KEMIJSKO-TEHNOLOŠKI FAKULTET U SPLITU

Zavod za organsku tehnologiju

Skripta za internu upotrebu

VJEŽBE IZ BIOTEHNOLOŠKIH PROCESA

Dr.sc. Branka Andričić, izv.prof.

Split, 2006.

SADRŽAJ Vježba 1. PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces........... 4

Vježba 2. IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA

ALGINATU………………………………………………………… ….

8

Vježba 3. PRIPRAVA SIRA……………………………………………………... 12

Vježba 4. EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ

PLODOVA BILJAKA (kivi, grašak, češnjak)…………………………

15

Vježba 5. SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG

JESTIVOG ULJA………………………………………………………

18

6. METODE ODREðIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH

KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA ……………

6.1. ODREðIVANJE GUSTOĆE……………………………………...

6.2. ODREðIVANJE KISELINSKOG BROJA………………………..

6.3. ODREðIVANJE PEROKSIDNOG BROJA………………………

6.4. ODREðIVANJE KINEMATIČKE VISKOZNOSTI……………..

6.5. ODREðIVANJE PLAMIŠTA……………………………………..

22

22

22

22

23

25

1

I. PRIPREMA ZA VJEŽBE U LABORATORIJU

• Detaljno pročitati tekst vježbe prije ulaska u laboratorij. • Ukoliko imate neka pitanja uvezi vježbe, zapišite ih i pitajte voditelja vježbi.

Jednostavno pitanje može znatno skratiti vrijeme potrebno za izvoñenje vježbi.

• Sve podatke zapisujte u bilježnicu. Ne koristite listove papira ili različite blokove jer se papiri lako zagube.

• Napravite potrebne tablice i eventualno proračune za potrebne kemikalije kako

bi prije započeli vježbe.

• Operite laboratorijsko posuñe na kraju vježbi tako da je spremno za druge vježbe. Mnogi studenti nepotrebno troše vrijeme na pranje i sušenje posuña koje će im služiti samo da prokuhaju vodu. RAZMIŠLJAJTE!

• Mnogi studenti se toliko žure završiti vježbu da zaborave zabilježiti važna

zapažanja kao što su: vrijeme kad se nešto dogodilo, promjenu boje, endotermnu ili egzotermnu promjenu, promjenu agregatnog stanja, vrelište, talište, temperaturu u laboratoriju, itd.

• Pogledajte rezultate! Izgledaju li logično za izvedenu vježbu? Ako sumnjate,

ponovite dio vježbe. Najbolje se uči na vlastitim greškama. Ako i tada niste sigurni, pitajte voditelja vježbi ili laboranta.

• Kad voditelj vježbi razgovara s drugim studentima, slušajte i vi, možda ćete čuti nešto što vam može pomoći.

• Važno je znati što se smije, a što ne smije, iz sigurnosnih razloga, raditi u

laboratoriju; ne samo zbog vaše osobne sigurnosti, već i zbog sigurnosti vaših kolega.

2

II. SAVJETI I MJERE OPREZA PRI RADU U LABORATORIJU

• Koristiti zaštitne naočale.

• Obavezno je nositi zaštitnu odjeću (bijeli mantil) radi zaštite ostale odjeće od kemikalija.

• Dugu kosu treba zavezati kako ne bi došla u dodir s kemikalijama ili

plamenom.

• U laboratoriju je zabranjeno jesti, piti i pušiti.

• Nikad ne raditi u laboratoriju bez nadzora ili znanja laboranta ili voditelja vježbi.

• Doñite u laboratorij pripremljeni. Ako ne znate što treba raditi, pitajte

voditelja vježbi ili laboranta.

• Otvoreni plamen može se upaliti samo kad nema zapaljivih otapala u blizini (što u laboratoriju organske tehnologije znači skoro nikada).

• Treba biti vrlo pažljiv pri rukovanju zapaljivim otapalima poput etera, acetona

ili metanola. Nikad ne isparavati ova otapala iznad kuhala i sl. Koristiti zatvoreni sustav za isparavanje.

• Nikad ne pipetirajte ustima. Postoji propipeta. Izbjegavajte udisanje

kemikalija i ne mirišite kemikalije.

• Zapamtite, VRUĆE posuñe izgleda kao i HLADNO . Pazite što uzimate u ruke.

• Uvijek označite reagense u tikvicama, čašama i sl. Većina organskih

kapljevina, vodene otopine kiselina i lužina prozirne su i bezbojne poput vode.

• Organske kapljevine najbolje je mjeriti volumenom. Pomoću laboratorijskih priručnika s podatcima o gustoći lako im je odrediti masu.

• Neke sintetičke tkanine mogu se oštetiti djelovanjem npr. acetona ili etil-

acetata. Čak i razrijeñena sumporna kiselina ošteti pamučne tkanine. Nemojte nositi svoju najbolju odjeću dok radite vježbe.

• U hladilu hladna voda ulazi na dnu, a izlazi na vrhu. Ne pretjerujte s

otvaranjem vode. Uvijek provjerite teče li voda prije nego uključite grijanje.

• Pri destilaciji nikad ne isparavajte do suha. Ostatak može postati nestabilan i eksplodirati (pogotovo ako ste radili s eterom ili alkoholom koji stvaraju organske perokside).

3

• Kad provodite ekstrakciju sačuvajte oba sloja dok niste potpuno sigurni koji treba ostaviti, a koji odbaciti.

• Nikad ne ostavljajte reakciju ili proces bez nadzora. Ukoliko morate izići,

zamolite kolegu da pripazi.

• Mnoge organske kemikalije ne miješaju se s vodom. Ne izlijevajte organske kemikalije u sudoper i druge odvode. Za to postoje posebne boce na kojima piše OTPAD.

4

Vježba 1. PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces cerevisiae Svrha vježbe: Prepoznavanje faza u razvoju kvasca. Praćenje kinetike rasta

stanica kvasca. Odreñivanje optimalne količine supstrata.

UVOD

Kvasci soja Saccharomyces (pekarski i pivski kvasac) su jednostanični organizmi

(gljivice) koji anaerobnom fermentacijom, tj. metabolizmom uz nedostatak kisika,

vrše enzimsku konverziju glukoze u alkohol i ugljični dioksid. Za njihov rast i

razmnožavanje neophodan je supstrat bogat glukozom, vlagom i aminokiselinama. U

prirodi se uobičajeno nalaze na različitom lišću i plodovima biljaka. Veće količine

kvasaca, za industrijsku primjenu, prireñuju se kultiviranjem na odgovarajućim

hranljivim podlogama. Kvasci se razmnožavaju pupanjem ili dijeljenjem stanica. Rast

kvasaca na nekom supstratu odvija se u nekoliko faza, slika 1.1.

Slika 1.1. Faze u razvoju kvasaca: 1. faza prilagodbe, 2. eksponencijalna faza,

3. post-log faza, 4. stacionarna faza, 5. faza ugibanja.

U eksponencijalnoj fazi, u svakom trenutku od jedne nastaju dvije stanice kvasca, tj.

ako se počne s jednom stanicom, u sljedećem trenutku bit će 2, zatim 4, pa 8 itd., što

znači da broj stanica (X) raste eksponencijalno s vremenom (t).

1

2

3 4

Bro

j sta

nica

kva

sca

Vrijeme, t

5

5

Matematički, to se može opisati:

dX/dt ∝ X (1)

Povećanjem broja stanica povećava i njihov ukupan volumen te se tada broj stanica,

X, može supstituirati volumenom stanica, V. Ako se znak proporcionalnosti iz prve

jednadžbe zamijeni konstantom (µ) dobije se :

dV/dt = µV (2)

gdje µµµµ označava specifičnu brzinu rasta i predstavlja brzinu kojom se pojedinačne

stanice dijele.

Pretpostavi li se da je µ konstantna te se integrira izraz (2) u vremenu izmeñu t0 i t1

kada je volumen stanica V0 i V1 dobije se :

∫∫ =1

0

1

0

1t

t

V

V

dtdVV

µ (3)

odnosno:

ln V1 - ln V0 = µ (t1 – t0) (4)

Crtanjem ovisnosti ln V nasuprot vremenu t u eksponencijalnoj fazi rasta kvasca

dobije se pravac čiji nagib, prema jednadžbi (4), odgovara specifičnoj brzini rasta µ,

slika 1.2.

Slika 1.2. Grafičko odreñivanje specifične brzine rasta

ln V

Vrijeme, t

t1, lnV1

t2, lnV2

µ=nagib= [(lnV2-lnV1)/(t2-t1)]

6

Ako se specifična brzina rasta odreñuje za različite koncentracije supstrata, [S], dobije

se u većini slučajeva Langmuirov tip grafa, slika 1.3. (Postoje i slučajevi kada zbog

inhibicije rasta supstratom doñe do opadanja specifične brzine rasta s porastom

koncentracije supstrata.) Koncentracija supstrata pri kojoj je specifična brzina rasta

jednaka polovici svoje maksimalne vrijednosti naziva se konstanta zasićenja, Ks.

Slika 1.3. Ovisnosti specifične brzine rasta stanica o koncentraciji supstrata

Matematički izraz za ovisnost specifične brzine rasta stanica o koncentraciji supstrata

izveo je Jacques Monod i glasi:

µ = µmaxS / (Ks+ S) (5) Rast stanica pekarskog kvasca lako je pratiti. Ukupna promjena volumena je rezultat

povećanje broja stanica kvasca, ali i nastajanja ugljičnog dioksida. Ipak, praćenjem

rasta kvasaca na prethodno opisani način moguće je dobiti uvid u faze razvoja kvasca

te odrediti specifičnu brzinu rasta

EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni pribor i materijal:

- odmjerne tikvice - pekarski kvasac, suhi ili svježi

- menzure - šećer (glukoza ili saharoza)

- zaporna ura - brašno

µmax

µmax/2

Ks [S]

7

Postupak

U odmjernim tikvicama od 100 cm3 napraviti 2, 4, 5, 6, 8 i 10 %-tne otopine šećera

(saharoze ili glukoze) u vodi (w/v). U menzuru od 100 ml uliti 20 cm3 otopine šećera,

dodati 3,6 g svježeg kvasca te pažljivo promiješati. Može se dodati i 2g brašna jer je

tada promjene lakše pratiti. Zabilježiti početni volumen i temperaturu u prostoriji.

Svake 2 minute očitavati volumen. Mjerenje je završeno kada volumen počne opadati.

Isti postupak ponoviti za preostale koncentracije supstrata.

Prvi korak u obradi podataka je za svaku koncentraciju posebno nacrtati krivulju

rasta kvasca, tj. ovisnost V nasuprot vremenu t, gdje je V = Vt - V0. Procijeni se

eksponencijalna faza rasta te se za tu fazu nacrta ovisnost lnV nasuprot t (najmanje 5

točaka). Nagib najvjerojatnijeg pravca koji prolazi kroz dobivene točke predstavlja

specifičnu brzinu rasta, µ (mi), za zadanu koncentraciju šećera. Kada se na prethodno

opisani način odrede specifične brzine rasta za sve koncentracije supstrata [S], nacrta

se ovisnost µ nasuprot [S]. Iz tako dobivenog grafa odredi se maksimalna brzina rasta

i Ks.

Zadatak

1. Nacrtati krivulju rasta kvasca u otopinama šećera mjerenjem promjene

volumena s vremenom.

2. Iz eksponencijalne faze rasta, crtanjem ovisnosti log V vs. t, odrediti

specifičnu brzinu rasta µ za svaku koncentraciju supstrata.

3. Iz ovisnosti specifične brzine rasta o koncentraciji supstrata odrediti

maksimalnu brzinu rasta te konstantu zasićenja.

4. Grafove crtati u Excel-u.

LITERATURA

1. W. Marison u: Biotechnology for Engineers; Biological Systems in Technological Processes, Ed. A.H. Scragg, Ellis Horwood Ltd. Chichester, 1988, str. 184-194

2. http://www.np.edu.sg/~dept-bio/biochemical_engineering/fermentation_tutorial

3. www.le.ac.uk/by/teach/biochem

8

Vježba br. 2.

IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA ALGINATU

Svrha vježbe: Imobilizacija stanica kvasca. Usporedba efikasnosti imobiliziranih

i neimobiliziranih stanica.

Uvod

Imobilizacija enzima definira se kao fizikalno ili kemijsko vezivanje ili

lokalizacija enzima na odreñenom nosaču uz zadržavanje katalitičkih svojstava

enzima i mogućnosti ponovne i kontinuirane uporabe. U nekim slučajevima nije

potrebno pročišćavanje enzima. Meñutim, ponekad je povoljnija imobilizacija stanica

jer stanice predstavljaju multienzimski sustav. Primjena imobiliziranih biokatalizatora

(enzima ili pak čitavih stanica) u biotehnološkim procesima provodi se u svrhu:

1. dobivanja spojeva stereospecifičnim reakcijama

2. proizvodnje energije biološkim reakcijama

3. selektivnog djelovanja na onečišćenja u svrhu rješavanja problema u okolišu

4. analize različitih spojeva s visokom osjetljivošću i specifičnošću

5. proizvodnje novih lijekova, umjetnih organa itd.

Enzimi se mogu imobilizirati na više načina, a stanice se imobiliziraju na četiri

osnovna načina i to: 1. adsorpcijom na nosač 2. zarobljavanjem u polimernoj matrici,

3. umetanjem (kapsuliranjem), 4. kombinacijom navedenih metoda.

Kao polimerna matrica često se koriste različiti polisaharidi: alginati, karagenani,

agar, agaroza…

Alginska kiselina je polisaharid koji se dobiva ekstrakcijom iz morskih algi u obliku

svojih soli - alginata, a kao rezultat postojanja više slobodnih karboksilnih skupina u

makromolekulama alginske kiseline (slika 2.1). Soli jednovalentnih metala (npr. Na)

su topljive u vodi. Takve soli služe u prehrambenoj industriji za podešavanje

viskoznosti različitih proizvoda.

Zamjenom Na+ iona s dvovalentnim ionima poput Ca2+ dolazi do stvaranja

koordinativnih kompleksa koji su netopljivi u vodi . Upravo ovo svojstvo alginata

rabi se za imobilizaciju enzima ili stanica. Kvasci imaju široku primjenu u industriji,

pa njihova imobilizacija čini procese u kojima su neophodni ekonomičnijim.

9

Slika 2.1. Kemijska struktura ponavljajuće jedinice u makromolekuli alginata

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor: Materijal:

- Erlenmayerove tikvice od 250 cm3 - Na - alginat (E 401)

- magnetska miješalica - pekarski kvasac

- bireta - 0,1 M otopina CaCl2

- čaše

- vrenjače

- supstrat za fermentaciju, pH=4,5:

1. glukoza 80 g/dm3

2. (NH4)2SO4 4 g/dm3

3. MgSO4 x 7H2O 1g/dm3

4. KH2PO4 2g/dm3

- metilensko crvenilo (indikator)

Postupak

1. Imobilizacija stanica kvasca

U izvaganu čašu uliti 100 cm3 destilirane vode, zagrijane na 60°C i otopiti 1,5 g Na-

alginata uz stalno miješanje. Kad se alginat sasvim otopi, ohladiti na 30-40°C i dodati

3,75 g suhog pekarskog kvasca i miješati dok se kvasac ne suspendira u otopini

alginata. Izvagati čašu sa suspenzijom. Suspenziju kvasca uliti u izvagani lijevak za

dokapavanje i s visine od oko 15 cm dokapavati u čašu s 200 cm3 0,1 M otopine

CaCl2 uz lagano miješanje pomoću magnetske miješalice, slika 2.2. Dokapavanjem u

otopinu kalcijeva klorida nastaju kuglice koje sadrže stanice kvasca «zarobljene« u

alginatnom gelu. (Potrebno je izvagati čašu i lijevak za dokapavanje nakon što je iz

10

njih ispražnjen sadržaj da se utvrdi masa udio suspenzije koji je ostao na stijenkama.

Izračunati koliko je stvarno kvasca zarobljeno u alginatnom gelu). Nakon 15 minuta

kapljevinu dekantirati i kuglice isprati svježom otopinom CaCl2 da se kompletira

proces nastajanja kompleksa, a zatim isprati 4 puta s destiliranom vodom da se ukloni

višak Ca2+. Kuglice prenijeti na filter papir da se osuše. Nastale kuglice očvrsnu u

vremenu 1…2 sata.

Slika 2.2. Imobilizacija kvasca u alginatnom gelu

2. Fermentacija glukoze

U dvije Erlenmeyerove tikvice uliti po 100 cm3 supstrata za fermentaciju. U jednu

tikvicu staviti kuglice imobiliziranih stanica kvasca, a u drugu masu kvasca jednaku

prethodno izračunatoj masi kvasca zarobljenog u alginatnom gelu. Obje tikvice sa

sadržajem izvagati i zabilježiti masu (m0). Na otvor svake tikvice staviti vrenjaču.

Vrenjača je konstruirana tako da omogućava izlaz CO2, a sprječava ulaz O2. U

vrenjaču se do oznake ulije voda i stavi par kapi indikatora metilenskog crvenila,

kojem se mijenja boja zbog nastajanja CO2, slika 2.3. Promjenu mase bilježiti svakih

pola sata (mt) za vrijeme trajanja vježbe, a zatim još nakon 24 i 48 sati. Razlika u masi

jednaka je masi nastalog CO2, a količina etanola nastalog fermentacijom ekvivalentna

je količini nastalog CO2, prema reakciji:

C6H12O6 (glukoza) → 2 C2H5OH (etanol) + 2 CO2

11

Iskorištenje se računa na sljedeći način:

Masa glukoze = 8 g ( 100 cm3 otopine koja sadrži 80 g/dm3 glukoze)

Stehiometrijska masa etanola: (ms) = (8/Mgl) x 2 mola x MEtOH

= (8 /180) x 2 x 48 = 4,09 g

Eksperimentalno dobivena masa etanola: me =[(m1 - m0) / MCO2] x MEtOH

Iskorištenje: η = (me / ms) x 100

Slika 2.3. Fermentacija s imobiliziranim kvascem

Zadatak

1. Imobilizirati stanice kvasca pomoću alginata. Odrediti ukupnu masu i približan

broj dobivenih kuglica.

2. Dobivene imobilizirane stanice upotrijebiti za fermentaciju glukoze.

3. Usporediti prinos na etanolu uporabom imobiliziranih i neimobiliziranih stanica

kvasca.

4. Navesti neke prednosti i nedostatke koje ste uočili pri radu s imobiliziranim

odnosno neimobiliziranim stanicama kvasca.

LITERATURA

1. A. H. Scragg, Biotechnology for Engineers; Biological Systems in

Technological Processes, Ellis Horwood Ltd. Chichester, 1988, str. 235-252

2. D. L. Vullo, M. B. Wachsman, J. Food Sci. Edu. 4 (2005) 53-55

12

Vježba 3. PRIPRAVA SIRA Svrha vježbe: Razumijevanje procesa koagulacije kazeina i njegova praktična

primjena

Uvod

Mlijeko se sastoji od 66-89 % vode i 11-14 % suhe tvari. Suha tvar sadrži 4,6-4,9%

laktoze, 2,6-4,2% proteina (kazeini i albumini), a ostatak čine masti, mineralne tvari,

vitamini i elementi u tragovima.

U prisustvu bakterija mliječno-kiselog vrenja (Streptoccocus, Lactoccocus,

Lactobacillus) odvija se proces kiselo-mliječne fermentacije kojim se mliječni šećer,

laktoza, transformira u mliječnu kiselinu. Taj proces može se prikazati:

C12H22O11 β-galaktozidaza glukoza + galaktoza

laktoza

C6H12O6 glikoliza CH3-CO-COOH laktat-dehidrogenaza CH3-CHOH-COOH

glukoza pirogrožñana kis. mliječna kis.

Kao što se vidi iz gornje sheme, bakterije proizvode mliječnu kiselinu koja snižava

pH mlijeka. Snižavanjem pH mijenja se naboj kazeina u mlijeku te pri pH=4,6

(izoelektrična točka) dolazi do njegove koagulacije, dok albumini zaostaju u

kapljevini koja se naziva sirutka. Zakiseljavanje mlijeka na ovaj način prvi je korak u

proizvodnji jogurta i nekih vrsta sira. Koagulacija se dodatno može pospješiti

zagrijavanjem.

U nekim procesima proizvodnja sira, odnosno koagulacija kazeina provodi se

dodatkom proteolitičkih enzima npr. kimozina (sirište, sirilo, renin). Proteolitički

enzimi cijepaju κ-kazein na površini kazeinskih micela i omogućavaju agregaciju

micela i koagulaciju kazeina. Koagulirajući enzimi su biljnog ili životinjskog

porijekla ili pak iz različitih mikroorganizama. Tradicionalni način dobivanja enzima

je iz želuca mlade teladi i janjadi koja se hrane mlijekom. Danas se uglavnom koristi

rekombinantni kimozin.

13

Enzimima katalizirana koagulacija odvija se u dvije osnovne faze:

1. Cijepanje κ-kazeina i promjena strukture micela kazeina-zgrušavanje. Za ovu fazu

neophodno je prisustvo iona kalcija.

2. Kontrakcija (sinereza) ugrušaka i istiskivanje vode iz zgrušane faze. Proces se

ubrzava zagrijavanjem.

Nastali sir se soli, formira u različite oblike, a zatim ostavlja da zrije, bez ili uz

dodatak plemenitih plijesni.

EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni pribor i materijal

- vodena kupelj - neobrano, pasterizirano mlijeko

- čaše različitog volumena - kiselo mlijeko

- pipete - sirište

- drveni štapići

- kapaljka

- epruvete

- pH papir

- tkanina za cijeñenje

Postupak

Napuniti vodenu kupelj vodom u visini 2-3 cm i zagrijati na temperaturu 37-42°C.

Pomiješati obično i kiselo mlijeko u omjeru 3:1 i ostaviti da poprimi sobnu

temperaturu. Kiselo mlijeko dodaje se da snizi pH mlijeka i radi boljeg okusa sira.

-U čašu od 100 cm3 uliti 40 cm3 smjese kiselog i običnog mlijeka te staviti u vodenu

kupelj 1 minutu.

-Dodati 4 kapi sirišta, sadržaj čaše promiješati okretanjem čaše u krug oko 5 sekundi.

-Vratiti čašu u kupelj, ostaviti 1 minutu, bez miješanja.

-Pomaknuti čašu i provjeriti dolazi li do koagulacije. Vratiti čašu u kupelj na još 1

minutu.

-Drvenim štapićem promiješati sadržaj i ostaviti u kupelj još 30…60 sekundi.

-Procijediti sadržaj čaše preko tkanine, skupiti vrhove i iscijediti tekućinu.

14

Zadatak

1. Provesti proces priprave sira prema opisanom postupku pri oko 40°C.

2. Postupak ponoviti pri sobnoj temperaturi.

3. Isti postupak kao pod 1 ponoviti uz deseterostruko razrjeñenje enzima.

4. Osnovni postupak provesti samo s običnim mlijekom (bez kiselog).

5. Zabilježiti opažanja

Literatura

1. Lj. Tratnik, Mlijeko-tehnologija, biokemija i mikrobiologija, Hrvatska

mljekarska udruga, Zagreb, 1998.

2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/cheese/

15

Vježba 4.

EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ PLODOV A

BILJAKA (kivi, grašak, češnjak)

Svrha vježbe: Primjena različitih fizikalno-kemijskih procesa i operacija pri

obradi intracelularnog produkta (down-stream processing)

Uvod

Deoksiribonukleinska kiselina (DNK) je genetski materijal prisutan u svim

organizmima, od bakterija do čovjeka. Osnovne grañevne jedinice DNK nazivaju se

nukleotidi, a sastoje se od dušične baze, šećera i fosfatne grupe. Stotine tisuća

nukleotida tvore lance, a dva takva lanca povezana vodikovim vezama preko dušičnih

baza u dvostruku uzvojnicu (heliks) tvore DNK. U organizmima čije stanice imaju

jezgru DNK se povezana s proteinima nalazi u kromosomima. Ljudski genom (ukupni

set gena u jednoj stanici) sadrži 3⋅109 osnovnih nukleotidnih parova. Kad bi se uzela

sva DNK iz stanice i razvukla, bila bi duga 2 m, a sama se nalazi u jezgri stanice

promjera 0,005 mm.

Kako bi se ekstrahirala DNK iz stanica, voće ili povrće se usitnjava i zagrijava čime

se najprije mehanički, a zatim toplinski cijepaju stanične stjenke. Da bi se otopili

lipidi u staničnim membranama i ovojnicama jezgri dodaju se površinski aktivne tvari

(detergenti). Slobodna DNK topljiva je u vodi jer fosfatne grupe svakog nukleotida

imaju negativan naboj. Pozitivno nabijeni ion natrija iz kuhinjske soli neutraliziraju

taj negativni naboj. Neutralizacija omogućava agregaciju molekula DNK, a da bi se

oslobodila pratećih proteina mogu se koristiti različiti proteoilitički enzimi, npr.

subtilisin A (sadržan u tabletama za deproteinizaciju kontaktnih leća), papain (iz

papaje) ili bromelain (iz ananasa). Dodatkom etanola u otopinu DNK precipitira na

meñupovršini etanol/voda jer nije topljiva u etanolu.

Kako dokazati DNK?

Svaki tip molekule, zahvaljujući jedinstvenoj strukturi, posjeduje karakterističan

apsorpcijski elektromagnetski spektar. Apsorpcijski spektar odreñuje se različitim

spektrofotometrima (UV/VIS, IR) pri čemu se bilježi stupanj apsorpcije

(apsorbancija) pri svakoj valnoj duljini. DNK ima maksimalnu apsorbanciju pri valnoj

16

duljini od ~260 nm, a tipični proteini pri ~280 nm. Ova razlika u apsorbanciji, točnije

njihov omjer, može poslužiti kao mjera uspješnosti ekstrakcije DNK.

Ako je A260 nm / A280 nm = 1,8…1,9 - uzorak je praktično čista DNK.

Ako je A260 nm / A280 nm = 1,9…2,0 - uzorak je praktično čista RNK.

Ako su vrijednosti gornjeg omjera manje od 1,8 znači da je zaostalo dosta proteina

koji apsorbiraju UV zračenje pri 280 nm.

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor i materijal

-sjeckalica za povrće - kivi ili grašak

-čaša od 500 cm3 ili tikvica od 250 cm3 - etanol

-graduirane čaše od 100 i 200 cm3 - led

-menzura - kuhinjska sol

-lijevak - detergent

-termometar - proteolitički enzimi

-filter papir

Postupak

A. Ekstrakcija DNK

1. Pripremiti ledenu vodenu kupelj visine 5…8 cm. U čašu uliti 50 cm3

etanola i staviti u ledenu kupelj.

2. Pripremiti otopinu za ekstrakciju: u čaši ili u tikvici otopiti 2 g kuhinjske

soli u 90 cm3 destilirane vode. Dodati 10 cm3 detergenta i lagano

promiješati da se ne zapjeni.

3. Kivi ili grašak usitniti u sjeckalici. Od ove mase uzeti 30 g i prenijeti u

čašu od 200 cm3.

4. Usitnjeni materijal preliti s otopinom za ekstrakciju tako da je ukupni

volumen dvostruko veći od volumena usitnjenog materijala.

5. Pripremiti vodenu kupelj temperature 50… 60°C.

6. Staviti čašu u kupelj. Uz miješanje zagrijavati 10-15 min.

7. Nakon perioda inkubacije prenijeti čašu sa sadržajem u ledenu kupelj. Uz

miješanje hladiti 5 minuta.

17

8. Filtrirati sadržaj čaše preko filter papira i filtrat hvatati u tikvicu.

9. Sadržaj u tikvici promiješati. 5 cm3 filtrata prenijeti u 2 epruvete. U jednu

epruvetu dodati proteolitičke enzime i povremeno miješati u vremenu od

30 minuta. U drugu ne dodavati proteolitičke enzime.

B. Precipitacija DNK

1. Sadržaju u epruveti dodati 10 cm3 što hladnijeg etanola i to pipetom na

dno epruvete, staviti u držač za epruvete i pratiti što se dogaña.

2. Ostaviti oko 2-3 minute da se DNK istaloži što se primjećuje po stvaranju

bijelog pahuljastog taloga. Radi boljeg taloženja ostaviti preko noći u

hladnjaku.

3. Pomoću kapaljke, staklene kuke ili štapića «pokupiti» DNK i prenijeti na

satno staklo.

Analiza produkta

1. Mikroskopija: malo precipitirane DNK staviti na staklo za mikroskop, dodati

kap metilenskog plavila i mikroskopirati.

2. UV spektroskopija: otopiti DNK u 5 cm3 destilirane vode. Po potrebi

profiltrirati i razrijediti destiliranom vodom. Slijepa proba je destilirana voda.

Odrediti apsorbanciju pri 260 i 280 nm standardnim postupkom.

Zadatak

1. Izvršiti ekstrakciju DNK iz dostupnog izvora.

2. Analizirati ekstrahirani produkt mikroskopskom i UV/VIS spektroskopijom te

objasniti dobivene rezultate.

Literatura

1. www.exploratorium.edu

2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/dna/

3. www.biotech.iastate.edu

18

Vježba 5.

SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG

JESTIVOG ULJA

Svrha vježbe: Dobivanje goriva iz otpadnog biljnog ulja Biodizel je naziv za gorivo koje se proizvodi alkoholizom ili transesterifikacijom

biljnog ulja ili životinjskih masti, a služi kao zamjena ili dodatak mineralnom dizelu.

Transesterifikacija je naziv za kemijske reakcije u kojima se ester jednog alkohola

prevodi u ester drugog alkohola. Osnovna sirovina za proizvodnju biodizela je ulje

uljane repice, soje ili druge pogodne uljarice. S obzirom na cijenu ovih ulja kao

alternativna sirovina može poslužiti otpadno jestivo ulje. Kvaliteta biodizela izravno

je povezana s kvalitetom sirovine. Zagrijavanjem biljnih ulja, npr. tijekom prženja,

može doći do toplinskih, oksidacijskih ili hidrolitičkih reakcija, što dovodi do

kemijskih promjena ulja. Promjena kemijskog sastava ne ovisi samo o vrsti ulja već i

o hrani koja je pržena te temperaturi i vremenu prženja. Stoga se otpadna ulja moraju

u odreñenoj mjeri rafinirati prije hidrolize. Najjednostavniji postupak je filtracija

zagrijanog ulja, hlañenje te fazna separacija zaostale vode. Sve sirovine moraju biti

bezvodne jer se uz prisustvo vode parcijalno odvija i reakcija saponifikacije

(nastajanje sapuna).

Alkoholiza ili transesterifikacija ulja općenito se odvija prema sljedećoj shemi:

H2C OCOR' ROCOR' H2C OH + HC OCOR'' + 3ROH katalizator ROCOR'' + HC OH + H2C OCOR'' ROCOR''' H2C OH triglicerid alkohol smjesa alkilnih glicerol estera Reakcija teče zadovoljavajućom brzinom pri umjerenim temperaturama i

atmosferskom tlaku. Prikladni alkoholi su metanol, etanol, propanol, butanol i amilni

alkohol. Najčešće se upotrebljava metanol, zbog niske cijene i povoljnih fizikalno-

19

kemijskih karakteristika. Iako je stehiometrijski omjer alkohola i ulja 3:1, zbog

povećanja iskorištenja i ubrzanja kemijske reakcije, radi se s alkoholom u suvišku.

Katalizatori mogu biti kiseli (sulfatna, fosfatna, kloridna kiselina) i bazni (NaOH,

KOH, karbonati, alkoksidi). Najčešće se provodi bazno-katalizirana transesterifikacija

jer je oko 4000 puta brža od kiselo-katalizirane.

Reakcija transesterifikacije efikasno se može katalizirati ekstracelularnim i

intracelularnim lipazama (lipaze iz gljivica Muchor miehei, Candida antartica,

Pseudomonas cepacia) bilo u vodenom ili u nevodenom mediju. Meñutim, lipaze su

znatno skuplje od nekog alkalnog katalizatora.

Prvi standard za biodizel dobiven iz repičinog ulja pojavio se u Austriji 1990 (ON

C1190). Slični standardi danas postoje i u Švedskoj, Francuskoj, Njemačkoj, Italiji,

Češkoj i SAD-u.

Neke značajke biodizela u odnosu na mineralni dizel prikazane su u tablici 5.1.

Tablica 5.1. Usporedba biodizela i dizelskog goriva

Svojstvo Biodizel iz repičinog

ulja

Biodizel iz otpadnog

repičinog ulja

Dizelsko gorivo

Gustoća(g/cm3) 0,882 (15°C) 0,895 0,830…0,840(15°C)

Cetanski broj 51…59,7 53 35,5

Kinematička viskoznost (mm2/s)

4,2 (40°C) 9,48 (30°C) 3,5 (40°C)

Plamište (°C) 170 192 80

Sumpor (%) 0,009 0,002 0,36

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor i kemikalije

- tikvica okruglog dna od 500 cm3

- magnetsko miješalo

- termometar

- lijevak za odjeljivanje, 2 kom

- metanol

- katalizator, KOH

- otpadno jestivo ulje

20

Postupak:

Predobrada sirovine: oko 300 g ulja zagrijavati uz miješanje oko 5 minuta na 110°C

da se ukloni eventualno prisutna voda, ohladiti do 50…60°C te filtrirati.

U tikvicu (slika 5.1) uliti 200 g prethodno obrañenog ulja i zagrijati do 60°C. Dodati

57,8 cm3 (43,4 g) metanola s otopljenim katalizatorom (1 % w/w KOH u odnosu na

masu ulja, tj. 2 g ).

Slika 5.1. Aparatura za provedbu procesa transesterifikacije

biljnog ulja

Reakcijsku smjesu snažno miješati 2 sata na zadanoj temperaturi, a zatim prebaciti u

lijevak za odjeljivanje da bi se odvojio glicerol (najmanje 4 sata ili preko noći).

Nakon ispuštanja glicerola dobiveni metilni ester prebaciti u drugi lijevak za

odjeljivanje i pažljivo isprati sa 50 cm3 destilirane vode kako bi se uklonili nastali

sapuni, višak metanola i katalizator te ostaviti da se slojevi odvoje. Izračunati

iskorištenje prema oleinskoj kiselini budući je ona glavna komponenta ulja:

1 mol triglicerida + 3 mol metanola 3 mola metil-estera (biodizela)

+ 1 mol glicerola

21

Mm triglicerida (oleina) = 885 g/mol, a masa je 200 g, pa je to 200/885 = 0,226 mola.

Molni odnos metanola i ulja je 6:1 (dvostruka stehiometrijska količina), a molekulska

masa metanola je 32 g/mol, pa je to 0,226 x 6= 1,356 mola x 32 = 43,4 g / 0,75 g/cm3

= 57,8 cm3.

Za teorijsko iskorištenje na biodizelu tj. metilnom esteru molekulske mase 296 g/mol

(metilni ester oleinske kiseline) vrijedi: 0,226 x 3 = 0,678 mola, a teorijska masa je

0,678 x 296 = 200,69 g

Stvarno iskorištenje u postotcima:

η = (masa dobivenog biodizela / 200,69) x 100.

Zadatak

1. Odrediti karakteristike otpadnog jestivog ulja: gustoću, kiselinski broj,

peroksidni broj.

2. Provesti sintezu biodizela iz otpadnog jestivog ulja.

3. Odrediti gustoću, kinematičku viskoznost i plamište dobivenog metilnog

estera (biodizela) te izračunati iskorištenje.

Literatura

1. H. Fukuda, A. Kondo and H. Noda, J. Biosci. Bioeng. 92, 2001, 405-416

2. C. L. Peterson et al. Appl. Eng. Agriculture, 18, 2002, 5-11

3. B. Supple et al. JAOCS, 79, 2002, 175-178

22

6. METODE ODREðIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH

KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA

6. 1. ODREðIVANJE GUSTOĆE

Tariranu (ili izvaganu) odmjernu tikvicu od 10 cm3 nadopuniti do oznake, pri

temperaturi 20°C. Izvagati tikvicu i uzorak. Ako je tikvica tarirana očitana masa u

gramima (m) je masa kapljevine u tikvici. U drugom slučaju masu prazne tikvice treba

oduzeti od mase pune tikvice.

Gustoća, ρ = m/10 (g/cm3)

6.2. ODREðIVANJE KISELINSKOG BROJA

Kiselinski broj (KB) označava mg KOH potrebne za neutralizaciju 1 g uzorka.

3…5 g uzorka otopiti u 50 cm3 etanola neutraliziranog s alkoholnom KOH i titrirati s

0,1 M KOH uz indikator fenoloftalein do prve pojave ružičaste boje koja se zadržava.

Izračunava se prema izrazu:

m

faKB

××= 61,5

a – utrošak 0,1 M KOH za titraciju / cm3

f- faktor 0,1 M KOH

5, 61 - masa KOH (u mg) sadržana u 1 mL 0,1 M alkoholne otopine KOH

m – masa uzorka / g

6.3. ODREðIVANJE PEROKSIDNOG BROJA

Peroksidni broj daje uvid u stanje oksidiranosti ulja, a po definicije predstavlja

količinu tvari u uzorku koje oksidiraju KJ, izraženu u milimolovima aktivnog kisika

po kg (mmol/kg).

23

U suhoj erlenmeyerovoj tikvici od 250 cm3 s brušenim čepom izvagati uzorak uz

točnost 0,001 g (0,3…0,5 g ako je otpadno ulje, a 1,2…2 g ako je novo ulje). Uzorak

otopiti u 10 cm3 kloroforma i 15 cm3 ledene octene kiseline, dodati 1 cm3 zasićene

otopine KJ, brzo začepiti tikvicu i sadržaj miješati 1 minutu, a zatim ostaviti u tami 5

minuta pri temperaturi 15…20°C.

Nakon toga dodati oko 75 cm3 destilirane vode, 2 cm3 otopine škroba i titrirati s 0,01

mol/L (za peroksidni broj ispod 12) ili 0,02 mol/dm3 (za peroksidni broj iznad 12)

otopinom natrijeva tiosulfata uz snažno mućkanje. Napraviti i slijepu probu. Za svaki

uzorak rade se dva odreñivanja. Peroksidni broj izračunava se prema izrazu:

10002

)( 0 ××

×−=

m

CVVPbr

V – volumen otopine natrijeva tiosulfata potrošen za titraciju uzorka / cm3

V0 - volumen otopine natrijeva tiosulfata potrošen za titraciju slijepe probe / cm3

C – koncentracija otopine natrijeva tiosulfata

1000 - konstanta, za izražavanje rezultata po kg uzorka

2- molovi tiosulfata koji odgovaraju jednom molu peroksida

m – masa uzorka /g

Rezultat predstavlja aritmetičku sredinu dvaju odreñivanja.

Osim u mmol/kg postoje i druge jedinice za izražavanje peroksidnog broja:

- mg/kg ili µg/g: Pbr x 16,

- meq aktivnog kisika / kg : Pbr x 2.

6.4. ODREðIVANJE KINEMATI ČKE VISKOZNOSTI

Viskoznost predstavlja otpor fluida protiv smicanja njegovih čestica.

Pojmovno se definira kao mjera žilavosti fluida koja pokazuje kojom će silom slojevi

meñusobno djelovati jedan na drugi, po jedinici površine, ukoliko se gibaju

jediničnom relativnom brzinom na jediničnoj udaljenosti. Tako definirana viskoznost

predstavlja dinamičku viskoznost η (eta). Omjer dinamičke viskoznosti i gustoće

fluida naziva se kinematička viskoznost ν (ni).

24

6.4.1. Odreñivanje viskoznosti Ostwaldovim viskozimetrom

Ovo odreñivanje sastoji se u mjerenju vremena protjecanja kapljevine kroz kapilaru

viskozimetra (slika 6.1).

Postupak:

Viskozimetar se uroni u vodenu kupku i temperira na 40°C. Zatim se pipetira točno

odreñena količina uzorka i ulije u širi dio viskozimetra. Nakon toga uzorak se usiše

kroz kapilaru viskozimetra do odreñene oznake i mjeri se vrijeme u kojem tekućina

teče do druge oznake. Treba izvršiti 3 mjerenja vremena, a kao rezultat uzima se

srednja vrijednost. Umnožak srednje vrijednosti vremena protjecanja i konstante

viskozimetra predstavlja kinematičku viskoznost:

ν = k · t (mm² s-1)

k – konstanta viskozimetra (0,0384)

t – vrijeme protjecanja kapljevine

Slika 6.1. Ostwaldov viskozimetar

25

6.5. PLAMIŠTE

Pod plamištem se podrazumijeva ona temperatura pri tlaku od 760 mm Hg,

kod koje se iznad ispitivanog uzorka, zagrijavanog u propisanom aparatu, skupi toliko

njegovih para, da se one u smjesi sa zrakom prvi put, na trenutak, zapale kada doñu u

dodir s plamenom ili iskrom.

Razlikuje se plamište u otvorenom i zatvorenom lončiću. Poklopac na lončiću

u ovom drugom slučaju sprječava izlazak pare, te stoga plamište u zatvorenom

lončiću predstavlja uvijek nižu vrijednost. Ova je razlika veća, što se plamište nalazi

na višoj temperaturi.

Postoji nekoliko tipova aparatura za odreñivanje plamišta, a izbor aparature ovisi o

temperaturi plamišta tekućine koja se ispituje. Kod tekućina s plamištem ispod 50 °C

odreñivanje se vrši u aparatu po Abel-Penskyu, iznad 50 °C upotrebljava se aparat po

Pensky-Martensu ili Marcussonu. Aparati po Abel-Penskyu i Pensky-Martensu imaju

posudicu sa poklopcem, dok je aparat po Marcussonu otvoren.

6.5. 1. Odreñivanje plamišta po Pensky-Martensu

Aparat po Pensky-Martensu upotrebljava se kod kapljevina s plamištem iznad

50 °C. Aparat je strogo normiran i ima dva termometra. Kod tvari s plamištem ispod

100 °C upotrebljava se termometar od 0 - 110 °C, a za tvari s plamištem iznad 100 °C

upotrebljava se termometar od 90 - 170 °C. Aparata po Pensky-Martensu prikazan je

na slici 5.

Brončana posuda za uzorak O uložena je u zračnu kupelj od lijevanog željeza

A, koja se grije preko žičane mrežice ili bez nje. Grijanje se vrši Bunsenovim

plamenikom. Brončana kupola D smanjuje na minimum gubitak na toplini. Tri otvora

na poklopcu posude za uzorak su pokrivena okretnim zaklopcem, koji se pokreće

pomoću ručke H. U ispitak kapljevine je uloženo miješalo sa širokim lopaticama za

miješanje i s malim lopaticama iznad za miješanje pare i zraka. Miješalo prolazi kroz

poklopac i pokreće se rotiranjem ručke K. Temperatura kapljevine kontrolira se

termometrom T.

26

Slika 6.2. Aparatura za odreñivanje plamišta po Pensky-Martensu

Postupak rada:

Svi dijelovi aparata moraju biti potpuno čisti i suhi. Posudica se napuni

ispitivanom kapljevinom do oznake i postavi u peć, a poviše nje stavi se poklopac s

termometrom. Zatim se upali i regulira plamičak prema standardnoj kuglici na

aparatu. Tada se zračna kupelj zagrije plamenikom, tako da temperatura ispitka raste

oko 5°C po minuti, te se stavi u pogon miješalo kod približno 60 okr./min. Najmanje

15°C ispod očekivane točke plamišta (u slučaju kada je nepoznato, izvrši se prethodni

grubi pokus, ispitujući svake pola minute) pokuša se spuštati plamičak u posudu i to

do 100°C kod svakog 1°C, a za temperaturno područje iznad 100°C svako 2°C. Kada

se spušta plamičak, prekida se miješanje. Plamičak se mora spustiti u roku od 0,5

sekundi, držati na mjestu 1 sekundu i tada brzo vratiti u početni položaj.

Plamište je temperatura pri kojoj se od plamička jasno upali smjesa para i

zraka skupljene nad površinom posude. Da je plamište blizu, poznaje se po tome što

plamičak postaje veći. Dva odreñivanja smiju se razlikovati najviše za 2 °C.

Kod odreñivanja plamišta vrlo viskoznih tvari ploha se stavi već ugrijana u

posudicu, koja je takoñer ugrijana na temperaturu blizu plamišta, i provede

ispitivanje. Jedina razlika je brzina grijanja, 2 - 3 °C/min., a miješanje 70 - 80

okr./min.