerációs képességet,

mint 57% (Bánkúti 1201/B70 törzs). A Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta három törzsének

(B2, B70, B8) in vitro regenerációs képessége, ha nem is minden esetben szignifikánsan, de

eltért egymástól (89,4%, 57,2%, 85,5% MS92 táptalajon; 93,1%, 68,0%, 96,2% MS92N

táptalajon). A három közül két búza törzs (B70, B8) növényregenerációs képessége

szignifikánsan magasabb volt MS92N hajtásregeneráló táptalajon, mint az MS92 táptalaj

alkalmazása mellett. Ez az eredmény nagyon hasonló Pellegrineschi és mtsai. (2002) által

publikált, a Bobwhite búzafajta egyes törzseinek növényregenerációs képességét

tanulmányozó kísérletekben tapasztaltakkal. Eredményeink az irodalmi adatokkal

megegyezıen azt jelzik, hogy lehetséges még egy tájfajtán belül is a jó regenerációs

képességre szelektálni. A Martonvásári búzafajták mindegyike, ebben a kísérleti beállításban

is, az MS92 táptalajon mutatott jobb regenerációs képességet. Közülük három búzafajta (Mv

Emese, Mv Emma két genotípusa) regenerációs hatékonysága szignifikánsan magasabb volt,

mint az MS92N táptalajon elért értékek. Ebben a kísérleti beállításban is, mint az elızı

kilencben is, a regenerációs képesség nagymértékben függött a búza genotípusától, de a

különbözı kísérletekben az egyes genotípusok hasonló módon viselkedtek. Mind a tíz

különbözı kísérleti beállításban kapott eredményeinket elemezve, a genotípus és a különbözı

szövettenyésztési körülmények között szoros, pozitív korrelációt állapítottunk meg (0,83** -

0,99***).

Összefoglalva elmondható, hogy az általunk kidolgozott szövettenyésztési módszer mind a

kilenc vizsgált, köztük hat kereskedelmileg is fontos magyar búzafajtára alkalmas, nagy

hatékonyságú módszer. A genotípusok közötti regenerációs képességbeli különbségek nem

tőntek el, ami azt jelezheti, hogy az általunk vizsgált paraméterek nagy valószínőséggel olyan

változásokat eredményeztek a kísérleteinkbe bevont ıszi búza genotípusok regenerációs

képességében, melyek általános érvényőek. Ennek eredményeként a módszer különösen

hasznos lehet, mivel jó kiindulási alapot szolgáltat további búzafajták regenerációs

képességének teszteléséhez, optimalizálásához.

66

5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz

A fentiekben tárgyalt, belövés nélküli regenerációs kísérleteinkben a növényregeneráció

hatékonyságát a hajtásregeneráló táptalajok összetételének és a hajtásregeneráció

körülményeinek (fény, hımérséklet viszonyok) változtatása mellett vizsgáltuk. A két

eredmény kombinációjaként a regenerálódás mértéke belövetlen kalluszokkal több ıszi búza

genotípusnál (Mv Emese, Mv Martina, Bánkúti 1201/B2 és B8 törzs) meghaladta a 90%-ot,

mely jó kiindulási alapot nyújtott a búza genetikai módosítására biolisztikus módszerrel. Ezt a

kidolgozott szövettenyésztési módszert búza transzformációs kísérleteinkben a fenti négy

legjobb regenerációs képességő ıszi búza genotípusra alkalmaztuk. A szelekciós markergént

és a transzgént ugyanúgy, mint korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) az éretlen

embriókból nyert egyhetes kalluszokba juttattuk be biolisztikus módszerrel. A célszövet

túlzott sérülésének elkerülése és a megfelelı hatékonyságú növényregeneráció fenntartása

érdekében a belövés fizikai paramétereit az irodalmi adatok szerinti optimális (Rasco-Gaunt

és mtsai., 1999a; Harwood és mtsai., 2000) értéknek választottuk. A transzformált sejtek

kiválogatásához, valamint belılük növények regenerálásához azt az nptII/kanamycin

szelekciós rendszert használtuk, mely a korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) sikeres

transzformációra vezetett. Az antibiotikum szelekciót a lövés utáni szövettenyésztés korai

szakaszában elkezdtük. A kalluszokat két hétig sötétben BEG2 táptalajon szelekciós ágens

nélkül tenyésztettük, majd a friss kalluszindukáló táptalajba 50 mg/l kanamycint adagoltunk

és további két hétig inkubáltuk sötétben. A hajtások és a gyökér regenerációja is szelekciós

nyomás alatt történt, mint azt más kutató laboratóriumokban is végezték (pl. Rooke és mtsai.,

1999). A belövés utáni növényregenerációs hatékonyság a kanamycin tartalmú táptalajokon a

kísérletbe vont ıszi búza genotípusoknál 8-15% volt, mely eredmény jól egyezik más kutató

csoportok eredményeivel (Lee Rooke személyes közleménye). Az irodalmi adatok szerint a

kanamycint ennél nagyobb koncentrációban (100 mg/l) csak transzgénikus rizs növények

szelekciójához használják (Chamberlain mtsai., 1994). Kísérleteinkben minden genotípus

esetén nagy számban (30-40) kaptunk regenerált búzanövényt, melyeknek csak egy részében

tudtuk kimutatni a transzgén jelenlétét (4-5 növény/genotípus). A DNS szintő vizsgálatokat a

fiatal növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en PCR módszerrel végeztük. A PCR pozitív

T0 növények T1 szemtermésébıl többet elvetettünk, de a T1 növényekbıl izolált DNS-ben

nem tudtuk kimutatni a szelekciós markergén jelenlétét. Ha figyelembe vesszük az

alkalmazott szelekció hatékonyságára vonatkozó irodalmi és személyes közleményeket (mint

fent), a gén „elvesztése” nagy valószínőséggel nem a szelekció hiányossága, hanem inkább

67

annak lehetett az eredménye, hogy a transzgén mozaikosan épült be a búza genetikai

állományába. A mozaikosságot a növényi transzformációban úgy tudjuk elkerülni, ha

megtaláljuk a szövettenyésztés körülményeinek kidolgozása során az alapvetıen

embriógenézist indukáló táptalajokat és körülményeket (Shewry és Jones, 2005).

A továbbiakban a növényregeneráció hatékonyságát javítani szándékozó szövettenyésztési

kísérleteinket olyan módosításokkal egészítettük ki, melyek a szomatikus embriógenézist

segíthetik elı. Míg korábbi növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai., 2004) csak

a hajtásregenerációban alkalmazott körülményeket (táptalajok összetétele, hımérséklet- és

fényviszonyok) változtattuk, addig a továbbiakban a kalluszindukció körülményeit és a

hajtásregeneráció korai szakaszának (elsı három hét) táptalaját módosítottuk. Korábbi

növényregenerációs kísérleteinkben valószínőleg a preparált éretlen embriók

dedifferenciálódása sem volt megfelelı. Mindezek miatt az embriópreparálás módját és a

kalluszindukcióban alkalmazott táptalajok összetételét módosítottuk.

Kísérleteinkben a legjobb regenerációs hatékonyságot mutató magyar ıszi búzafajta (Mv

Emese) mellett két tavaszi, úgynevezett modell búzafajtát is vizsgáltunk (Bobwhite és

Cadenza). A modell búzafajták alkalmazása lehetıvé tette a használt szövettenyésztési

körülmények és táptalajok, valamint a kiindulási növényi anyag tesztelését.

A csírázás megakadályozása, valamint az embriók eredeti genetikai programjának leállítása

érdekében az éretlen embriók embriócsúcsát mikroszkóp alatt eltávolítottuk. Az így preparált

szkutellum ma az egyik leggyakrabban használt kiindulási szövet a búza biolisztikus

módszerrel történı transzformációjában (Jones és mtsai, 2005). A preparált szkutellumokat

olyan kalluszindukáló táptalajra helyeztük, melyek nem tartalmaztak glicint, de tartalmaztak

10 mg/l AgNO3-ot, nagyobb mennyiségő szacharózt (30 g/l helyett 90 g/l) és változó

mennyiségben 2,4-D auxin típusú hormont (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l). Kísérleti

eredményeink azt mutatták, hogy a növényregeneráció hatékonysága leginkább a preparált

embriók méretétıl (azaz hormon tartalmától) függött, mint azt Pastori és mtsai. (2001) is

publikálták. A regenerációs képességet nagymértékben befolyásolta a kísérletbe vont

búzafajta genotípusa is. A legtöbb növényt a Bobwhite és Cadenza búzafajtáknál a kicsi (0,5-

1,0 mm) és közepes mérető (0,8-1,2 mm) embriókból kiindulva neveltünk (75-80%), míg az

Mv Emese búzafajta regenerációs képessége a nagymérető (1,0-1,6 mm) embriókból

kiindulva (5.1 ábra) volt a legmagasabb (80%). Az Mv Emese búzafajta kicsi embrióiból

preparált szkutellumok kalluszaiból egyáltalán nem lehetett növényt regenerálni. Az

embriócsúcs eltávolítása mindenegyes búzafajta esetén és bármely mérető embrióból

kiindulva megakadályozta a csírázást.

68

6 5 4 3 2 1

5.1 ábra Éretlen embriók csoportosítása méret szerint: 1 és 2 kicsi (0,5-1,0 mm), 3 közepes (0,8-1,2 mm), 4 és 5 nagy (1,0-1,6 mm), 6 túl nagy. A Bobwhite búzafajta transzformálásához a hármas számú, áttetszı szkutellumot és kissé opálos embriócsúcsot tartalmazó közepes mérető embriók a megfelelıek (Pellegrineschi személyes közleménye).

A növényregeneráció mértékét a genotípus és az embrió mérete mellett a kalluszindukáló

táptalaj 2,4-D tartalma (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l) is nagymértékben befolyásolta.

Mindhárom genotípus esetén a 0,5 mg/l 2,4-D tartalmú kalluszindukciós táptalaj (MD0,5;

Függelék II. táblázat) használatakor kaptuk a legtöbb növényt, mely jó korrelációt mutatott a

sötétben indukált embriogén kalluszok számával (az adatokat nem közöljük). Ez a

megfigyelés nagyon fontos, hiszen az embriogén kalluszokból az új növény a kallusz egyetlen

totipotens sejtjébıl fejlıdik ki embriószerő képzıdményen keresztül, s ezáltal a

géntechnológiai úton módosított növény feltételezhetıen minden sejtje hordozni fogja az

idegen DNS-molekulát. Az embrioidok hajtássá fejlıdését az elsı hajtásregeneráló fázisban

használt táptalajban (RZ+1/2Cu; Függelék II. táblázat) oldott 0,05 mM CuSO4-tal segítettük

az irodalomban publikáltak szerint (Sparks és Jones, 2004). Ugyanezen célból, valamint a

szomaklonális variabilitás elıfordulási esélyének csökkentése érdekében minden

szövettenyésztési fázist három hétre rövidítettünk le. A változtatások, azaz a szkutellumok

megfelelı mérető embriókból történı preparálása, embriógenézist indukáló táptalajok

használata a kalluszindukcióban és a hajtásregeneráció korai szakaszában, valamint a

szövettenyésztési fázisok lerövidítése elvezettek a megfelelı minıségő és hatékonyságú

növényregenerációhoz, s így a sikeres búza transzformációhoz.

69

5.3 Búza transzformációs kísérletek

5.3.1 Transzgénikus búzanövények elıállítása és tesztelése

Búza transzformációs kísérleteinkhez két tavaszi búzafajtát (Bobwhite 26 törzse, Cadenza),

valamint az ıszi búzafajták közül a növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai.,

2004) legjobbnak bizonyult Mv Emese Martonvásári búzafajtát használtuk. Több kísérletben

összesen 600 db Bobwhite, 3000 db Cadenza és 1260 db Mv Emese búzafajta éretlen

szkutellumát kotranszformáltuk ekvimoláris mennyiségő pAHC25 és AmA1-pTLZ jelő

transzformációs kazettákkal. A széles körben alkalmazott pAHC25 jelő plazmid, mely a

herbicid rezisztenciát biztosító bar gént hordozza, lehetıvé tette a transzgénikus növények

szelekcióját (5.3 táblázat). Az AmA1-pTLZ jelő transzformációs kazetta az Amaranthus

hypochondriacus ama1 génjét tartalmazza, ami egy esszenciális aminosavakban gazdag

albumin típusú trartalékfehérjét kódol (Raina és Datta, 1992). Ez a 35 kDa molekulatömegő

AmA1 fehérje amellett, hogy nagy táplákozástani értéket képvisel és allergenitásra utaló

aminosav szekvenciákat nem tartalmaz. A megfelelı szövetspecifikus génexpresszió

biztosítása érdekében az ama1 gént búza endospermium specifikus promóter (1Bx17 HMW-

GS) mögé építettük. Ennek eredményeként az extra tartalékfehérje termelıdését csak a búza

endospermiumában várjuk, mely fehérje megjelenik a belıle készült búzalisztben is.

Munkánkban összesen 89 herbicid rezisztens T0 növényt regeneráltunk foszfinotricin (PPT)

szelekcióval. A szelekciós nyomást a szövettenyésztés késıi fázisában, csak a második

háromhetes hajtásregenerációs fázissal kezdıdıen alkalmaztuk. A táptalajok PPT

koncentrációja 4 mg/l volt. A különbözı genotípusokból regenerált herbicid rezisztens

növények számát, a PCR vizsgálatok eredményét és a transzformáció hatékonyságát az 5.3

táblázatban foglaljuk össze és a következı alfejezetben tárgyaljuk. A táptalajban alkalmazott

foszfinotricin szelekciót túlélt putatív transzgénikus növények mindegyike egészséges volt és

fenotípusosan sem különbözött a donor növényektıl.

5.3 táblázat A transzformáció hatékonyságának változása a genotípussal. Zárójelben (negyedik oszlop) a kotranszformáció hatékonysága látható.

PCR pozitív növény (db) genotípus

belıtt szkutellum

(db)

szelekciót túlélt

növény (db) bar bar és ama1

transzformáció hatékonysága bar

génre (%) Bobwhite26 600 16 6 5 (83%) 1,00 Cadenza 3000 60 20 12 (60%) 0,67 Mv Emese 1260 13 3 1 (33%) 0,24

összesen 4860 89 29 18 (62%) 0,60

70

5.3.1.1 Transzgénikus búzanövények tesztelése

A szelekciós markergén (bar) és a transzgén (ama1) jelenlétét a szelekciót túlélt három-négy

leveles állapotú búzanövények levelébıl kinyert genomi DNS-en PCR módszerrel

bizonyítottuk (5.2 ábra). Vizsgálatainkhoz génspecifikus primereket használtunk.

42 44 49 52 58 59 65 66 67 68 71 75 76 78 80 81 82 83 86 H2OCa Em Pl+ Pl+

5.2 ábra Transzgénikus növények genomi DNS-én végzett PCR vizsgálat AmaF1-NosR3 primer párral. Az amplifikált termék mérete 480 bp. 52, 58, 59, 65, 71, 76, 80, 83: PCR pozitív T0 növények számjelzése, Ca és Em: negatív növényi kontrollok (Cadenza és Mv Emese donor növények), Pl+: plazmid pozitív kontroll.

A bar gén jelenlétét hat Bobwhite, húsz Cadenza és három Mv Emese búzafajta szelekciót

túlélt, regenerált növényében mutattuk ki, mely 0,24-1,00 % transzformációs hatékonyságot

jelent (5.3 táblázat). A szelekciós markergént tartalmazó 29 búzanövény közül 18, a növények

62 %-a tartalmazta az ama1 transzgént is. Ezek a transzformációs- és kotranszformációs

gyakoriságra vonatkozó eredményeink jó egyezést mutatnak a korábban modell genotípusok

éretlen embrióival végzett legtöbb kísérlet eredményeivel (lásd. Rasco-Gaunt és mtsai., 2001

összefoglalója,). Kísérleteinkben a kotranszformáció hatékonysága genotípusonként változott

(5.3 táblázat, negyedik oszlop). A legmagasabb kotranszformációs hatékonyságot (83%) a

Bobwhite fajta, a legalacsonyabbat pedig (33%) az Mv Emese ıszi búzafajta esetén

tapasztaltuk. A Cadenza búzafajta kotranszformációja (60%) az átlaggal megegyezı volt. A

transzformációban elıállított, PCR pozitív T0 növényeket üvegházi kontrollált körülmények

között, elkülönítve neveltük fel. A búzanövények mindegyike fertilis, normális magkötésőnek

bizonyult.

A transzgénikus búzanövények további vizsgálataihoz (T1 és T2 generáció) a T0 növények

közül hét független transzgénikus vonalat választottunk. Ezek a Bobwhite búzafajta #15, a

Cadenza búzafajta #28, #58, #59, #80, #83, és az Mv Emese búzafajta #71 számú

transzgénikus vonalai voltak. Minden kiválasztott T0 növény 16 db T1 magjából T1

növényeket neveltünk, és a három-négy leveles növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en

71

a bar és az ama1 gén jelenlétét PCR módszerrel vizsgáltuk. Ezt követıen az öt-hat leveles

állapotú növényekben a bar gén aktivitását herbicid resziztencia teszttel is ellenıriztük úgy,

hogy egy hét eltéréssel a növényeket 1 g/l PPT tartalmú kereskedelmi forgalomban lévı

totális gyomirtó szerrel (FINALE, glufozinát-ammónium) kétszer lepermeteztük. A herbicid

resziztencia tesztet túlélt növények száma a különbözı transzgénikus vonalaknál 9-13 közötti

volt, ami a lepermetezett növények 56,3-78,6%-a (5.4 táblázat). A herbicid rezisztancia

tesztnek ellenálló legtöbb búzanövényt (13) a Cadenza búzafajta #59 vonala adta, a

legkevésbé ellenálló pedig az Mv Emese (#71) és a Cadenza búzafajta #58 és #83 számú

vonalai voltak (9 túlélı/16 tesztelt növény). A teszt eredménye nem csak a búza fajtájától

függıen változott, de a Cadenza búzafajtánál az egyes transzgénikus búzavonalakra is eltérı

eredményeket adott.

5.4 táblázat Génaktivitás ellenırzése herbicid resziztencia- és GUS hisztokémiai teszttel. PPT-permetezés (T1 generáció)

GUS festés (T2 generáció)

T0 növény számjelzése genotípus kezelt

növények (db)

túlélı növények

(db)

túlélı növények

(%)

tesztelt növények

(db)

GUS pozitív

növények (db)

GUS pozitív

növények (%)

#15 Bobwhite 16 10 62,5 48 23 47,9 #28 Cadenza 16 12 75,0 48 40 83,3 #58 Cadenza 16 9 56,3 27 21 77,8 #59 Cadenza 16 13 78,6 24 20 83,3 #80 Cadenza 16 11 68,8 36 27 75,0 #83 Cadenza 16 9 56,3 24 15 62,5

#71 Mv

Emese 16 9 56,3

nem teszteltük

Függetlenül azonban a búza fajtájától és azon belül a transzgénikus vonaltól, minden vizsgált

transzgénikus búzanövény esetében azt tapasztaltuk, hogy a bar gént hordozó PCR pozitív

növények mindegyike a bar gén által kódolt foszfinotricin-acetiltranszferáz (PAT) enzimet

expresszálta, mely inaktiválta a totális gyomírtószert, s ezzel biztosította a lepermetezett

növény számára a túlélést. A genomi DNS-en transzgénre (ama1) elvégzett PCR vizsgálatok

eredményei azt mutatták, hogy minden vizsgált transzgénikus vonal T1 utódja, mely

tartalmazta a markergént és expresszálta a PAT enzimet, hordozta az ama1 transzgént is.

Ebbıl azt a következtetést vonhatjuk le, hogy nagy valószínőséggel a bar gént tartalmazó

pAHC25 nevő plazmid és az ama1 gént hordozó AmA1-pTLZ jelő transzformációs kazetta

egymáshoz közeli helyre (lokuszra) épült be a búza genetikai állományába. Eredményeink

összhangban vannak számos kutatócsoport eredményeivel, miszerint a búza biolisztikus

72

transzformációja során a kotranszformált gének többnyire ugyanazon lokuszra épülnek be

(Pawlowski és Somers, 1998; Stoger és mtsai.,1998; Rooke és mtsai., 2003). A szerzık arról

is beszámoltak, hogy a szelekciós markergén és a transzgén az esetek többségében együtt

öröklıdtek át a következı nemzedékre. Kísérleteinkben a mindkét génre PCR pozitív

növények száma az elemzett T1 generációban a növények 56-78%-át tette ki, ami a Mendeli

öröklıdés szabályainak majdnem teljes mértékben megfelel. Ez jó egyezést mutat az elmúlt

néhány évben elvégzett búza transzformációs kísérletekben tapasztaltakkal, hogy a

géntechnológiai módszerrel bejuttatott gének a transzgénikus növények korai generációiban

Mendeli öröklıdés szerint jutnak tovább a következı nemzedékre (Vasil összefoglalója,

2007).

A T2 generáció nagy számú növényében (24 db növény/transzgénikus vonal) a marker-,

riporter- és transzgén jelenlétét a genomi DNS-en végzett PCR reakcióval, míg az uidA

génrıl expresszálódó glükuronidáz enzim (GUS) jelenlétét a szemtermésekben hisztokémiai

GUS teszttel igazoltuk. Ehhez a T1 növények érett T2 magjaiból (kivéve az Mv Emese #71

vonalát, mely apró szemeket termett) vékony szeletet vágtunk le a csíra oldallal szemben és

GUS festıoldatban inkubáltuk. Az GUS fehérjét expresszáló növények szemtermésének

vékony metszete kékre szinezıdött (5.3 ábra).

negatív kontroll 1 2 3 4 5

5.3 ábra A transzgénikus növények T2 szemtermésének hisztokémiai tesztje.

(GUS enzim aktivitás kimutatás) 1-5: a vizsgált búza növény utódvonalainak száma.

A csírát tartalmazó részbıl növényt neveltünk. A levélszövetbıl kinyert genomi DNS-en

végzett PCR reakciók valamint a GUS teszt eredményei azt mutatták, hogy a kotranszformált

marker/riporter- és a transzgén (bar/uidA és ama1 gének) a T2 generációban is megfeleltek a

Mendeli öröklıdés szabályainak (5.4 táblázat). A vizsgált növények 48-83%-a hordozta mind

a három gént. Találtunk a transzgénikus Cadenza #28, #59 és #80 vonalak utódjai között

olyan vonalakat is, melyeknek mind a 12 vizsgált T2 növénye hordozta mind a három gént

(úgynevezett ‘tiszta’ vonalak). A kotranszformált gének ebben a generációban is szinte

minden vizsgált transzgénikus vonal utódjaiban együtt, nem szegregálódva jutottak át a T2

73

generációba. Ez alól egyetlen kivétel volt, a transzgénikus Bobwhite #15 vonala, melynek két

T2 növénye csak az ama1 transzgént tartalmazta. Ehhez hasonló adatokat találunk az

irodalomban is, miszerint a kotranszformált gének általában együtt öröklıdnek, de az esetek

kis százalékában (<10%) a markergén és a transzgén szegregálódik a magasabb

generációkban (Rooke és mtsai., 2003). A Bobwhite búzafajta #15 vonala két transzgénikus

utódvonalainak további vizsgálata lehetıséget nyújt arra, hogy csak ama1 gént tartalmazó

transzgénikus búzavonalakat állítsunk elı. A szelekciós markergén hiánya elméleti

lehetıséget adhat arra, hogy a transzgénikus növény további szigorú feltételek teljesülése

mellett, alapos és körültekintı vizsgálatok után, akár kereskedelmi forgalomba is kerülhessen.

Ehhez természetesen szükséges a szabályozó szervezetek engedélye és a fogyasztók elfogadó

magatartása is, mely hosszú távon nem elképzelhetetlen.

5.3.1.2 Southern-blot analízis

Az ama1 gén jelenlétét a búza genomjában nem csak PCR reakcióval, hanem Southern-

hibridizációval is ellenıriztük. A sikeres beépülést, valamint az integrálódás mintázatát két

független transzgénikus Cadenza vonal (#28 és #58) több PCR pozitív T1 utódjában

vizsgáltuk. Negatív kontrollként a transzgénikus #28 vonal egyik PCR negatív utódvonalát

(transzgénikus null minta) használtuk. A növények levélszövetébıl CTAB módszerrel kinyert

genomi DNS EcoRI restrikciós enzimmel emésztett elegyét agaróz gélen elválasztottuk,

Nylon membránra transzferáltuk, majd a membránon lévı DNS-t DIG jelölt próbával

hibridizáltuk. Kemiluminszcens detektálás után megállapítottuk, hogy a #28 vonal utódjaiban

egy, míg az #58 vonal utódjaiban három (plusz egy hosszabb és egy rövidebb) hibridizálódó

DNS szakasz mutatható ki. A belsı kontrollként használt PCR negatív utódvonalban

(transzgénikus null #28 vonal) az elvárásoknak megfelelıen hibridizálódó sávot nem

detektáltunk (5.4 ábra).

74

5.4 ábra Transzgénikus Cadenza T1 növények Southern-blot analízise az ama1 génre. 1: a molekulatömeg standard (Promega, 1kb ladder) 1000bp mérető sávja, 2: negatív kontroll (a transzgénikus #28 vonal PCR negatív utódvonala), 3-6: a transzgénikus #28 vonal négy PCR pozitív utódvonala, 7: plazmid kontroll (a linearizált plazmid mérete ~6,4 kb), 8 és 9: a transzgénikus #58 vonal két PCR pozitív utódvonala. A nyilak a búza genomjába integrálódott, a próbával hibridizálódó DNS fragmenteket jelzik.

A vizsgálattal nem csak azt bizonyítottuk, hogy az ama1 gén stabilan integrálódott a búza

genetikai állományába, hanem a Southern-blot eltérı mintázata azt is jelzi, hogy a két

transzgénikus búzavonal biztosan két egymástól független transzformációs eseménybıl

származik. A hibridizálódott sávok száma jelzésértékő az integrálódó fragmentek számát

illetıen. A Cadenza búzafajta transzgénikus #28 vonalának Southern-blot elemzésekor

detektált egy sáv mérete megfelel a transzformációs kazetta restrikciós enzimmel történı

emésztése után kapott DNS molekula relatív mobilitásának. Ez azt jelzi, hogy az integrálódás

során a plazmid nem rövidült meg. Ezzel szemben az #58 vonalban a transzformáció során a

DNS kazetta nem csak teljes mérető integrálódása történt meg, hanem vagy beépülés közben

megrövidült a kazetta, vagy a beépülés után átrendezıdés történt, melyet a Southern-blot két

extra hibridizációt mutató sávja valószínősít. A legrövidebb (~1000bp) fragment mérete (5.4

ábra) megfelel az ama1 gén hosszának, azaz a transzformációs kazetta valószínőleg

elveszítette a promóter és a vektor részét. Ilyen jelenségrıl már korábban is beszámoltak búza

és rizs biolisztikus, valamint agrobaktérium közvetítette transzformációja során egyaránt (Fu

és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2006; Zhao és mtsai., 2007).

A transzgénikus növényeket és a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus

növényeket a donor növényektıl elkülönítve, kontrollált körülmények között neveltük fel.

75

5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása

A transzgén transzkripció ját a transzgénikus búzanövények éretlen T1 szemtermései

endospermiumából tisztított mRNS-en végzett RT-PCR reakcióval vizsgáltuk. A hosszában

félbevágott 20 napos éretlen szemek elemzésével minden, ama1 génre PCR pozitív növény

fejlıdı endospermiumában kimutatható volt az mRNS jelenléte is. Transzgénikus

vonalanként változó szintő transzkripciót detektáltunk (5.5 ábra), bár ez a szemi-kvantitatív

módszer nem a legmegfelelıbb a transzkripció mennyiségi viszonyainak jellemzésére,

összehasonlítására.

5.5 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának igazolása RT-PCR reakcióval. dw: desztilláltvíz, M: molekulatömeg standard, pl: plazmid pozitív, #28, #31, #58, #59, #80, #83: a T0 transzgénikus vonalak számjelzései, #49: a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus (PCR negatív) növény számjelzése.

A munkánkban használt búza endosperm specifikus promóter (1Bx17 HMW-GS)

szövetspecifitását transzkripciós szinten is igazoltuk. A levélbıl és gyökérbıl tisztított

mRNS-rıl átírt cDNS mintákon a PCR reakció negatív volt, míg a tubulin fehérje génjének

(pozitív kontroll) transzkripcióját mindkettıben ki tudtuk mutatni. Az endospermium

specifikus promóter az ama1 gén transzkripcióját csak az endospermiumban teszi lehetıvé.

Eredményeink összhangban vannak a korábban mások által (Jones és mtsai., 2005) és saját

munkánk során is tapasztaltakkal (Oszvald és mtsai., 2007), miszerint búza endosperm

specifikus promóterrel szabályozott idegen eredető gének is csak a búza endospermiumban

expresszálódnak.

Az ama1 gén transzkripciója idıbeli változását a Cadenza #28 transzgénikus vonal három T2

növényének éretlen szemtermésében követtük nyomon. Az éretlen endospermiumokból

virágzás után 10, 17, 24 és 31 nappal teljes RNS-t izoláltunk és a mintákban qRT-PCR

módszerrel tanulmányoztuk az mRNS mennyiségét. A reakcióelegyben lévı SybrGreen

76

floureszcenciájának mérésével kimutattuk, hogy az ama1 génrıl átíródott mRNS már a 10

napos mintákban is jelentıs mennyiségben jelen van. A telítési jellegő görbe elemzésével

megállapítottuk, hogy mennyisége kb. a huszadik napig tovább nıtt, majd nagyon lassú

csökkenés indult el (5.6 ábra).

0,0000

0,0001

0,0010

0,0100

0,1000

1,0000

10,0000

0 5 10 15 20 25 30 35

Virágzást követ ı napok száma

ama1

mR

NS

rel

atív

men

nyis

ége

T3 mag 28-3-13

T3 mag 28-3-22

T3 mag 28-3-2

5.6 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának mennyiségi elemzése qRT-PCR reakcióval. Az ama1 mRNS mennyiségét a tubulin fehérje mRNS-ének mennyiségéhez viszonyítottuk. A vizsgálatot három T2 növény (T228-3-2, T228-3-13, T228-3-22) éretlen szemtermésével végeztük.

Minden mintát és a kontrollt is öt ismétlésben elemeztünk. A PCR reakció után felvett

olvadási görbék minden esetben egy csúcsot tartalmaztak, ami a reakciókörülmények (reakció

elegy összetétel, kapcsolási hımérséklet) helyességét igazolta. Eredményeink összhangban

vannak a korábban publikált adatokkal (Grimwade és mtsai. (1996), ami szerint a búza

endospermiumban a tartalékfehérje gének transzkripciója már 10 nappal a virágzás után

megindul, és az mRNS termelıdése, ami a 21-ik nap körül éri el a maximumát, majd lassú

csökkenést mutat a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig.

Az AmA1 fehérje búza szemtermésben történı expresszióját a félbevágott éretlen (20

DPA) T1 szemek másik felébıl kinyert fehérje Western-blot analízisével bizonyítottuk. A

Western-blot analízist arra is felhasználtuk, hogy ellenırizzük az ama1 gén transzlációjának

idıbeli korrekt lejátszódását. Ehhez a legjobban expresszáló Bobwhite #15 és Cadenza #28

vonalak egy-egy T1 növényének éretlen T2 szemtermésébıl nyertünk ki fehérjét a virágzás

után 17, 24 és 31 nappal. Az elválasztást követıen már az SDS-PAGE gélen egy új fehérje

sávot figyeltünk meg a kontrollként használt búzafehérje extraktum mintázatához képest. Az

új sáv mérete alapján a detektált fehérje molekulatömege 35 kDa (5.7.a. ábra), és a sáv

intenzitása a virágzás után eltelt idıvel egyre erısödött. A Western-blot analízis (5.7.b. ábra)

bizonyította, hogy ez az extra sáv az AmA1 fehérjének felel meg.

77

5.7 ábra Transzgénikus Cadenza növény (#28-4 vonal) SDS-PAGE és Western-blot elemzése. (a) A virágzás után 17, 24 és 31 nappal begyőjtött éretlen szemtermésbıl kinyert albumin fehérjefrakció SDS-PAGE vizsgálata. (b) Ugyanabból az éretlen szemtermésbıl extrahált fehérje Western-blot elemzése. A nem specifikus kötıdéső sáv a búza albumin fehérjének felel meg, mely az érés során változatlan mennyiségben expresszálódik. AmA1: az amarantusz magból extrahált vízoldható albumin fehérje, C: a donor (nem transzformált) növénybıl nyert búza endospermium fehérje. A nyilak mindkét ábrán a 35 kDa mérető AmA1 fehérjét (rekombináns fehérje) mutatják.

Az 5.7 ábrán jól látható, hogy a transzgénikus növények szemtermésében termelıdött extra

fehérje (rekombináns fehérje) az endospermium szövetekben növekvı mennyiségben

akkumulálódott a szemtermés fejlıdésének elırehaladtával. Eredményeink jól egyeznek

korábban publikált megfigyelésekkel, miszerint a búza tartalékfehérjék expressziója már 14

nappal virágzás után kimutatható az endospermiumban és szintézisük fokozódó intenzitással

folyik a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig (Gupta és mtsai., 1996).

5.3.3 Transzgénikus lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele

5.3.3.1 A szemtermések fizikai vizsgálata

A T2 szemtermés fizikai vizsgálataihoz a herbicid rezisztencia tesztet (PPT permetezés) túlélt

T1 növények szemtermését használtuk (lásd 5.4 táblázat). Az Mv Emese fajta #71 vonalának

utódjait nem vizsgáltuk, mert a búzaszemek nagyon aprók voltak (ezerszem tömeg 20 g, míg

a donor- és T0 növényé 42-45 g), s véleményünk szerint ez irreális eredményeket adott volna

a továbbiakban. A többi transzgénikus vonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59, #80 és

#83) esetében, mivel a markergén és az ama1 transzgén a T1 generációban együtt öröklıdtek,

az egyes vonalak T1 növényeinek szemtermését (90%-át) egyesítettük, hogy egy-egy vonalból

a vizsgálatokhoz elegendı mennyiség álljon rendelkezésre. Annak ellenére, hogy nem

78

jellemeztük teljesen a szemeket, a szemtermést egységes mintaként kezeltük, ahogyan ezt

korábban mások is tették transzgénikus búzavonalak T2 szemtermésének vizsgálatakor (Rooke

és mtsai., 1999). A transzgénikus vonalanként termett 260-300 búzaszembıl Perten SKCS

4100 készülékkel mért szemátmérı, ezerszem tömeg és szemkeménység értékeket az 5.5

táblázat tartalmazza. A szemtermés korlátozott mennyisége miatt a lisztmintákat a

szemkeménység mérés után kapott töret ırlésével mikro-szitán megszitálva állítottuk elı. A

vonalankénti 2,5-3,5 g lisztet (lisztkihozatal értékek az 5.5 táblázatban) a késıbbiekben

fehérje és funkcionális oldalról is vizsgáltuk.

A T3 szemtermést minden transzgénikus búzavonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59,

#80, #83) 3-4 független utódvonala 12 magjából kicsírázott T2 növények felnevelésével

nyertük (28-50 g szem) (lásd 5.4 táblázat). Találtunk négy Cadenza T1 vonalat (T128-6, T128-

12, T159-16, T180-16), melyek 12 magját elvetve a felnevelt növények mindegyike hordozta a

transzgént (tiszta T2 vonalak). A T4 szemtermést a T2-28-1-1 növény 12 magjából felnevelt

növények (tiszta T3 vonalak) termése adta. A fizikai paramétereket a Perten SKCS 4100

készülékkel 400-800 búzaszemen vizsgáltuk. A lisztet a töretbıl és teljes szemekbıl ıröltük,

majd szitáltuk. A mérési eredményeket két kontrollhoz viszonyítottuk, a nem transzformált,

úgynevezett donor növény, és a PCR negatív T2 növények, úgynevezett null transzgénikus

(null segregant) növények, szemtermésének adataihoz. A mért értékeket az 5.6 táblázatban

foglaljuk össze.

5.5 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésének fizikai jellemzıi és lisztkihozatala.

búzavonal szemátmérı (mm)

ezerszem tömeg (g) szemkeménység lisztkihozatal

(%) Bobwhite (donor) 2,50 34,2 78 35,01 T2-15 2,12 24,2 81 29,87 Cadenza (donor) 2,84 43,9 68 43,15 Cadenza (null transzgénikus)

2,68 38,7 69 41,15

T2-28 1,97 26,4 68 36,21 T2-58 2,06 28,9 62 41,75 T2-59 2,10 28,2 71 32,02 T2-80 2,29 33,2 76 32,04 T2-83 2,25 32,7 77 29,42

szórás 0,5 12 13 -

Méréseink szerint a T2 szemek átmérıje (1,97-2,29 mm) és ezerszem tömege (24,2-33,2 g)

szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll növények termésén mért értékeknél (2,50-2,84

mm; 34,2-43,9 g), ami általában jellemzı az elsı két transzgénikus generáció termésére (Peter

79

R. Shewry személyes közleménye). A búzaszemek kisebb mérete több esetben alacsonyabb

lisztkihozatalt eredményezett (29-42%), mint a kontroll búzaszemeké (35-43%).

A T3 és T4 búzaszemek átmérıje (2,51-3,23 mm) és ezerszem tömege (38,7-56,8 g)

hibahatáron belül egyezı értékeket mutatott a kontrollok értékeihez képest (2,73-2,84 mm;

41,1-45,8 g). A keménységi indexeket elemezve megállapítottuk, hogy az AmA1 fehérje

expressziója az endospermiumban nincs hatással a búzaszem keménységére, így mind a

három generáció transzgénikus pozitív és negatív növényei ugyanúgy, mint a donor

növények, a kemény endospermium szerkezető búzák közé sorolhatók (50-70 keménységi

index).

5.6 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésének fizikai jellemzıi és lisztkihozatala.

búzavonal szemátmérı (mm)

ezerszem tömeg (g) szemkeménység lisztkihozatal

(%) Bobwhite (null transzgénikus)

2,73 45,8 57 43,43

T3-15 3,03 50,5 67 43,55 Cadenza (donor) 2,84 43,9 68 44,12 Cadenza (null transzgénikus)

2,81 41,1 69 43,73

T3-28-6-tiszta 2,90 45,7 76 43,85 T3-28-12-tiszta 3,23 55,5 64 42,82 T4-28-1-1-tiszta 2,91 47,1 69 43,54 T3-58 3,13 56,8 54 39,67 T3-59-tiszta 2,70 43,1 66 42,43 T3-80-tiszta 2,56 41,7 58 44,45 T3-83 2,51 38,7 75 41,09

szórás 0,5 12 13 -

5.3.3.3 Lisztminták teljes- és rekombináns AmA1 fehérjetartalma

Teljes fehérjetartalom

A transzgénikus búzavonalak T2, T3 és T4 szemtermésébıl ırölt lisztminták fehérjetartalmát

Kjeldahl módszerrel három ismétlésben határoztuk meg.

A Cadenza búzafajták T2 lisztmintáiban a legalacsonyabb (12,59%) fehérjetartalmat a #80

vonal lisztjében, míg a legmagasabbat (13,10%) az #58 vonal lisztjében mértük (5.7 táblázat).

A mért értékek csak kis eltérést mutattak a nem transzformált (donor) és a nem transzgénikus

(null) növénybıl nyert kontroll lisztminták fehérjetartalmához képest (12,65 és 12,58%). A

Bobwhite #15 vonal T2 lisztjének teljes fehérjetartalma (12,18%) sem mutatott szignifikáns

eltérést a kontroll lisztminta fehérjetartalmától (11,60%).

80

5.7 táblázat Transzgénikus búza T2 szemtermésébıl nyert lisztminták teljes- és AmA1 fehérjetartalma.

lisztminta teljes fehérje (%) AmA1 fehérje (%) Cadenza (donor) 12,65 0 Cadenza (null transzgénikus)

12,58 0

T2-28 12,81 2,41±0,05 T2-58 13,10 2,28±0,05 T2-59 12,92 2,17±0,05 T2-80 12,59 2,25±0,05 T2-83 12,66 1,78±0,05 Bobwhite (donor) 11,60 0 T2-15 12,18 2,22±0,05

A transzgénikus búzavonalak T3 és T4 szemtermésébıl ırölt lisztminták teljes

fehérjetartalma 12,16% (Bobwhite #15) és 14,03% (Cadenza #58) között változott (5.8

táblázat). A mért értékek ezekben a generációkban sem különböztek jelentısen a kontroll

lisztminták értékeitıl, a rekombináns fehérje expressziója nem növelte az endospermium

fehérjetartalmát számottevıen (Bobwhite 11,55%, Cadenza 12,85).

5.8 táblázat Transzgénikus búza T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták teljes- és AmA1 fehérjetartalma.

lisztminta teljes fehérje (%) Ama1 fehérje (%)

Bobwhite (null transzgénikus)

11,55 0

T3-15 12,16 2,09±0,05 Cadenza (donor) 12,85 0 Cadenza (null transzgénikus)

12,97 0

T3-28-6-tiszta 12,29 2,16±0,05 T3-28-12-tiszta 13,51 2,41±0,05 T4-28-1-1-tiszta 13,68 2,57±0,05 T3-58 14,03 2,07±0,05 T3-59-tiszta 13,87 2,45±0,05 T3-80-tiszta 13,04 2,27±0,05 T3-83 12,97 1,94±0,05

Chakraborty és mtsai. (2000) ugyanezt az AmA1, albumin típusú, amarantusz tartalékfehérjét

expresszáltatták burgonya gumóban a keményítı bioszintézisben résztvevı enzim (GBSS)

szövetspecifikus promóterének irányítása alatt. Az általuk publikált eredmények, a hatás,

változás mértékét tekintve, jelentıs mértékben eltérnek az általunk mért adatoktól. A

transzgénikus növény gumójában a fehérjetartalom 35-45%-kal nıtt. Az eltérés egyik

lehetséges magyarázata, hogy a kontroll növény gumóinak fehérjetartalma rendkívül alacsony

81

(1,15%) volt. További indok lehet, hogy a két promóter hatékonysága eltér egymástól,

valamint hogy a transzgén nem egy, hanem több mint három kópiában épült be a

burgonyanövény genomjába.

Hasonlóan magas fehérjetartalom növekedést detektáltak (6-32%) transzgénikus kukorica

endospermium szövetében az amarantusz amarantin nevő fehérjéjét (11S globulin)

expresszáltatva, a rizs glutelin-1 promótere segítségével Rascón-Cruz és mtsai. (2004). A

nagymértékő fehérje expresszió növekedést itt is valószínőleg a transzgén magas kópia száma

(10 vagy több) indokolja, de befolyásolhatta az alkalmazott szövetspecifikus promóter eltérı

hatékonysága is az adott célszövetben.

Lisztminták AmA1 rekombináns fehérjetartalma

A transzgénikus búzában expresszálódó AmA1 fehérje relatív mennyiségét (a teljes fehérje

százalékában) indirekt ELISA módszerrel, Kang és mtsai. (2003) leírása alapján határoztuk

meg.

A T2 szemtermésbıl ırölt lisztminták teljes fehérjetartalma, mint azt fent bemutattuk, nem

különbözött szignifikánsan a kontroll búzanövények lisztjének teljes fehérjetartalmától.

Ugyanakkor az AmA1 fehérje mennyiségét a különbözı transzgénikus búzanövények

lisztjében 1,78-2,41% közötti értékeknek találtuk (5.7 táblázat). A legalacsonyabb AmA1

fehérjetartalmat (1,78%) a Cadenza #83 vonal lisztjében, míg a legmagasabb fehérjetartalmat

(2,41%) a Cadenza #28 vonal lisztjében mértük. A Bobwhite #15 vonalak AmA1

fehérjetartalma a szemtermés lisztjében 2,22%, míg a T3 szemek endospermiumában 2,09%

volt. A Cadenza búzavonalak T3 szemtermésbıl ırölt lisztmintáinak AmA1 fehérjetartalma

1,94-2,45% között változott (5.8 táblázat). A legalacsonyabb AmA1 fehérjetartalmat (1,94%)

szintén a Cadenza #83 vonal lisztjében, míg a legmagasabbat (2,45%) a Cadenza #59 ’tiszta’

vonalának lisztjében mértük. A T2-28-1-1 növény 12 utódjának (tiszta T3 vonalak) T4

szemtermése ırlésével nyert liszt AmA1 rekombináns fehérjetartalma volt a legmagasabb

(2,57%) az összes vizsgált transzgénikus búza lisztmintáé között (5.8 táblázat).

Hasonló eredményeket publikáltak Altpeter és mtsai. (1996a) endospermium specifikus

promóterrel szabályozott transzgén expressziójának szintjére transzgénikus búzában.

Munkájukban a Bobwhite búzafajtába az abból egyébként hiányzó 1Ax1 HMW-GS

tartalékfehérje gént biolisztikus transzformációval juttatták be, aminek hatására az

endospermiumban mért alegységfehérje koncentráció elérte a 2,3%-ot a legjobban

expresszáló transzgénikus vonalakban az összfehérjére vonatkoztatva. Amikor ugyanezt a

genotípust a hibrid 1Dy10:1Dx5 HMW-GS konstrukcióval transzformálták (Blechl és

Anderson, 1996), az endospermiumban expresszálódott fehérje mennyisége hasonló volt a

82

vadtípusú gének expressziós szintjéhez (2% körüli érték). Ennél jelentısen magasabb fehérje

expressziót detektáltak Barro és mtsai. (1997) egyes HMW-GS fehérje génnel transzformált

transzgénikus búzavonalaikban. Ennek magyarázata lehet, hogy az 1Dx5 HMW

tartalékfehérje gént hordozó DNS szakasz igen magas kópiaszámban (10-15) van jelen a

transzgénikus búzavonalak genetikai állományában. Szántóföldi kísérletekben is igazolták,

hogy ez a magas expressziós szint (4-6-szorosa a vadtípusnak) stabilan öröklıdött több

generáción át (Rakszegi és mtsai., 2005; Shewry és mtsai., 2005). Az általunk kapott

adatokhoz hasonló értékeket mértek transzgénikus rizs endospermiumában az idegen fehérje

expresszióját vizsgálva Oszvald és mtsai. (2007). Kísérleteikben ugyanazt az endospermium

specifikus promótert (búza 1Bx17 HMW-GS) alkalmazták, s az ehetı vakcinaként is

használható fehérje koncentrációja elérte a 2,7%-ot (a teljes fehérjére vonatkoztatva) az egyes

vonalakban.

5.3.3.4 Lisztminták esszenciális aminosav tartalma

A különbözı transzgénikus búzavonalak lisztmintáinak esszenciális aminosav összetételét

Adebowale és mtsai. (2007) módszerével határoztuk meg. A T2 szemtermésbıl ırölt összes

lisztmintára vonatkozó eredményeket a Függelék III. számú táblázatában adjuk meg. A

táblázatban látható, hogy az egyes aminosavak tartalmában 0-6,4% növekedés mutatható ki a

kontroll lisztminta értékeihez képest. A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41%)

transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) lisztjének mért értékeit az 5.9 táblázatban is

bemutatjuk. Ebben a lisztmintában a legnagyobb változást (6,4% növekedés) a lizin aminosav

mennyiségében találtuk a donor növény (negatív kontroll) lisztminták lizin tartalmához

képest. A tirozin aminosav mennyisége 3,8%-kal, a treonin aminosavé 3,1%-kal nıtt, a

kontroll minták megfelelı aminosavainak értékeihez képest. A metionin aminosav

mennyiségében nem mérhetı változás ezzel a módszerrel.

83

5.9 táblázat A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41 %) transzgénikus Cadenza #28 vonal T2 szemtermésébıl nyert lisztminta esszenciális aminosav összetétele.

aminosav tartalom (%) aminosav

Cadenza (donor) Cadenza (null) transzgénikus #28 vonal His 2,26 2,20 2,28 (0,9) Ile 3,38 3,33 3,46 (2,4) Leu 6,53 6,45 6,58 (0,8) Lys 2,19 2,18 2,33 (6,4) Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) Phe 5,03 4,98 5,08 (1,0) Thr 2,53 2,51 2,61 (3,1) Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) Val 4,28 4,26 4,34 (1,4)

Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.

A legmagasabb AmA1 fehérjetartalommal rendelkezı ’tiszta’ búzavonalak (Cadenza #28,

#59, #80 utódai) T3 és T4 termésébıl ırölt lisztminták esszenciális aminosav tartalma az 5.10

táblázatban látható.

5.10 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták esszenciális aminosav összetétele.

aminosav tartalom (%) aminosav

Cadenza (donor) Cadenza (null) T4-28-tiszta T3-59-tiszta T3-80-tiszta His 2,26 2,20 2,29 (1,2) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) Ile 3,38 3,33 3,48 (3,0) 3,46 (2,4) 3,45 (2,1) Leu 6,53 6,45 6,62 (1,4) 6,58 (0,8) 6,57 (0,6) Lys 2,19 2,18 2,35 (7,3) 2,33 (6,4) 2,32 (6,0) Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,33 (0,8) Phe 5,03 4,98 5,10 (1,4) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8) Thr 2,53 2,53 2,63 (4,0) 2,61 (3,1) 2,60 (2,8) Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) 2,72 (4,2) 2,71 (3,8) Val 4,28 4,26 4,36 (1,9) 4,34 (1,4) 4,33 (1,2)

Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.

Az egyes aminosavak tartalmában figyelemreméltó növekedést mutattunk ki a kontrollhoz

lisztmintákhoz képest. A legnagyobb változást (7,3% növekedés) a lizin aminosav

mennyiségében mértük a transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) ‘tiszta’ T3 növényei

szemtermésébıl ırölt T4 lisztben, mindkét negatív kontroll lisztminta lizin aminosav

tartalmához képest. A másik két transzgénikus búzavonal (#59 és #80) T3 lisztjében is a lizin

84

aminosav mennyisége változott a legnagyobb mértékben (6,4% és 6,0%), míg a tirozin

mennyiségében 3,8-4,2%, a treonin mennyiségében 2,8-3,1% növekedést mértünk.

Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az AmA1 fehérjét legnagyobb mennyiségben

(2,57%, 2,45% és 2,27%) termelı transzgénikus Cadenza búza #28, #59 és #80 ’tiszta’

vonalainak lisztjében a rekombináns fehérjetartalom növekedése szoros összefüggést mutat a

lisztminta esszenciális aminosav tartalom növekedésével. Az adatok alapján feltételezzük,

hogy ez az aminosav tartalom változás a transzgénikus búza szemtermésének

endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérjének köszönhetı. Irodalmi adatok szerint

(Chakraborty és mtsai., 2000) ennek a fehérjének burgonya gumóban történı expresszáltatása

magas fehérjetartalom növekedés (35-45%) mellett azzal arányos, jelentıs mértékő esszen-

ciális aminosav tartalom növekedést is eredményezett (a lizin mennyisége ötszörösére, a

cisztein, metionin és tirozin aminosavak mennyisége hétszeresére nıtt a nem transzformált

növényben mért adatokhoz képest).

Rascón-Cruz és mtsai. (2004) transzgénikus kukoricában az Amaranthus hypochondriacus

11S globulin fehérjéjét (amarantin) expresszáltatták rizs glutelin-1 promótere segítségével. A

magas fehérjetartalom növekedéssel (6-32%) az esszenciális aminosav tartalom arányosan

nıtt (lizin 18%-kal, triptofán 22%-kal) a vadtipusú kukoricáéhoz képest (0,34% és 0,09%

teljes ırleményben).

Eredményeink azért biztatóak, mert a búza különösen e három (Lys, Thr, Tyr) esszenciális

aminosavban szegény. Az általunk mért, az irodalomban publikált adatokhoz képest

(Chakraborty és mtsai., 2000; Rascón-Cruz és mtsai., 2004) kisebb mértékő aminosav

tartalom növekedés, ahogyan a kisebb mértékő idegen fehérje koncentráció is, a transzgén

alacsonyabb kópia számával, valamint a búza endospermium jóval magasabb fehérje- és

esszenciális aminosav tartalmával magyarázható. Ha azonban figyelembe vesszük, hogy

Barro és mtsai. (1997) képesek voltak olyan transzgénikus búzát elıállítani, mely a

géntechnológiai úton bejuttatott 1Dx5 HMW-GS tartalékfehérje gént több kópiában (10-15),

több generáción át stabilan öröklıdve hordozza és magas szinten (4-6-szoros a vadtípushoz

képest) termeli, úgy tőnik technikailag lehetséges olyan magas Ama1 fehérjetartalmú búzát is

elıállítani, mely jelentısen megemelkedett szintő táplálkozástani értéket képvisel (akár 30-

35%-os esszenciális aminosav tartalom növekedés).

85

5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analízise

A transzgénikus búzanövények T2, T3 és T4 szemtermésébıl nyert búzalisztben nem csak a

fehérjetartalmat (teljes- és AmA1 fehérje), valamint aminosav tartalmat határoztuk meg,

hanem HPLC kromatográfiás módszerekkel vizsgáltuk és jellemeztük a transzgénikus búzák

tartalékfehérje összetételét is. Az SE- és RP-HPLC módszerek alkalmasak arra, hogy

tanulmányozzuk a lisztben megjelenı AmA1 rekombináns fehérje hatását a liszt funkcionális

tulajdonságaira, valamint hogy elıre jelezzük a tészta minıségében esetleg bekövetkezı

változásokat.

5.3.4.1 SE-HPLC vizsgálatok

A lisztmintákban a polimer (glutenin) és monomer (gliadin) fehérjék arányát (számított

Glu/Gli arány) az SE-HPLC kromatogramm adataiból, Batey és mtsai. (1991) módosított

módszerét követve határoztuk meg. A vizsgálatokhoz a transzgénikus vonalakból, valamint a

kontroll búzák lisztjébıl teljes-, oldható- és oldhatatlan fehérje frakciókat extraháltunk, majd

elemeztük azokat három ismétlésben. A herbicid rezisztencia tesztet túlélt transzgénikus

növények T2 szemtermésébıl nyert lisztmintákban a glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz

viszonyított mennyisége 0,958 és 1,224 között változott (számított Glu/Gli arány, 5.11

táblázat).

5.11 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.

lisztminta polimer/monomer (Glu/Gli) arány UPP% HMW/LMW arány

Cadenza (donor) 1,110 100,0 0,482 Cadenza (null) 1,112 97,64 0,462 T2-28 1,213* 108,4* 0,436 T2-58 0,958* 79,0* 0,477 T2-59 1,171* 104,4 0,509 T2-80 1,224* 106,5* 0,512 T2-83 1,184* 105,1* 0,518 Bobwhite (donor) 1,073 100,0 0,625 T2-15 1,074 109,9* 0,643

UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége, HMW/LMW arány: nagy molekulatömegő- és kis molekulatömegő glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a polimer frakcióban. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.

Négy transzgénikus Cadenza vonal (#28, #59, #80 és #83) Glu/Gli aránya szignifikánsan nıtt

mindkét kontroll értékéhez képest (1,110 és 1,112). A donor növény lisztjének elemzési

adataiból számolt Glu/Gli arányt száz egységnek véve, az eltérések 5,5-10,1% között voltak.

86

A glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a Bobwhite #15 vonal

lisztjében szignifikánsan nem különbözött a kontrollhoz képest.

Az oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyiségének (UPP%) meghatározásához egy

széles körben elterjedt módszert alkalmaztunk (Gupta és MacRitchie, 1994). A polimer

fehérjék méreteloszlásának jellemzésére használt UPP% értéket a Cadenza donor növény

értékéhez viszonyítva adjuk meg. Azt 100 egységnek véve, a transzgénikus vonalak

lisztmintáinak UPP% értéke 4,4-9,9%-kal nıtt, ami a transzgénikus vonalak lisztmintáiban

(egy kivétellel) szignifikáns eltérést mutatott a kontroll minták értékeihez képest (5.11

táblázat). Szignifikáns pozitív változást három Cadenza vonal esetében kaptunk (#28, #80,

#83). A transzgénikus Bobwhite vonal (T2-15 minta) UPP% értéke jelentısen magasabb volt

(+9,9%), mint a kontrollé.

A T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztminták Glu/Gli aránya 0,582 és 0,756

között változott (5.12 táblázat). Három transzgénikus búzavonal (Cadenza T4-28-1-1-tiszta,

T3-59-tiszta, T3-80-tiszta) Glu/Gli értéke szignifikáns pozitív változást mutatott mindkét

kontroll búzaliszthez képest, míg a #58 vonal lisztmintájában (Cadenza T3-58) szignifikánsan

alacsonyabb értéket kaptunk. A transzgénikus pozitív és negatív Bobwhite búzafajta

lisztjének Glu/Gli értékei nem tértek el egymástól.

5.12 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.

lisztminta polimer/monomer Glu/Gli arány

UPP%

Bobwhite (null transzgénikus) 0,577 100,0 T3-15 0,582 101,8 Cadenza (donor) 0,716 100,0 Cadenza (null transzgénikus) 0,703 100,2 T3-28-6-tiszta 0,702 101,3 T3-28-12-tiszta 0,726 101,9 T4-28-1-1-tiszta 0,751* 113,6* T3-58 0,668* 93,7* T3-59-tiszta 0,756* 114,8* T3-80-tiszta 0,741* 101,8 T3-83 0,738 104,8

UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.

A transzgénikus búzavonalak T3 szemtermésébıl nyert lisztminták UPP% értéke 1,3-14,8 %-

kal nıtt a kontrollhoz képest (5.12 táblázat), míg a T3-58 mintában csökkenést tapasztaltunk

(mínusz 6,3%), ami szignifikáns eltérést jelent. Szignifikáns pozitív változást a T3

87

szemtermések lisztjében csak egy esetben (T3-59-tiszta, 14,8%) mértünk, de a T4-28-1-1-tiszta

lisztmintában is nıtt (13,6%) az oldhatatlan polimer fehérjék aránya. A transzgénikus

Bobwhite búzafajta ezen paramétere sem mutatott változást az AmA1 fehérje expressziójának

hatására.

Vizsgálatainkban a Cadenza búzafajta egyik transzgénikus vonala (#58) rendre eltérı módon

viselkedett a többi transzgénikus vonal lisztmintáitól a funkcionális tulajdonságokat vizsgáló

SE-HPLC analízisek során. A T2-58 és T3-58 transzgénikus lisztmintákban lévı

tartalékfehérjék Glu/Gli arányát és UPP% értékét egyaránt szignifikánsan alacsonyabbnak

találtuk a kontrollhoz képest. A szignifikánsan negatív eltérések a kontrolltól valószínőleg a

transzformáció során bekövetkezı nem kívánatos változások következményei, mely eredhet

magából a transzformáció eljárásából, de okozhatja a transzgén hibás integrációja vagy

kromoszóma átrendezıdés is (Rooke és mtsai., 2003; Shewry és Jones, 2005). Mindezek

kiszámíthatatlan agronómiai tulajdonságbeli (Svitashev és mtsai., 2002; Barro és mtsai.,

2003) vagy funkcionális tulajdonságbeli változásokhoz vezethetnek (Blechl és mtsai., 1998;

és Békés Ferenc személyes közleménye).

Ugyanakkor a transzgénikus Cadenza búza #28-as vonal utódainak szemtermésébıl készült

lisztminták Glu/Gli arányát és UPP% értékeit mind a három generációban szignifikánsan

magasabbnak találtuk a kontrollok értékeihez képest. Ezek a megemelkedett értékek, irodalmi

adatok szerint, hozzájárulnak a búzalisztbıl készült tészták dagasztási reológiai és

tulajdonságainak javulásához (Uthayakumaran és mtsai., 1999; 2001). Munkájuk során

összehasonlítottak különbözı Glu/Gli értékekkel rendelkezı búzaliszteket és kimutatták, hogy

a lisztben mérhetı polimer/monomer fehérje arány pozitívan korrelált a tészta reológiai,

dagasztási és kenyérsütési paramétereivel. A búzaliszt másik fontos, a végtermék minıségét

(end-use quality) befolyásoló paramétere a lisztben lévı polimer fehérjék méreteloszlása,

melyet az UPP% értékkel jellemezhetünk. Irodalmi adatok szerint szoros összefüggés van a

polimerek méreteloszlása és a különbözı búzafajták kenyérsütési (pl. cipó magasság és cipó

térfogat) tulajdonságai között (Gupta és mtsai., 1995).

Nem csak különbözı vad típusú búzafajták lisztjeiben vizsgálták a Glu/Gli, továbbá az UPP%

értékek és a liszt funkcionális tulajdonságainak kapcsolatát, hanem búza HMW glutenin

alegységfehérje génekkel transzformált transzgénikus búzavonalakban is. A transzgénikus

liszt funkcionális tulajdonságainak változása erıs korrelációt mutat a két érték

megnövekedésével (Rooke és mtsai., 1999; Uthayakumaran és mtsai., 2003; Rakszegi és

mtsai., 2005; León, és mtsai., 2009). Az 1Dx5 HMW alegységfehérje expressziója a

transzgénikus búzában olyan mértékben megváltoztatta a Glu/Gli és az UPP% értékét a

88

lisztben, hogy a kenyértészta túlzottan erıssé vált, a bevált módon mikro-készülékben nem

volt dagasztható (Barro és mtsai., 1997). Az LMW glutenin alegységfehérjék expressziója

transzgénikus búzában szintén megváltoztatta a polimer monomer fehérjék arányát és az

UPP% értékét, mivel képesek beépülni a sikér fehérje mátrixába, de kevésbé drasztikusan

növelték a polimer fehérjék méreteloszlását. Emiatt hatásuk kevésbé erıteljes a liszt

funkcionális tulajdonságaira, a tészta egyes dagasztási paramétereire (Masci és mtsai., 2003;

Tosi és mtsai., 2005).

Az általunk vizsgált transzgénikus búzavonalak lisztjében a szignifikánsan magasabb Glu/Gli

és UPP% értékek az amarantusz albumin fehérje pozitív hatását jelzik a búzaliszt funkcionális

tulajdonságaira.

5.3.4.2 RP-HPLC vizsgálatok

A liszt minıségét még a HMW/LMW arány változása is befolyásolhatja (Gupta és mtsai.,

1989, 1995), ezért ezt az arányt is megmértük a transzgénikus lisztmintákban. A polimer

frakción belül a HMW- és LMW glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított

mennyiségét RP-HPLC módszerrel határoztuk meg. A vizsgálatokhoz Marchylo és mtsai.

(1989) módosított eljárását használtuk. A transzgénikus és kontroll búzanövények T2

szemtermésébıl nyert lisztminták kromatogrammjainak görbe alatti területeibıl HMW/LMW

arányt számoltunk. Az adatok az 5.11 táblázatban láthatók (5.3.4.1 fejezet). A transzgénikus

Cadenza búzafajták lisztjének HMW/LMW aránya 0,436 és 0,518 között változott. A számolt

értékek egyike sem mutatott szignifikáns eltérést a kontroll növények adataihoz képest. A

transzgénikus Bobwhite búzafajta HMW/LMW aránya sem mutatott szignifikáns eltérést a

kontroll növényben mért értékhez képest. Eredményeink azt jelzik, hogy a pszeudo cereália

albumin fehérjéjének expressziója a búza endospermiumában nem befolyásolja a búzaliszt

ezen paraméterét, azaz nem változtatja meg sem a nagy-, sem a kismolekulatömegő glutenin

fehérjealegységek expressziós szintjét. Mivel a T2 szemtermésbıl nyert lisztminták

HMW/LMW arányában nem tapasztaltunk változást a transzgénikus lisztmintákban, ezt a

paramétert a T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztmintákban nem vizsgáltuk.

5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai

A búzafajták kenyérminıségét meghatározó módszerek alapvetıen két típusba sorolhatók. Az

úgynevezett közvetett módszerek valamilyen, a tészta minıségével szoros összefüggésben

álló fizikai tulajdonságot határoznak meg, mint pl. az ülepedési képesség – szedimentációs

érték. Az úgynevezett közvetlen módszerek a tészta reológiai tulajdonságairól (erısség,

89

stabilitás, nyújthatóság) adnak információt. A fajta nemesítés kezdeti szakaszában, a genetikai

módosítás lehetıségeinek tanulmányozásakor és a változások molekuláris szinten történı

magyarázatához szükséges vizsgálatokban a rendelkezésre álló minta mennyisége korlátozott.

A hagyományos mőszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékekkel és mikro-

módszerekkel már néhány grammnyi liszt minıségi paramétereit, illetve a paraméterek

néhány mg tisztított fehérje adagolása hatására bekövetkezı változásait vizsgálhatjuk (Békés

és mtsai., 2003).

5.3.5.1 Lisztminták Zeleny szedimentációs tesztje

Munkánkban a Zeleny szedimentációs teszt (AACC Method 56-61A) kis mintamennyiségek

vizsgálatára alkalmas változatát használtuk (mikro Zeleny teszt) és a Tömösközi és mtsai.

(2005) által leírt módszert követtük. A transzgénikus búzavonalak szemtermésébıl ırölt

lisztminták vizsgálati eredményeit az 5.13 táblázatban mutatjuk be.

5.13 táblázat Transzgénikus búzák T2 , T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták szedimentációs vizsgálata.

T2 szemtermés mikro Zeleny érték (ml)

T3 és T4 szemtermés

mikro Zeleny érték (ml)

Bobwhite (donor) 3,86 Bobwhite (null transzgénikus)

3,49

T2-15 3,75 T3-15 3,52 Cadenza (donor) 3,33 Cadenza (donor) 3,63

Cadenza (null transzgénikus)

3,38 Cadenza (null transzgénikus)

3,77

T2-28 3,85* T3-28-6 -tiszta 3,85

T3-28-12 -tiszta 4,19*

T4-28-1-1 -tiszta 4,21*

T2-58 2,84 T3-58 3,58

T2-59 4,55* T3-59 -tiszta 4,09*

T2-80 4,47* T3-80 -tiszta 4,16*

T2-83 4,00* T3-83 4,07* Az értékek 3 párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,1.

A transzgénikus Bobwhite #15 búzavonal lisztmintáinak szedimentációs értéke (3,75 ml T2-

15; 3,52 ml T3-15) egyik generációban sem különbözött a kontrollétól. A transzgénikus

Cadenza búzavonalak lisztmintáinak szedimentációs értékei 2,84-4,55 ml (T2 szemtermés) és

3,52-4,19 ml (T3 szemtermés) között változtak, és három kivétellel (2,84 ml T2-58 lisztminta;

3,58 ml T3-58; 3,85 ml T3-28-6 -tiszta) szignifikánsan magasabb értéket mutattak a kontroll

90

búzanövények lisztmintáira kapott értékeknél. A legmagasabb szedimentációs értéket (4,21

ml) az összes vizsgált minta között a Cadenza T4-28-1-1-tiszta szemtermésébıl nyert

lisztmintán mértük. A transzgénikus Cadenza vonalak két generációjának lisztmintáira kapott

eredményeink nagyon hasonlóak, a lisztminták többségének szedimentációs értéke magasabb

volt a kontrollokénál. Ez azt jelezheti, hogy az AmA1 fehérje megjelenése a búza

endospermiumban pozitív hatással van, de biztosan nem rontja, a liszt funkcionális

tulajdonságait, melyeket a Zeleny szedimentációs teszt segítségével is mérhetünk. Ez a

módszer, az irodalmi adatok szerint, a liszt poliszacharidjainak és fehérjéinek duzzadási

tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, amely többek között hatással lehet a

vizsgált genotípus lisztjébıl készült tészta erısségére és a várható kenyértérfogatra

(Halverson és Zeleny, 1988). Shewry és Tatham (2000) kimutatták, hogy a Zeleny

szedimentációs érték pozitív korrelációt mutat a fehérjetartalommal és a szemkeménységgel,

de befolyásolja azt a búza endospermium tartalékfehérje összetétele és a liszt készítésekor

alkalmazott ırlési technológia is. Utóbbi a keményítıszemcsék töredezettségét, és ezen

keresztül vízfelvevı képességét módosíthatja. Az általunk vizsgált szemtermések keménységi

indexe és a belılük nyert lisztminták fehérjetartalma nem változott meg szignifikánsan a

rekombináns fehérje búza endospermiumban történı expressziója hatására. Így nagy

valószínőséggel, mint azt az SE-HPLC vizsgálatok eredményei is jelzik, a búzaszemek

tartalékfehérje összetétele módosulásából adódó változást tudtuk kimutatni a Zeleny szám

változásával. A vizsgált lisztminták egy része nem mutatott szignifikáns pozitív eltérést, vagy

éppen alacsonyabb szedimentációs értékő volt, mint a kontroll lisztminták értékei. Hasonlót

tapasztaltak Masci és mtsai. (2003) is, akik az LMW-GS tartalékfehérje génekkel

transzformált búzavonalak lisztjének SE-HPLC és reológiai vizsgálataival ugyanakkor

egyértelmően igazolták a transzgén expressziójának pozitív hatását a liszt funkcionális

tulajdonságaira.

5.3.5.2 Lisztminták reológiai tulajdonságainak vizsgálata mikro-Valorigráffal

A reológiai sajátságok mérése a lisztbıl víz hozzáadásával készült tészta dagasztási

paramétereinek meghatározásával történik. Annak tanulmányozására, hogy a transzgénikus

búzában expresszáltatott albumin típusú fehérje milyen hatással van a lisztbıl készített tészta

dagasztási paramétereire, nagyobb mennyiségő búzaliszttel kell rendelkezni. Így a dagasztási

kísérletekhez azokat a T3 és T4 szemtermésbıl ırölt lisztmintákat használtuk, melyek legalább

15-18 g mennyiségben álltak rendelkezésünkre (Bobwhite T3-15 és 7 db transzgénikus

Cadenza búzavonal lisztmintái). A mérést mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) prototípusán

91

végeztük úgy, ahogyan azt a szerzık leírták (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai.,

2004). Egy a készülékkel felvett tipikus alapgörbét és a belıle leolvasható paramétereket az

5.8 ábrán mutatjuk be.

5.8 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe. DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, s). PR: maximális tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, s). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance, VU x s).

A transzgénikus búzavonalak lisztmintáival elvégzett dagasztási kísérletek eredményeit az

5.14 táblázatban foglaltuk össze.

A Bobwhite transzgénikus búzavonal T3-15 szemtermése lisztmintájából készített tészta

dagasztási idıszükséglete (DDT), dagasztással szembeni maximális ellenállása (PR) és tészta

ellágyulási értéke (BD) nem különbözött szignifikánsan a Bobwhite null transzgénikus

kontroll értékétıl. Ugyanakkor a tészta stabilitása szignifikánsan magasabb volt (1,4 perc),

mint a kontrollé (1,1 perc).

DDT

92

5.14 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták dagasztási paraméterei.

lisztminta maximális

tésztaellenállás (VU)

dagasztási idıszükséglet

(perc)

tésztaellágyulás (VU x s)

stabilitás (perc)

Bobwhite (null transzgénikus)

450 3,23 118 1,1

T3-15 477 3,35 118 1,4* Cadenza (donor) 483 3,52 97 0,8 Cadenza (null transzgénikus)

497 3,58 98 0,9

T3-28-6-tiszta 433* 3,59 62* 1,6* T3-28-12-tiszta 530* 4,11* 98 1,4* T4-28-1-1-tiszta 583* 4,22* 89 1,4* T3-58 493 3,47 98 1,0 T3-59-tiszta 531* 3,24* 100 1,1* T3-80-tiszta 486 3,46 81 1,2* T3-83 505 3,59 89 1,2*

Az értékek 2 párhuzamos mérés átlagai. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 10% szignifikancia szinten.

A Cadenza transzgénikus búzák lisztmintáin mért dagasztási idık 3,24 és 4,22 perc között

változtak. A vizsgált hét Cadenza lisztminta közül két minta (T3-28-12-tiszta, T4-28-1-1-

tiszta) dagasztási idı szükséglete szignifikánsan magasabb (10% szignifikancia szinten), a T3-

59-tiszta mintáé szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollok értékei (3,52 és 3,58

perc). Ez utóbbi azért érdekes, mert tésztájának maximális ellenállása a második legmagasabb

érték volt (531 VU) és stabilitása is szignifikánsan nagyobb volt (1,1 perc), mint a

kontrolloké. A dagasztással szembeni maximális ellenállás értékei (PR) 433 és 583 VU között

változtak. A tésztaminták dagasztással szembeni ellenállása szignifikánsan nıtt, azaz a tészta

erısebb volt, a Cadenza #28 transzgénikus vonal, három úgynevezett ’tiszta’ utódvonalainak

szemtermésébıl nyert lisztmintákból készült tészták esetén. Közülük is a legmagasabb PR

értéket a T4 szemtermés lisztjébıl készült tészta mutatta (583 VU). A vizsgált lisztminták

mindegyike egy kivétellel (T3-58) jelentısen stabilabb tésztát adott (ST 1,1-1,4 perc), mint a

kontrollok.

A transzgénikus Cadenza T3-58 szemtermés lisztjébıl készült tészta egyetlen egy dagasztási

paramétere sem különbözött a kontrollétól. A dagasztási kísérletekben ugyanúgy eltérı

viselkedést mutatott, mint azt az SE-HPLC és a Zeleny szedimentációs vizsgálatokban

tapasztaltuk. Feltételezzük, hogy a többi transzgénikus vonaltól eltérı viselkedés oka a

transzformáció során lejátszódott folyamatokban keresendı. Fontos megjegyezni, hogy az 58-

as vonal Southern blot analízisének képe eltért a 28-as vonal képétıl.

93

A legjobb paraméterekkel jellemezhetı tésztát a T4-28-1-1-tiszta lisztmintából dagasztottuk,

melynek három mért paramétere szignifikánsan eltért a kontrollokéitól. A T4-28-1-1-tiszta

lisztmintából és a kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta dagasztási görbéit az 5.9

ábrán mutatjuk be. Az ábrán látható görbék lefutása hasonló, de a transzgénikus mintán mért

jelentısen nagyobb maximális ellenállás és a stabilitás értékek erısebb (rugalmasabb és

stabilabb) tészta kialakulását igazolják. A T4-28-1-1 mintából kapott lisztnek a dagasztás

során mért, az erısségre vonatkozó paraméterei, az összes vizsgált minta közül a

legmagasabbak (PR, 583 VU; DDT, 4,22 perc). Ugyanakkor jelentısen javult a tészta

stabilitása, melyet az ST érték növekedése (1,4 perc) és a tészta ellágyulási értéke (BD)

csökkenése (89 VU x s) jelez. Irodalmi adatok szerint a tészta erısség javulását a dagasztási

idıszükséglet (DDT) és az úgynevezett maximális dagasztási ellenállás (PR) növekedése jelzi

(Békés és mtsai., 1994b). Hasonlóan jó dagasztási paramétereket mértünk a T3-28-6-tiszta

lisztmintából készült tésztán is, melynek stabilitás értéke a legmagasabb (1,6 perc),

ellágyulási értéke a legkisebb (62 VU x s) és PR értéke is szignifikánsan magasabb (433 VU)

volt a kontrollénál. A dagasztási idıszükséglet (3,59 perc) nem különbözött a kontrollétól.

5.9 ábra A transzgénikus T4-28-1-1-tiszta lisztmintából és a Cadenza kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta alapgörbéi.

Irodalmi adatokból jól ismert, hogy az amarantuszok tartalékfehérjéi pozitív hatással vannak a

búzalisztbıl készült tészta funkcionális tulajdonságaira mind egyszerő addíció után (Ayo,

2001; Silva-Sanchez és mtsai., 2004) mind inkorporálva azokat a búzaliszt fehérje mátrixába

(Oszvald és mtsai., 2009). A búzalisztben lévı fehérjék szabad SH csoportjaikon keresztül

képesek diszulfid hidakat (S-S kötés) létrehozni, melynek eredményeképpen javul a

búzatészta erıssége, rugalmassága (Tamas és mtsai., 2002). Az S-S kötések létrejöttének

hatását a búzaliszt tulajdonságaira egyrészt a polimer/monomer (Glu/Gli) fehérjék arányának

mérésével (SE-HPLC technika, 5.3.4 fejezet), dagasztási kísérletekkel (mint fent), valamint a

94

lisztminták dagasztása során kapott tészták fehérje összetételének elemzésével (SE-HPLC,

mint alább) követhetjük nyomon.

A tésztamintákat, melyek dagasztását a maximális ellenállás elérésekor abbahagytuk,

fagyasztva szárítottuk, majd a korábban leírt módon kinyert három fehérje frakció összetételét

SE-HPLC módszerrel elemeztük. A görbe alatti területekbıl számolt Glu/Gli arány értékeket

és a normalizált (a Cadenza donor növény lisztjének tésztájára vonatkoztatott) UPP%

értékeket az 5.15 táblázatban mutatjuk be. Eredményeink szerint a transzgénikus Bobwhite

búzafajta T3-15 lisztjébıl készült tészta fehérje összetétele valószínőleg megváltozott

(szignifikánsan nagyobb Glu/Gli arány és UPP% a Bobwhite null transzgénikus kontroll

értékeihez képest), ami az AmA1 fehérjének a sikér fehérje mátrixába való beépülését jelzi.

Hasonlóan pozitív változás figyelhetı meg a Cadenza lisztminták dagasztása során is három

kivétellel (T3-28-12-tiszta, T3-59-tiszta, T3-83), mely mintáknak csak az egyik mért

paramétere mutatott jelentıs eltérést a kontrollétól. A másik három minta (T3-28-6-tiszta, T4-

28-1-1-tiszta és T3-80-tiszta) mindkét szignifikánsan magasabb mért értéke azt jelzi, hogy a

rekombináns AmA1 fehérje expressziója a búza endospermiumban pozitív hatással van a

búzaliszt funkcionális tulajdonságaira, a tészta minıségére.

5.15 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 lisztjébıl dagasztott tésztaminták HPLC analízise.

lisztminta UPP% polimer/monomer (Glu/Gli) arány

Bobwhite (null transzgénikus) 104,1 0,718 T3-15 112,1* 0,767* Cadenza (donor) 100,0 0,931 Cadenza (null transzgénikus) 97,0 0,920 T3-28-6-tiszta 116,7* 1,016* T3-28-12-tiszta 110,7 0,994* T4-28-1-1-tiszta 122,3* 1,136* T3-58 - - T3-59-tiszta 113,7* 0,955 T3-80-tiszta 111,7* 0,972* T3-83 114,4* 0,951

UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége. Az értékek 3 párhuzamos mérés átlagai. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.

A kapott eredményeket úgy értelmezhetjük, hogy az AmA1 fehérje cisztein aminosavainak

szabad -SH csoportjain keresztül S-S kötéseket alakított ki a búza tartalékfehérjék szabad -SH

csoportjaival, ami hosszabb polimer fehérjék létrejöttét eredményezte. Ennek következtében

az SE-HPLC mérések során magasabb Glu/Gli arány és UPP% értékeket kaptunk ezen

95

transzgénikus mintákban. Fontos megjegyezni, hogy ezeket a lisztmintákat ’tiszta’

transzgénikus búzavonalak szemtermésébıl nyertük, melyben a transzgén jelenléte homogén,

minden búzaszemben jelen van és expresszálódik róla a fehérje. Eredményeink jól egyeznek

Uthayakumaran és mtsai. (1999) által publikáltakkal, akik rekonstrukciós tészta kísérletek

sorozatán keresztül bizonyították, hogy a polimer/monomer arány növekedése (állandó

fehérjetartalom mellett) erısen befolyásolja a kenyértészta tulajdonságait, így például

szignifikánsan növeli a tészta kialakulási idıt, a tészta erısségét, stabilitását, valamint a

kenyércipó magasságát és térfogatát.

A munkánk során elıállított egyes transzgénikus búzavonalak endospermiumában 1,94-2,57%

rekombináns AmA1 fehérjetartalmat mutattunk ki, miközben a lisztminták teljes

fehérjetartama nem különbözött szignifikánsan a kontroll növények lisztmintáinak

fehérjetartalmától. A legmagasabb AmA1 fehérjetartalom a T4-28-1-1-tiszta lisztmintát

jellemzi, melynek minden kísérletünkben vizsgált paramétere szoros összefüggést mutat ezzel

az értékkel. Az AmA1 fehérjét tartalmazó transzgénikus búzaliszttel kapott eredményeink

teljes összhangban vannak a korábban, amarant albumin típusú fehérjékkel elvégzett és

publikált, búzalisztbıl készült tészta, rekonstrukciós vizsgálatainak eredményeivel (Oszvald

és mtsai., 2009). Kémiai inkorporációs, mikro-dagasztási és SE-HPLC módszerekkel kapott

eredmények értékelése alapján megállapították, hogy 3% (a liszt teljes fehérjetartamára

vonatkoztatva) amarantusz albumin fehérje beépítése a tészta fehérje mátrixába pozitívan

befolyásolja a búzatészta minıségét.

Eredményeink azt mutatják, hogy a géntechnológiai úton történı nemesítés nem csak a búza

táplálkozástani minıség javításának alkalmas módszere lehet a búzaliszt esszenciális

aminosav tartalmának növelése által, de megfelelı tulajdonságú fehérje génjének beépítésével

a búza genetikai állományába, javíthatók a búzaliszt funkcionális tulajdonsága is.

96

6. ÖSSZEFOGLALÁS

A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani minıségét és a búzalisztbıl készült tészta

felhasználhatóságát fıként az endospermiumban található tartalékfehérjék kémiai összetétele

és szerkezete határozza meg. A búza táplálkozástani értéke jelentısen eltér az állati fehérjék

táplálkozástani értékétıl, mert az endospermiumból ırölt liszt esszenciális aminosavakban

szegény (arginin, hisztidin, tirozin, treonin), de különösen a lizin aminosav mennyisége

limitáló. A liszt fehérje-, valamint annak aminosav összetételét, továbbá a liszt funkcionális

tulajdonságait ma már géntechnológiai úton történı nemesítéssel is meg lehet változtatni.

A sikeres genetikai transzformáció elsıdleges követelménye a hatékony növényregenerációs

rendszer, ezért munkánk elsı lépéseként magyar ıszi búza genotípusok (Mv Emese, Mv

Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, Mv Emma, Bánkúti 1201/B2, /B8, /B70) éretlen embrióinak

szövettenyésztéséhez dolgoztunk ki megfelelı módszert. A hımérséklet- és a hajtásregeneráló

táptalajokban alkalmazott MS makroelemek mennyiségének csökkentése, valamint a

fényintenzitás fokozatos növelése minden vizsgált genotípus esetén magas (átlag 78%)

regenerációs hatékonyságot eredményezett. A legjobban regenerálódó (99%) Mv Emese és

két tavaszi búzafajtával (Bobwhite, Cadenza) a módszert búza transzformációhoz

optimalizáltuk. A szkutellumok megfelelı mérető éretlen embriókból történı preparálása és a

szövettenyésztési körülmények módosítása (rövid, 3 hetes fázisok, embriógenézist indukáló

táptalajok használata a kalluszindukcióban és a hajtásregeneráció korai szakaszában) olyan

növényregenerációs rendszerhez vezetett, melynek alkalmazása lehetıvé tette a sikeres,

megfelelı hatékonyságú búza transzformációs rendszer kialakítását.

Munkánk célkitőzésének megvalósításához (búza táplálkozástani minıségének javítása) az

Amaranthus hypochondriacus egyik tartalékfehérje génjét választottuk. A gén által kódolt

nem allergén fehérje nagy táplálkozástani értéket képvisel, esszenciális aminosav tartalma

magas (lizin 7,7%, tirozin 7,0%, treonin 5,4%), emiatt a WHO is ajánlja fogyasztásra. A 35

kDa mérető fehérjét kódoló ama1 gént búza endospermium specifikus promóterhez

kapcsoltuk és biolisztikus módszerrel juttattuk a búza genetikai állományába. Az elıállított

nagy számú transzgénikus búzavonalból hét független vonalat (Bobwhite #15, Cadenza #28,

#58, #59 #80, #83, Mv Emese #71) több generáción át vizsgáltunk. A levélbıl kinyert genomi

DNS-en elvégzett PCR analízissel megállapítottuk, hogy a transzgén öröklıdése megfelelt a

Mendeli öröklıdés szabályainak. A T2 generáció növényei között találtunk olyan

utódvonalakat is, melynek minden vizsgált növénye hordozta a transzgént. Ezeket ’tiszta’

97

vonalaknak neveztük. A transzgén jelenlétét a genomi DNS-ben Southern-blot, a fehérje

expressziót Western-blot analízissel bizonyítottuk. A promóter szövetspecifikus mőködését

RT-PCR-rel, igazoltuk. A növények éretlen szemtermésében a mRNS már 10 nappal a

virágzás után jelentıs mennyiségben jelen volt, termelıdése a 20-ik napig nıtt, majd lassan

csökkent. Az éretlen endospermiumokban expresszálódó AmA1 fehérje növekvı

mennyiségben akkumulálódott a búzaszem fejlıdésének elırehaladtával.

A T2, T3 és T4 szemtermésbıl ırölt lisztben indirekt ELISA módszerrel 1,78-2,57%

rekombináns fehérjetartalmat mértünk, miközben a teljes fehérjetartalom érdemben nem

változott. A legjobban expresszáló búzavonalban a rekombináns fehérjetartalom növekedése

szoros összefüggést mutatott a lisztminta esszenciális aminosav tartalom növekedésével

(7,3% lizin, 4,0% treonin és 3,8% tirozin aminosav), ami alapján feltételezzük, hogy ez a

transzgénikus búza endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérjének tulajdonítható.

A transzgénikus búza lisztmintákban megjelenı AmA1 fehérje hatását SE- és RP-HPLC

módszerekkel vizsgáltuk. A vizsgált lisztminták nagy részében szignifikánsan magasabb

polimer/monomer fehérje arányt (Glu/Gli) és a polimer fehérjék méreteloszlását jellemzı

UPP% értéket mutattunk ki. A Cadenza #28 búzafajta utódvonalainak szemtermésébıl készült

lisztminták Glu/Gli aránya és UPP%-a mind a három generációban szignifikáns javulást

mutatott a kontroll lisztmintákhoz képest. A megemelkedett értékek a tészta dagasztási,

reológiai tulajdonságainak javulását jelezték. A dagasztási paramétereket mikro z-arm

mixerrel mértük. A T4-28-1-1-tiszta lisztmintából dagasztott tészta három dagasztási

paramétere szignifikánsan eltért a kontrollok értékeitıl. Nıtt a tészta erıssége és stabilitása,

valamint csökkent a tészta ellágyulási értéke. A dagasztott tésztából kinyert fehérjeminta SE-

HPLC vizsgálata valószínősíti, hogy a több cisztein aminosavat tartalmazó AmA1 fehérje

beépült a tészta fehérje mátrixába. Eredményeink in vivo igazolják a korábban amarantusz

albumin fehérjével, búza lisztmintán végzett inkorporációs vizsgálataink publikált adatait.

Már kb. 3% albumin fehérje képes javítani a búzaliszt funkcionális tulajdonságait, a tészta

dagasztási paramétereit, ha az beépül a tészta fehérje mátrixába.

Eredményeink igazolják, hogy a géntechnológiai úton történı nemesítés során lehetıség van a

búza táplálkozástani értékének és a liszt funkcionális tulajdonságának együttes javítására, ha

megfelelı tulajdonságú fehérjét választunk ki a transzformáláshoz.

98

SUMMARY

Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important food crops for about half of the

human population forming a staple diet in over 60 countries. The nutritional quality of the

wheat is mainly determined by the low essential amino acid content of the storage proteins.

Especially the lysine and threonine are present in limiting amounts in the prolamin protein

fraction of the flour. The white flour contains even less lysine and threonine as a result of the

milling process. With the removal of the aleurone and embryo tissues of the grain, high

amounts of essential amino acids are lost. Our attempt to improve the amino acid contents of

the flour produced from wheat is the gene technology approach to express recombinant

storage protein with the appropriate amino acid profiles in the wheat endosperm tissue.

In the present work Hungarian winter wheat varieties with high callus induction and plant

regeneration ability, suitable for breeding purposes, were screened. An efficient tissue culture

method for plant regeneration from immature embryos of wheat varieties (Mv Emese, Mv

Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, Mv Emma, Bánkúti 1201/B2, /B8, /B70) was established.

The effects of the concentration of macroelements in the regeneration medium, the incubation

temperature and the light intensity were investigated on the plant regeneration frequency. The

most remarkable effect was achieved by reducing both the incubation temperature to 23 °C

and the concentration of macroelements in the regeneration medium to half strength. This

modification increased the average plant regeneration frequency from about 10% to 78%.

Changes in the light intensity and the temperature raised the average frequency to 83%. The

method was optimised for biolistic transformation of the best performing Mv Emese and two

spring wheat varieties (Bobwhite, Cadenza) with the use of embriogenesis inducing tissue

culture parameters.

For biolistic transformation of these bread wheat varieties, an amaranth (A. hypochondriacus)

albumin gene, encoding the 35-kDa AmA1 protein of the seed, with high content of essential

amino acids (Lys 7.7%, Tyr 7.0%, Thr 5.4%), was chosen. Transformation cassette carried the

ama1 gene under the control of a powerful wheat endosperm-specific promoter (1Bx17

HMW-GS). Southern blot analysis of T1 lines (#28 and #58) confirmed the stable integration

of the foreign gene into the genetic material. Seven independent transgenic lines (Bobwhite

#15, Cadenza #28, #58, #59, #80, #83, Mv Emese #71) were investigated in T1, T2 and T3

generations by PCR analysis of the genomic DNA. The segregation ratio (around 3:1) was

consistent for the normal transmission of a single transgene locus. Transcription and

99

translation of the ama1 gene showed tissue specificity in both RT-PCR and Western blot

analysis of the endosperm prepared from either immature or mature seeds. Transcripts were

detected neither in leaf nor in root tissues. Study of the protein expression pattern on

developing endosperm tissues (at 17, 24 and 31 DPA) in the best performing transgenic line

#28 also confirmed the proper function of the promoter. The amaranth albumin protein

appeared in increasing amount within the wheat endosperm.

The effects of the extra albumin protein on the properties of flour, produced from T2, T3 and

T4 seeds, total protein, essential amino acid content analysis, furthermore polymeric-to-

monomeric protein and HMW-to-LMW glutenin subunit ratio measurements were performed.

We found no significant changes in total protein content of the flour from transgenic lines,

while the AmA1 protein was present in reasonable quantity (1.78-2.57%). The amount of the

accumulated AmA1 protein showed a close correlation with the increase in the essential

amino acids content (7.3% Lys, 4.0% Thr, 3.8% Tyr). From these data we conclude that the

improvement of the amino acid composition was due to the expression of the AmA1 protein.

These findings are very important, as these amino acids are highly deficient in common wheat

flour. To detect any changes in the flour functional quality, like the S-S bond formation

between the storage proteins, the polymeric-to-monomeric (Glu/Gli) protein ratio and the

unextractable polymeric protein ratio (UPP%) were calculated from the SE-HPLC data. The

Glu/Gli ratio and the size distribution of the polymeric proteins in the flour (UPP%) were

found to be significantly higher in most of the transgenic lines compared to the control

samples. According to correlative studies, these parameters are related to better end-use

quality and breadmaking properties of the wheat cultivars. Data gained during the

investigation of transgenic line #28 in T2, T3 and T4 generations, indicated the positive

effects of the amaranth albumin protein on the flour end-use quality. The reological properties

of the dough, using the best performing flour sample (T4-28-1-1), was measured by micro z-

arm mixer. Three significantly higher parameters (dough development time, peak resistance

and stability) proved that stronger and more stable dough can be produced from this

transgenic wheat flour. SE-HPLC analysis of the protein sample, extracted from this dough,

confirmed that the recombinant protein had integrated into the protein matrix of the gluten,

formed during the dough development.

Our results indicated that transgenic approach can be a method of choice to improve not only

the essential amino acid content of the wheat flour, but certain functional quality attributes in

parallel.

100

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet fejezem ki családomnak és mindenkinek, akik hozzájárultak munkám

sikeréhez és dolgozatom elkészültéhez:

Köszönet illeti témavezetıimet, Dr. Bedı Zoltán akadémikust az MTA Mezıgazdasági

Kutatóintézetének igazgatóját és Dr. Tamás László egyetemi docenst (ELTE, Növényélettani

és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék) szakmai tanácsaikért és támogatásukért.

Köszönetet mondok Dr. Láng Lászlónak, Dr. Rakszegi Mariannak a kísérleti munkák

feltételeinek biztosításáért. Dr. Sági Lászlónak tanácsaiért. Köszönöm Némethné Kisgyörgy

Boglárka fiatalos lendületét és kitartó munkáját a búza transzformációban és a transzgénikus

növények tesztelésében.

Köszönöm Dr. Peter Shewry és Dr. Huw Jones hozzájárulását a laboratóriumukban töltött 4

hetes tanulmányúthoz (Rothamstead Research, 2007). Hálás köszönettel tartozom Dr.

Caroline Sparks és Dr. Mark Wilkinson tanácsaiért és türelmes közremőködéséért a Southern

blot analízis elvégzésében.

Köszönöm koreai partnereinknek, hogy együttmőködési pályázat keretén belül Dr. Moon-Sik

Young rendelkezésünkre bocsátotta az ama1 gént, valamint Dr. Tae Kang-nak az AmA1

fehérje elleni antitestért és az indirekt ELISA módszer elvégzéséhez nyújtott tanácsaiért.

Köszönöm Dr. Békés Ferenc (CSIRO Plant Industry, Ausztrália) szakmai tanácsait és a

funkcionális vizsgálati eredmények statisztikai értékelésében nyújtott segítségét. Dr.

Tömösközi Sándornak (BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék)

a funkcionális vizsgálati eszközök használatának lehetıségét. Dr. Oszvald Máriának a

lisztvizsgálatok elvégzésében nyújtott segítsége mellett hasznos tanácsait is.

Köszönöm az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet Kalászos Gabona Nemesítési Osztály

Molekuláris laboratóriumában dolgozó minden munkatársnak, de különösen Holtainé Patona

Magdolnának a szövettenyésztésben, növénynevelésben és tesztelésben nyújtott nagyszerő

segítségét. Pásztohi Irénnek és Illés Klárának a DNS kinyerésben, Bodnárné Jávori Tímeának

(Lisztlabor) a HPLC vizsgálatokban nyújtott segítségét.

Köszönöm az ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék dolgozóinak,

Kremmerné Palczer Katalinnak és Pardi Sándornénak odaadó munkáját a DNS, RNS és

fehérje vizsgálatokban.

Köszönöm minden kedves, a fentiekben nem említett kollegámnak segítségét és soha nem

szőnı szakmai támogatását, emberi biztatását.

101

Köszönettel tartozom a kutatási munkát támogató pályázatok pénzügyi segítségéért:

AKP 98-36 3.1,

OTKA T034791,

OTKA 68659, OMFB 39/2000,

ICGEB Fund (CRP/HUN00-02),

TéT KOR 13/99.

102

7. IRODALOMJEGYZÉK AACC Method 55-31. Physical Tests. Singel-kernel characterization system for wheat kernel

texture. 1999. AACC Method 56-50: Pelshenke-test. Approved Methods of the AACC, 8th edition, St.

Pauls, Minnesota, 1983. AACC Method 56-61A: Sedimentation test based on Zeleny. Approved Methods of the

AACC, 8th edition, St. Pauls, Minnesota, 1983. Abebe, T., Guenzi, A.C., Bjorn, M., Cushman, J.C., 2003. Tolerance of mannitol-

accumulating transgenic wheat to water stress and salinity. Plant Physiol 131, 1748–1755.

Adebowale, YA., Adeyemi, IA., Oshodi, AA., Niranjan, K., 2007. Isolation, fractionation and characterization of proteins from Mucuna bean. Food Chem 104, 287–299.

Ahmed, K.Z., Sági, F., 1993. Culture of and fertile plant regeneration from regenerable embryogenic cell-derived protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell Reports 12, 175-179.

Altpeter, F., Vasil, V., Srirastava, V., Vasil, I.K., 1996a. Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotechnology 14, 1155-1159.

Altpeter, F., Vasil, V., Srivastava, V., Stöger, E., Vasil, I.K., 1996b. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Reports 16, 12-17.

Altpeter, F., Diaz, I., McAuslane, H., Gaddour, K., Carbonero, P. and Vasil, I.K., 1999. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CME. Mol Breed 5, 53-63.

Altpeter, F., Baisakh, N., Beachy, R., Bock, R., Capell, T., Christou, P., Daniell, H., Datta, K., Datta, S., Dix, P.J., Fauquet, C., Huang, N., Kohli, A., Mooibroek, H., Nicholson, L., Nguyen, T.T., Nugent, G., Raemakers, K., Romano, A., Somers, D.A., Stoger, E., Nigel, T., Visser, R., 2005a. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breed 15, 305–327.

Alvarez, M.L., Guelman, S., Halford, N.G., Lustig, S., Reggiardo, M.I., Ryabushkina, N., Shewry, P., Stein, J., Vallejos, R.H., 2000. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits. Theoretical Applied Genetics 100, 319-327.

Amoah, B.K., Wu, H., Sparks, C., Jones, H.D., 2001. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany 52, 1135–1142.

Anderson, O.D., Greene, F.C., Yip, R.E., Halford, N.G., Shewry, P.R., Malpica-Romero, J.M., 1989. Nucleotid sequences of the two high-molecular-weight glutenin genes from the D-genome of a hexaploid bread wheat, Triticum aestivum L., cv Cheyenne. Nucleic Acids Research 17(1), 461-462.

Ayo, J.A., 2001. The effect of amaranth grain flour on the quality of bread. International Journal of Food Properties 4, 341-351.

Baga, M., Chibbar, R.N., Kartha, K.K., 1999a. Expression and regulation of transgenes for selection of transformants and modification of traits in cereals. Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants 5, pp 83-131. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.

Barba de la Rosa, A.P., Gueguen, J., Paredes-López, O., Viroben,G., 1992. Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and aminoacid composition of amaranth seed protein. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 931-936.

103

Barba de la Rosa, A.P., Herrera, A., Utsumi, S., Parades-López, O., 1996. Molecular characterization, cloning and structural analysis of a cDNA encoding an amaranth globulin. J. Plant Physiol. 149, 527-532.

Barcelo, P. and Lazzeri, P. A., 1995. Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues. In: Methods in Molecular Biology: Plant Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. H. Jones), Humana Press, Totowa. Vol. 49, pp 113-123.

Barcelo, P. and Lazzeri, P.A., 1998. Direct gene transfer: Chemical, electrical and physical methods. In Lindsey, K. (eds), Transgenic Plant Research pp. 35-55. Harwood Academic Publishers, The Netherlands.

Barro, F., Rooke, L., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Barcelo, P., 1997. Transformation of wheat HMW subunit genes results in improved functional properties. Nature Biotechnology 15, 1295-1299.

Barro, F., Cannell, M.E., Lazzeri, P., Barcelo, P., 1998. Influence of auxins on transformation of wheat and tritordeum and analysis of transgene integration patterns in transformants. Theoretical Applied Genetics 97, 684-695.

Barro, F., Martin, A., Lazzeri, P.A., Barcelo, P., 1999. Medium optimisation for efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from immature inflorescences and immature scutella of elite cultivars of wheat, barley and tritordeum. Euphytica, 108, 161-167.

Barro, F., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Ballesteros, J., Martin, A., 2003. Functional properties of flours from filed grown transgenic wheat lines expressing the HMW glutenin subunit 1Ax1 and 1Dx5. Molecular Breeding 12, 223-229.

Baruah-Wolff, J., Harwood, W.A., Lonsdale, D.A., Harvey, A., Hull, R., Snape, J.W., 1999 Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Reports 18, 715-720.

Batey, IL., Gupta, RB., MacRitchie, F., 1991. Use of SE-HPLC in the study of wheat flour proteins: An improved chromatographic procedure. Cereal Chem 68, 207-209.

Beccari, J.B., 1745. De Frumento. De Bononiensi Scientarium et Artium. Instituto atque Academia Commentarii: Bologna 2, 122-127.

Bechtel, D.B., Wilson, J.D., Shewry, P.R., 1991. Immunocytochemical localization of the wheat storage protein triticin in developing endoperm tissue. Cereal Chem. 68, 573-577.

Bedı, Z., Kárpáti, M., Vida, Gy., Kramarik-Kissimon, J., Láng, L., 1995. Good breadmaking quality wheat (Triticum aestivum L.) genotypes with 2+12 subunit composition at the Glu-D1 locus. Cer. Res. Comm. 23, 283-289.

Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., Hickman, D.R., Tatham, A.S. 1993. Effects of a high Mr glutenin subunit (1Bx20) ont he dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science. 19, 3-7.

Békés, F. and Gras, P.W., 1994. Effects of individual HMW glutenin subunits on mixing properties. In ’Gluten Proteins 1993’. Association of Cereal Research, Detmold, Germany, 170-179.

Békés, F., Anderson, O., Gras, P.W., Gupta, R.B., Tam, A., Wrigley, C.W., Apples, R., 1994a. The contribution to mixing properties of 1D glutenin subunits expressed in a bacterial system. Proc.'Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering', (Eds. Henry, R., and Ronalds, J.) pp 97-104.

Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1994b. Mixing properties as a measure of reversible reduction and oxidation of doughs. Cereal Chemistry. 71, 44-50.

104

Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1995. The effects of purified cereal polypeptides on mixing properties of dough, 92-98. in: Proc. 45th Australian Cereal Chemistry Conf. Y.A. Williams and C.W. Wrigley, eds. RACI: Noth Melbourne, Australia.

Békés, F., Southan, M.S., Tömösközi, S., Nanasi, J., Gras, P.W., Varga, J., McCorquodale, J., Osborne, B.G. 2000. Comparative studies on a new micro scale laboratory mill. Proc. 49. RACI Conference, Eds.: Panozzo, J.F., Ratcliffe, M., Wootton, M., Wrigley, C.W., 483-487., RACI, Melbourne.

Békés, F., Lukow, O., Uthayakumaran, S., Mann, G., 2003. Small-scale dough testing methods. In: Shewry, P.R., Lookhart, G. (Eds.), Wheat Gluten Protein Analysis. AACC, St. Paul, USA, pp 173–198.

Ben Amer, I.M., Korzun, V., Worland, A.J., Börner, A., 1997. Genetic mapping of QTL controlling tissue-culture response on chromosome 2B of wheat (Triticum aestivum L.) in relation to major genes and RFLP markers. Theoretical Applied Genetics 94, 1047-1052.

Bhattacharyya-Pakrasi, H., Peng, J., Elmer, J.S., Laco, G., Shen, P., Kaniewska, M.B., Kononowicz, H., Wen, F., Hodges, T.K., Beachy, R.N., 1993. Specificity of a promoter from the rice tungro bacilliform virus for expression in phloem tissues. Plant Journal 4, 71-79.

Blechl, A.E., Anderson, O.D., 1996. Expression of a novel high molecular weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nat Biotechnol 14, 875–879.

Blechl, A.E., Le, H.Q., Anderson, O.D., 1998. Engineering changes in wheat flour by genetic transformation. Journal of Plant Physiology 152, 703-707.

Blechl, A.E., Lin, J., Nguyen, S., Chan, R., Anderson, O.D., Dupont, F.M., 2007. Transgenic wheats with elevated levels of Dx5 and/or Dy10 high-molecular-weight glutenin subunits yield doughs with increased mixing strength and tolerance. Journal Of Cereal Science. 45, 172-183.

Boutrot, F., Guirao, A., Alary, R., Joudrier, P., Gautier, M.F., 2005. Wheat non-specific lipid transfer protein genes display a complex pattern of expression in developing seeds. Biochim. Biophys. Acta 1730, 114-125.

Bregitzer, P., Halbert, S.E., Lemaux, P.G., 1998. Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theoretical Applied Genetics 96, 421-425.

Bressani, R. and Garcia-Vela, L.A., 1990. Protein fractions in amaranth grain and their chemical characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38, 1205-1209.

Brinch-Pedersen, H., Olesen, A., Rasmussen, S.K., Holm, P.B., 2000. Generation of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) for constitutive accumulation of an Aspergillus phytase. Molecular Breeding 6, 196.

Brinch-Pedersen, H., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2002. Engineering crop plants: getting a handle on phosphate. Trends in Plant Science 7, 118–125.

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2003. Concerted action of endogenous and heterologous phytase on phytic acid degradation in seeds of transgenic wheat (Triticum aestivum L.). Transgenic Research 12, 649–659.

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Stoger, E., Arcalis, E., Pontopidan, K., Holm, P.B., 2006. Heat-stable phytases in transgenic wheat (Triticum aestivum L.): deposition pattern, thermostability, and phytate hydrolysis. J Agric Food Chem 54, 4624–4632.

Burgess, S.R., and Shewry, P.R., 1986. Identification of homologous globulins from embryos of wheat, barley, rye and oats. J. Exp. Bot. 37, 1863-1871.

Burton, R.A., Wilson, S.M., Hrmova, M., Harvey, A.J., Shirley, N.J., Medhurst, A., Stone, BA., Newbigin, N.J., Bacic, A., Fincher, GB., 2006. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall (1,3;1,4)-b-D-glucans. Science 311, 1940–1942.

105

Bushuk, W., 1998. Wheat breeding for end-product use. Euphytica. 100, 137-145. Bushuk, W. Interactions: The Keys To Cereal Quality, 1st ed. Hamer, R.J. and Honesey, R.C. Eds. American Association of Cereal Chemistry: St. Paul. Mn. 1998. Chapter 2.

Bushuk, W. and Tkachuk, R. Eds. 1991. Gluten proteins 1990. Am. Assoc. Cereal Chemistry: St. Paul, Mn.

Butow, B.J., Tatham, A.S., Savage, A.W.J., Gilbert, S.M., Shewry, P.R., Solomon, R.G., Békés, F., 2003a. Creating a balance – the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. Journal of Cereal Science. 38, 181-187.

Butow, B.J., Ma, W., Gale, K.R., Rampling, L., Larroque, O., Morell, M.K., Békés, F., 2003b. Molecular discrimination of Bx7 alleles demonstrates that highly expressed high-molecular weight glutenin allele has major impact on wheat flour dough strength. Theoretical and Applied Genetics 107, 1524-1532.

Cannell, M.E., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1998. Stability and heritability of marker genes in transgenic wheat and Tritordeum. In Slinkard AE (eds), Proceedings of the 9th International Wheat Genetic Symposium 3, 92-94. University Extension Press, University of Saskatoon, Canada.

Capell, T. and Christou, P., 2004. Progress in plant metabolic engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 148-154.

Chakraborty, S., Chakraborty, N., Datta, A., 2000. Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3724–3729.

Chalupa, V., 1987. Temperature. In: Bonga JM, Durzan DJ (eds) Cell and Tissue Culture in Forestry, Vol. 1. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, pp 142-151.

Chamberlain, D.A., Brettel, R.I.S., Last, D.I., Witrzens, B., McElroy, D., Dolferus, R., Dennis, E.S., 1994. The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Australian Journal of Plant Physiology 21, 95-112.

Champagne, E.T., Wood, D.F., Juliano, B.O., Bechtel, D.B., 2004. The rice grain and its gross composition. In: Champagne, E.T. (Ed.), Rice: Chemistry and Technology, third ed. AACC, St. Paul, MN, pp 77–107.

Chaturvedi, A., Sarojini, G., Nirmala, G., Nirmalamma, N., Satyanarayana, D., 1997. Glycemic index of grain amaranth, wheat and rice in NIDDM subjects. Plant Foods for Human Nutrition 50, 171-178.

Chaure, P., Gurr, S.J., Spanu, P., 2000. Stable transformation of Erysiphe graminis, an obligate biotrophic pathogen of barley. Nature Biotechnology 18, 205-207.

Chawla, H.S., Cass, L.A., Simmonds, J.A., 1999. Developmental and environmental regulation of anthocyanin pigmentation in wheat tissues transformed with anthocyanin regulatory genes. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 35, 403-408.

Chen, S.F., Paredes-Lopez, O., 1997. Isolation and characterization of the 11S globulin from amaranth seedsSource. Journal of Food Biochemistry 21, 53-65.

Chen, Z., Young, T.E., Ling, J., Chang, S.C., Gallie, D.R., 2003. Increasing vitamin C content of Plant through enhanced ascorbate recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3525–3530.

Cheng, M., Fry, J.E., Pang, S., Zhou, H., Hironaka, C.M., Duncan, D.R., Conner, T.W., Wan, Y., 1997. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiology 115, 971-980.

Christensen, A.H. and Quail, P.H., 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5, 213-218.

106

Christou, P. and Twyman, R.M., 2004. The potential of genetically enhanced Plant to address food insecurity. Nutr. Res. Rev. 17, 23–42.

Constabel, F., Shyluk, J.P., 1994. Initiation, nutrition, and maintenance of plant cell and tissue culture. In: Vasil IK, Thorpe TA (eds) Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 3-15.

Cornish, G., Békés, F., Larroque, O., Appels, R., 1998. The relationships between allelic composition of glutenin subunits and functional properties. In ‘Cereals 98—Proceedings of the 48th RACI Cereal Chemistry Conference’. (Eds AW Tarr, AS Ross, CW Wrigley) pp 536–539. (RACI: North Melbourne)

Crow, J.F., Kermicle, J., 2002. Oliver Nelson and quality protein maize. Genetics 160, 819–821.

D’Appollonia, B.L. and Kunerth, W.H. Eds. 1984. The Farinograph handbook, AACC, St. Paul, MN, ISBN-0-913250-37-6.

Dai, S., Carcamo, R., Zhang, Z., Chen, S., Beachy, R.N., 2001. The bacterial cytosine deaminase gene used as a conditional negative selection marker in transgenic rice plants. Plant Cell Reports 20, 738–743.

Dannenhoffer, J.M., Bostwick, D.E., Or, E., Larkins, B.A., 1995. Opaque-15, a maize mutation with properties of a defective opaque-2 modifier. Proceedings of the National Academy of the Sciences USA 92, 1931–1935.

De Block, M., Debrouwer, D., Moens, T., 1997. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters. Theoretical Applied Genetics 95, 125-131.

Diaz de la Garza, R.I., Quinlivan, E.P., Klaus, S.M.J., Basset, G.J.C., Gregory III, J.F., Hanson, A.D., 2004. Folate biofortification in tomato by engineering the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13720-13725.

Diaz de la Garza, R.I., Gregory, J.F., Hanson, A.D., 2007. Folate biofortification of tomato fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4218–4222.

Distelfeld, A., Uauy, C., Olmos, S., Schlatter, A.R., Dubcovsky, J.,Fahima, T., 2004. Microlinearity between a 2-cM region encompassing the grain protein content locus Gpc-6B1 on wheat chromosome 6B and a 350-kb region on rice chromosome 2. Functional and Integrative Genomics 4, 59–66.

Distelfeld, A., Uauy, C., Fahima, T., Dubcovsky, J., 2006. Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker. New Phytologist 169, 753–763.

Dubetz, S., Gardiner, E.E., Flynn, D., de la Roche, A.I., 1979. Effect of nitrogen fertilizer on nitrogen fractions and amino acid composition of spring wheat. Canadian J Plant Sci 59, 299-305.

Ducreux, L.J.M., Morris, W.L., Hedley, P.E., Shepherd, T., Davies, H.V., Millam, S., Taylor, M.A., 2005. Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of beta-carotene and lutein. J. Exp. Bot. 56, 81–89.

Dudits, D. és Heszky, L., 2003. Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest (második, bıvített kiadás).

Dudley, J.W., Lambert, R.J., Alexander, D.E., 1974. Seventy generations of selection for oil and protein concentration in the maize kernel. In: Dudley, J.W. (Ed.), Seventy Generations of Selection for Oil and Protein in Maize. Crop Science Society of America, Madison, WI, pp 181–212.

Dunwell, J.M., Purvis, A. and Khuri, S., 2004. Cupins: the most functionally diverse protein superfamily. Phytochem. 65, 7-17.

Dwivedi, S., Perotti, E., Ortiz, R., 2008. Toward molecular breeding of reproductive traits in cereal crops. Plant Biotechnology Journal 6(6), 529-559.

107

Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., Yamakado, M., 1997. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene as a selectable marker. Proceedings of the National Academy of Science 94, 2117–2121.

Ebinuma, H., Komamine, A., 2001. MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants. Cell. Dev. Biol.–Plant 37, 103-113.

Edlin, D.A.N., Kille, P., Wilkinson, M.W., Jones, H.D., Harwood, J.L., 2000. Morphological and metabolic changes in transgenic wheat with altered glycerol-3-phosphate acyltransferase or acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase activities. In: 14th International Symposium on Plant Lipids, Biochemical Society Transactions 28(6), 682-683.

Falco, S.C., Guida, T., Locke, M., Mauvais, J., Sandres, C., Ward, R.T., Webber, P., 1995. Transgenic canola and soybean seeds with increased lysine. Bio/Technology 13, 577.

FAO/WHO/UNU, 1985. Necessidades de Energia y Proteinas. World Health Organisation, Geneva.

Feldman, M., Lupton, F.G.H., Miller, T.E., 1995. Wheats Triticum spp. In Evolution of Crop Plants 2nd edition (eds. Smartt,J. and Simmonds,N.W.) Longmann Scientific and Technical, pp184-192.

Fennell, S., Bohorova, N., van Ginkel, M., Crossa, J., Hoisington, D., 1996. Plant regeneration from immature embryos of 48 elite CIMMYT bread wheats. Theoretical Applied Genetics 92, 163-169.

Fido, R.J., Békés, F., Gras, P.W., Tatham, A., 1997. The effects of added gliadin classes on the mixing properties and extension of dough. Journal of Cereal Science 26, 271-277.

Fischer-Iglesias, C., Sundberg, B., Neuhaus, G., Jones, A.M., 2001. Auxin distribution and transport during embryonic pattern formation in wheat. Plant J 26, 115-129.

Frame, B.R., Drayton, P.R., Bagnall, S.V., Lewnau, C.J., Bullock, W.P., Wilson, H.M., Dunwell, J.M., Thompson, J.A., Wang, K., 1994. Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide fiber-mediated transformation. The Plant Journal 6, 941-948.

Frederico, M.L., Kaeppler, H.F., Skadsen, R.W., 2005. The complex developmental expression of a novel stress-responsive barley Ltp gene is determined by a shortened promoter sequence. Planr Molecular Biology 57(1), 35-51.

Fu, X.D., Duc, L.T., Fontana, S., Bong, B.B., Tinjuangjun, P., Sudhakar, D., Twyman, R.M., Christou, P., Kohli, A., 2000. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns. Transgenic Res 9, 11-19.

Fukuyima, D., 1991. Structures of plant storage proteins and their functions. Food Rev. Int. 7, 353-381.

Furtado, A. and Henry, R.J., 2005. The wheat Em promoter drives reporter gene expression in embryo and aleurone tissue of transgenic barley and rice. Plant Biotechnology Journal 3(4), 421-434.

Galili, G., 1995. Regulation of lysine and threonine synthesis. Plant Cell 7, 899–906. Galili, G., 2002. New insights into the regulation and functional significance of lysine

metabolism in Plant. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 53, 27–43.

Gianibelli, M.C., Larroque, O.R., MacRitchie, F., Wrigley, C.W., 2001. Biochemical, genetic and molecular characterization of wheat endosperm proteins. Online review. AACC.

Gibbon, B.C., Larkins, B.A., 2005. Molecular genetic approaches to developing quality protein maize. Trends in Genetics 21, 227-233.

108

Geisel, J., 2003. Folic acid and neural tube defects in pregnancy – a review J. Perinat. Neonat. Nurs. 17, 268-279.

Golovkin, M.V., Ábrahám, M., Mórocz, S., Bottka, S., Fehér, A., Dudits, D., 1993. Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts. Plant Science Limerick 90, 41-52.

Gordon-Kamm, W.J., Baszczynski, C.L., Bruce, W.B., Tomes, D.T., 1999. Transgenic cereals: Zea mays (maize). Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants V, 189-253. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.

Gorinstein, S., Jaramillo, N.O., Medina, O.J., Rogriques, W.A., Tosello, G.A. and Paredes-Lopez, O., 1999. Evaluation of Some Cereals, Plants and TubersThrough Protein Composition Journal of Protein Chemistry 18(6), 687-693.

Gras, P.W., Békés, F., Gupta, R.B., MacRitchie, F., 1992. in ’Proceedings of the 24nd RACI Cereal Chemistry Conference’ (V.J. Humphrey-Taylor, ed.) RACI, Parkville, Australia. pp 171-180.

Gras, P.W., Varga, J., Rath, C., Tömösközi, S., Fogod, D., Salgo, A. and Békés, F., 2000. Screening for improved water absorption and mixing properties using four grams of flour: A new small-scale Farinograph –type mixer. In Proceeding of 11th International Cereal and Bread Congress, Broadbeach, QLd, Australia.

Gras, P.W., Anderssen, R.S., Keentok, M., Békés, F., Apples, R., 2001. Gluten protein functionality in wheat flour processing: a review. Aust. J. Agric. Res. 52, 1311-1323.

Grimwade, B., Tatham, A.S., Freedman, R.B., Shewry, P.R., Napier, J.A., 1996. Comparison of the expression patterns of genes coding for wheat gluten proteins and proteins involved in the secretory pathway in developing caryopses of wheat. Plant Mol Biol 30, 1067-1073.

Gupta, R.B., Singh, N.K., Shepherd, K.W., 1989. The cumulative effect of allelic variation in LMW and HMW glutenin subunits on physical dough properties in progeny of two bread wheats. Theor. Appl. Genet. 77, 57-64.

Gupta, R.B., Shepherd, K.W., McRitchie, F., 1991a. Genetic control and biochemical properties of some high molecular weight albumins in bread wheat. J. Cereal Sci. 13, 221-235.

Gupta, R.B., Békés, F., Wrigley, C.W., 1991b. Prediction of physical dough properties from glutenin subunit composition in bread wheats: correlation studies. Cereal Chemistry 68, 328–333.

Gupta, R.B., Batey, I.L., MacRitchie, F., 1992. Relationship between protein composition and functional properties of wheat flours. Cereal Chemistry. 69, 125-131.

Gupta, R.B. and McRitchie, F., 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19, 19-29.

Gupta, R.B., Popineau, Y., Lefebvre, J., Cornec, M., Lawrence, G.J., McRitchie, F., 1995. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. II. Changes in polymeric protein –formation and dough/gluten properties associated with the loss of low M(R) or hight M(R) glutenin subunits. Journal of Cereal Science 21, 103-116.

Gupta, R.B., Masci, S., Lafiandra, D., Bariana, H.S., McRitchie, F., 1996. Accumulation of protein subunits and their polymers in developing grains of hexaploid wheats. J Exp Bot 47, 1377-1385.

Guzmán-Maldonado, S. H., Paredes-López, O., 1998. Functional products of indigenous Plant to Latin America: Amaranth, quinoa, common beans and botanicals. In Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects. Mazza, G., Ed., Technomic Publishing: Lancaster, PA, Chapter 9, pp 293-328.

109

Hamer, R.J. and van Vliet, T., 2000. Understanding the structure and properties of gluten: An overview. pp 125-131. in Wheat Gluten. P.R. Shewry and A.S. Thatam. Eds. Royal Society of Chemistry: Cambrige, UK.

Hagan, N.D., Upadhyaya, N., Tabe, L.M., Higgins, T.J.V., 2003. The redistribution of protein sulfur in transgenic rice expressing a gene for a foreign, sulfur-rich protein. The Plant Journal 34, 1–11.

Haldrup, A., Petersen, SG., Okkels, FT., 1998. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. Plant Cell Reports 18, 76-81.

Halverson, J. and Zeleny, L., 1988. Criteria of wheat quality. In: Wheat: Chemistry and Technology (Y. Pomeranz ed.), Vol. II., AACC, St.Paul, Minnesota, USA, pp. 15-46.

Haraszi, R., Gras, P.W., Tömösközi, S., Salgo, A., Békés, F., 2004. The application of a micro Z-arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chem. 81, 550-560.

Harvey, A., Moisan, L., Lindup, S., Lonsdale, D., 1999. Wheat regenerated from scutellum callus as a source of material for transformation. Plant Cell Tiss Org Cult 57, 153-156.

Harwood, W.A., Ross, S.M., Cilento, P., Snape, J.W., 2000. The effect of DNA/gold particle preparation technique, and particle bombardment device, on the transformation of barley (Hordeum vulgare). Euphytica 111, 67-76.

He, D.G., Yang, Y.M., Scott, K.J., 1989. The effect of macro elements in the induction of embryogenic callus from immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci 64: 251-258.

He, G.Y., Rooke, L., Steele, S., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Barcelo, P., Shewry, P.R., Lazzeri, P.A., 1999. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var. durum) with high-molecular-weight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Molecular Breeding 5, 377-386.

He, G.Y., Lazzeri, P.A., Cannell, M.E., 2001. Fertile transgenic plants obtained from tritordeum inflorescences by tissue electroporation. Plant Cell Reports 20, 67-72.

Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6, 271-282.

Higgins, T.J.V., 1984. Synthesis and regulation of major proteins in seeds. Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 191-221.

Higgins, T.J.V., Beach, L.R., Spencer, D., Chandler, P.M., Randall, P.J., Blagrove, R.J., Kortt, A.A., Guthrie, R.E., 1987. cDNA and protein sequence of a major pea seed albumin. Plant Molecular Biology 8, 37-45.

Hoa, T.T.C., Bong, B.B., Huq, E., Hodges, T.K., 2002. Cre/lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome. Theoretical and Applied Genetics 104, 518–525.

Howarth, J.R., Jacquet, J.N., Doherty, A., Jones, H.D., Cannell, M.E., 2005. Molecular genetic analysis of silencing in two lines of Triticum aestivum transformed with the marker gene construct pAHC25. Annals of Applied Biology 146, 311–320.

Huang, S., Adams, W.R., Zhou, Q., Malloy, K.P., Voyles, D.A., Anthony, J., Kriz, A.L., Luethy, M.H., 2004. Improving nutritional quality of maize proteins by expressing sense and antisense zein genes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 1958–1964.

Huang, S., Spielmeyer, W., Lagudah, E.S., James, R.A., Platten, J.D., Dennis, E.S., Munns, R., 2006. A sodium transporter (KHT7) is a candidate for Nax1, a gene for salt tolerance in durum wheat. Plant Physiol 142, 1718–1727.

110

Hughes, K.W., 1981. In vitro ecology: exogenous factors affecting growth and morphogenesis in plant tissue cultures. Env Exp Bot 21, 281-288.

I’Anson, K.J., Morris, V.J., Shewry, P.R., Tatham, A.S., 1992. Small-angle X-ray-scattering studies of the C hordeins of barley (Hordeum vulgare) Biochemical Journal 287, 183-185.

Iser, M., Fetting, S., Scheyhing, F., Viertel, K., Hess, D., 1999. Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. Journal of Plant Physiology 154, 509-516.

Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T., Kumashiro, T., 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14, 745-750.

Jach, G., Binot, E., Frings, S., Luxa K., Schell, J., 2001. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (dsRED) as a reporter for plant gene expression. The Plant Journal 28, 483-491.

Jelenska, J., Tietze, E., Tempe, J., Brevet, J., 2000. Streptothricin resistance as a novel selectable marker for transgenic plant cells. Plant Cell Reports 19, 298-303.

Jenes, B., Bittencourt, P.A.L., Csányi, Á., Pauk, J., Nagy, I., Toldi, O., Balázs, E., 1996. The GENEBOOSTER - a new microprojectile bombardment device - for genetic transformation of plants. Plant Tissue Culture and Biotechnology 2, 42-51.

Jensen, S.A. and Martens, H., 1983. The botanical constituents of wheat and wheat milling fractions. II. Quantification by amino acids. Cereal Chemistry 60, 172–177.

Jones, H., Doherty, A., Wu, H., 2005. Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-mediated transformation of wheat. Plant Methods 1, 5.

Juhasz, A., Larroque, R.O., Tamas, L., Hsam, S.L., Zeller, F.J., Bekes, F., Bedo, Z., 2003. Bankuti 1201--an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theoretical Applied Genetics 107 (4), 697-704.

Kang, TJ., Loc, NH., Jang, MO., Jang, YS., Kim, YS., Seo, JE., Yang, MS. 2003. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Res 12, 683-691.

Karunaratne, S., Sohn, A.A., Scott, J., Steinbiss, H.H., Scott, KJ., 1996. Transformation of wheat with the gene encoding the coat protein of barley yellow mosaic virus. Australian Journal of Plant Physiology 23, 429-435.

Kermode, A.R. and Bewley, J.D., 1999. Synthesis, processing and deposition of seed proteins. In: Seed Proteins (Eds. Shewry, P.R. and Casey, R.) pp 807-841.

Kinney, A.J. Cahonn, E.B. Damude, H.G., Hitz, W.D., Kolar, C.W., Liu, Z-B., 2004. E.I. Du Pont de Nemours and Company. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed Plant, WO 2004/071467 A2

Kirkman, M.A., Shewry, P.R., Miflin, B.J., 1982. The effect of nitrogen nutrition on the lysine content and protein composition of barley seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture 33, 115–127.

Kleese, R.A., Kirihara, J.A., Sandahl, G.A., 1991. Gene transfer to elevate methionine levels. In: Proceedings 46th Annual Corn and Soybean Industrial Research Conference. American Seed Trade Association, Washington DC, pp. 124–129.

Kohli, A., Gahakwa, D., Vain, P., Laurie, DA., Christou, P., 1999. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: Molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta 208, 88-97.

Kohli, A., Twyman, R.M., Abranches, R., Wegel, E., Stoger, E. and Christou, P., 2003. Transgene integration, organization and interaction in plants Plant Molecular Biology. 52, 247-258.

111

Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N., Kumashiro, T., 1996. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant Journal 10, 165-174.

Komari, T. and Kubo, T., 1999. Methods of genetic transformation: Agrobacterium tumefaciens. In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop, pp 43–82. Kluwer Academic, London.

Konishi, Y., Horikawa, K., Oku, Y., Azumaya, J., Nakatani, N., 1991. Extraction of two albumin fractions from amaranth grains: comparison of some physicochemical properties and the putative localization in the grains. Agric Biol Chem 55 (11), 1745-1750.

Koprek, T., Hänsch, R., Nerlich, A., Mendel, R.R. and Schulze, J., 1996. Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue culture response. Plant Sci. 119, 79–91.

Kunkel, T., Niu, Q.W., Chan, Y.S., Chua, N.H., 1999. Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. Nature Biotechnology 17, 916-919.

Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage. Nature 227:680-685.

Lai, J., Messing, J., 2002. Increasing maize seed methionine by mRNA stability. The Plant Journal 30, 395–402.

Larkin, PJ., 1982. Sugarcane tissue and protoplast culture. Plant Cell Tiss Org Cult 1, 149-164.

Larroque, O.R., Bekes, F., 2000. Rapid size-exclusion chromatography analysis of molecular size distribution for wheat endosperm protein. Cereal Chemistry 77, 451–453.

Laursen, C.M., Krzyzek, R.A., Flick, C.E., Anderson, P.C., Spencer, T.M., 1994. Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. Plant Molecular Biology 24, 51-61.

Lawrence, G.J. and Shepherd, K.W., 1980. Variation in glutenin protein subunits of wheat. Aust. J. Biol. Sci. 33, 221-233.

Lee, Y.K., Békés, F., Gras, P., Ciaffi, M., Morell, M.K., Appels, R., 1999a. The low-molecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. IV. Functional properties of products from individual genes. Theor Appl Genet 98, 149-155.

Lee, T.T.T., Chung, M.-C., Kao, Y.-W., Wang, C.-S., Chen, L.-J., Tzen, J.T.C., 2005. Specific expression of a sesame storage protein in transgenic rice bran. Journal of Cereal Science 41, 23–29.

Lehmann, J. W., 1996. Case history of grain amaranth as an alternative crop. Cereal Foods World 41, 399-411.

León, E., Marín, S., Giménez, M.J., Piston, F., Rodríguez-Quijano, M., Shewry, P.R., Barro, F., 2009. Mixing properties and dough functionality of transgenic lines of a commercial wheat cultivar expressing the 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 49(1), 148-156.

Lörz, H., Baker, B., Schell, J., 1985. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Molecular and General Genetics 199, 178-182.

Lu, S., Van Eck, J., Zhou, X., Lopez, A.B., O'Halloran, D.M., Cosman, K.M., Conlin, B.J., Li, L., 2006. The cauliflower Or gene encodes a DnaJ cysteinerich domain-containing protein that mediates high levels of beta-carotene accumulation. Plant Cell 18, 3594–3605.

Lucca, P., Hurrell, P., Potrykus, I., 2001. Genetic engineering approaches to improve the bioavailability and the level of iron in the rice grains. Theoretical and Applied Genetics 102, 392–397.

112

Machii, H., Mizuno, H., Hirabayashi, T., Li, H., Hagio, T., 1998. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. 53, 67–74.

Maheshwari, N., Rajyalakshmi, K., Baweja, K., 1995. In-vitro culture of wheat and genetic-transformation-retrospect and prospect. Critical reviews in plant sciences 14(2), 149-178.

Marchylo, BA., Kruger, JE., Hatcher, DW., 1989. Quantitative RP-HPLC analysis of wheat storage proteins as a potential quality prediction tool. J Cereal Sci 9, 113-130.

Marcone, M.F., 1999. Evidence confirming the existence of a 7S globulin-like storage protein in Amaranthus hypochondriacus seed. Food Chem. 65, 533-542.

Margiotta, B., Urbano, M., Colaprico, G., Johansson, E., Buonocore, F., D’Ovidio, R., Lafiandra, D., 1996. Detection of y-type subunit at the Glu-A1 locus in some Swedish bread wheat lines. J. of Cer. Sci. 23, 203-211.

Marion, D. and Dubreil, L., 1998. Lipids, lipid-protein interactions and the quality of baked cereal products. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp 131-167.

Martínez, E.N., Castellani, O.F., Anón M.C., 1997. Common Molecular Features among Amaranth Storage Proteins. J. Agric. Food Chem. 45, 3832-3839.

Maruta, Y., Ueki, J., Saito, H., Nitta, N., Imaseki, H., 2001. Transgenic rice with reduced glutelin content by transformation with glutelin A antisense gene. Mol. Breed. 8, 273-284.

Masci, S., Lafiandra, D., Porceddu, E., Lew, E.J.L., Tao, H.P., Kasarda, D.D., 1993. D-glutenin subunits: N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine. Cereal Chem. 70, 581-585.

Masci, S., D’Ovidio, R., Scossa, F., Patacchini, C., Lafiandra, D., Anderson, O.D., Blechl, A.E., 2003. Production and characterization of a transgenic bread wheat line over-expressing a low-molecular-weight glutenin subunit gene. Mol Breeding 12, 209–222.

McElroy, D., Blowers, A.D., Jenes, B., Wu, R., 1991. Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5’ region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics 231, 150-160.

McRitchie, F., 1987. Evaluation of combinations from wheat protein fractions to dough mixing and breadmaking. Journal of Cereal Science 6, 259-268.

McRitchie, F., Kasandra, D.D., Kuzmicky, D.D., 1991. Characterization of wheat protein fractions differing in contributions to breadmaking quality. Cereal Chemistry 68, 122-130.

McRitchie, F. and Gupta, R.B., 1993. Functionality-composition relationships of wheat flour as a result of variation in sulfur availability. Aust. J. Agr. Res. 44, 1767-1774.

Melo, M.M., Xavier-Filho, J., Lima, M.S., Prouvost-Danon, A., 1994. Allergenicity and tolerance to proteins from Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.). Food and Agricultural Immunology 6, 185-195.

Mertz, E.T., Bates, L.S., Nelson, O.E., 1964. Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm. Science 145, 279–280.

Meyer, F.D., Smidansky, E.D., Beecher, B., Greene, T.W., Giroux, M.J., 2004. The maize Sh2r6hs ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) large subunit confers enhanced AGP properties in transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Science 167(4), 899-911.

Mossé, J., Huet, J.-C., 1990. Amino acid composition and nutritional score for ten cereals and six legumes or oilseeds: causes and ranges of variations according to species and to seed nitrogen content. Sciences des Alimentations 10, 151–173.

Munck, L., Karlsson, K.E., Hagberg, A., Eggum, B.O., 1970. Gene for improved nutritional value in barley seed protein. Science 168, 985–987.

113

Murashige, T. and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology 15, 473-497.

Newman, C.W. and McGuire, C.F., 1985. Nutritional Quality of Barley. In: Rasmussen DC (Ed.), Barley, Agronomy Monograph 26. ASACSSA- SSSA, Madison, WI, 403–456.

Nordlee, J.A., Taylor, S.L., Townsend, J.A., Thomas, L.A., Bush, R.K., 1996. Identification of a Brazil nut allergen in transgenic soybeans. New England Journal of Medicine 334, 688-692.

O’Kennedy, M.M., Grootboom, A., Shewry, P.R., 2006. Harnessing sorghum and millet biotechnology for food and health. Journal of Cereal Science 44, 224–235.

Olmos, S., Distelfeld, A., Chicaiza, O., Schlatter, A.R., Fahima, T., Echenique, V., Dubcovsky, J., 2003. Precise mapping of a locus affecting grain protein content in durum wheat. Theoretical and Applied Genetics 107, 1243–1251.

Oria, M.P., Hamaker, B.R., Axtel, J.D., Huang, C.-P., 2000. A highly digestible sorghum mutant cultivar exhibits a unique folded structure of endosperm protein bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 5065–5070.

Osuna-Castro, J.A., Rascón-Cruz, Q., Napier, J., Fido, R.J., Shewry, P.R. and Paredes-López, O., 2000. Overexpression, Purification, and in Vitro Refolding of the 11S Globulin from Amaranth Seed in Escherichia coli. J. Agric. Food Chem. 48, 5249-5255.

Osborne,T.B., 1924. The Vegetable Proteins. 2nd edn. Longmans, Green and Co., London, p 154.

Oszvald, M., Kang, T.J., Tömösközi, S., Tamás, C., Tamás, L., Kim, T.G., Yang, MS., 2007. Expression of a synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of E. coli heat labile enterotoxin in rice endosperm, Molecular Biotechnology 35, 215-224.

Oszvald, M., Gardonyi, M., Tamas, C., Takacs, I., Jenes, B., Tamas L., 2008. Development and Characterization of a chimaeric tissue-specific promoter in wheat and rice endosperm. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 44, 1-7.

Oszvald, M., Tamás, C., Rakszegi, M., Tömösközi, S., Békés, F., Tamás L., 2009. Effects of incorporated amaranth albumins on the functional properties of wheat dough. Journal of the Science of Food and Agriculture DOI 10.1002/jsfa.3528

Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Drake, R., 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat. Biotechnol. 23, 482–487.

Paredes-López, O., Mora-Escobedo, R., Ordorica-Falomir, C., 1988. Isolation of amaranth proteins. LWT - Food Science and Technology 21, 328-333.

Pastori, G.M., Wilkinson, M.D., Steele, S.H., Sparks, C.A., Jones, H.D., Parry, M.A.J., 2001. Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties. J Exp Bot 52, 857-863.

Pauk, J. and Szarka, B., 1991. Protoplast isolation and investigations in common wheat (Triticum aestivum L.). Physiologia Plantarum 82, 1.

Paul, A.A., and Southgate, D.A.T., 1978. McCance and Widdowson’s The Composition of Foods, fourth ed. Elsevier, Amsterdam

Pawlowski, W.P. and Somers, D.A., 1998. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 12106–12110.

Payne, P.I., Holt, L.M., Jackson, E.A. and Law, C.N., 1984. Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Phil Trans R Soc Lond B 304, 359-371.

114

Pellegrineschi, A., McLean, S., Salgado, M., Velazquez, L., Hernandez, R., Brito, R.M., Noguera, M., Medhurst, A., Hoisington, D., 2000. Transgenic wheat plants: A powerful breeding source. In Bedı, Z., Láng, L. (eds), Wheat in a Global Environment pp 325-330.

Pellegrineschi, A., Noguera, M., Skovmand, B., Brito, R.M., Velazquez, L., Salgado, M., Hernandez, R., Warburton, M., Hoisington, D., 2002. Identification of highly transformable wheat genotypes for mass production of fertile transgenic plants. Genome 45, 421-430.

Perutto, A.D.B., Pogna, N.E., Curioni, A., 1996. Evidence for the presence of disulphide bonds between β-amylase and low molecular weight glutenin subunits, pp 312-315. in: Gluten ’96. C.W.Wrigley, Ed. RACI, Melbourne, Australia

Petolino, J.F., Hopkins, N.L., Kosegi, B.D., Skokut, M., 2000. Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize. Plant Cell Reports 19, 781-786.

Phillips, R.L., Morris, P.R., Wold, F., Gengenbach, B.G., 1981. Seedling screening for lysine-plus-threonine resistant maize. Crop Science 21, 601-606.

Phillips, R.L., McClure, B.A., 1985. Elevated protein-bound methionine in seeds of a maize line resistant to lysine plus threonine. Cereal Chemistry 62, 213-218.

Pomeranz, Y., 1988. Chemical composition of kernel structures. pp 97-158. in: Wheat Chemistry and Technology, Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.

Pons, J.L., de Lamotte, F., Gautier, M.F., Delsuc M.A., 2003. Refined solution structure of a liganded type 2 wheat nonspecific lipid transfer protein. J. Biol. Chem. 278, 14249-14256.

Pónya, Z., Finy, P., Fehér, A., Mityko, J., Dudits, D., Barnabás, B., 1999. Optimisation of introducing foreign genes into egg cells and zygotes of wheat (Triticum aestivum L.) via microinjection. Protoplasma 208, 163-172.

Popineau, Y., Deshayes, G., Lefebvre, J., Fido, R., Tatham, A.S., Shewry, P.R., 2001. Prolamin aggregation, gluten viscoelasticity, and mixing properties of transgenic wheat lines expressing 1Ax and 1Dx high molecular weight glutenin subunit transgenes. J Agric Food Chem 49, 395–401.

Potenza, C., Aleman, L., Sengupta-Gopalan, C., 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40(1), 1-22.

Potrykus, I., 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technol. 8, 535–542. Prasanna, B.M., Vasal, S.K., Kassahun, B., Singh, N.N., 2001. Quality protein maize. Current

Science 81, 1308–1319. Pauk, J., Hänsch, R., Schwarz, G., Nerlich, A., Monostori, T., Mészáros, A., Jenes, B.,

Kertész, Z., Matuz, J., Schulze, J., Mendel, R.R., 1998. Genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.) in Hungary. Növénytermelés 47, 241-251.

Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, J.A., Lazarus, C.M., 2004. Production of very long chain polyunsaturated ω-3 and ω-6 fatty acids in Plant. Nat. Biotechnol. 22, 739–745.

Raina, A. and Datta, A., 1992. Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition from Amaranthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11774-11778.

Rakszegi, M., Bekes, F., Lang, L., Tamas, L., Shewry, P.R., Bedo, Z., 2005. Technological quality of transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW glutenin subunit. J Cereal Sci 42, 15–23.

115

Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.

Rasco-Gaunt, S. and Barcelo, P., 1999. Immature inflorescence culture of cereals: a highly responsive system for regeneration and transformation. In Hall RD (eds), Methods in Molecular Biology: Plant Cell Culture Protocols pp 71-81. Humana Press Inc., Totowa, NJ.

Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1999a. Analysis of particle bombardment parameters to optimize DNA delivery into wheat tissues. Plant Cell Reports 19, 118-127.

Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Lazzeri, P., Barcelo, P., De Block, M., 1999b. A facile method for screening for phosphinothricin (PPT)-resistant transgenic wheats. Molecular Breeding 5, 255-262.

Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Cannell, M., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 2001. Procedures allowing the transformation of a range of European elite wheat (Triticum aestivum L.) varieties via particle bombardment. Journal of Experimental Botany 52, 865-874.

Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.

Regina, A., Bird, R., Topping, D., Bowden, S., Freeman, J., Barsby, T., Kosar-Hashemi, B., Li, Z., Rahman, S., Morell, M., 2006. High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats. Proc Natl Acad Sci USA 103, 3546–3551.

Regina, A., Bird, R., Li, Z., Rahman, S., Mann, G., Chanliaud, E., Berbezy, P., Topping, D., Morell, M.K., 2008. Bioengineering Cereal Carbohydrates to Improve Human Health. Cereal Foods World 52(4), 182-187.

Robbins, G.S., Pomeranz, Y., Briggle, L.W., 1971. Amino acid composition of oat groats. Journal of Agricultural Food Chemistry 19, 536–539.

Roesler, K.R., Rao, A.G., 1999. Conformation and stability of barley chymotrypsin inhibitor-2 (CI-2) mutants containing multiple lysine substitutions. Protein Engineering 12, 967-973.

Roesler, K.R., Rao, A.G., 2000. A single disulfide bond restores thermodynamic and proteolytic stability to an extensively mutated protein. Protein Science 9, 1642-1650.

Romero-Zepeda, H. and Parades-López, O., 1996. Isolation and characterization of amarantin, the 11S amaranth seed globulin. Journal of Food Biochemistry 19, 329-339.

Rooke, L., Békés, F., Fido, R., Barro, F., Gras, P., Tatham, A.S., Barcelo, P., Lazzeri, P., Shewry, P.R., 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science 30, 115-120.

Rooke L., Steele S.H., Barcelo P., Shewry P.R., Lazzeri P.A., 2003. Transgene inheritance, segregation and expression in bread wheat. Euphytica, 129, 301–309.

Rothfus, J.A. and Kennel, S.J., 1970. Properties of wheat β-amylase adsorbed on glutenin. Cereal Chem. 47, 140-146.

Ruiz, M. and Carrillo, J.M., 1993. Linkage relationships between prolamin genes on chromosomes 1A and 1B of durum wheat. Theor Appl Genet 87, 353-360.

Russell, D.A., Fromm, M.E., 1997. Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research 6, 157-168.

Sanford, J.C., 1988. The biolistic process - a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnology 6, 229-302.

116

Sapirstein, H.D. and Fu, B.X., 1996. Characterization of an extra-strong wheat functionality

of 1) gliadin- and glutenin-rich fractions, 2) total HMW and LMW subunits of glutenin assessed by reduction-oxidation. In ’Gluten ’96, Proceedings of the 6th International Gluten Workshop’, (C.W: Wrigley, ed.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne. Australia. 212-216.

Schropp, P., Belitz, H.D., Weiser, H., 1995. Reoxidation of high molecular weight subunits of glutenin. Cereal Chem 72, 406-410.

Schropp, P. and Weiser, H., 1996. Effects of high molecular weight subunits of glutenin on the rheological properties of wheat gluten. Cereal Chemistry 73, 410-413.

Segal, G., Song, R., Messing, J., 2003. A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 165, 387–397.

Segura-Nieto, M., Vázquez-Sánchez, N., Rubio-Velázquez, H., Olguín-Martínez, L., Rodriguez-Nester, C. and Herrera-Estrella, L., 1992. Characterization of Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 1553-1558.

Segura-Nieto, M., Barba de la Rosa, A.P., Parades-López, O., 1994. Biochemistry of amaranth proteins. In: Amaranth: Biology, Chemistry and Technology. (ed. Parades-López, O.) CRC Press, Boca Ratón FL. Chap 5. pp 75-106.

Segura-Nieto, M., Shewry, P.R., Parades-López, O., 1999. Globulins of Pseudocereals: Amaranth, Quinoa, and Buckwheat. In: Seed proteins. Shewry, P.R., Casey R. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp 453-475.

Serik, O., Ainur, I., Murat, K., Tetsuo, M., Masaki, I., 1996. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into cells of wheat (Triticum aestivum L.) mature embryos. Plant Cell Reports 16, 133-136.

Shewry, P.R., Franklin, J., Parmar, S., Smith, S.J., Miflin, B.J., 1983. The effects of sulfur starvation on the amino acid and protein compositions of barley grain. Journal of Cereal Science 1, 21–31.

Shewry, P.R., 1993. Barley seed proteins. In: MacGregor, A.W., Bhatty, R.S. (Eds.), Barley: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp. 131–197

Shewry, P.R., Napier, J.A., Tatham, A.S., 1995. Seed proteins-structures and biosynthesis. Plant Cell. 7, 945-956.

Shewry, P.R. and Tatham, A.S., 1997. Disulphide bonds in wheat gluten proteins. J. of Cer. Sci. 25, 207-227.

Shewry, P.R., Tatham, A.S., Halford, N.G., 1999. The prolamins of the Triticeae. pp 35-78. in: Seed Proteins. P. R. Shewry and R. Casey (Eds.), Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands.

Shewry, P.R., Tatham, A.S., 2000. Wheat. The Royal Society of Chemistry. Cambridge CB4 OWF, UK: 335–339.

Shewry, P.R. and Jones, H.D., 2005. Transgenic wheat: where do we stand after the first 12 years. Ann Appl Biol 147, 1–14.

Shewry, P.R., 2007. Improving the protein content and composition of cereal grain. Journal of Cereal Science 46, 239–250.

Shewry, P.R., Baudo, M., Lovegrove, A., Napier, J.A., Ward, J., Baker, J., Beale, M.A., 2007. Is GM wheat different to conventionally bred wheat. Trends in Food Science and Technology 18, 201–209.

Shintani, D. and Della-Penna, D., 1998. Elevating the vitamin E content of Plant through metabolic engineering. Science 282, 2098–2100.

117

Shoup, F.K., Pomeranz, Y., Deyoe, C.W., 1966. Amino acid composition of wheat varieties and flours varying widely in bread-making potentialities. Journal of Food Sci 31, 94–101.

Silva-Sanchez, C.J., Gonzalez-Castaneda, J., De Leon-Rodriguez, A., De La Rosa, APB., 2004. Functional and rheological properties of amaranth albumins extracted from two Mexican varieties. Plant Foods for Human Nutrition 59, 169-174.

Simmonds, N.W., 1995. The relation between yield and protein in cereal grain. Journal of the Science and Food in Agriculture 67, 309–315.

Singh, N.K., Shepherd, K.W., Langridge, P., Gruen, L.C., 1991. Biochemical characterization of triticin, a legumin-like protein in wheat endosperm. J Cereal Sci 13, 207–219.

Singh, N.K. and MacRitchie, F., 2001. Application of polymer science to properties of gluten. J. cereal Sci. 33, 231-243.

Sissons, M.J., Békés, F., Skerritt, J.H., 1998. Isolation and functionality testing of low molecular weight glutenin subunits. Cereal Chemistry 75, 30-36.

Soriano-Santos, J., Iwabuchi, S., and Fujimoto, K., 1992. Solubility of Amaranth seed protein in sodium sulfate and sodium chloride: the main factor in quantitative extraction for analysis. Int. Journ. of Food Sci and Techn. 27, 337-346.

Sparks, C.A., and Jones, H.D., 2004. Transformation of wheat by biolistics. In: (Curtis I, ed) Transgenic Crops of the World. Kluwer Academic Publ., pp 1-16.

Srivastava, V., Anderson, O.D., Ow, D.W., 1999. Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceeding of the National. Academy of Science 96, 11117-11121.

Stacey, J., Isaac, P.G., 1994. Isolation of DNA from plants. In: Isaac PG (ed.) Methods in Molecular Biology – Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes. Humana Press Inc, Totowa, NJ. vol. 28, pp 9–15.

Stewart, Jr C.N., 2001. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell Reports 20, 376–382.

Stoger, E., Williams, S., Keen, D., Christou, P., 1998. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression. Transgenic Res. 7, 463–471.

Stoger, E., Williams, S., Christou, P., Down, R.E., Gatehouse, J.A., 1999. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galathus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effect on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding 5, 65-73.

Sugita, K., Matsunaga, E., Ebinuma, H., 1999. Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports 18, 941-947.

Svitashev, S.K., Pawlowski, W.P., Makarevitch, I., Plank, D.W., Somers, D.A., 2002. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. Plant J 32, 433-445.

Takumi, S. and Shimada, T., 1996. Production of transgenic wheat through particle bombardment of scutellar tissues: frequency is influenced by culture duration. Journal of Plant Physiology 149, 418-423.

Tamás, L., Békés, F., Greenfield, J., Tatham, A.S., Gras. P.W., Shewry, P.R., Apples, R., 1998. Heterologous expression and dough mixing studies of wild-type and mutant C hordeins Journal of Cereal Science 27, 15-22.

Tamás, C., Tamás, L., Morell, KM., Appels, R., 1999. The use of GFP gene as a reporter gene in wheat transformation. 4th Congress of the Hungarian Genetical Society, p 166.

Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z., 2000. Temperature, light and medium optimisation for plant regeneration of winter wheat varieties. 6th International Wheat Conference, p. 308. Budapest, Hungary, 5-9 June 2000.

118

Tamás, L., Gras, P.W., Solomon, R.G., Morell, M.K., Apples, R., Békés, F., 2002. Chain extension and termination as a function of cysteine content and the length of the central repetitive domain in storage proteins. Journal of Cereal Science 36, 313-325.

Tamás, C., Szucs, P., Rakszegi, M., Tamás, L., Bedo, Z., 2004. Effect of combined changes in culture medium and incubation conditions on the regeneration from immature embryos of elite varieties of winter wheat. Plant Cell Tissue and Organ Culture 79, 39-44.

Tamás, L. and Shewry, P.R., 2006. Heterologous expression and protein engineering of wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science 43, 259-274.

Tatham, A.S. and Shewry, P.R., 1995. The S-poor prolamins of wheat, barley and rye. J. of Cer. Sci. 22, 1-16.

Terzi, V., Pastori, G., Shewry, P.R., Di Fonzo, N., Stanca, A.M., Faccioli, P., 2005. Real-time PCR-assisted selection of wheat plants transformed with HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 41, 133–136.

Thorpe, T.A., 1980. Organogenesis in vitro: Structural, physiological and biochemical aspects. Int Rev Cytol Suppl 11, 71-111.

Thorpe, T.A., 1994. Morphogenesis and regeneration. In: Vasil, I.K., Thorpe, T.A. (eds) Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 17-36.

Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang, M., Thornton, S., Brettell, R., 1997. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. The Plant Journal 11, 1369-1376.

Tosi, P., D’Ovidio, R., Napier, J.A., Bekes, F., Shewry, P.R., 2004. Expression of epitope-tagged LMW glutenin subunits in the starchy endosperm of transgenic wheat and their incorporation into glutenin polymers. Theor Appl Genet 108, 468–476.

Tosi, P., Masci, S., Giovangrossi, A., D’Ovidio, R., Bekes, F., Larroque, O., Napier, J., Shewry, P.R., 2005. Modification of the low molecular weight (LMW) glutenin composition of transgenic durum wheat: effects on glutenin polymer size and gluten functionality. Molecular Breeding 16, 113–126.

Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354.

Tömösközi, S., Varga, J., Gras, P.W., Rath, C., Salgó, A., Nánási, J., Fogor, D. and Békés, F., 2000. Scale down possibilities in development of dough testing methods. in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN 0-85404-865-0, Univ. of Bristol, UK.

Tömösközi, S., Nádosi, M., Ercsey, K., Nánási, J., Varga, J., 2005. Development of small-scale methods for measuring wheat quality - A new instrument for determination of sedimentation value. 50 YEARS ICC JUBILEE CONFERENCE 1955-2005”Cereals - The future challange” Vienna, Austria July 3-6.

Tulecke, W.R., 1953. The pollen of Ginko biloba. In vitro culture and tissue formation. Am. J. Bot. 44, 602-608.

Tzafrir, I., Torbert, K.A., Lockhart, B.E.L., Somers, D.A., Olszewski, N.E., 1998. The sugarcane bacilliform badnavirus promoter is active in both monocots and dicots. Plant Molecular Biology 38, 347-356.

Uauy, C., Distelfeld, A., Fahima, T., Blechl, A., Dubcovsky, J., 2006. A NAC gene regulating senescence improves grain protein, zinc and iron content in wheat. Science 314, 1298–1301.

Ullrich, S.E., 2002. Genetics and breeding of barley feed quality attributes. In: Slafer, G.A., Molina-Cano, J.L., Savin, R., Araus, J.L., Romagosa, I. (Eds.), Barley Science: Recent Advances from Molecular Biology to Agronomy of Yield and Quality. Food Products Press, pp. 115–142.

119

Uthayakumaran, S., Békés, F., Gras, P.W., 1997. Effect of varying protein content and gliadin to glutenin ratio on the functional properties of wheat dough. In ’Proceedings of the 47th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia, pp 212-216.

Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Békés, F., 1998. A systematic study of the wheat storage proteins and their functionality. In ’Proceedings of the 48th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia. 150-155.

Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoddard, F.L., Békés, F. 1999. Effect of varying protein content and glutenin-to-gliadin ratio on the functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry 76, 389-394.

Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoodard, F.L., Békés, F., 2000. Optimized methods for incorporating glutenin subunits into wheat dough for extension and beaking studies. Cereal Chemistry 77, 731-736.

Uthayakumaran, S., Tömösközi, S., Savage, A.W.J., Tatham, A., Gianibelli, M.C., Stoddard, F.L. and Békés, F., 2001. Effects of gliadin fractions on the functional properties of wheat dough depend on molecular size and hydrophobicity. Cereal Chem. 78, 138-141.

Uthayakumaran, S., Lukow, O.M., Jordan, M,C., Cloutier, S., 2003. Development of genetically modified wheat to assess its dough functional properties. Molecular Breeding 11(4), 249-258.

Van Eenennaam, A.L., Lincoln, K., Durrett, T.P., Valentin, H.E., Shewmaker, C.K., Thorne, G.M., Jiang, J., Baszis, S.R., Levering, C.K., Aasen, E.D., Hao, M., Stein, J.C., Norris, S.R., Last, R.L., 2003. Engineering vitamin E content: From Arabidopsis mutant to soy oil. Plant Cell 15, 3007–3019.

Vasco-Méndez, N.L. and Parades-López, O., 1995. Antigenic homology between amaranth glutelins and other storage proteins. Journal of Food Biochemistry 18, 227-238.

Vasil, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E., Vasil, I.K., 1992. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. BioTechnology 10, 667-674.

Vasil, I.K., Bean, S., Zhao, J., McCluskey, P., Lookhart, G., Zhao, H.- P., Altpeter, F., Vasil, V., 2001. Evaluation of baking properties and gluten protein composition of field grown transgenic wheat lines expressing high molecular weight glutenin gene 1Ax1. J Plant Physiol 158, 521–528.

Vasil, I.K., 2007. Molecular genetic improvement of cereals: transgenic wheat (Triticum aestivum L.) Plant Cell Rep 26, 1133–1154.

Veraverbeke, W.S., Verbruggen, I.M., Delcour, J.A., 1998. Effects of increased high molecular weight glutenin subunits content of flour on dough mixing behaviour and breadmaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 4830-4835.

Vogel, K.P., Johnson, V.A., Mattern, P.J., 1978. Protein and lysine contents of endosperm and bran of the parents and progenies of crosses of common wheat. Crop Science 18, 751–754.

Wakasa, K., Hasegawa, H., Nemoto, H., Matsuda, F., Miyazawa, H., Tozawa, Y., Morino, K., Komatsu, A., Yamada, T., Terekawa, T., Miyagawa, H., 2006. Highlevel tryptophan accumulation in seeds of transgenic rice and its limited effects on agronomic traits and seed metabolite profile. Journal of Experimental Botany 57, 3069-3078.

Weegels, P.L., Marseille, J.P., Bosveld, P., Hamer, R.J. l994. Large-scale separation of gliadins and their bread-making quality. Journal of Cereal Science 20, 253-264.

Weeks, T., 1998. USDA Agricultural Research Report.

120

Weir, B., Gu, X., Wang, M.B., Upadhyaya, N., Elliot, A.R., Brettell, R.I.S., 2001. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using suspension cells as a model system and green fluorescent protein as a visual marker. Australian Journal of Plant Physiology 28, 807-818.

White, P.J., Broadley, M.R., 2005. Biofortifying crops with essential mineral elements. Trends in Plant Science 10, 586-593.

Wieser, H., Seilmeier, W. and Kieffer, R. 1994. Relationship between the amount of gluten protein on rheological properties of different wheat cultivars. Pages 141-150. in: Gluten prteins 1993. Assoc. Cereal Res.:Detmold, Germany.

Wieser, H., 2007. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiology 24, 115-119. Wright, M.-Dawson, J.-Dunder, E.- Suttie, J.- Reed, J.-Kramer, C.-Chang, Y.- Novitzky, R.-

Wang, H.-Artim-Moore, L.: 2001. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Reports 20, 429–436.

Wrigley, C.W., and Bietz, J.A., 1988. Proteins and amino acids. pp 159-275. in: Wheat: Chemistry and Technology Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.

Wrigley, C.W., 1996. Giant proteins with flour power. Nature 381, 738-739. Wu, G., Truksa, M., Datla, N., Vrinten, P., Bauer, J., Zank, T., Cirpus, P., Qiu, X. 2005.

Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in Plant. Nat. Biotechnol. 23, 1013–1017.

Wu, H., Sparks, C., Amoah, B., Jones, H.D., 2003. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat. Plant Cell Reports 21, 659-668.

Wu, H., Sparks, C.A., Jones, H.D., 2006. Characterization of T-DNA loci and vector backbone sequences in transgenic wheat produced by Agrobacterium-mediated transformation. Mol Breed 18, 195–208.

Wu, H. X. Doherty, A. Jones, H. D., 2007. Efficient and rapid Agrobacterium-mediated genetic transformation of durum wheat (Triticum turgidum L-var. durum) using additional virulence genes. Transgenic Research 17(3), 425-436.

Xia, G.M., Li, Z.Y., He, C.X., Chen, H.M., Brettell, R., 1999. Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Acta Phytophysiologica Sinica 25, 22-28.

Xu, X., Li, B., 1994. Fertile transgenic Indica rice plants obtained by electroporation of seed embryo cells. Plant Cell Reports 13, 237-242.

Ye, X., Beyer, P., 2000. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287, 303–305.

Yu, J., Peng, P., Zhang, X., Zhao, Q., Zhy, D., Sun, X., Liu, J., Ao, G., 2004. Seed-specific expression of a lysine rich protein sb401 gene significantly increases both lysine and total protein content in maize seeds. Molecular Breeding 14, 1–7.

Zhang, S., Cho, M.J., Koprek, T., Yun, R., Bregitzer, P., Lemaux, P.G., 1999. Genetic transformation of commercial cultivars of oat (Avena sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings. Plant Cell Reports 18, 959-966.

Zhang, L., Rybczynski, J.J., Langenberg, W.G., Mitra, A., French, R., 2000. An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration. Plant Cell Reports 19, 241-250.

Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C., Peschke V., Gilbertson L., 2003a. Cre/lox-mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants. Theoretical and Applied Genetics 107, 1157–1168.

121

Zhao, Y., Qian, Q., Wang, H., Huang, D., 2007. Heredity Behavior of bar Gene Cassette is Complex in Rice Mediated by Particle Bombardment. J of Gen and Genom 34, 824-835.

Zhao, Z.-Y., Glassman, K., Sewalt, V., Wang, N., Miller, M., Chang, S., Thompson, T., Catron, S., Wu, E., Bidney, D., Kedebe, Y., Jung, R., 2003. Nutritionally improved transgenic sorghum. In: Vasil, I.K. (Ed.), Plant Biotechnology 2002 and Beyond. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 413–416.

Zhu, C., Naqvi, S., Gomez-Galera, S., Pelacho, A.M., Capell, T., Christou, P., 2007. Transgenic strategies for the nutritional enhancement of Plant. TRENDS in Plant Science Vol.12 No.12.

Zuber, M.S., Darrah, L.L., 1987. Breeding, genetics and seed corn production. In: Watson, S.A., Ramstad, P.E. (Eds.), Corn: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp 31–51.

122

8. FÜGGELÉK

I. táblázat İszi búza éretlen embriók szövettenyésztésében alkalmazott táptalajok Táptalaj Táptalaj összetétel BEG 2 MS makro- és mikroelemek (Murashige és Skoog, 1962). 770 µg/l glicin, 130 µg/l

nikotinsav, 25 µg/l tiamin·HCl, 25 µg/l piridoxin·HCl, 25 µg/l kalciumpantotenát, 100 mg/l mio-inositol, 200 mg/l kazaminsav, 200 mg/l L-aszparagin, 146 mg/l L-glutamin, 30 g/l szacharóz, 9 µM 2,4-D, 8 g/l agar, pH 5,8

MS9 MS makroelemek, MS mikroelemek, MS vitaminok (Murashige & Skoog, 1962), 2,0 mg/l glicin, 20 g/l szacharóz, 2,7 µM IAA, 4,4 µM BAP, 8 g/l agar, pH 5,8

MS9N MS9 táptalaj IAA nélkül, helyette 2,7 µM NAA MS92 MS9 táptalaj fele mennyiségő MS makro sóval MS92N MS9N táptalaj fele mennyiségő MS makro sóval

II. táblázat A transzformációban alkalmazott táptalajok összetétele (Sparks és Jones, 2004; Tamás és mtsai., 2004)

Táptalaj Táptalaj összetétel MD0,5 MS makroelemek (Murashige and Skoog, 1962), L mikroelemek (Lazzeri és

mtsai., 1991), MS Fe-Na-EDTA, MS(-Gly) vitaminok (Murashige and Skoog, 1962), 3AA aminosavak (Sparks and Jones, 2004), 100 mg/l mio-inozitol, 90 g/l szacharóz, 10 mg/l AgNO3, 0,5 mg/l 2,4-D, 8 g/l agar, pH 5,8

MD1 Mint MD0,5 de 1 mg/l 2,4-D tartalmú MD2 Mint MD0,5 de 2 mg/l 2,4-D tartalmú R0 L7 makroelemek (Barro és mtsai., 1999), L mikroelemek, MS Fe-Na-EDTA, L

vitaminok (Sparks és Jones, 2004), 200 mg/l mio-inozitol, 30 g/l maltóz, 8 g/l agar, pH 5,8

RZ+1/2Cu R0 táptalaj és 0,1 mg/l 2,4-D, 5 mg/l zeatin, 0,05 mM CuSO4 RZ R0 táptalaj és 5 mg/l zeatin RZPPT4 RZ táptalaj és 4 mg/l PPT RPPT4 R0 táptalaj és 4 mg/l PPT

123

III. táblázat Transzgénikus Cadenza búzavonalak T2 szemtermésébıl nyert lisztek esszenciális aminosav összetétele aminosav tartalom, %

aminosav Cadenza (donor)

Cadenza (null

transzgénikus) #28 #58 #59 #80 #83

His 2,26 2,20 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,27 (0,5)

Ile 3,38 3,33 3,46 (2,4) 3,45 (2,1) 3,46 (2,4) 3,46 (2,4) 3,44 (1,9)

Leu 6,53 6,45 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,57 (0,6)

Lys 2,19 2,18 2,33 (6,4) 2,32 (6,0) 2,32 (6,0) 2,32 (6,0) 2,30 (5,0)

Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0)

Phe 5,03 4,98 5,08 (1,0) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8)

Thr 2,53 2,51 2,61 (3,1) 2,59 (2,4) 2,60 (2,8) 2,60 (2,8) 2,58 (2,1)

Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,70 (3,5)

Val 4,28 4,26 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,33 (1,2) Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búza növény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.

124

I. ábra A valorigram és a belıle leolvasható paraméterek

M A G L P

ATCAGATTAACATAATTTCACAATAAAAAAAAAAAAAAGAGCTTAAATGGCGGGATTACC 60 V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N AGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAA 120 I Q Q Y G L L Q F S A D K I L D P L A Q TATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTJAGATCCATTAGCTCA 180 F E V E P S K T Y D G L V H I K S R Y T ATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACAC 240 N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E TAACAAATATTTGGTTAGGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGA 300 P D E N K S N W A C T L F K F L Y V E E ACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGA 360 G N M K K V R L L H V Q L G H Y T E N Y AGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACAGAAAATTA 420 T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G TACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGG 480 S K D V F H V I D W K S I F Q F P K T Y CTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAACATA 540 V T F K G N N G K Y L G V I T I N Q L P TGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCC 600 C L Q F G Y D N L N D P K V A H Q M F V ATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATCAAATGTTTGT 660 T S N G T I C I K S N Y M N K F W R L S CACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCAATTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTC 720 T D N W I L V D G N D P R E T N E A A A TACGGATAATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCTGC 760 L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T GTTGTTTAGGTCGGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAAC 840 U F I K R F T S G K P E F I N C M N A A TTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGAGTTTATAAATTGTATGAATGCAGC 900 T Q I V D E T A I L E I I E L G S StpStp TACTCAAATTGTTGATGAAACTGCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAACTA 960 ATATATTGGATTGCTTTTAAGATTCAAATTAAAGTCTAGTTGTTAATGTAAGGAATAAAA 1020 CGTTGTAAGTCGTCTCTTTGGAAACAAGAGGGTTCTTCCTTGTATCATATCTCTATGGTC 1080 TCTTTCAGATTTTGACCATAAGATTACTATTAAATACTTGTAATGTGTTTGTCTGTGATG 1140 ATTACTCTTTGTTGGAATAAAATAATTGTTAGAATTATATTAC 1183

II. ábra Az AmA1 fehérje aminosav szekvenciája. A lizin (K) és a cisztein (C) aminosavakat

vastagított, valamint vastagított és aláhúzott betőkkel jelöltük.