13. skrining antimikroba
TRANSCRIPT
LOGO
PENCARIAN ZAT
ANTIMIKROBA BARU
SUMBER ZAT ANTIMIKROBA
1. Mikroorganisme yang diisolasi dari tanah, air atau udara, contoh : Streptomyces yang memproduksi streptomisin dan tetrasiklin.
2. Bakteriofaga
3. Metabolit sekunder dari tumbuhan atau hewan yang berkhasiat sebagai zat antimikroba
4. Semisintesis : molekul prekursor diproduksi melalui fermentasi mikroorganisme, lalu dimodifikasi secara kimia, contoh : penisilin dan sefalosporin
5. Sintesis, contoh : kloramfenikol
INFORMASI SUMBER ZAT
ANTIMIKROBA
Penggunaan secara empiris oleh
masyarakat
Buku/pustaka pengobatan tradisional
Media massa : cetak dan elektronik
Penelitian lanjutan yang disarankan
TAHAP PENCARIAN ZAT ANTIMIKROBA
BARU
SELEKSI ANTIMIKROBA
PEMISAHAN ANTIMIKROBA
PEMURNIAN ANTIMIKROBA
Seleksi Zat Antimikroba dari Tanah/Air/Udara
SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
suspensi tanah
+ NaCl fis
dekantasi
supernatan
encerkan
Supernatan
encer
inokulasi
Media agar
inkubasi
4x24 jam
Koloni bakteri
dicungkil
Uji aktivitas
antibakteri
Media+bakteri
uji
inkubasi
Zona hambat
isolasi
inokulasi
Media cair
inkubasi
Suspensi
bakteri
(Biakan murni)
Kultur Non
Patogen
SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
Sampel tanah disuspensikan dalam NaCl fis steril didekantasi ambil supernatannya.
Supernatan diencerkan diinokulasi pada medium padat inkubasi 4 x 24 jam pada suhu ttt spy memproduksi zat antimikroba tumbuh berbagai koloni
Dengan alat perforator, koloni & medium sekitarnya dicungkil dipindahkan ke medium + mikroba uji inkubasi amati koloni2 mana yang menghasilkan zone inhibisi tanam sebagai biakan murni
SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
Suspensi bakteri
(Biakan murni)Fermentasi
dlm media
cair
inokulasi
Ambil
sampel pd
interval
waktu ttt,
lalu
disentrifuga
si
supernatan
Saring dgn
bakteri filter
Uji aktivitas
Media uji
inkubasi
Zona hambat
terbesar
selama waktu
fermentasi
tertentu
positif
PEMISAHAN ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
Biakan murni difermentasi dalam medium cair
(fermentasi) tiap interval waktu ttt disampling
Sampel-sampel disentrifugasi, lalu
supernatannya disaring dengan filter bakteri
Tiap supernatan diuji aktivitas antimikrobanya
untuk menentukan supernatan mana yang
menghasilkan zona hambat terbesar waktu
panen zat antimikroba
PEMISAHAN ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
Suspensi bakteri
(Biakan murni)Fermentasi
dlm media
cair sampai
waktu
panen
inokulasi disentrifugasi
supernatan
Saring dgn
bakteri filter
Uji aktivitas
Media uji
inkubasi
Zona hambat
terbesar
ekstraksi
ekstrakEkstrak pekat evaporasi
SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH
Biakan murni difermentasi dalam volume medium cair yang lebih banyak sampai titik maks fermentasi disentrifugasi
Supernatan diekstraksi dengan berbagai pelarut organik dalam corong pisah
Berbagai ekstrak diuji aktivitas antimikrobanya kembali
Setelah diperoleh pelarut yang cocok, supernatan diekstraksi dengan pelarut tersebut dipekatkan dengan rotary evaporator/freeze drying
Tumbuh-tumbuhan
Dan lain-lain….
SELEKSI ZAT ANTIMIROBA DARI TUMBUHAN
Tumbuhan dideterminasi, bagian tumbuhan diambil dan dibuat simplisia
Simplisia dihaluskan dan diayak sampai derajat kehalusan tertentu diekstraksi dengan pelarut organik
Ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator/freeze drying
Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrakkental untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak.
Ekstrak kental (konsentrasi 50%) diuji aktivitasnya terhadap mikroba tertentu
PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBA
Ekstrak pekat
KLT
K. kolom
fraksi2KLT Fraksi dgn Rf
sama digabung
evaporasi
Fraksi pekat
Uji aktivitas
Fraksi prospektif
KLT preparatifpita
kaca+penampak
bercak -> kerok
pelarut organik
Larutan2 dari
pita
Uji aktivitas,
evaporasi
Kristal
murni
KLT 2 dimensi
KLT prep 2
dimensi
konsentrat Zat murniUji aktivitas
kristalisasi
Uji kemurnian kristal
Penentuan struktur
PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA
Ekstrak kental ditutulkan pada KLT dipisahkan menggunakan berbagai pengembang disemprot penampak noda diperoleh pengembang yang dapat memisahkan berbagai noda pada ekstrak sbg pengelusi pada kromatografi kolom
Ekstrakkental dikromatografi kolom tiap fraksi ditampung KLT kembali fraksi2 dengan Rf sama digabungkan, dipekatkan dan diuji aktivitas antimikrobanya
Fraksi dengan aktivitas antimikroba terbaik di KLT preparatif
Tutup sebagian KLT dengan kaca, lalu bagian yg tampak disemprot dengan penampak noda pita-pita yang tertutup kaca dikerok & dimasukkan dalam vial tambah pelarut organik yang mengendapkan silika gel
Tiap larutan dari masing2 pita diuji aktivitas antimikrobanya yang terbaik dipekatkan
Konsentrat di KLT 2 dimensi untuk mengetahui kemurniannya jika belum murni (terbentuk ekor), dimurnikan dengan KLT preparatif 2 dimensi
PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA
Hasil pemurnian diuji aktivitas antimikrobanya
dipekatkan untuk memperoleh kristal
Kemurnian kristal diuji melalui penentuan TL
(titik lelehnya) jika rentang TL lebar, dilakukan
rekristalisasi
Kristal antimikroba di KLT bersama dengan zat-
zat antimiroba pembanding dilihat kesamaan
Rf nya
Jika tidak ada yang sama, dilakukan elusidasi
struktur
PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA
UJI AKTIVITAS ANTIMIROBA
Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri dan metode difusi agar caranya sama dengan penentuan potensi antibiotika, tetapi hanya 1 dosis, umumnya 50%.
Perbedaannya :
uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahan
Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama
UJI BANDING ANTIMIROBA
Untuk mendapatkan uji aktivitas mikroba yang bernilai semi kuantitatif, maka dilakukan uji banding fraksi atau kristal murni zat antimikroba terhadap antibiotika pembanding dari jenis berbeda cara yang sama dengan uji potensi antibiotika
Perbedaannya :
uji banding antimikroba bersifatsemi kuantitatif, artinya perhitungan matematis yang dihasilkan harus duji kebenarannya kembali secara mikrobiologi
Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentasi kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama
PROSEDUR UJI BANDING AKTIVITAS
Pengenceran konsentrasi zat uji dan antibiotik pembanding
Uji aktivitas
Pengukuran zona hambat
Pembuatan grafik dan persamaan garis (x = logaritma
konsentrasi (ppm); y = diameter hambat zat pembanding (mm))
Nilai banding aktivitas
CONTOH PERHITUNGAN
TETRASIKLIN
Y = 7,4561x – 2,1559
Pada x = 10 ppm, maka y = 5,3 mm
ZAT UJI
Y = 4,8588x – 12,99
Pada y = 5,3 mm, maka x = 3,764
Konsentrasi zat uji = antilog 3,764
= 5812 ppm
Untuk mendapatkan diameter hambat yang sama, berapa
konsentrasi zat uji ?
Nilai banding = konsentrasi zat uji
konsentrasi zat pembanding
= 5812 atau 1 : 0,00172
10
Artinya untuk menghasilkan derajat hambat yang sama,
1 ppm zat uji sebanding dengan 0,00172 ppm tetrasiklin
PENENTUAN MIC DAN MBC
MIC dan MBC digunakan untuk menghitung
dosis minimal/MEC zat antimikroba dalam suatu
sediaan
Penentuan MIC dan MBC sebaiknya dilakukan
terhadap fraksi atau kristal murni, setelah uji
aktivitas antimikroba
Variasi konsentrasi yang digunakan untuk
penentuan MIC dan MBC adalah pengenceran
konsentrasi yang dipakai untuk uji aktivitas
antimikroba.
UJI MIKROBILOGI LAIN PADA
SEDIAAN FARMASI
Uji stabilitas mikrobiologi perhitungan koloni
mikroba.Uji ini dilakukan pada rentang waktu
tertentu utk mengetahui pengaruh waktu
penyimpanan thd stabilitas mikrobiologi sediaan
atau mengetahui efektivitas zat pengawet dalam
sediaan
Uji aktivitas antimikroba dari sediaan aktivitas
antimikroba sediaan dibandingkan aktivitas zat
aktif saja utk mengetahui pengaruh formulasi
sediaan thd aktivitas antimikroba zat aktifnya
Penentuan koefisien fenol dilakukan terhadap
sediaan antiseptika atau desinfektan