UNIVERSIDADDELAREPÚBLICAPROGRAMADEDESARROLLODELASCIENCIAS

BÁSICASÁREABIOLOGÍA

TESISPRESENTADAPARAACCEDER

ALAMAESTRÍAENCIENCIASBIOLÓGICASOpciónBiologíaCelularyMolecular

“Caracterizacióndecélulasproliferantesenplatelmintosparásitosy

estudiodeunposiblemarcadormolecular”

UmbertoGermánCaurlaMorales

DepartamentodeBiologíaCelularyMolecularSecciónBioquímica,FacultaddeCiencias,UniversidaddelaRepública

DepartamentodeGenéticaFacultaddeMedicina-UniversidaddelaRepública

Directordetesis:Tribunal:Dr.JoseTortDra.AdrianaEsteves(Presidenta)Dra.EstelaCastilloDra.IleanaCorvo(Vocal)Dra.LeticiaPerez(vocal)

Montevideo,Uruguay2015

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Tabladecontenido

RESUMEN...............................................................................................................................................3INTRODUCCIÓN...................................................................................................................................5CARACTERÍSTICASGENERALESDELOSPLATELMINTOS..................................................................................6BIOLOGÍADECESTODOS........................................................................................................................................7BIOLOGÍADETREMATODOS.................................................................................................................................9ESTUDIODENEOBLASTOSENPLATELMINTOS-PROLIFERACIÓN..............................................................11NEOBLASTOSENCESTODOS..............................................................................................................................15NEOBLASTOSEINCORPORACIÓNDEEDUENTREMATODOS.......................................................................18EDU.......................................................................................................................................................................20PCNA.....................................................................................................................................................................21ANTECEDENTESDELGRUPODETRABAJO.......................................................................................................24

OBJETIVOGENERAL:.......................................................................................................................26OBJETIVOSESPECÍFICOS:...................................................................................................................................26

MATERIALESYMÉTODOS.............................................................................................................27CLONADOENELVECTORDEEXPRESIÓN.........................................................................................................28MinipreparacionesdeADNplasmídico................................................................................................29Transformación(Shocktérmico)delosproductosdeligación.................................................29

EXPRESIÓNDELAPROTEÍNARECOMBINANTE...............................................................................................29Análisisdelasolubilidaddelaproteínarecombinante(mL).....................................................30Purificación.......................................................................................................................................................30CuantificaciónProteínarecombinante................................................................................................31

ELECTROFORESISDEPROTEÍNASENGELESDEPOLIACRILAMIDA..............................................................31ANÁLISISINFORMÁTICO.....................................................................................................................................32OBTENCIÓNDEMATERIALPARASITARIO........................................................................................................32CultivodeMesocestoidescorti..................................................................................................................32ObtencióndeAdultosFasciolahepática..............................................................................................33Obtencióndehuevos,miracidiosyesporocitstos.............................................................................33

TRANSCRIPCIÓNINVITRODESONDASMARCADASCONDIGOXIGENINA-UTP(DIG-UTP)..................33Integridadycuantificacióndelassondas...........................................................................................34

HIBRIDACIÓNINSITUSOBRECRIOCORTESYORGANISMOSENTEROS.........................................................34Criocortes...........................................................................................................................................................34Hibridacióninsitusobrecriocortes.......................................................................................................34Hibridaciónsobreorganismosenteros.................................................................................................35

GENERACIÓNANTICUERPOPOLICLONALANTI-EGPCNAR..........................................................................36INMUNOHISTOQUÍMICA......................................................................................................................................36Inmunohistoquímicasobrecriocortes..................................................................................................36Inmunohistoquímicasobreorganismosenteros..............................................................................37

WESTERNBLOT....................................................................................................................................................37Westernblotsobreextractosproteicos................................................................................................38

INCORPORACIÓNDEEDU..................................................................................................................................38IncorporacióndeEDUMesocestoidesCorti........................................................................................38IncorporacióndeEDUFasciolahepática............................................................................................39

RESULTADOS.....................................................................................................................................40ANÁLISISBIOINFORMÁTICOS............................................................................................................................41EstructuraGénicaPCNA.............................................................................................................................41AnálisisFilogenético.....................................................................................................................................43PrediccióninformáticadelaestructuratridimensionaldePCNAparadiferentesParásitos............................................................................................................................................................46

PRODUCCIÓNDELAPROTEÍNAPCNAENFORMARECOMBINANTE...........................................................48Expresióndelaproteínarecombinante...............................................................................................48SolubilidadPCNA...........................................................................................................................................49

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PurificaciónEgPCNArFPLC(FastProteinLiquidChromatography).....................................50ConfirmaciónEgPCNArmedianteWesternBlot..............................................................................51DeteccióndePCNAenextractosproteicosdeM.cortiyF.hepática.......................................52

ENSAYOSDEHIBRIDACIÓNINSITU...................................................................................................................53ExpresiónespacialdelARNdePCNAenMesocestoidescorti.....................................................53Hibridaciónsobreorganismosenteroscomenzandoelprocesodesegmentación..........55

EXPRESIÓNESPACIALDELARNDEPCNAENFASCIOLAHEPÁTICA...........................................................57HibridaciónsobrecorteshistológicosF.hepática...........................................................................57

LOCALIZACIÓNESPACIALDELAPROTEÍNAPCNAMEDIANTEINMUNOHISTOQUÍMICACONANTICUERPOSANTI-EGPCNA...........................................................................................................................59InmunolocalizacióndePCNAenM.corti.............................................................................................59InmunolocalizacióndePCNAenFasciolahepática........................................................................64

DETECCIÓNDECÉLULASENDIFERENTESESTADIOSABORDABLESDEDESARROLLODEF.HEPÁTICAYM.CORTITRASINCORPORACIÓNDEEDU........................................................................................................69DeteccióndelaincorporacióndeEduenF.hepártica..................................................................69IncorporacióndeEduM.corti..................................................................................................................74

CONCLUSIONESYPERSPECTIVAS...............................................................................................75REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................78APÉNDICEI.........................................................................................................................................86

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Resumen

El advenimiento de nuevas técnicas para el estudio de la proliferacióncelularenneoblastos(célulasindiferenciadas)grandesavancessehanlogradoenel entendimiento de los mecanismos de regeneración celular en platelmintos.Muchos de los estudios más relevantes se han llevado a cabo mediante lautilizacióndemarcadoresmoleculares.

EstetrabajoplanteacomoobjetivocontribuiralconocimientodelabiologíadeldesarrollodelosplatelmintosparásitosMesocestoidescortiyFasciolahepáticacomoorganismosmodelodeCestodosyTrematodosrespectivamenteestudiandoenparticularlascélulasproliferativas,bajolahipótesisdequePCNA(ProliferatingCell Nuclear Antigen) es un posible marcador molecular específico de célulasproliferantesenplatelmintosparásitos

PCNAesuncofactordelasADNpolimerasasδyε(AyyagariR.,etal.,1995;McAlearM.etal.,1994)cuyafunciónesaumentarsuprocesividad(George-LucianMoldovan, et al., 2007). Como antecedente (tesina de grado German Caurla) seaisló y caracterizo el gen de PCNA para Mesocestoides corti, Echinococusgranulosus,yFasciolahepáticaproyectandoenesteestudio laproduccióndeunaproteína recombinante deE.granulosus EgPCNAr (Echinococusgranulosus PCNArecombinante) para generar un anticuerpo y así localizar PCNA en ensayos deinmunohistoquimica sobre distintos estadios (abordables) de desarrollo de losparásitos. Así también planteamos realizar una caracterización espacial paradeterminar si existe expresión diferencial en regiones del organismo medianteensayosdehibridaciónconsondasdeARN.

Seprobólaincorporaciónde5-etinil-2'desoxiuridina(EDU)alADN,elcualesunmétodoparadetectarlasíntesisdeADNencélulasproliferantes.Yserealizoun análisis informático de secuencias génicas y estructuras de proteína paracorroborardatosacercadelahistoriaevolutivadelgenquesesabeseencuentraaltamenteconservadoalolargodelahistoria.

Selogróexpresarlaproteínarecombinante,inmunizarunconejoyobtenerun anticuerpo contra PCNA. Los resultados de inmunomarcado con dichoanticuerpomuestranpoblacionescelularespositivasparaPCNAquepresentanunadistribución similar ensayos de Hibridación in situ con sondas de ARN eincorporacióndeEDUtantoenM.corticomoF.hepática. Segeneraungradienteanteroposterior conforme comienza el desarrollo y crecimiento paraM. corti. lalocalización se da a nivel del parénquima medular encontrando mayoresconcentracionesencuelloyescólex.EnF.hepática ladistribuciónseconcentraanivel de las glándulas vitelogenas no descartando la tinción en aparatoreproductor.Asuvezlosresultadosobtenidossecorrespondenaloencontradoenlabibliografíaparaotrosmodelos.Lasinferenciasinformáticasdemuestranelalto

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porcentajedeidentidadqueexisteaniveldesecuenciagénicasibienlaseparaciónencladosquedabiendefinidaparacadaclase.SevisualizotambiénlaaltasimilitudaniveldeestructuraquepresentaPCNAentodoslosorganismos.

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Introducción

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CaracterísticasgeneralesdelosPlatelmintos

Los platelmintos son un filo de animales invertebrados acelomados,protóstomos, triblásticosque comprendeunas20.000especies. Sonorganismosaplanadosdorso-ventralmenteypresentansimetríabilateral.Sucuerpoesmacizoy relleno de tejido parenquimático laxo. El espacio entre el ectodermo y elendodermo está lleno de mesénquima en donde se encuentran los órganosinternos. No existe cavidad general como en el caso de los nemátodos y lasestructurasintraparenquimatosascorrespondenalosórganosgenitales(Osimani,1982).

En la mayoría de los casos la organización del sistema genital eshermafroditaconlaexcepciondealgunasespecies.Eltubodigestivocarecedeano,actuandocomocavidadgastrovascularlacualrealizalasfuncionesdigestivasydedistribuciónde losnutrientes, dadoque carecendeaparato circulatorio.Muchasformas parásitas carecen de aparato digestivo. Tampoco tienen aparatorespiratorio y el oxígeno que necesitan para su metabolismo lo intercambian atravésdesusdelgados tegumentos.Tienenunsencillosistemanerviosobilateralquerecorreelcuerpoyunaparatoexcretorrudimentarioqueestáconstituidoporlosprotonefridios,quecomienzanciegosenelmesénquima.

Dentrodelciclobiológicodelasformasparásitassepuedenpresentarunoomás hospederos intermediarios, pudiendo llegando en ocasiones a ser muycomplejo.Segúnlaclasificacióntradicional,elfiloplatelmintos,comprendecuatroclases.

- Turbelarios: platelmintos de vida libre que ocupan elmediomarino,lacustreodulceacuícola.

- Trematodos:platelmintosparásitosinternosyexternostantodevertebradoscomoinvertebrados.

- Cestodo: platelmintos endoparásitos. En su extremidadanterior está situado el denominado escólex, donde encontramos órganosde fijación para adherirse a su hospedero, el resto del cuerpo posee unnúmerovariabledesegmentosllamadosproglotis.

- Monogéneos: platelmintos parásitas principalmente de pecesy anfibios. Considerados durante largo tiempo comoun ordende la claseTrematoda, fueron separadosde ellos, entre otrosmotivos, porpresentarunciclobiológicoconunsolohospedero.

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BiologíadeCestodosLoscestodossonhermafroditasyengeneraltienenciclosqueimplicanmás

de un hospedero. La forma adulta vive en la mayoría de los casos en el tubodigestivo de mamíferos y se encuentra especializada para la sobrevida en eseentorno. Los adultos tienen una pequeña cabeza o escólex, con órganosespecializados de fijación (ventosas y/o ganchos), seguido por un corto cuello ozonadebrotación(proliferación)quegeneralossegmentosdelcuerpooestróbila,que consiste de hasta 1000 proglótides. Constantemente, se están formandonuevasproglótidesporbrotamientotransversalenelcuello,yamedidaquecrecey se aleja del escolex cada proglótide madura dando lugar a los órganosreproductoresmasculinosyfemeninos,losqueporautofecundaciónofecundacióncruzadadanlugaramilesdehuevos.Estospermanecenal interiordelproglótidemaduro, y eventualmente los proglótides terminales grávidos son liberados.Cuandosoningeridosporloshospederosintermediarios,liberanformaslarvariasque se enquistan en los tejidos del hospedero intermediario; en algunos casosestosquistesdan lugaramúltiples formas larvariasporgemaciónal interiordelquiste (como es típico en especies del género Echinococcus) (Figura 1). Lageneracióndeprotoescólexapartirde lacapagerminativadelquistehidáticoesunclaroejemplodelaexistenciadecélulasindiferenciadasconunaaltacapacidadproliferativaydediferenciación.

En varios laboratorios el Cestodo Mesocestoides corti está siendoincorporadocomomodeloalternativoparaelestudiodecestodos(Markoskietal.'03;Espinozaetal. '2005).M.cortiposeeunciclodevidacomplejo,conalmenostreshospedadores.Eladultoesuntípicocestodosegmentado,viveenelintestinode animales homeotermos carnívoros varios, y produce huevos con oncósferas(embriones), que infectan a un primer hospedador intermediario; este esprobablemente un artrópodo pero la identidad del mismo se desconoce. Esteprimer hospedador intermediario sería entonces ingerido por el segundohospedadorintermediario;enestecaso,unaampliagamadeanimalessoncapacesdealojarlo,comoporejemplolagartijas,serpientes,ratonesycánidos(Britosetal.'2000). En la cavidad peritoneal de estos hospedadores, se desarrollan comotetratiridios,unestadolarvalpropiodelgénero,queessimilaraladultoencuantoaqueposeeunescólexconcuatroventosas,peronoseencuentraaúnsegmentadoni posee rudimentos del aparato reproductor. Los tetratiridios proliferanasexualmentemediantefisiónlongitudinalenestoshospedadores.LostetratiridiosdeM.cortipuedenmantenerseenel laboratorioporinfecciónderatasyratones,rindiendo grandes cantidades de larvas en poco tiempo. El cultivo in vitro de

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tetratiridios según las condiciones puede inducir la proliferación asexual de laslarvas,ollevaralasegmentaciónylaformacióndelasgónadas(Thompsonetal.'82;Markoskietal.'03).Estosprocedimientoshansidopuestosapuntoennuestrolaboratorio(Britosetal.'00;Lalanneetal.'04).

Figura(1) -CiclodevidadeMesocestoidesCorti.Enlafigurasemuestranlasdiferentesetapas del desarrollo que es posible encontrar en este parásito. Modificada dehttp://www.ufrgs.br/depbiot/206a/Ciclo.htm

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BiologíadeTrematodos

Entremátodoslosciclosbiológicossoncomplejosimplicandogeneralmenteun molusco como hospedero intermediario y un vertebrado como hospederodefinitivo, pudiendo existir más hospederos intermediarios entre éstos (Figura2a). Salvo los Schistosomas que son dioicos, todos los tremátodos sonhermafroditas,ysereproducensexualmenteensufaseadulta.Loshuevos(Figura2b)producidos generan larvasque infectan al hospedero intermediario, pero enéste ocurre un proceso de amplificación asexual, de modo que a partir de unmiracidio (Figura 2c) que infecta un caracol pueden emerger varios cientos decercarias. Se conoce desde hacemás de un siglo que el desarrollo asexual en elhospederointermediariodependedemasasgerminalesdecélulas.Losmiracidiosque eclosionan de los huevos, invaden el caracol que les sirve de hospederointermediario, y se transforman en una estructura hueca, el esporocisto, quecontieneensuinterioralgunascélulasgerminales.Estassedividenydesarrollandando lugar a las formas larvarias siguientes, las redias. Estas emergen delesporocisto, ymigranalimentándosede los tejidosdelhospedero.En su interiorpersistencélulasindiferenciadasqueproliferannuevamentedandolugaranuevasmasas germinales. Estas a su vez se diferencian en redias hijas o en cercariasdependiendodelascondicionesambientalesynutricionalesdelhospedero.

Lascercariassonesencialmenteunaformainmaduraqueluegodeinvadiralhospedero definitivo culmina el proceso de crecimiento, diferenciación ymaduración.Sibiennohansidoidentificados,verdaderosprecursoresgerminalesdebenestarpresentesenlascercarias,paradarlugara lasgónadaspresentesenlosadultos.Estasdosotresrondasdereproducciónasexualenelcaracolsignificanuna amplificación biológica, donde a partir de un único miracidio se puedenobtener varios cientos de metacercarias (Wilson & Draskau '76; Andrews '99;Keiser'10).

En nuestro país la prevalencia de infección con F. hepática en ovinos ybovinossuperael50%.Lainfecciónseadquiereporingestadevegetación(berroen el caso típico humano) contaminada conmetacercarias, las que se activan alpasar por el estómago y se desenquistan en el duodeno. Los juvenilesrecientementedesenquistados(JRD)atraviesan lapared intestinal,migranpor lacavidad peritoneal y erosionan el parénquima hepático en su trayecto hasta sudestino final en los canalículos biliares. En este entorno inmunológicamenteseguro, maduran sexualmente, produciendo miles de huevos diarios que sonliberadosconlashecesdelhospedero.LosmiracidiosgeneradosinfectancaracolesdelgéneroLymnea,dondesedandosotresciclosdeamplificaciónasexualcomo

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se describió anteriormente, liberando finalmente una forma de vida libre(cercaria) que se enquistan en la vegetación transformándose enmetacercaria ycerrandoelciclo(Andrews'99.)

Figura 2c - Imagen Miracidio adaptada de -Area de Biología. Lab. de Microfauna (M.V.ZSantosVázquezCervantes)

Figura 2a - Ciclo de vida de F. hepática. En la figura se muestran las diferentes etapas del ciclo con sus hospedadores. Modificado de página Centers for Disease Control and Prevention http://www.dpd.cdc.gov/dpdx

Figura 2b – Huevo de Fasciola hepática.Huevo operculado, Forma elipsoidal y depared fina aunque altamente impermeable.Tamaño: 130-150 x 60-90 µm. Imagenadaptada de Curso practicas demicrobiología para farmacéuticos –UniversidaddeGranada

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Los helmintos parásitos son responsables de infecciones en una grancantidadespeciesdeanimales.Debidoalimpactosanitarioyeconómicohansidoestudiados buscando dilucidar aspectos básicos referidos a su biología,inmunología, y epidemiología. Sin embargo, a pesar del conocimientoacumulado,ningunadelasestrategiasdiseñadasparaerradicarloshanfuncionadoporloqueesimprescindibleprofundizarenelconocimientodesubiología.

EstudiodeneoblastosenPlatelmintos-Proliferación

Las Planarias son gusanos planos, de cuerpo blando, y sin segmentaciónvisible. Muchas especies de este tipo son conocidas, entre las que se incluyenespecies de agua dulce, agua salada, e incluso hay terrestres. "Planaria" es untérmino coloquial que hace referencia a los miembros de vida libre del ordenTricladida,dentrodelaClaseTurbelaria.Estosgusanoshanatraídolaatencióndediversos biólogos debido a su asombrosa capacidad regenerativa (un pequeñofragmentodelcuerposepuederegenerarenel lapsode1semana)(Rink,2013;)La regeneración celular enPlanarias está basada enun tipo celular pluripotentedenominados neoblastos. Éstos están distribuidos en el parénquima de losorganismos y conforman aproximadamente el 25 - 30 % del total de células(Baguñá et al., 1989). Los neoblastos en Planarias se caracterizan por sumorfología, su gran capacidad proliferativa, y por la expresión de marcadoresmolecularescaracterísticosdeestetipocelular(Peteretal.,2004;Reddien,2013;ReuteryKreshchenko,2004).Lahistoriadeldescubrimientodelosneoblastoshasidorecientementerevisada(Baguñá,2012).Eltérmino"neoblasto"seusóenunprimer momento para describir a las células pequeñas y redondas que seencontrabanenelmesénquimadelasPlanarias,aexcepcióndelazonafrentealosfotorreceptoresyalafaringe(únicasáreasincapacesderegenerarse)(ReddienyAlvarado, 2004). Mediante el microscopio electrónico de transmisión (TEM) sepudieroncaracterizarmorfológicamentecomocélulasconundiámetrode5a10micras, con un citoplasma delgado, gran cantidad de ribosomas libres, cuerposcromatoidesprominentes,yunnúcleograndeconpocaheterocromatina(BaguñáyRomero,1981;Betchaku,1967;Brøndsted,1969;Coward,1974;HeyyCoward,1975;Hori,1982;Pedersen,1959).Un indiciodequeestascélulas jueganunrolpreponderante en la regeneración surgió al observar mediante diversosexperimentos que todas las divisiones celulares en planarias ocurríanexclusivamente en células que concordaban con la descripción morfológicadetalladaanteriormente,locualculminóconlaafirmacióndeque"enplanarias,losneoblastossonlasúnicascélulasquesedividen".Enconsecuencia,losmarcadoresdedivisióncelulargenéricostalescomofosfo-histonaH3,incorporacióndeBrdU,o

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la expresiónde componentesde lamaquinariade la división celular, tales comoPCNAsoncomúnmenteutilizadoscomomarcadoresdeneoblastos(MoritayBest,1984;NewmarkySánchezAlvarado,2000;Oriietal.,2005;Salvettietal.,2000).Losavancesentécnicasmolecularesycelulareshanreveladolosmecanismosquerigenlafuncióndelosneoblastosylaregeneracióncelular.Comorespuestaaunaamputaciónoaunalesióneneltejidodelorganismo,lasPlanariassoncapacesdecicatrizar la herida mediante la migración de células epiteliales adyacentes,seguido por una rápidamigración y proliferación de neoblastos (Baguñá, 1976;Eisenhofferetal.,2008;SalóyBaguñá,1984;Sasidharanetal.,2013;WenemoseryReddien, 2010;). El inicio de la regeneración implica una pérdida selectiva decélulasviejascercadelaregiónheridamedianteelprocesodeapoptosis,seguidade una remodelación de tejidos viejos y nuevos. El resultado es la restauracióncompletadelamorfologíanormaldelanimal(Loboetal.,2012).Un experimento esencial para validar el papel de los neoblastos realizado porWagnerysuscolegasen2011consistióentrasplantarunneoblastoaungusanoletalmente irradiado (depletado de células madre) se logró como resultado ungusanototalmentesanoydelgenotipodelgusanodonantedelneoblasto(Wagneret al., 2011). Existen experimentos que ponen en evidencia este mecanismo atravésdelatécnicademarcajeconBrdUyposteriorirradiacióndelorganismo,porejemploenMacrostomumlignano(Pfisteretal.,2007,Nodonoetal.,2012).

Otra característica inusual de los neoblastos de Planarias es su altaactividad mitótica basal, por la cual todos los tejidos del organismo se estánrenovandodemanera continuayprobablemente, carezcande cualquier tiposdecélulas de larga vida (Rink, 2013). Esta estrategia de renovación celular enPlanarias contrasta con la existente en otrosmodelos animales conocidos, comoporejemploenmamíferos,dóndedependiendodel tejido,puedencoexistirentrelascélulasproliferantes,célulasmadre(condiversosnivelesdecompromisoparasudiferenciación)yelementoscelularesyadiferenciados.

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Tabla1-GenesdePlanariainvolucradosenlaBiologíadecélulasproliferativas.ObtenidodeDisease Models and Mechanisms 2011 4: 12-19; doi: 10.1242/dmm.006692

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Hahabidoungrandesarrollodetécnicasparaelestudiodelaproliferacióncelularenneoblastosylosmecanismosderegeneraciónenplatelmintos.Algunosde los avances más espectaculares se han logrado mediante la utilización demarcadoresmolecularesparalosneoblastosysu progeniemediantehibridacióninsitueinmunohistoquímica,elusodecitometríadeflujo(Domínguezetal.,2014;Higuchietal.,2007), laexistenciadeproyectosgenomaydeexpressedsequencetags (ESTs) que permiten el aislamiento sencillo de genes y la construcción demicroarrays (Robbet al., 2008;Rossi et al., 2007; SanchezAlvaradoet al., 2002;Zayas et al., 2005), y el desarrollo de técnicas para el knock-down medianteinterferenciadeARNdelosgenesinvolucrados(Newmarketal.,2003;Nimethetal.,2004;Reddienetal.,2005;SanchezAlvaradoetal.,2002;SanchezAlvaradoyNewmark,1999).

Mediante el uso de las técnicas mencionadas, se han podido identificaralgunosmarcadoresmoleculares entre los cuales se encuentran genes efectoresque participan directamente en los procesos de replicación del ADN (Tabla 1)comolaproteínaPCNA(Oriietal.,2005),yelgenMCM2(Salvettietal.,2000),yfactores que podrían participar en la regulación de estos procesos (como ser elregulador post-transcripcional Pumilio (Rossi et al., 2008; Salvetti et al., 2005).Existenevidenciasdequeelmecanismoderenovacióncelularenlosplatelmintosparásitos neodermados es similar al de platelmintos de vida libre (Koziol et al.,2014;SanchezAlvaradoetal.,2003;Nimethetal.,2004),especialmenteenelcaso

Figura 3. Características Células indiferenciadas en Planarias. A:Célula indiferenciada. B:Neoblasto. Alta relación núcleo / citoplasma,Nucleolo prominente, Alta basofilia debido a la cantidad de ribosomaslibres, Escaso retículo endoplasmático rugoso y aparato de Golgi,Presenciadecuerposcromatoides.ObtenidodeShibata,N.2010

A

B

C

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decestodos,sibienexistenalgunosestudiosendigeneos(ReuteryKreshchenko,2004.

NeoblastosenCestodos

Algunosautores,Galindoetal.,(2003)handescritolaexistenciadeparches

decélulasproliferativasen lacapagerminaldelquistehidático(fase larvaria)deEchinococcusgranulosus,apartirdeloscualessedesarrollaríanlosprotoescólices(fase infectiva para el perro); la proliferación celular disminuiría una vez quecomienzaladiferenciacióndelosmismos.Encestodosadultos,porotraparte,seencuentra establecido para algunas especies que la proliferación celular existeprincipalmenteenelparénquimadelaregióndelcuello,dondesevangenerandolosproglótidos(segmentos)delaestróbila(Merchantetal.,1997).

Estudios enDipyllobothriumdendriticum (Figura 4 a,b,c) han demostradoque los neoblastos se localizan en el parénquima medular y adyacentes a lamusculatura interna.Además, seanalizó ladistribuciónduranteeldesarrollodelprimordio genital, que surge como una acumulación en el centro de cadaproglótido que con el tiempo aumenta de tamaño existiendo proliferación en lapartemásexternadelprimordio(Gustafsson,1976b).EnCylindrotenia(Figura5),seanalizótambiénedesarrollodelprimordiogenital,alolargodelosproglotidescondistintosestadosdeldesarrollodelaparatorepoductor.

Figura5 -Etapas sucesivasen la formacióndel primordio genital en Cylindrotaenia(Douglas,1961)

Figura4b/c-PrimordiogenitalDiphyllobothriumdendriticum.A:Temprano,B:Tardío(Wikgrenetal.,1971)

Figura4a-DistribuciónNeoblastosenDiphyllobothriumdendriticum(cortetransversal),(Gustafsson,1976b)

a

b c

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En el caso de M. corti, un estudio descrbió la presencia de los neoblastosduranteeldesarrolloestrobilarmediantemarcadometabolicocontiminatritiada(Figura 6), (Espinoza et al., 2007). Caracterizaron en forma cuantitativa laproliferacióncelularunavezinducidalasegmentación.Midieronlaincorporaciónde 3H-T, el porcentaje de células que incorporan 3H-T, y los niveles totales deexpresión del ARNm del gen para la histona H4. Se identificaron dos fases deproliferación en el desarrollodesde tetratiridio a gusano adulto, y un segundoymayoraumentoalsucederlasegmentación.Sedeterminólalocalizaciónencorteshistológicosmedianteauto-radiografíadelascélulasqueincorporaron3H-T.Eneltetratiridioendivisiónasexual longitudinal, ladistribuciónseobservaen todoelorganismoperoespecialmenteen laregiónanterior (juntoa lasventosasyenelextremo apical) y en el límite entre el parénquima cortical y el parénquimamedular. Interpretan esto como una asociación o incorporación de las célulasproliferantesa loscordonesnerviosos, sibienen lamismaregiónseencuentrantambién los haces musculares longitudinales internos. En tetratiridios noinducidosytraslainducciónseobservanpatronessimilaresenlosquelascélulasproliferantes se observan principalmente en el límite exterior del parénquimacortical.

Figura 6 - Análisis auto-radiográfico de la incorporación de 3H-T porejemplares de M. corti tras diferentes tiempos tras la inducción de lasegmentación.Labarrarepresenta100µm.TomadodeEspinozaetal.,2007

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LosestudiosdeincorporacióndeBrdUrealizadosporU.Koziol(Figura7)en el organismo entero las células BrdU+ se encuentran en toda la región delparénquimamedular,enparticularenlaperiferiadelmismo.

No se encontró evidencia de acumulación preferencial de células BrdU+alrededor de la región de los cordones nerviosos principales. En todo elparénquima cortical y en la región sub-tegumentaria no se observanprácticamentecélulasBrdU+.

Las células BrdU+ muestran una acumulación en el escólex y en toda laregiónanteriorenparticularjuntoalasventosasgenerandoungradientealolargodelejeantero-posterior.EntrelasventosasdelostetratiridoselnúmerodecélulasBrdU+esalto,peronomuestraunaconcentraciónmuchomayordecélulasBrdU+queenotrasregionescercanasalasventosas.

Figura-7InmunodeteccióndeBrdUentetratiridiosinducidoscontaurocolatodesodio,trasunpulsode24 horas con BrdU. Microscopía confocal de fluorescenciaVista general de tetratiridio inducido aún nosegmentado.Labarrarepresenta1000µmAdaptadodeU.Koziol2010

Figura8-IncorporacióndeBrdUenM.corti.ReveladoconAEC.AdaptadodeU.Koziol

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NeoblastoseincorporacióndeEduenTrematodos

Mediante marcado con un análogo de timina, se mostró que las célualsproliferantespresentanunadistribuciónalolargodelparénquimadelorganismo,obviamente enriquecida en los organos reproductores de los adultos. Ademáspresentan lamismamorfologíade losneoblastosdeplanarias, conununnucleoprominenteyuncitoplasmapequeño,(Collinsetal.2013).

Son tambiénsensiblesa la radiación,yaque losorganismos irradiadosnoson capaces de incorporarEdU. Los organismos irradiados presentan128 genescon expresión disminuida, los cuales corresponden a los genes caracterizadoscomomarcadoresdeneoblastosdeplanarias(Tabla2).

Figura9-ProliferacióndecélulassomaticasenadultosdeSchistosoma,A:MarcadodeadultodeEdu.B:MarcadodehembraconEDU.f:MorfologíaEDU+,EDU–g:FISHparalaHistonah2bjuntoconEDUdecélulasaisladas.Lasbarrasrepresentanena500mm,fyg5mm.AdaptadodeCollinsetal.(2013).Nature,494,476-479

Figura10–HibridacióninsituparaladeteccióndelaHistonaH2b.a:Parasitomacho,b:Parasitohembra.AdaptadodeCollinsetal.(2013).Nature,494,476-479

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Tabla 2. Expresión en miracidios y esporocistos de genes homólogos de neoblastos en planarias.AdaptadodeWangetal.2013

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EDU

La incorporación de 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU)al ADN es unmétodorapidoparadetectar lasíntesisdeADNencélulasproliferantesquesustituye losensayosdeBrdu(Bromodeoxiuridina).Surápidadetecciónsedebealusodeunaazida fluorescente la cuala travésdeunenlaceCuhacenque ladeteccióncon lamoleculaEdUseamuysensibleysepuedelograrenminutos.Elpequeñotamañode las azidas fluorescentes utilizadas para los revelados logran un alto grado depenetraciónyunaaltatasadedetecciónpermitiendounamejortinciónentodoelpreparadado. En contraste con BrdU, estemétodo no requiere la fijación de lamuestra o desnaturalización del ADN lo cual permite una buena conservación anivelestructuraldelostejidos(TimothyJMead,2014). Está técnica ha sido utilizada para caracterizar las células que proliferan decestodos(Koziol,2014)y trematodos(Collins2013,Wang2013).EncestodossepuedodescribirestascélulasymostrarqueelcrecimientoylaregeneracióndelalarvadeE.multilocularisesdirigidoporestáscélulasgerminativas.Dichascélulassonmorfológicamenteyfuncionalmentesimilaresalosneoblastosdeplatelmintosde vida libre, peromuestran diferencias en los patrones de expresión de genesreguladores conservados de células madres e incluso alguno de ellos se hanperdido.Losautoresplanteanquelasdiferenciasentrelascélulasgerminativasdeestecestodoylosneoblastospuededeberseaunaadaptacióndeesteparásitoporsu particular desarrollo asexual. Esto permite plantear a este como un buenmodelo para estudiar los orígenes evolutivos de la reproducción asexual y susefectosenelsistemadecélulasmadreseneltrematodoS.mansonielusodelEDUpermitió caracterizar una población de células neoblastos like. Fue posiblemostrarsudistribucióneneladultoysuscaracterísticamorfológicaslasquesonsimilaresa losneoblastosdeplanaria (Collins,2013).Tambiénrealizarondoblesmarcados quepermitierondeterminar la colocalizaciónde célulasmarcadas conEDU y hibridadas con genes marcadores de proliferación. El marcado con EDUtambiénfueusadoparadeterminareldescensodecélulasproliferativasluegodela irradiación . Estas poblaciones de células irradiadas y no irradiadas fueronanalizadasporRNAseqmostrando128genes"dowregulated".Medianteelusodemarcado con EDU también fue posible identificar estas células en larvas de S.mansoni(Wang,2013).Lascélulasproliferativasdeesporocistosexpresanmuchosde los genes reguladores conservados en las células madre. Usando RNAiidentificarongenes reguladoresquesonrequeridos paramantener la capacidadproliferativadeestascélulas.

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PCNALaidentificacióndegenesrelevantesylacaracterizacióndelascélulasque

los “expresan” resulta imprescindible para lograr elucidar los mecanismosmoleculares del desarrollo en el phylum Platyhelminthes (platelmintos). Nosproponemos estudiar la proteína PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), uncofactordelasADNpolimerasasδyε(AyyagariR.,etal.,1995;McAlearM.etal.,1994)cuyafunciónesaumentarsuprocesividad(George-LucianMoldovan,etal.,2007). Su expresión en células proliferativas se encuentra ampliamentedocumentadaalolargodelaescalaevolutiva.

PCNAfueprimerodescubiertacomounfactorderelevanteimportanciaenelprocesodeelongaciónenlareplicacióndelADNdelvirusdelsimio40(SV40)(B.Stillmanetal.,1988),permitiendounamayoreficienciadelamismaenpresenciadeextractocitoplasmáticodecélulashumanas.EnausenciadePCNA,lapolimerasaδtieneunaactividadlimitadaquedandoresumidaencadenasdevariasdecenasdenucleótidos,peroconsuadiciónesposibleobservarunimportanteincrementoenellargodelashebrasdeADNsintetizadas(G.Prelich.,etal1987).

Tiempoatrásutilizandoelectroforesisdedosdimensionesseencontróunaproteína ácida expresada diferencialmente durante el ciclo celular, enconsecuencia fue propuesta como una proteína perteneciente a la familia de lasciclinas. Más tarde, se reveló que PCNA y la ciclina eran las mismas proteínas(MathewsM.B.etal.,1984).YesasíqueesefactoresencialparalareplicacióndelADNdelSV40 invitro fue identificadocomoPCNA(TanC.Ketal1986,Prelichetal., 1987). Su aparición periódica en núcleos en fase S, co-localizada con laincorporacióndebromodesoxiuridina(BravoR.etal,1980;Bravo,R.etal1987),sugirióunarelaciónconlareplicacióndelADN.

PCNA interactúa con varias proteínas que pueden estar implicados en elcontroldel ciclo celularo en reacciones implicadas en la reparacióndelADN (Z.Kelmanetal.,1997,HubscherU.etal.,1996),variosdeestosmotivos fueron losque años atráshicieronque se la identificara equívocamente comounaproteínadentrodelafamiliadelasciclinas.

Laestructura tridimensionaldePCNAseencuentraconservadadurante laevolución,susecuenciadeaminoácidosenratasyhumanosdifiereentansólo4de261 aminoácidos. En la figura 11 se muestra por cristalografía de rayos X suestructura, PCNA tiene una organización en forma de toroide (Gulbis J.M et al.,1996, Krishna T. S. et. al, 1994, Schurtenberger P. et. al, 1998, Ellison V. andStillmanB,2001).

Cada monómero de PCNA se compone de dos dominios unidosestrechamenteformandounahojaBextendida(Figura11b)(GulbisJetal.,1996,

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KrishnaT et al., 1994). Tresmonómeros se une entre si para formar el trímeroresultanteydarformadeanilloalaproteína(Figura11c).

Eltrímero,PCNAseestimaen~34Åparaeldiámetrointerno,~80Åparael diámetro externo y~ 30Å de espesor. A pesar de que PCNA tiene una carganegativa general, la superficie interior está cargado positivamente, debido a lapresenciadevariosresiduosdelisinayarginina(10porsubunidad).EstosugierequelacarganegativaADNpuedepasaratravésdelanillosinrepulsiones.

Encuantoalmecanismodeacción,enlafigura12serepresentaelesquema

enzimático básico necesario para la replicación del ADN. La replicación es unprocesocomplejoquetienelugardurantelafaseSdelciclocelular,ybásicamenteocurre en dos etapas; iniciación y elongación. En los primeros momentos de lareacción sepreparaun complejoADN/Proteínael cualdará lugar a la iniciación,

Figura-11DiferentesnivelesdeorganizacióndePCNA.(A)SecuenciaaminoacídicaPCNAhumano.,IDCL(Interdomainconnectingloop)(118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135),Loopcentral(centerloop,CL),CL(41DSSH44),C-terminal,C(254KIEDEEGS261)semuestraenrojo;backsideloop,BL(184QTSNVDKEEEAV195)semuestraenrosado.(B)ModelodelaestructuratridimensionaldePCNA.IDCL,CL,C;BL.Áreasdehélices(helixareas)(aA1,aB1,aA2,aB2)enrosadoyhojasβ(bA1,bB1,bC1,bD1,bE1,bF1,bG1,bH1,bI1,bA2,bB2,bC2,bD2,bE2,bF2,bG2,bH2,bI2)semuestranenamarillo.(C).OrganizacióntrimericadePCNA(1XC)semuestrapordelante.(D)vistalateral(E)ModelodeldobletrímerodePCNA.IDLC,CLC,BL.AdaptadodeGulbisJ.Metal.,1996

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unaADNhelicasa,topoisomerasas(encargadasdeliberarlatorsióngeneradaporladoblehebra),proteínadereplicación, lasproteínasdeuniónalDNAdecadenasimpleSSBP(singlestrandbindingprotein)yunaK/Polprimasaquecumplecondos funciones, la de sintetizar los primeros cebadores de ARN en la que será lahebralíderyenparalelosintetizarpequeñosARNsdiscontinuosquedaránlugaralosllamadosfragmentosdeOkazakienlahebrarezagada).ElADNesdesenrolladodandolugara loqueseconocecomohorquilladereplicación.PCNA,RFCyNpolsonnecesariasparacambiarelaparatodesíntesisdelaPolKalaPolN,quienserálaencargadadecompletarlasíntesisdeADNenambashebras.

En eucariotas la replicación requiere de una enzima adicional llamadaPolimerasa δ que se ha sugerido participa en la replicación del ADNindirectamenteatravésdelamediaciónderespuestasfrenteadañoenelADNoen la transferencia incompletadeseñalesdereplicación,yaquesussubunidadestienenunrolenlospuntosdecontrol(A.Suginoetal.,1995)

Figura12-Modelodeliniciodereplicacióneucariotaconlaubicaciónhipotéticadelasdiferentesenzimasqueparticipanenel.Toshikiet.Al,1998

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AntecedentesdelgrupodetrabajoEn el laboratorio donde se llevó a cabo esta tesina de Maestría, se pudo

caracterizar la localización, abundancia ymorfología de las células proliferativasde M. corti desde su estadío larval hasta el adulto. Además, se esclareció elrecorridoquerealizalaprogeniedelasmismasluegodesudivisión(Koziol,2009).También, mediante la técnica de citometría de flujo y tinción con diversoscolorantes, se pudo observar que las células proliferantes tienen característicassimilares a las células germinativas de otros cestodos; núcleo grande concromatina poco compacta, nucléolo prominente, forma redondeada o conpequeñasextensiones,altabasofiliadebidoa laabundanciadeARNribosomal,yno muestran indicios de diferenciación (Domínguez et al., 2014). A través dediversos estudios se pudo determinar que estas células se encuentran en elparénquimainteriordeM.corti,próximasalacapamuscularinterna.Enlalarvaseobserva un gradiente antero-posterior, y luego de proliferar, la progenie celularmigraalparénquimaexteriorytejidosubtegumentariodondesediferencian.

Durante el desarrollo deM.corti se observaron acumulaciones periódicas

de células proliferantes en el cuello (región posterior al escólex que genera lossegmentos sucesivos) incluyendo una masa central en cada primordio quecorresponde al primordio genital que generará los órganos reproductoresmasculinosyfemeninosencadasegmento.Estascaracterísticasenlaformaciónyproliferación celular en el primordio genital muestran similitudes con otroscestodos estudiados (Douglas, 1961;Wikgren et al., 1971), sugiriendo que estoseventos y mecanismos del desarrollo se encuentran conservados en esta clase.DebidoaqueladistribucióndecélulasproliferantesquepresentaM.cortipareceser una característica conservada en el desarrollo estrobilar de las especies decestodosestudiadas(BollayRoberts,1971;Douglas,1961;27Gustafsson,1990),el mismo representa un modelo ideal para estudiar este tipo de células encestodos.

Hemos clonado y caracterizado varios genes como por ejemplo uno tipopumilio y un homólogo de pcna como marcadores moleculares de célulasproliferantes.LosgenespumiliodeM.cortiseexpresanenvariostejidosalolargodetodoeldesarrolloentrelaformalarvariayadulta,observándoseunaexpresiónpreferencial de dichos genes en células proliferantes. En cuanto al gen pcna, sepudoclonarelhomólogodeM.cortiydemostrarmedianteWesternBlotlautilidad

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del anticuerpo monoclonal PC10 (Waseem & Lane, 1990) para reconocer laproteínaPCNAdeesteorganismo.

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Hipótesis de trabajo:Porsupapelen lasíntesisdeADNPCNAhasidodescritocomomarcadordecélulasproliferantesenotrosmodelos.DadoquelosneoblastosparecenserlasúnicascélulasqueproliferanenplatelmintosdevidalibreentoncesPCNApodríaserunposibleMarcadorMolecularespecificodecélulasproliferantesenPlatelmintosParásitos.

Objetivogeneral:

ElobjetivogeneralbuscacontribuiralconocimientodelabiologíadedesarrollodelosplatelmintosparásitosestudiandoenparticularlascélulasproliferativasyPCNAcomounposiblemarcadormolecular

ObjetivosEspecíficos:1.IdentificaciónyconservacióndePCNAenlosgenomasdePlatelmintos

2.ClonadoyexpresióndelaproteínarecombinanteygeneracióndeunanticuerpoantiPCNA

3.EstudiarelpatrónespacialdeexpresióndelgenmarcadorPCNAenF.hepáticayM.cortiNivelARN/Proteína

4. Identificar lascélulasproliferantesmediantemarcaciónconEDUenM.cortiyenestadiosabordablesdeF.hepática

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MaterialesyMétodos

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MaterialesyMétodos

Clonadoenelvectordeexpresión

Se diseñaron cebadores para clonar la región codificante de la proteína

EgPCNA completa (Fw 5´ATGTTTGAGGCTCGGTTGCCGCA, Rev 3´GGATCCTTCTCACGCCTCATCGTCCTC)EstoscebadoressefusionaronalossitiosderestricciónparalasenzimasPstIyBamHIparaelclonadodireccionalenelvectorpET14b.DeestamaneraseobtuvolasecuenciacodificanteenmarcoparaPCNAyuna coladehistidinasenel extremoC-terminalpresenteenelVector. Se realizóunareaccióndePCRcon laenzimaTaqDNAPolymerase(Invitrogen)apartirde0.5μldelplásmidoPGem-TelcualconteníalasecuenciacasicompletadeEgPCNA(cita) utilizando estos cebadores. Las condiciones de reacción y el programa deamplificaciónsedescribenenlatabla3.

Losampliconesseanalizaronmedianteelectroforesisengelesdeagarosaal1%continciónconGelRedTM.LosproductosdePCRsepurificaronmedianteelkitISOLATEPCRandGel(Bioline).ElvectordeexpresiónpET14bylosampliconessedigirieroncon10unidadesde laenzimaPstI(Fermentas–ThermoScientific)enbuffer Tango 1X (Fermentas – Thermo Scientific) en una reacción de 50μl devolumen final conteniendo10μgdeplásmido. Se incubó esta reaccióndurante 2horas a 37°C y se analizó una alícuota en gel de agarosa para verificar lalinealización total del plásmido. Se ligaron los insertos y el vector pET14butilizando10unidadesdelaenzimaT4DNALigase(Fermentas).Sesiguióconlatransformación en la cepa E. coli DE3 y el aislamiento de plásmidos para laverificacióndelaconstrucciónporsecuenciación.

Tabla 3 - Condiciones del programa de amplificación

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MinipreparacionesdeADNplasmídico

Serealizócultivoen3mldeLBapartirdeunacoloniaaisladayseincubódurantetodalanochea37°Cconagitación.Secentrifugó30segundosa13600xgparacolectarlascélulasysedescartólatotalidaddelmedio.Seresuspendieronlascélulasen200μldesoluciónI(Tris–HCl50mMpH8,EDTA10mM)sinvórtexyseagregó 200μl de solución II (NaOH 200mM, SDS 1%). Se mezcló por inversiónsuavemente y se incubó 2minutos a temperatura ambiente. Se agregó 200μl desoluciónIII(Acetatodepotasio3MpH4,8),semezclóporinversiónyseincubó5minutosenhielo.Secentrifugó20minutosa12000xgatemperaturaambienteyserecuperó el sobrenadante. Se agregó 10mg de RNasa y se incubó 15minutos a37°C. Se purificó el ADN plasmídico mediante el agregado de 1 volumen decloroformo:isoamílico(24:1)ycentrifugaciónparasepararlasfases.Serecuperólafaseacuosayseprecipitóagregandounvolumendeisopropanol,centrifugandopor 15 minutos a 10000xg a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se lavó elsedimentocon300μldeEtanol70%.Sesecóbajolámparayseresuspendióen30μldeaguamQ.

Transformación(Shocktérmico)delosproductosdeligación

Se descongelan las células competentes, cepas de Escherichia colipreparadasconCaCl2,enhielopor10minutos.Seañadeelproductodelaligación

ysedejaincubarenhielopor20minutos.Secolocanlascélulasenbañoa42oC90segundos (shock térmico), luego se colocan en hielo por 1-2minutos. Se agrega600μldeLBlíquidotermostatizadoa37°C,yseincubaconagitacióndurante45-60minutos.SeplaqueaconrastrilloenplacaLBagar la cual contieneampicilina100μg/μl,4ldeIPTG(2%)y40ldeX-Gal(20mg/ml).Seagregaelproductodelaligaciónyseincubaenhielopor20minutos.

Expresióndelaproteínarecombinante

SeutilizaronlascepasE.ColiDE3(Invitrogen)paralaexpresióndeEgPCNAen el vector pET14b. La expresión de proteínas se realizó en medio LBsuplementado con antibiótico LB-Ampi (100µg/mL). Se partió de un precultivoconunacoloniaaisladaen3mldemedioselectivocrecidodurantetodalanochea37°C.Seinocularonmatracesconteniendo250mldemediocon2.5mldeprecultivoyseincubarona200rpmy37°ChastaalcanzarunDO600de0.6.EnesemomentoseindujolaexpresiónconIPTGaunaconcentraciónfinalde1mM.Sedejóinducir

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a30°Cy37°Cdurantedistintostiempos. Setomaronalícuotasde1mldecultivoparalaverificacióndelaexpresión.Secentrifugarondurante2minutosamáximavelocidadyse recuperóel sobrenadante.Se resuspendióel sedimentocelularen0.1volúmenesde100mMTris–HClpH8ysecombinóconelmismovolumendebuffer de carga de proteínas 4X. (apéndice I). Esta muestra constituyó ladenominada Fracción Total (FT). El medio de cultivo se volvió a centrifugar 20minutos amáxima velocidad para eliminar cualquier célula remanente. Una vezcombinadas conbuffer de cargadeproteínas, lasmuestras se calentaron a 90°Cdurante5minutosy sealmacenarona -20°Co seprocedió inmediatamentea suanálisisporSDS-PAGE.El resto del cultivo fue centrifugado a 10000xg por 10minutos, descartando elmediodecultivoycongelandoelsedimentocelularparaanálisisposteriores.

Análisisdelasolubilidaddelaproteínarecombinante(mL)

Para la determinación de la solubilidad de la proteína recombinante, serealizóunfraccionamientosubcelular.Setomóunaalícuotade1mLdecultivoparaobtenerlafraccióntotal(FT)Seanalizólapresenciadelaproteínarecombinanteenlafracciónsolubleoenlafraccióninsoluble.Paraello,elsedimentocelularseresuspendióenbufferdelisisysecongelóa-20°C.Aldescongelarseselisaronlascélulasporsonicadoal60%delaamplitudmediantelaaplicaciónde3pulsosde30 segundos interrumpidos por 1 minuto en hielo. Se centrifugó a 10000xgdurante 45 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante que constituyó ladenominadaFracciónSoluble(FS).SetomóunvolumendeFSysemezclóconunvolumen de buffer de carga de proteínas 4X. El sedimento remanente se lavó 2vecescon50mMTris–HClpH7.5yseresuspendióenunbufferderesuspensióndesnaturalizante,constituyendo ladenominada fracción insoluble (FI).SemezclóunvolumendeFI conunvolumendebufferdecargadeproteínas4X.Todas lasmuestrasunavezmezcladasconbufferdecargadeproteínasfueroncalentadasa90°Cdurante5minutos y almacenadas a -20°Co analizadas en elmomentoporSDS–PAGEytinciónconCoomassieBlue

Purificación Paralapurificaciónsesiguióelprotocolodepurificaciónrecomendadoporel equipo (Akta Prime Plus GE). Las soluciones utilizadas para la creación delgradientesedescribenenelApéndice1

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CuantificaciónProteínarecombinanteUnavezexpresadaypurificadarestacuantificarelproductoobtenido,para

esto se utilizo el método de Bradford realizando diluciones por triplicado de 3muestras y comparando los resultados sobreuna calibración conBSA.El equipoqueseutilizofueunvarioSkANconfiguradoparatrabajarymedira∧=595nm

CuantificacióndePCNArecombinante:concentraciónde0,125mg/ml(resultadosvaloresAbsnomostrados)

Electroforesisdeproteínasengelesdepoliacrilamida.

Para el análisis de proteínas se realizaron geles discontinuos de

poliacrilamidaal15%encondicionesdesnaturalizantes(SDS–PAGE)siguiendoelmétodo de Laemmli modificado por Gallagher (2003). Para la siembra de lasmuestras se utilizó el buffer de carga de proteínas 4X que se describe en elApéndice1.Serealizólaelectroforesisa15mAporgeldurantelacorridaenelgel

BSAmg/ml

21,510,750,50,250,1250,0621,510,750,50,250,1250,06

MuestraA,B,C

ControlBufferelución

Representación sembrado de muestras para analizar espectro de Absorción yestimarlaconcentraciónderPCNA

1/101/101/101/101/101/101/101/101/10

1/201/201/201/201/201/201/201/201/20

1/401/401/401/401/401/401/401/401/40

00,20,40,60,81

21,5

1,25 1

0,5

0,25

0,125

0,06

Abs

Conc.mg/ml

Serie1

Lineal(Serie1)

CurvadecalibraciónconconcentracionesconocidasdeBSA

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concentradorya30mAporgeldurantelacorridaenelgelseparador.La tinciónde proteínas se realizó por incubación enCoomassieBlueR (Sigma –Aldrich)(Apéndice1)durantetodalanocheydecoloradohastalavisualizacióndebandasdiscretasconSolucióndecolorante(Apéndice1).AnálisisInformático Las secuencias obtenidas fueron alineadas utilizando ClustalX (Thompsonet al., 1997) bajo parámetros estándar, y las regiones con gaps eliminadas delalineamiento. El alineamiento fue visualizado con BioEdit y coloreado parahomologíamayora85%.El análisis filogenéticoporunióndevecinos (NeighborJoining)fuerealizadoenbioedit.Las imágenes de estructura génica se muestran bajo capturas de pantallarealizadasconelprogramaArtemisylasinferenciasinformáticasdelaestructurase realizaron utilizando el servidor de http://swissmodel.expasy.org/ con lassecuencias aminoacidicas de cada organismo comparando en la web contra elmodelocristalográficodePCNAdeDrosophilamelanogaster(cita)ObtencióndematerialParasitario

CultivodeMesocestoidescorti

Los tetratiridios de M. corti se mantuvieron mediante pasajesintraperitoneales en ratones por Jenny Saldaña y colaboradores (Facultad deQuímica,UniversidaddelaRepública).LacepadeM.cortiestudiadafueobtenidaoriginalmente por Specht y Voge (1965). Para el cultivo in vitro deM. corti, losratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical, y se extrajeron lostetratiridiosencondicionesestérilesmedianteel lavadode la cavidadperitonealconsolucióndeHanks(Sigma-Aldrich,catálogonúmeroH6136,Lote087K83012)Los tetratiridios recogidos fueron lavados cinco veces con solución de Hanksestéril, y puestos en cultivo en placas conmedio RPMI 1640modificado (RPMI1640-mod; con 10 % de suero fetal bovino (SFB; el origen del mismo fueLaboratoriosSantaElena,Uruguay,oGIBCO, Invitrogen, EstadosUnidos)enunaestufaincubadoraa37ºCenunaatmósferacon5%CO2Se cultivaron aproximadamente 400 a 500 μl de tetratiridios por cada 15ml demedio. Se cambiaron dos tercios delmedio de cultivo cada 48 a 72 horas. Loscultivos fueron realizados con la colaboración de la Lic. María FernandaDomínguez y la Lic. Serrana Estrade. Para inducir el desarrollo estrobilar, seañadióalmediotrasdosdíasdecultivoTaurocolatodeSodio(TC;Sigma-Aldrich;1mg/mlconcentraciónfinal).

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ObtencióndeAdultosFasciolahepática

Los gusanos adultos de F. hepatica se extrajeron mecánicamente delconductobiliardeanimales infectadosnaturalmente,disponiblesenel frigoríficoCarrasco. Estos fueron transportados al laboratorio vivos, en bilis a bañomaríaunavezallífueronlavadosen10mMtampónfosfatodesodio(PBS)pH7.3a37ºCAlgunos de los gusanos luego de los lavados fueron cultivados enmedio RPMI-1640(SigmaAldrich)pH7.3conteniendo2%deglucosa,30mMdeHEPESy25mg/mldegentamicinaa37ºCparasuusoenexperimentosde incorporacióndeEDU. Los gusanos cultivados y los lavados fueron secados con papel, masados(pesohúmedo),congeladosyalmacenadosa-80ºChastasuutilización.

Obtencióndehuevos,miracidiosyesporocitstosLa larvaciliadamiracidio sedesarrolladentrodelhuevoentre los10-20díasdeextraídos loshuevos (13díasnormalmente) la luzestimulaalmiracidio, el cualeclosiona al medio. Una vez obtenidos los miracidios estos se inducen atransformarenesporocistosmedianteelagregadodeCBSSalmediodecultivoelcualsimulaelinteriordelcaracolainfectar

Transcripcióninvitrodesondasmarcadascondigoxigenina-UTP(DIG-UTP)

LosfragmentosyaaisladosdelosgenesMcPCNAyFhPCNAfueronclonadosenelvectorpGemT.Estemismotiene juntoalsitiodeclonadomúltipleunsitiopromotorT7por un lado y SP6para el otro.Un inserto (McPCNA) se encuentraclonado de tal manera que la transcripción desde el promotor T7 generatranscritos anti-sense no siendo así para FhPCNAque generaun transcripto antisenseapartirdeSp6. Estos plásmidos fueron utilizados directamente para transcribir con ARNpolimerasaSP6oT7(Promega)paragenerarsondasantisense.Lasreaccionesdemarcadoconsistieronen20μldevolumenenlassiguientescondiciones:bufferdetranscripción 1 x,mezcla de rNTPs conDIG-UTP (concentraciones finales 1mMATP,1mMCTP,1mMGTP,0.65mMUTP,0,35mMDIG-UTP(Roche)),inhibidordeARNasa(40unidades),ADNmolde(1μg)yARNpolimerasaSP6oT7(20unidadesporreacción).Lasreaccionesseincubarondurante60mina37ºC,siendoluegotratadas con ADNasa RQ1 (1 unidad; Promega) durante 15 minutos a 37 º yprecipitadasconetanolabsolutoyLiCl.Lassondassedisuelvenentoncesen50%formamida.

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IntegridadycuantificacióndelassondasLas sondas separadas mediante electroforesis se transfirieron a membranas denylon (Hybond N, Amersham) por el método de transferencia seca. Para lacuantificaciónsesembrarondilucionesseriadasde lasmismasenmembranasdenylonjuntoadilucionesseriadasdeunasondadeconcentraciónconocida(Roche)paraelblot.ElARNsefijóalamembranaporexposiciónaluzultravioleta.Paraelreveladoseincubaronlasmembranasconagitacióndurante5minutosenBuffer 1 (Apéndice 1), seguido de un bloqueo durante 20 minutos en Buffer 2(Apéndice 1). Se realizó un lavado durante 5 minutos en Buffer 1 y se incubódurante 20minutos en una dilución 1/1000 en Buffer 2 de un anticuerpo anti-Digoxigeninaconjugadoafosfatasaalcalina(Roche).Finalmente,lasmembranasselavaron2vecesdurante5minutosenBuffer3yserevelaronmedianteincubaciónconlosreactivoscromogénicosNBTyBCIP(Bufferderevelado,Apéndice1)Hibridacióninsitusobrecriocortesyorganismosenteros

Criocortes EjemplaresdeM.corticultivadosdurante6díasfueronfijadosdurante90minenPFA/PBSa temperatura ambiente, lavados5 veces conPBS (5minutoscadauna),ydejadosensacarosa30%a4-8ºCdurante48horas.Losejemplaresfueron entonces embebidos en la resina de inclusión (OCT), congeladosrápidamenteconnitrógenolíquido,ycortadosconuncriostatoencortesde10μm,montados sobre portaobjetos SilanePrep (Sigma-Aldrich). Los cortes se dejaronsecar2horasatemperaturaambienteysecongelarona-20ºChastaelmomentodesuuso.

Hibridacióninsitusobrecriocortes.

Se descongelaron los criocortes durante 30 minutos a temperaturaambiente,sefijaron15minutosenPFA4%diluidoenPBSyselavaron3vecesconPBSdurante5minutoscadavez.Sepermeabilizaronporincubación30minutosenPBSTx(Apéndice1)y10minutosenHCl0,2N.Todaslasincubacionesanterioresfueron realizadas a temperatura ambiente. A continuación se prehibridaron loscortesconsolucióndeprehibridación(Apéndice1)por10mina60°Cy,luegodeuncambiodesolución,durante120minutosa53°C.Sedesnaturalizó la sondapor incubación2minutos a80°Cy enfriado rápidoenhielo.Serealizólahibridacióncon0.1ng/μldesondadesnaturalizadaensolución

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deprehibridaciónsobreelportaobjetoscubiertoconParafilmencámarahúmedaa53°Cdurante toda lanoche.ParadesprenderelParafilmsindañar los cortes, seincubó con agitación en abundante SSC 2X precalentado a 53°C. Se realizaronlavadosderigurosidaddecrecientedurante20minutoscadaunoa53°Csobreelportaobjetosconsolución1ysolución2(Apéndice1).Los cortes fueron lavados a temperatura ambiente 2 veces en buffer MAB(Apéndice 1) durante 30 minutos cada vez y se bloquearon durante 1 hora ensolución de bloqueo (Apéndice 1) a temperatura ambiente. A continuación seincubaron en cámara húmeda durante 90 minutos a 37°C con un anticuerpomonoclonal anti-Digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina (Roche) diluido1/500ensolucióndebloqueo.Selavaron6vecesenMABT(Apéndice1)durante15minutoscadavezyseequilibraron10minutosenbufferAP(Apéndice1).Seaplicó el reactivo NBT/BCIP (Apéndice 1) y se incubó en oscuridad hasta laapariciónde laseñal.Sedetuvo lareacciónconPBSTw(Apéndice1),yse fijaronlos cortes con PFA 4% en PBS durante 20 minutos. Se lavaron con PBS, semontaron en glicerol 80% diluido en PBS y se fotografiaron en unmicroscopioOlympusmodeloBHAconunacámaraadaptada(USBEye-PieceDigitalMicroscopeCamera–Dino-Lite).

Hibridaciónsobreorganismosenteros

Se rehidrataron los organismos almacenados en metanol 100% porincubación a temperatura ambiente en metanol 50% y PBSTx (Apéndice 1)durante 10 minutos cada uno. Se trataron con Proteinasa K (Apéndice 1) parapermeabilizarlosorganismosysefijaron10minutosatemperaturaambienteenPFA4%enPBS.Selavaron2vecesdurante5minutoscadavezenPBSTxydurante10minutosensolucióndeprehibridación(Apéndice1)diluida1/2enPBSTx.Seprehibridaron los organismos durante 10 minutos a 60°C para inactivar lafosfatasaendógenay2horasa56°Censolucióndeprehibridación.Se desnaturalizó la sonda durante 5minutos a 80°C y se enfrió rápidamente enhielo. Para la hibridación se incubaron los organismos toda la noche a 56°C ensolucióndehibridaciónprecalentada(Apéndice1).Acontinuaciónserealizaron2lavadosderigurosidaddecrecientedurante30minutosa56°Cconcadaunadelassolucionesde lavadoprecalentadasdescritasenelapéndice1.Acontinuaciónselavaron2vecesenMABT(Apéndice1)durante10minutoscadavezatemperaturaambienteysebloquearondurante2horasensolucióndebloqueo(Apéndice1)atemperatura ambiente. Se incubaron con anticuerpo anti- Digoxigenina (Roche)diluido 1/4000 en solución de bloqueo durante toda la noche a 4°C en cámarahúmeda.Selavaron6vecesconMABTdurante20minutoscadavezatemperaturaambiente y se incubaron 10 minutos en buffer AP (Apéndice 1) a temperatura

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ambiente. Se revelaron con reactivo NBT/BCIP (Apéndice 1) siguiendo eldesarrollo de color bajo lupa y se fijaron enPFA4%diluido enPBSdurante 10minutosatemperaturaambiente,seguidodeunlavadoenPBSTx.Seincubaronenetanol100%durante20minutosyenetanol50%durante5minutos.Semontaronenglicerol80%enPBSy se fotografiaronunmicroscopioOlympusmodeloBHAconunacámaraadaptada(USBEye-PieceDigitalMicroscopeCamera–Dino-Lite).

Todas las soluciones que se describen para la hibridación in situ hasta elpaso de incubación con el anticuerpo anti-digoxigenina fueron tratadaspreviamente con Dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1% durante toda la noche atemperaturaambienteyautoclavadasdurante40min.

Generaciónanticuerpopoliclonalanti-EgPCNArLainmunizacióndelconejoparalaproduccióndelanticuerpopoliclonalantiPCNAdeEgPCNArfuerealizadaporlaDra.IleanaCorvo

Inmunohistoquímica

Inmunohistoquímicasobrecriocortes

Los criocortes realizados se descongelaron durante 30 minutos a

temperatura ambiente y se incubaron 15minutos en PFA 4% diluido en PBS atemperaturaambiente.Se lavaron3vecesdurante5minutoscadavezconPBSatemperatura ambiente y se inactivó la peroxidasa endógena por incubacióndurante10minutosenperóxidodehidrógenodiluidoal3%enPBS.Sebloquearondurante1horaatemperaturaambienteensolucióndebloqueo(Apéndice1)yseincubaron toda la noche a 4°C en cámara húmeda con suero anti- PCNA diluido1/500ensolucióndebloqueo.Serealizaron4lavadosenPBSdurante15minutoscadavezatemperaturaambienteyseincubaronconanticuerpoanti-IgGdeconejoconjugadoaperoxidasaderábano(GEHealthcare,N°catálogo:NA934oSigma–Aldrich, N° catálogo: A6154) diluido 1/1000 en solución de bloqueo durante 2horasatemperaturaambiente.Serealizaron4lavadosenPBSdurante15minutoscadaunoyunlavadode2minutosenbufferacetatodesodio50mMpH5.Serevelócon el reactivo cromogénico 9- etilcarbazol-3-amina (AEC – Sigma Aldrich –Número de catálogo A6926) monitoreando el desarrollo de color bajo lupa. Sedetuvo la reacción con PBS, semontaron en Glicerol 80% y se fotografiaron unmicroscopio Olympus modelo BHA con una cámara adaptada (USB Eye-PieceDigitalMicroscopeCamera–Dino-Lite).

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Inmunohistoquímicasobreorganismosenteros

En elmomento de realizar la inmunohistoquímica, los organismos fueronrehidratadosporincubaciónensolucionesdeconcentracióndecrecientedeetanolenPBS.Unavezhidratados,setrataronlosorganismosconproteinasaK(20μg/mlenPBS)durante20minatemperaturaambienteseguidodeunlavadode1minutoen PBS. A continuación se incubaron en HCl 1N por 30 minutos a temperaturaambienteconagitaciónyselavaronenPBShastaqueelpHfuerade7.4.Selavarondos veces con PBSTx (Apéndice 1) durante 15minutos cada uno seguido de unlavadode1minutoenPBS.Sebloquearonlosorganismosensolucióndebloqueo(Apéndice1)todalanochea4°C.Seincubaronconsueroanti-PCNAproducidoenconejo, diluido 1/500 en solución de bloqueo, durante 2 horas seguido de 6lavadosde20minutos cadaunoenPBSTw.A continuación se incubaron conunanticuerpoanti-IgGdeconejo conjugadoaperoxidasade rábano (GEHealthcare,N° catálogo: NA934 o Sigma – Aldrich, N° catálogo: A6154) diluido 1/5000 ensolución de bloqueo, seguido de 6 lavados de 20minutos cada uno con PBSTw.Paraelreveladoseincubaron5minutosenbufferacetatodesodio50mMpH5yse incubaron con el reactivo cromogénico 9-etilcarbazol-3-amina (AEC – SigmaAldrich–NúmerodecatálogoA6926)hastalaaparicióndecolor.Losorganismosfueronmontados con glicerol 80% y fotografiados con unmicroscopioOlympusmodeloBHAconunacámaraadaptada(USBEye-PieceDigitalMicroscopeCamera–Dino-Lite).Comocontrolpositivoserealizóelmismoprocedimientoincubandocon un suero anti- tropomiosina producido en conejo disponible en nuestrolaboratorio.

Westernblot

Setransfirieronlasproteínasdesdeelgelpoliacrilamidaaunamembrana

de nitrocelulosa de 0.45μm (Thermo Scientific - Número de catálogo 88018)equilibradaenbufferdetransferencia(Apéndice1)deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante.Latransferenciaserealizóenuncassettedetransferenciahúmedo(BioRad Mini – PROTEAN® TetraCell) durante 2 horas a 200mA en buffer detransferencia y a continuación se bloqueó la membrana a 4°C durante toda lanoche en buffer de bloqueo (Apéndice 1). Se incubó con suero anti PCNAproducido en conejo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se realizaron 12lavadosde5minutoscadaunoenTBST(Apéndice1)atemperaturaambienteconagitación vigorosa. A continuación, se incubó con anticuerpo anti-IgG conejoconjugadoaperoxidasaderábano,diluidoenbufferdebloqueo,yserealizaron12lavados de 5 minutos cada uno en TBST a temperatura ambiente con agitación

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vigorosa. Se visualizó la reacciónmediante incubación durante 1 minuto con elreactivo quimioluminiscente Chemiluminescent Peroxidase Substrate - 3 (CPS-3,Sigma–Aldrich)ysecapturólaquimioluminiscenciamedianteelusodeunGbox(Syngene) o exposición a placas Biomax MR Film (Kodak) en oscuridad.Alternativamente, se reveló con el sustrato cromogénico AEC (3-Amino-9-etilcarbazol, Sigma – Aldrich, número de catálogo A6926) con una incubaciónpreviadelamembranaenbufferacetatodurante5minutos.

Westernblotsobreextractosproteicos

Se sembraronmuestrasproteicasenunSDS–PAGEal15%.Seutilizaron5μg de proteínas totales del extracto proteico de M. corti y un equivalente aextractosdeproteínadeE.coli.Seprocedióarealizalatransferenciaeincubacióndeanticuerpos,utilizandounadilución1/1000delsueroantiEgPCNArproducidoen conejo y una dilución 1/5000 de anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado aperoxidasa de rábano (Sigma – Aldrich, N° catálogo: A6154). Se visualizó lareacciónmediantequimioluminiscencia

IncorporacióndeEDU

ElEDUestaalicuotadoa-20ºCdisueltoenDMSOaunconcentraciónde10mM.

IncorporacióndeEDUMesocestoidesCortiSe cultivaron con EDU. se cultivaron M. corti durante 5 días en medio sintaurocolato.SelavaronconmedioRMPIvariasvecesyseincubaronenplacasde12 pocillos conteniendo 4ml demedio RPMI con 20μM de EDU. se incubaron 3horas y se lavaron con PBS exhaustivamente. Se fijaron O.N. (toda la noche) en4%PFAatemperaturaambienteysedeshidrataronenetanolesdeconcentracióncreciente,sealmacenarona-20Chastasuuso

FijaciónpermeabilizaciónyreveladodeEDUM.cortiSe rehidrataron lasmuestras en etanol de concentracióndecreciente, se lavaroncon PBS 1X por 10 minutos. Se fijaron durante 15 minutos en PFA 4%, seincubaron15minutosenproteasaK20μg/ml,selavaron5minutosenBSA3%enPBSyseincubaron15minutosenPBStx.Selavaron10minutosenPBS15minutosenBSA3%enPBSyserevelócon200μldecoctaildereacción.

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IncorporacióndeEDUFasciolahepática

Suspensionescelulares,cultivoeincubaciónconEDUSe cultivaron fasciolas 3 días en Somule media y se recuperaron las vivas, secambioenmedioyseincubaronO.Ncon20μMdeEDUsinextractodelevaduraen3mldemedio.Serecuperaronlasfasciolas,selavaronenPBSyseresuspendieronen 1mL de PBS. Se tomaron 200μL para cultivar en 6mL de Somule media, sefijaronO.N.enPFA4%enplacadePetri.SelavaronO.N.conaguadelacanilla.Serealizaron las suspensiones celulares mediante el protocolo Tripsina EDTAconcentración

Fijación,permeabilizaciónyreveladodeEDUEl resto se centrifugaron6minutos a 4000RPMy se resuspendieron en 1mLdePFA4%,fijándosedurante15minutosconagitación,secentrifugaron6minutosa4000 RPM y se resuspendieron en PBS – 3% BSA. Se centrifugaron en igualescondicionesy se lavaronsin resuspenderenPBS. Se resuspendieronen20μLdePBS y se depositaron sobre portaobjetos xilanados. Se dejaron secaraproximadamente 20minutos y se incubaron conPBStx durante 20minutos. Selavarondurante5minutosconPBS–BSA3%yseprocedióalreveladocon400μLdecoctaildereacción

MiracidiosLos huevos fueron incubados en Somule media. Se probó diferentesconcentraciones de EDU, 5μM de EDU, 10μM de EDU, 20μM de EDU y 30μM deEDU,añadiendoalmedioCBSS(brindadoporelLic.FedericoFossa).

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ResultadosEstrategiaexperimental

Mc Fh

41

AnálisisBioinformáticos

EstructuraGénicaPCNA

Coneladvenimientodelasnuevastécnicasytecnologíasdesecuenciaciónhoydíaesposible contar con losgenomascompletosparaunagranvariedaddePlatelmintos,tantodevidalibrecomoparásitos.Entreestosúltimosseencuentrandisponibles los genomas completos de nuestros modelos de estudio Fasciolahepatica yMesocestoides corti, información que años atrás no estaba disponiblecuando se comenzó con el desarrollo y puesta a punto de este trabajo. En lasfiguras 13 a,b,c,d es posible visualizar la gran similitud que existe a nivel deestructura génica del gen de PCNApara estos ejemplos tanto de Cestodos comoTrematodos.EstosdatosseríancongruentesconloobtenidoenlosalineamientosparalarealizacióndelaFilogenia(Figura14)dadoelaltoporcentajedeidentidadquepresentananiveldesecuenciaaminoacidica,estobrinda informaciónacercade lo conservado que se encuentra el gen a lo largo de la evolución. Son genespequeñosdemenosde1Kb(900pbaproximadamente)compuestopor5exonesy4intronesloscualespresentanigualdisposiciónytamañosimilar.

Figura13a-EstructuragénicaPCNAFasciolahepática.SemarcaencelestelaCDS(codingsecuence)regiónquecodificaparaeltranscriptodeARNmigualqueenamarillolosexones.Sepuedevisualizarenlaestructuradelgenquepose4intronesrepresentadosenblanco.

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Figura 13b - Estructura génica PCNAMesocestoides corti. Semarca en celeste la CDS (coding secuence)regiónque codificapara el transcriptodeARNm igualqueenamarillo los exones. Sepuedevisualizar en laestructuradelgenquepose4intronesrepresentadosenblanco.

Figura13c -EstructuragénicaPCNASchistosomamansoniSemarcaencelestelaCDS(codingsecuence)región que codifica para el transcripto de ARNm. Se puede visualizar en la estructura del gen que pose 4intronesrepresentadosenblancoyunsitiodesplicingenanaranjado.

Figura 13d - Estructura génica PCNA Echinococus granulosus. Se marca en rojo la CDS (codingsecuence)regiónquecodificaparaeltranscriptodeARN.Sepuedevisualizarenlaestructuradelgenquepose4intrones.

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AnálisisFilogenético En la Figura 15 se puede visualizar como el grupo de trematodos quedajunto,por fuera loscestodos formandouncladodistintoypor fueradeestos losplatelmintos de vida libre. El alineamiento para la elaboración de la filogenia(Figura 14) revela la alta identidad que presentan las secuencias aminoacidicasentre los diferentes organismos como mencionamos anteriormente. Los gruposexternosseleccionadossonDrosophilaMelanogasteryHomoSapiencaenporfueradeloscladosdePlatelmintosysuelecciónsedebióalobiendocumentadoqueseencuentraestegenenlaBibliografíadecadaorganismo

Figura14–AlineamientovisualizadoconBioEditdelasecuenciaAminoacidicadePCNAdediferentesOrganismos.RealziadoconClustalX.Cestodos(Echinococusgranulosus, Mesocestoides corti, Taenia asiática, Hymenolepis microstoma)Trematodos (Fasciola hepática, Schistosoma mansoni, Schistosoma japónica,Opistorchisviverrini),Vidalibre(Dujesiajapónica,Macrostomumlignano)comogrupocontrol se utilizo el gen deDrosophilamelanogaster yHomo spaiens. Se encuentracoloreado para similitudmayor a 85% y sitios identicos por encima de ese valoraparecenrecuadrados.

Figura15-AnálisisfilogenéticodePCNAenplatelmintos.PlatelmintosPárasitos,deVidalibreyotrosorganismoscomogruposexternos.LahistoriaevolutivaseinfiereusandoelmétodoNeighborJoining.Enla figuraseseñalanporclaseytipoquedando agrupados todos los organismos de la clase Cestoda y por fuera los trematodos, aun por fuera de ellos losPlatelimentosdevidalibre.(Valoresnodos)

Trematodos

Cestodos

Vidalibre

Grupoexterno

44

LasproteínasPCNAtantodeTrematodoscomoCestodosformanungrupomonofiléticoqueexcluyegenesdeotrotipodePlatelmientoscomoserlosdeVidalibre(Figura15).Nuestrosresultadossonsimilaresa loobservadoen labasededatos de wormbase.parasite.org (Figura 16), donde es posible observar unadistribución idéntica de los organismos en sus clados, formando así grupomonofileticossegúnlaclasedelosorganismos.

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Figura16-AnálisisfilogenéticodePCNAtomadodellinkdeTreefamenwormbase.parasite.orgMarcargrupos

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PrediccióninformáticadelaestructuratridimensionaldePCNAparadiferentesParásitos

ConeltiempolosavancesenelcampodelaBioinformáticahanpermitidorealizar aproximaciones e inferencias in silico que resultan ser muy útiles almomentodeinterpretarresultados.Estasherramientassonunpotentemotorparaelavanceydesarrollodelosexperimentosyaqueenocasionesesposibleprevery/o encontrar soluciones rápidas a posibles interrogantes, lo que presenta unamejoraencuantoalostiemposdeespera,direccionamientodefondosyesfuerzos.

En este caso el servidor de http://swissmodel.expasy.org/ permitemodelar la estructura tridimensional de proteínas partiendo de la secuenciaaminoacidica. Este modelado lo hace por homología y resulta ser un métodoampliamente utilizado para el modelado de estructuras 3D de proteínas. Laconstrucciónserealizaentrelasecuenciadeaminoácidosbrindadaylaestructuratridimensional experimental de una proteína ya cirstalografiada. Estudios handemostrado que las estructuras proteicas se encuentranmas conservadas entrehomólogos que sus secuencias, aunque secuencias con menos de un 20% deidentidadpuedenpresentarestructurasmuydiferentesChothia,et.al (1986),nosiendoelcasoparaestasproteínaslascualespresentanaltosgradosdeidentidadensusecuenciaaminoacidica.

Figura17-EstructuratridimensionaldePCNA.ModeladoporhomologíadePCNAdea:M.corti,b:H.Microstoma,c:F.hepática,d:E.granulosus.,eyf:S.Mansoni1y2respectivamente.Obtenidodehttp://swissmodel.expasy.org

PCNAM.corti PCNAH.microstoma PCNAF.hepatica

PCNAS.Mansoni1PCNAE.granulosus PCNAS.Mansoni2

a b c

d e f

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En la figura 17 es posible observar la similitud a nivel de estructura que

presentan losmodelos de las diferentes proteínas. En el caso deS.Mansoni yE.Granulosus si bien no se observa el trímero se modelaron los monómeros loscuales presentan características similares que sus homólogos en los demásorganismos. Estos resultados informáticos resultan de gran interés y justifican de losensayos de esta tesis ya que si bien años atrás no se contaba con todo estedesarrollobioinformático, losdatosdisponiblesmostrabanloconservadodeestaproteína lo cual seria esencial para el diseño y producción de un anticuerpopoliclonalproducidoapartirdeunaproteínaPCNArecombinantedeEchinococusgranulosusyutilizadoennuestrosmodelosdeestudioF.hepáticayM.cortiparalosensayosdeinmunolocalizaciónpresentadosenlospróximoscapítulos.

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ProduccióndelaproteínaPCNAenformarecombinante

Como antecedente en trabajos anteriores (tesis grado German Caurla)(citar), se intentó producir la proteína recombinante PCNA de Echinococusgranulosus(EgPCNAr)enunsistemadeexpresiónprocariotaconocidoyutilizadonuestro laboratorio en ensayos similares, el vector pET14b y la cepa de E. coliBL21 Star (Invitrogen). La elección de trabajar con la secuencia de EgPCNA sedebióaquecontábamosconlimitadainformacióndetalladaenlasbasesdedatospara nuestros modelos de estudio mientras que el genoma de Echinococusgranulosusseencontrabadisponibleenlaweb.DeestamanerafueposiblerealizarunjuegodecebadoresparapoderamplificarelgendePCNAdeE.granulosus.SelogroobtenerlasecuenciadeEgPCNAparcialmentecompleta,aisladayclonadaenel vector de clonación PGem-T. Una vez que se cambio el vector (al Pet-14b) setransformaronlascepasBL21Staryrealizadoslosensayosdeexpresiónseobtuvolaproteínaenformainsoluble.LoqueimposibilitabaapriorilaproduccióndeunantisueroenconejocontralaproteínarecombinanteEgPCNA.

Dentrodelmarcodeltrabajodemaestríaestofuecorregidoconlaadición

de los primeros 5 AA (los cuales eran los únicos faltantes en el diseño de laproducción de EgPCNAr) que resultarían ser esenciales para el correctoplegamientodelaproteínaenformasoluble,enlaFigura14sepuedenvisualizaresoscincoprimerosAA (MFEAR)que tuvieronqueserañadidosa la secuenciapara la producción de la proteína recombinante en forma soluble. Si bien laincorporacióndeestosAAnogarantizabasusolubilidadlosresultadosexpuestosacontinuaciónconfirmaronqueresultaríandesumaimportancia.

Expresióndelaproteínarecombinante

La expresión de la proteína recombinante EgPCNA fue llevada a cabo encepasdeE.coliBl21DE3(star),elgenfueclonadoenelvectorPet14belcualfuedigeridoconenzimasderestricción(PstIyBamH1paraesteestudio)quepermiteque la secuenciaquedeen fasey evitarproblemasde corrimientodemarcoquepuedandesplazarelsentidode“lectura”almomentodelatraducción.Elclonadoen este vector permite incorporar a la proteína una cola de histidinas en elextremoC-terminalparaluegopoderpurificarlaporcolumnadeafinidad.

Laexpresiónse indujoadiferentestemperaturas30°Cy37°C(Figura18.)Lasmuestrasasembrarencadacarrildelgelfueronestandarizadasconelfindecargar la misma cantidad de proteína total por carril y así poder tener datoscomparables.

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En la figura18sepuedeobservarunabandadel tamañoesperado30KDa

presenteen loscarrilescorrespondientesalvectorconel inserto(Pet/PCNA),no

siendo así para el caso del vector solo (Pet). Esto indicaria que la proteina se

expresaenestascondiciones.Unavezdefinidalatemperaturade37ºCseprocedio

averificarlasolubilidaddedichaproteina.

SolubilidadPCNA

Figura 18 - Expresion EgPCNAr. Gel de Poliactrilamida del 15%.Vector sin inserto (Pet), vector con inserto Pet/PCNA GelPoliacrilamida15%.,carriles1,Pet/PCNA1hr30°C,2Pet1hr30°C,3.Pet/PCNA2hr30°C,4Pet2hr30°C,6Pet/PCNA1hr37°C,7Pet1hr37°C , 8. Pet/PCNA2hr37°C, 9Pet 2hr37°C . 10:Marcadordepesomolecular.SeseñalaconflechaeltamañoesperadoparaPCNA

PCNA

Pet/PCNA +-+- +-+-

30ºC1hr/2hrs

37ºC1hr/2hrs MWM

46kDa 30kDa 25kDa 17kDa 7kDa

Figura19-ExpressionPCNASoluble(Sol)vsinsoluble(Insol)SDS-PAGEal15%enBufferTris–Glicina, teñidoconCoomassieBlue.Carriles1.Pet/PCNASol2.Pet/PCNAInsol3.Pet/PCNASol4.Pet/PCNAInsol5MPM.SeseñalaPCNAconeltamañoesperado

PCNA

FracciónSoluble(S)FracciónInsoluble(I)

SISI12345

58kDa 46kDa 30kDa 25kDa 17kDa

50

Para la determinación de la solubilidad de la proteína recombinante, serealizóunfraccionamientosubcelulardondeseanalizólapresenciadelaproteínarecombinanteenlafracciónsolubleoenlafraccióninsoluble.DelresultadodelaFigura19esposibleconcluirqueEgPCNArfueexpresadayvisualizadaenfracciónSoluble.Estosresultadosnospermitieronexpresarlaenmayorescantidadesparaluegoprocederapurificarla.

PurificaciónEgPCNArFPLC(FastProteinLiquidChromatography) LapurificacióndeEgPCNArserealizoporcromatografíadeafinidadconelAKTA prime plus de General Electric. La proteína se encuentra fusionada a unacola poli Histidina en el extremo C- Terminal lo que permite su purificaciónmediante el uso de la resina Thermo Scientific HisPur Ni-NTA(Níquel-IMAC)donde los iones divalentes de Niquel (Ni2+) quedan unidos a la resina, y lasproteínas con las colas de histidina quedan retenidas en la misma. por lo queesperamosquelaproteínaEgPCNArseunaparasuposteriorelución.Paraeluirlaseutilizoungradienteenascensodebufferdeelución(líneaamarillafigura20)

EnlaFigura20sepuedeobservarunpicoquecorrespondeaEgPCNArunavez obtenidas estas fracciones fueron visualizadas en un gel de poliacrilamida(Figura21)paraconfirmarlapresenciadeunaúnicaproteínaenelpicoyevaluarsumigraciónamododeestimarsutamaño.

Figura 20 - Grafica de elución del AKTA prime plus GE; en amarillo el aumento en laconcentracióndebufferdeeluciónyenAzullacurvadeelucióndeproteínaenlacolumnadeafinidad

51

ComosepuedeobservarenlaFigura21paraloscarrilescorrespondidasal

picodeeluciónseobservaunabandapredominantesibienenlaprimerascolectasaparecenotras entidadeso fraccionesproteicasnibiennos acercamosalpico lamuestrasevuelvemaspurayconeltamañoesperadoparaPCNA

ConfirmaciónEgPCNArmedianteWesternBlotUnavezpurificadalaproteínaseprocedióalarealizacióndeunensayode

WsternBlot(Figura22)conelobjetivodeconfirmarefectivamentelaidentidaddeesaproteína comoEgPCNArconel anticuerpomonoclonalPC10.ComosepuedeobservarclaramenteEgPCNAresreconocidaporelanticuerpoMonoclonalPC10elcualcomoyamencionamos(Antecedentesdelgrupodetrabajo)reconocePCNA.Sibienexistenotrasbandasreconociendootrasentidadesproteicasparalafraccióncolectadaenelpicodelacurvadepurificaciónelreconocimientoendichafracciónesúnico.

Parte de estas otras bandas observadas pueden deberse a productos dedegradación de la proteína recombinante y/o productos proteicos propio delsistemadeexpresión(E.coli)queseadhierenalacolumnainespecíficamente.

Figura21-FraccioneseluidasAKTAPrimeplus.SDS-PAGEal15%enBufferTris–Glicina,teñidoconCoomassieBlue.Seobservalasfraccionescolectadas del AKTA Prime plus y control PCNA soluble. Carriles 2 – 7Fracciones16–21respectivamente;carril1:12Pet/PCNA:8:MPM

PCNA

Pet/PCNA

AKTAPRIMEPLUS

12345678

30kDa

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LogramosobtenerlaproteínaPCNAdeformarecombinante.Estaproteína

seusaráparainmunizarconejosydeestamaneraobtenerunanticuerpoquenospermitirá seguir profundizando en el posible rol de la PCNA durante el ciclo devidadelosparásitos.

DeteccióndePCNAenextractosproteicosdeM.cortiyF.hepáticaUna vez obtenido el suero antiEgPCNArseutilizoparadetectarPCNAen

extractostotalesproteicosdeM.cortiyF.hepática.ComoseobservaenlaFigura23 es que existe un reconocimiento por parte del Antisuero en las fraccionescorrespondientesalosParásitos.

Figura 23 - Detección de PCNA en extractos proteicos de M. corti y F. hepática. Carril 1 MWM, carril 2 extracto de F. hepática, carriles 3 y 4 extracto de E.coli PET/EgPCNA carril 5 extracto de M. corti

12345

PCNA

Figura 22 - Detección de EgPCNAr purificada por western blot. Carril 1 MWM. carril 2, 3,4 fracción 19, 20, 21 respectivamente. Carril 5. expresión E.coli Bl21

12345

PCNA

46kDa 30kDa 25kDa 17kDa 7kDa

53

Ensayosdehibridacióninsitu

ExpresiónespacialdelARNdePCNAenMesocestoidescorti

ComoprimeraaproximaciónalestudiodelaexpresióndelgenPCNAdeM.corti, se confirmómediantePCRapartir de cDNA la transcripcióndel genPCNAutilizandocebadoresdegenerados.SeobtuvieronfragmentosdeamplificaciónporPCRconuntamañosimilaralesperado(alrededorde600p.b.)partiendodeADNc.Los fragmentosobtenidos fueron clonados en el vectorde clonaciónPGem -T ysecuenciados,confirmandoquecorrespondieranalgenPCNAunavezcomparadosyalineadoscongenomasconocidosenlabasededatos(ObtenidodetesisdegradoGermanCaurla)

El análisis de la expresión espacial del ARNm se realizo mediantehibridacionessobrecriocortesysobreorganismosenterosdediversosejemplares,paralocualseutilizounasondaantisentidocomplementariaaladeltranscripto.

Figura24-HibridaciónintotoconsondaantisentidodelgenMcpcna.ReveladoconNBT-BCIP.a.Imagenlongitudinaldeunejemplar,enunestadiotempranodeldesarrollo,semuestralazonadelescolexycuello.C,d.Ampliacióndeunaregióndea.Abreviaciones(v)ventosas,(cu)cuello,(pm)parenquimamedular(t)tegumento).e.InmunodeteccióndeBrdUentetratiridiosinducidoscontaurocolatodesodiotrasundepulsode24horasconBrdU.Microscopíaconfocaldefluorescencia.VistageneraldetetratiridioinducidoaúnnosegmentadodondeseobservaelgradienteanteroposteriordecélulasproliferativasobtenidoporKoziol,2009)Lasbarrasrepresentan50μm,exceptoenAquerepresenta100μm.

c d

cu

pm

v cuPm

v

cupm

pm

a b

e

t

t

tt

54

EnlaFigura24seobservaclaramentelaexpresiónpreferencialdeMcPCNAencélulasdelaregióninternaenelparenquimamedulardejandoenevidencialaausenciadelasmismasenlaregiontegumental.Nosedetectanabundatescelulaspositivas para PCNA en la zona del escolex. En cambio en la zona del cuello laacumulaciónesrepresentativamentemayorlocualconcuerdaconelhechodequeenesa regióncomenzara la segmentaciónyporendehabramayorproliferación.Resultadossimilaressepuedenobservarcomomuestra la (Figura24e)para lascélulas proliferantes marcadas con BrdU U. Koziol, a su vez estos resultadosconcuerdanconloobtenidoen(Espinozaetal.,2007)laformacióndeungradienteanteroposteriordecélulas.

Al cambiar la técnicade revelado, realizandoel revelado conAEC (Amino

etil Carbazol) es posible observar una distribución similar en organismos nodesarrolladosaunperoconunmayorgradodecrecimientoquelosmostradosenla Figura 25 donde la tinción se concentra en el parénquimamedular interno, ymayor abundancia en cuello y escólex. Resultados similares a los quepresentaremos en los ensayos de Inmunodetección. Con lo que podríamoscomenzarainferirestetipodedistribucióndecélulaspositivasparaPCNAyaqueambastécnicassitúan lasmarcasen lasmismasregiones,resultadossimilaresseobservanen célulasproliferantes enSmithyMcKerr, 2000 sibien todavíanoesposiblerealizaresacorrelación.

Figura25-HibridaciónintotoconsondaantisentidodelgenMcPCNAReveladoAEC(Aminoetil carbazol).Corte longitudinaldeunejemplar,con7díasdedesarrollo.a:Regionanterior.b:Zonaposteriordeotro ejemplardelmismoensayo.Abreviaciones(v) ventosas, (cu)cuello, (pm)parenquimamedular.Lasbarrasrepresentan100μm

a b

v

pmcu

55

Hibridaciónsobreorganismosenteroscomenzandoelprocesodesegmentación.

EnbasealosresultadosobtenidosenlosprimerosensayosenTetratiridiosseanalizoelpatrónquepresentanlascélulaspositivasparaPCNAaniveldeARNmensajeroenorganismosmasdesarrollados.

Los resultadosde los estudiosde localizacióndelARNmdel genPCNAen

ejemplares iniciando el proceso de segmentación (Figura 26) muestran unaexpresiónpreferencial(evidenciadaporunamayorintensidaddeseñal)encélulasdistribuidas enelparénquimamedularpróximasa loshacesmusculares al igualque Espinoza et. al 2007. Los sitios demayor expresión son las regiones dondedaránlugarlosprimordiosgenitalesencadasegmento.Parapodersacarmejores

Figura 26 - Hibridación intotocon sonda anti sentidodel genMcPCNA.ReveladoAEC(Aminoetilcarbazol).Vista longitudinaldeunejemplar, con 9 días de desarrollo iniciando la segmentación del cuerpo a: Regionmedia y escolex. B: aumento de la zona del Cuello delorganismodelaimagéncyd:controlessondassentido.Abreviaciones(v)ventosas,(cu)cuello.Labarrarepresentan100μme:Análisisauto-radiográficode la incorporaciónde 3H-Tpor ejemplaresdeM.cortitrasdiferentes tiempos tras la inducciónde la segmentación. Labarrarepresenta100µm.Exceptofigurad30µm.TomadodeEspinozaetal.,2007

c d

e

a b

v

v

vcu

Control(-) Control(–)c d

56

conclusiones de la expresión del ARNm en estas regiones serían necesariosexperimentosdedoblemarcadomedianteinmunodeteccióndePCNAehibridaciónin situ, esto confirmaría la colocalización de ARN y proteína para confirmar laidentidadyubicaciónespacialclaradelapoblacióndecélulasproliferantes.

57

ExpresiónespacialdelARNdePCNAenFasciolahepática

HibridaciónsobrecorteshistológicosF.hepática

AligualqueenlosestudiossobrecorteshistológicosdeM.cortielrevaeladoparaF.hepáticasellevoacaboconAEC(AminoetilCarbazol),nofueutilizadoNBT–BCIPdebido a la alta actividadFosfatasa alcalinaquepresentan losAdultos. SeutilizoAECel cual utiliaza la enzimaPeroxidadsa y todos los organismos fuerontratadosparainnibirlaactividadPeroxidasaendogena.

LosadultosfueronincubadosconsondaantisentidoparaPCNAyrevelados.EnlaFigura28seobservaclaramentelamarcaencélulasdelaregióndeglandulasvitelogenas al igual que lo observado en estudios de inmunolocalizaciónpresentadosenelpróximocapitulodejandoenevidencialaausenciadelasmismasenlaregiondeltegumento,noesposibledescartaraunquenoexistaalgunazonateñidapertenecientealaparatoreproductorespecialmentelostesticulosquecomosemencionoseencuentranaltamenteramificadosa lo largode losdosprimerosterciosdelorganismo.En los controles realizados conuna sonda sentidoparaelgenPCNAsepuedevertincionaniveldelasglandulasvitelogenastambiénlocuales comun para todos los preparados. Para lograr evitar esta tinción seríaconvenienterealziar losreveladosconalgunmarcadorantidig (vermaterialesymetodos) conjugado a un fluoroforo. De la misma manera es posible observartambiénunaseñalinespecificaaniveldeltegumento.

58

Figura28-HibridacióninsitusobrecriocortedeF.hepáticaconsondaantisentidodelgen FhPCNA Revelado AEC. Corte longitudinal de un ejemplar Adulto zona media.Abreviaciones(T)tegumento,(I)Intestino.Labarrarepresenta50μm

Control–sondasense

tt

t

t

i

i

i

i

59

LocalizaciónespacialdelaproteínaPCNAmedianteinmunohistoquímicaconanticuerposanti-EgPCNA.

Basándonos en la hipótesis de que PCNA es un posible marcador molecular

especifico de células proliferantes buscamos la localización espacial y temporal deestasusandounanticuerpopoliclonal el cual fueobtenidousandocomoantígeno laproteína recombinante EgPCNAr obtenida al principio de este trabajo. Habiendoexpresado la proteína en forma soluble exitosamente y producido un anticuerpo enconejo, seprocedióa realizar losensayosde inmunodetección.Esperandoencontrarresultados concluyentes acerca de la localización de células positivas para PCNA ypoder realizar futuras inferencias acerca de la localización de células proliferativas.ParalosreveladosdePCNAseutilizounanticuerpoanti–Igdeconejoconjugadosafluorocromos(AlexaFluor594).

Se utilizo Faloidina para teñir actina en los revelados fluorescentes que nospermite teñir actina y así lograr una mejor resolución a nivel de estructura en elorganismo. Se realizaron los ensayos en Adultos de F. hepática obtenidos delfrigorífico (FrigoríficoCarrasco) ymantenidos enbilis por4horashasta su fijación,inclusiónenParafinauOCTparacriocortesyposteriorcorte.

InmunolocalizacióndePCNAenM.corti

ComoprimeraaproximaciónalainmunolocalizacióndePCNAserealizoelreveladoconNBT–BCIP.EnlaFigura29esposibleobservarlosresultadosdeladistribuciónespacialdecélulaspositivasparaPCNAenunorganismocomenzandoa desarrollarse aunque no segmentado aun. La tinción semantiene constante ycongruentealovistoenlosensayosdeHibridaciónintoto/insitu.

Amedidaqueelorganismocomienzaadesarrollarselapresenciadecélulasproliferantescomienzaaacumularseen lazonadelcuelloyescólex.parénquimamedular interno tal como ha sido demostrado en los resultados publicados porUrielKoziol2010yloyavistoenlaFigura25enlosensayosdeHibridacióninsitu.

60

InmunolocalizacióndePCNAenM.corti,reveladofluorescente LosensayosdeinmunodetecciónfluorescenteenM.cortisellevaronacaboen organismos con 7 días de desarrollo donde se espera que la segmentacióncomience a ser evidente en cultivo con taurocolato de sodio. Debido a que eldesarrolloesasincrónicoesposibleencontraren lamismapoblacióndiferenciasde crecimiento donde la segmentación pueda ser menos evidente, si bien losejemplaresyacomienzanatenerunaformamasalargadaconcuelloyescólexbiendefinidos. Tal como se vio en los resultados de Hibridación sobre organismosenteros donde la expresión preferencial de PCNA se da en células de la regióninterna en el parenquima medular y próximas a las fibras musculares. Losresultadosde Inmunomarcadomuestranqueamedidaque sedesarrollay crecesegúnloobservadoenlafiguras30y31lamarcaesclaraaniveldelparenquimainterno y sub-tegumentaría. Si bien a nivel del tegunemento aparece una señalinespecificayaobservadaenotrastecnicasyreveladostantoconM.corticomoF.hepatica(Figura28)

Figura29-InmunolocalizacióndePCNAintotodeM.corti.ImágenesCamaraDino-EyePremierAM4023Xsección medio - anterior del organismo. Revelado con NBT - BCIP La barra corresponde a 100 μmAbreviacionesv(ventosas),t(tegumento)pm(parénquimamedular)

v v

t

pm

61

Figura30 - InmunolocalizacióndePCNA sobreCriocortesdeM.corti.Corte longitudinalde7μmdeespesor40X.ImágenesMicroscopioinvertidoOlympusIX2secciónmedio-posteriora:DetecciónPCNA/AlexaFluor594b:TinciónconDAPIAzul.c:FaloidinaVerde,d:MergeDAPI–PCNA;e:MergePCNA–DAPI–FaloidinaLabarracorrespondea25μmAbreviacionest(tegumento)fm(fibrasmusculares)

Labarracorrespondea25μm

a b

d d

t

t

t t

fm

PCNA

FALOIDINA

DAPI

MERGE

Figura31-InmunolocalizacióndePCNAsobrecriocortesdeM.corti,cortelongitudinalde7μmdeespesor40X.ImágenesMicroscopioinvertidoOlympusIX2secciónmedio-posteriora:DetecciónPCNA/AlexaFluor594b:TinciónconDAPIAzul.c:AnticuerpoantiFaloidinaVerde,d:MergeDAPI–PCNAFaloidina.Labarracorrespondea100μm

a b c da

t t tt

PCNA FALOIDINA DAPI MERGE

62

LosresultadosmostradosdelasFiguras32y33presentansimilitudconlodescritoparacélulasqueincorporanBrdUenKoziol2010.(mostrarproliferación

Figura32-InmunolocalizacióndePCNAsobreCriocortesdeM.corti,cortelongitudinalde7μmdeespesor40X.ImágenesMicroscopioinvertidoOlympusIX2secciónmedio-posteriora:DetecciónPCNA/Alexa Fluor 594b:Tinción conDAPIAzul.c:Anti cuerpoanti FaloidinaVerde,d:MergeDAPI–PCNA-FaloidinaAbreviacionesv (ventosas)Labarracorrespondea100μm

a ba

c d

v v

v v

PCNA FALOIDINA

DAPI MERGE

b

a ca

de

Figura33-InmunolocalizacióndePCNAsobrecriocortesdeM.corti,cortelongitudinalde7μmdeespesor40X.ImágenesMicroscopio invertidoOlympus IX2 secciónmedio - posterior a: Detección PCNA /Alexa Fluor 594 b:TinciónconDAPIAzul.c:AnticuerpoantiFaloidinaVerde,d:MergeDAPI–PCNA–Faloidina.Labarracorrespondea100μm

vv v v

PCNA DAPIFALOIDINA MERGEb

63

enlazonadelescólex)AlalcanzarunmayorgradodedesarrolloenM.corti,existeunincrementodecélulasenelescólexyelcuello,seguidoporunnúmeromenorde células en la región inmediatamente posterior al cuello. Esto es esperable yaque enmuchos cestodos el cuello es la región donde se comienza a generar losnuevossegmentosporendeunazonademayorproliferaciónesperada.

Los resultadosmuestran células positivas para PCNA que comienza a sermasevidenteenelescólexFigura33asítambiénpróximasalasfibrasmusculareslongitudinalesqueseprolonganpordelantedelasventosas.

EnlaFigura34nuevamenteseobservaunadistribuciónparenquimaparalascélulaspositivasparaPCNAconunaaparenteacumulaciónenlazonadel(característicasde)aparatoexcretor,dondeseencuentranlosporosexcretoresaccesoriostraslareproducciónasexual.

DAPI tiramida Merge

Control

PCNA

Tropom

iosina

Figura34-InmunolocalizacióndePCNAsobreCriocortesdeM.corti,cortetranversalde10μmdeespesor.ImágenesMicroscopio invertido Olympus IX2 secciónmedio – posterior. Detección PCNA, Tiramida y Tropomiosina La barracorrespondea50μm

64

InmunolocalizacióndePCNAenFasciolahepática

InmunolocalizacióndePCNAenFasciolahepática,reveladofluorescente

En la Figura 35 podemos observar con claridad células positivas para el

anticuerpo contra PCNA en la zona subtegumentaria y de glándulas vitelógenasestas ultimas se encuentran distribuidas en forma de racimos localizados en lascaraslateralesdelcuerpo.Dedichasglándulassedesprendencélulasvitelógenas,llenasdecorpúsculosdeviteloqueviajanporlostuboscolectoresqueconducenaconductos vitelinos transversales para juntarse y formar lo que es el conductovitelinoprincipalyluegodesembocarenelootipo,queesdondesesintetizanlosmaterialesqueformaránalhuevo.

Deestosresultadosnoesposibleafirmaraunqueexistatincióndecélulaspertenecientesalaparatoreproductorqueesteseencuentraaltamentedistribuidoy ramificado para el caso de los testículos en los dos tercios anteriores delorganismo.

EnlaFigura36apartedelaseñalparaPCNAenelcanalrojosepuedeverruido de fondo producto de la autofluorescencia de los portaobjetos, si bien latinción dentro del organismo es clara y diferencial. La detección de célulaspositivasparaPCNAenlazonamediaesnotable.Esdeesperartambiénenestosresultados que parte de la marcación se encuentre compartida con regionescomprendida por los testículos, muy ramificados a lo largo del Adulto, aunqueestosdatosaligualquelosanalizadosparalashibridacionesinsitusobrecortesdeFasciola hepática no serian concluyentes acerca de la localización especifica decélulasproliferantes,sievidenciandoelmarcadodecélulaspositivasparaPCNAlocualmarcaelcamino

65

Figura 35 - InmunolocalizacióndePCNAen Adultosde Fh, corte longitudinal de7μm deespesor. ImágenesMicroscopio invertidoOlympus IX2regiónmedio–anterior.Lasflechasseñalaloscortestransversalesdel tubodigestivo.a:DetecciónPCNA/AlexaFluor594b:TinciónconDAPIAzul.c:Anticuerpoanti FaloidinaVerde,d:MergeDAPI–PCNAe:MergeDAPI-PCNA–Faloidina.f:ControlnegativosinEDU.Abreviaciones(T)Tegumento.Labarracorrespondea25μm

ba

c d

e

TT

TT

T

PCNA DAPI

FALOIDINADAPI-PCNA

DAPI-PCNA-FALOIDINA CONTROL(-)

ef

66

a b

c d

Figura 36 - Inmunolocalizaciónde PCNAen Adultos deF. hepática, corte longitudinalde7μmdeespesor.ImágenesMicroscopioinvertidoOlympusIX2secciónmedio-posteriora:DetecciónPCNA/AlexaFluor594b:Tinción con DAPI Azul. c: Anti cuerpo anti Faloidina Verde, d: Merge DAPI - PCNA – Faloidina, e: Controlnegativo sin primario. La barra corresponde a 25μm Abrevación T (Tegumento) V (Ventosa), las felchasseñalanloscortestrasversalesdelintestino

TT

TT

PCNA DAPI

FALOIDINA MERGE

e

T

CONTROL(-)

67

De estos resultados no es posible concluir que existiría un proceso de“proliferacióncelular”(célulaspositivasparapcna)desarrolladoenlazonadelasglándulasvitelogenas.SibienlosresultadosobtenidosconcuerdanconlovistoenensayosdeHibridacionesconsondasdeARNantisentidoparaPCNAenlaFigura28ylabibliografía(Robinsson,2001)yloobtenidoenCollinsetal.(2013)paraladistribución de celulas proliferantes donde visualizaron marca positiva paracélulasvitelogenas.

c1 d1

Figura 37 - Inmunolocalización de PCNA en Adultos de Fh, corte longitudinal de7μm deespesor 40X. ImágenesMicroscopioinvertidoOlympusIX2secciónmedio-posteriora:DetecciónPCNA/AlexaFluor594b:TinciónconDAPIAzul.c:AnticuerpoantiFaloidinaVerde,d:MergeDAPI-PCNA-FaloidinaLabarracorrespondea5μm(Abrebiaciones)

tt t

ta b c d

a1 b1

v v v v

68

InmunolocalizacióndePCNAenFasciolahepática

Talcomolovistoparalosresultadosdeinmunodetecciónconfluorescenciareciéndescritosylosresultadosparahibridacionesinsitudelcapituloanteriorlasmarcas se hacen predominantes en las regiones de glándulas vitelogenas. Estosresultadosllevaríanaunaprimeraaproximaciónalalocalizacióny/odistribuciónasí como también a lamorfologíade las células positivasparaPCNAyaque contécnicas distintas se visualizo lo mismo. En la detección con fluoroforos quedademostrado que no existiría marcado inespecífico por actividad de la enzimaPeroxidasa endógena como se podría esperar del organismo en el revelado conAEC si bien como mencionamos anteriormente se realiza una inactividad de laenzimaprevioalensayo.

i

Control-

Figura38-InmunolocalizacióndePCNAenAdultosdeF.hepatica,cortelongitudinalde10μmdeespesor.ImágenesCamaraDino-EyePremierAM4023Xsecciónmediodelorganismo.DetecciónPCNAconanticuerposecundarioconjugadoaPeroxidasa.Labarracorrespondea10μmAbreviacionesI(intestino)T(Tegumento)

i

i

i

T

T

T

T

69

DeteccióndecélulasendiferentesestadiosabordablesdedesarrollodeF.hepáticayM.cortitrasincorporacióndeEdu

LadeteccióndecélulasentrandoenlafaseSdelciclocelularsedeterminómediante la incorporacióndeEdu (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) ensayoanálogoalde5-bromo-2´-deoxiuridina(BrdU)queesincorporadoalADNdurantesusíntesis.Estos estudios se llevaron a cabo tanto en adultos de F. hepática, suspensionescelulares,MiracidiosyEsporocitos.

BasándonosenqueenM.corti yahabíamos realizadoestudiospreviosdeincorporación de BrdU para localizar las células proliferantes, (Smith y McKerr(2000).Serealizaronestudiostraspulsosde2,4y8horasdeduraciónconEduendiferentes etapas del desarrollo de F. hepática. La elección del tiempo deincubación se decidió plantear así debido en primer lugar a la viabilidad de losorganismos y por otro lado comparando con los cestodos donde la duracióndelciclocelularesde24horas(WikgrenyGustafsson,1967;BollayRoberts,1971),seesperaenestosplazosqueunaporcióndelapoblacióndecélulasproliferantesqueincorporanEDUquedemarcada.

DeteccióndelaincorporacióndeEduenF.hepártica

DeteccióndelaincorporacióndeEduensuspensionescelularesdeAdultosdeFasciolahepática

LaincorporacióndeEDUserealizóenadultosincubadosconEDUloscualesfueronsometidosposteriormentealprotocoloTripsina–EDTAamododeobteneruna suspensión celular de adultos de F. Hepática. La decisión de realizar esteensayo fue debido a que por mas de los numerosos intentos por lograr laincorporación de EDU en adultos enteros no era posible la detección de ningúnáreamarcada luegode la fijaciónyposterior inclusión, (imágenesnomostradas)sinembargoenestudiosanterioresseobservomedianteextraccióndeADNydotqueIncorporabanBrdU.Estopuededebersealoimpermeabledeltegumentooporaccióndelaparatodigestivo.Inclusoseproboseccionarendosunadultoconelfindevisualizarunaregióndecélulasproliferantesenlazonadelcorteperosinéxitoalguno siendo que en esa área la zona se encontraba desprovista de tegumento(imágenesnomostradas).

Debido a esto se decidió realizar suspensiones celulares luegode incubarlosAdultosdeF.hepáticaconEDU.

En la Figura 39 se muestra una población celular la cual incorpora EDUexitosamente y según la morfología descrita para este tipo de células (los

70

neoblastos) se puede visualizar que presentarían cierta característica similarencuantoalpequeño tamaño,alta relaciónnúcleo/citoplasmática, según lodescritoporKoziol2010,Shibata,N.2010.

Figura 39 - Detección de Edu Suspensiones celulares de Adultos de F. hepática incubados O.N.Microscopíaconfocaldefluorescenciaayd:DAPI.bye:EDU,cyf:Merge.Labarracorrespondea5μm

DAPI

DAPI

EDU

EDU

MERGE

MERGE

a

d

b

e

c

f

71

IncorporacióndeEDUenhuevosFasciolahepática Loshuevosmidende130a150micrasde longitudpor60a90micrasdeancho; tienen opérculo y la cubierta formada por proliferol y proteínas. Lamaduraciónseefectúaenalos9a15díasatemperaturade22a25ºCconloqueestospuedensermantenidosenfríoyprotegidosdela luzsinquemaduren.Sonaltamente herméticos lo cual dificulta en varias ocasiones su estudio ya que nopuedenseranalizadosensuinteriorsinmodificardrásticamentesumorfología.En la figura40sepuedevisualizarclaramente loantesmencionadoyaqueen laimagen a y las demás de la primer fila el huevo se encuentra con el opérculoabierto es decir que ya no esta sellado completamente y es así que se puedeapreciar tanto la entrada de EDU como DAPI y la tinción de algunas células detejidosdelmiracidio.Lafigura40iylasdemásdelafilasemuestraunescenariodistinto donde es posible apreciar la presencia de dos huevos, uno vacío(izquierda)yotroconteniendolalarvadentro(derecha)yelopérculocerrado,enlasFigura40j,k,lsevenfantasmasdeloshuevosquenoincorporanEDUoDAPI

a

da

Figura40-DeteccióndeEduenhuevosdeFasciolahepáticaMicroscopíaconfocaldefluorescenciaa,e,i:Imagendecampoclaro.b,f, j:DAPI.c,g,k .EDU.d,h,i:MergeEDUDAPI.SeseñalaelmiracidiodentrodelhuevoLasbarrasrepresentan50μm

b

g ha

EDU

DAPI

DAPI EDU

MERGE

c MERGE

fe

da

i j k l DAPI EDU

MERGE

72

IncorporacióndeEDUenMiracidios

Elmiracidio es una larva ciliada que eclosiona tras lamaduración de loshuevos, abriendoelopérculoy liberadosalmedio.Estas larvadebeencontraralhospederoprimario (uncaracolpulmonadode la familiaLymnaeidae)enunas8horasaproximadamente.Enlosprimerosresultados(nomostrados)analizandolaincorporación de EDU en miracidios no mostraron incorporación alguna(imágenesnomostradas),estosepodríadebera la faltadeproliferacióncelular.Una posible explicación a lo observado es que el miracidio desde que eclosinadebidoalacortaviabilidadquetienenodestinarecursosalaproliferaciónysialmovimientoymetabolismoenergético.

Pararesolvereseproblemaoptamosporsimularelmediodel interiordel

caracoldondeelmiracidiocomienzaadesarrollarseredondeándoseparaformarelesporocisto, estadio siguiente en la evolución del ciclo. En la Figura 41 quedacomprobado que la actividad celular de los miracidios cambio completamentecomenzando a aparecer poblaciones celulares que proliferan.Dichas células queincorporan EDU se encuentran distribuidas a lo largo de todo el organismo quecambiacompletamentesumorfología.a

c d

Figura41- DeteccióndeEduenMiracidios.Microscopíaconfocaldefluorescenciaa,e,i:Imagendecampoclaro.b,f,j:DAPI.c,g,k:EDU.d,h,l:MergeEDUDAPI.LaflechaseálalamanchaocularLasbarrasrepresentan50μm

e

i

b

f

j

c

g

k

d

h

l

DAPI

DAPI

DAPI

EDU

EDU

EDU

MERGE

MERGE

MERGE

73

IncorporacióndeEDUenEsporocitos Los esporocistos son el estadio siguiente al miracidio. en el desarrollo,estado el cual dará lugar a las redias con el trascurso de las semanas en elhospedero y posteriormente las cercarías que abandonan el caracol y nadanlibremente hasta enquistarse y seguir con el ciclo. La sobrevidas tanto deMiracidioscomodeEsporociosenmedioconEDUsevedificultadayaqueelEDUes disuelto en DMSO (Dimetilsulfoxido) el cual es altamente nocivo para losorganismos y varios ensayos a diferentes concentraciones de EDU fueronrealizados

LaincorporacióndeEDUenesporocistosFigura42esclaraaligualqueloobservado en los miracidios, es posible apreciar una intensa señal a nivel decélulas proliferativas las cuales acompasan con el proceso el cual estadesarrollandoelorganismo(descritoenlaintroducción)

a

c d

Figura 42 - Detección de Edu en Esporocistos. Microscopía confocal de fluorescenciaa, e, i: Imagendecampoclaro.b,f,j:DAPI.c,g,k:EDU.d,h,l:MergeEDUDAPI.Lasbarrasrepresentan50μm

EDU

MERGE

e

i

b

f

j

c

g

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d

h

l

DAPI

DAPI

DAPI

EDU

EDU

EDU

MERGE

MERGE

MERGE

74

IncorporacióndeEduM.corti Para los ensayos de detección de la incorporación de EDU enM.Corti seutilizaroncultivosdeM.corticon5díasdedesarrolloyseincubaronconEDUpor3horasparaluegoserfijadosyrevelados.EsposibleladeteccióndeincorporacióndeEDUaniveldelesoclexycuello tal como loobservadoen losdemásensayos.También se observo un grupo celular que incorporo EDU exitosamente y seencuentraenlaregióndelparénquimamedularinternotalcomoseobservoenlosresultadosobtenidosporKoziol2010.

Figura44- DeteccióndeEduM.cortiMicroscopíaconfocaldefluorescenciaayd:DAPI,bye:EDUcyf:Merge.Labarracorrespondea150μm

DAPI

DAPI

EDU

EDU

MERGE

MERGE

a

d

b

e

c

f

CAMPOCLARO

75

Conclusionesyperspectivas

Este trabajoaportoal conocimientodeunposiblemarcadormoleculardecélulasproliferantesenPlatelmintosparásitos.Enconcordanciaconlodescritoenla bibliografía se comprobó que PCNA se encuentra altamente conservada a lolargo de la escala evolutiva (S. N. Naryzhny, 2008). Tanto sus secuencias comoestructura génica muestran un alto porcentaje de identidad y similitudrespectivamentemantienendoseincambiadadeunaespecieaotra.Losresultadosde losmodeladosbioinformáticos son congruentes con lo antesdichoyaque laspredicciones estructurales para la proteina resutalrian ser identicas de unorganismoaotro.Sibienesposbibleahondareneldetalleestructuralycompararsitiosespecificosdentrodelasdiferentesproteínas,siempreseesperaencontrarhomologia de estructuras. Parte de esta conservación se explica con el hechoevolutivodeloincambiadoquesehamantenidoelescenariodeaccióndePCNAyaque la maquinaria de replicación célular tiene sus orignes en la base de laevolución manteniendose funcional he incambiada a lo largo de la historia.CiertamenteestosestudiossonderelevanciayaquehacenalacaracterizacióndelgenenestosPlatelmintosParásitos.

Se logró expresar la proteína recombinante EgPCNAr en forma soluble,purificarla exitosamente e inmunizar un conejo para así obtener un anticuerpopoliclonal contra EgPCNAr. Los ensayos de inmunolocalización revelaron lautilidaddelanticuerposibienenalgunosresultadoslastincionesinespecíficasnoserían congruentes con lo esperado tanto paraM. corti como F. hepática.EnM.corti se observó distribuciones de células positivas para PCNA que se localizanprincipalmente en el parénquimamedular junto a la capamuscular longitudinalinterna,sibienseobservolocalizaciónentodoelparénquimamedular.Inclusoenlaregióndelescólexselocalizanprincipalmentecercadeloshacesmusculares.Nose visualizaron células en la región del parénquima cortical exterior y sub-tegumentaria. La abundancia de estas células es mayor en la región anterior(escólex y cuello), siendo especialmente escasas en la región más posterior, seobservó señal dónde se acumulan los poros excretores accesorios. En líneasgeneralessegeneraungradienteanteroposteriorconformecomienzaeldesarrolloycrecimientoparaM.corti. la localizaciónsedaaniveldelparénquimamedularencontrandomayores concentracionesen cuelloy escólex.Resultadosde igualescaracterísticasdeencuentranenlabibliografíaanteriormentedescritaeneltexto.

LosensayosdehibridaciónconsondasdeARNantisentidoenM.cortiparael gen PCNA revelaron resultados similares los de las inmunolocalizaciones en

76

cuantoa ladistribucióndecélulaspositivasparaPCNA.EnelcasodeF.hepáticatanto en ensayos de hibridación como inmunomarcado la distribución seconcentraaniveldelasglándulasvitelogenasnodescartandolatinciónenaparatoreproductor.Segúnlatécnicadereveladoseobservótincióneneltegumentoperoseinfiereapegadoinespecíficopropiodelatécnica.

Seprobolaincorporaciónde5-etinil-2'desoxiuridina(EDU)alADN,elcualesunmétodoparadetectarlasíntesisdeADNencélulasproliferantes.ParaelcasodeM.cortiseobservounpatrónsimilardemayorconcentraciónaniveldelcuelloy escólex lo que generaría un gradiente anteroposterior tal como se observo enKoziol2010,Espinozaetal.,2007.

En F. hepática los ensayos sobre organismos enteros no arrojaroninformaciónalgunayaquenosedetectóincorporación,tantoporqueelEDUnoerapermeable al tegumento o que fuera eliminado por el organismo. Es así que seoptoporladisgregacióncelulardeadultosincubadosyenestascondicionessiseobservo tinción y fue posible caracterizar las células las cuales presentaron lamisma morfología descrita en la bibliografía pequeño tamaño, alta relaciónnúcleo/citoplasmática, nucléolo prominente según lo descrito por Koziol 2010,Shibata,N.2010.

LosresultadossobrehuevosmostraronloimpermeablesquesonyaqueenhuevostotalmentecerradosnofueposiblevisualizarincorporacióntantodeEDUcomoDAPI, una vez abiertos presentando elmiracidio dentro se logró observarmarca. Los primeros ensayos de incorporación en miracidios eclosionados norevelaron incorporación de EDU hecho el cual asociamos a que una vez elmiracidioesliberadotienepocasobrevidahastaencontrarsuhospederoynoseríaesperableencontrarproliferacióncelularenestaetapa.Unavezsimuladoelmediodel interior caracol e incubados los huevos en el mismo, los miracidios queeclosionansetransformanaesporocistos(etapasiguienteenelciclodevida)yenesas condiciones fue posible visualizar células que incorporan EDU, tanto enmiracidioscomoesporocistos.Ladistribuciónesuniforme,resultadoesperadoyaque el cambiomorfológicoque sepresenta es significativo. Profundizar enotrasetapas del ciclo de vida sería de suma relevancia así como también realizarensayos de disgregación celular en estos dos estadios abordados con el fin decaracterizarconmayorresoluciónlamorfologíadelascélulasproliferantes.

En conclusión con los datos aportados en este trabajo restaría realizarensayos de co-localización utilizando combinaciones de estas técnicas si bienensayosdeincorporacióndeEDUeinmunolocalizaciónconjuntosfueronrealizaosenadultosdeF.hepáticasinresultadospositivos.Enestetrabajosepusoapuntocadatécnicaporseparadocon lapuestaapuntode losensayosenconjuntoseráposible identificar con precisión y caracterizar exhaustivamente la población de

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célulasproliferantesenestosmodelosdeplatelmintosyevaluarlaexclusividaddePCNAcomoposiblemarcadordecélulasproliferantes

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86

ApéndiceI

Figura2Apendice1Materiales yMetodos.MaparestricciónvectorpET

14b

Figura1ApendiceMaterialesyMetodos-Marcadoresdepesomolecular

87

SolucionesCultivodeMesocestoidescorti

1. Hanks: 9.8g/l sales de Hanks (Sigma - Aldrich, catálogo número H6136, Lote087K83012),350mg/lNaHCO3(Fluka).SeajustóelpHa7.5yseesterilizóporfiltración.

2. MedioRPMI1640modificado:10.4g/lRPMI(Sigma-Aldrich,catálogonúmeroR4130, Lote 049K8307), 4.2g/l NaHCO3 (Fluka), 4.3g/l Glucosa (Sigma -Aldrich),4.8g/lextractodelevadura(Sigma-Aldrich).SeajustóelpHa7.5,se agregó gentamicina 50μg/ml concentración final y se esterilizó porfiltración.

ExtraccióndeARNyproteínas

a. PBS(BufferFosfatosalino):137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4.SeajustóelpHa7.4yseesterilizóporautoclavado.Enelcasodeutilizarlo para extracción de ARN se utilizó PBS en tabletas (Sigma –Aldrich,catálogonúmeroP4417)disueltasenaguaDEPC(Sigma–Aldrich).

b. Buffer de Lisis: 50mM Tris – HCl pH 8; 150mMNaCl, 1% Triton X-100, 1mMPMSF(Sigma–Aldrich).

Preparacióndematerialparaestudioshistológicos

HibridaciónintotodeARN

Figura 3 Apendice 1 Materiales y Metodos - Mapa restricción

vectorpET14b-MaparestricciónvectorpGEMT

88

a. PBSTx: PBS – 0.5% Triton-X100b. Soluciónreductora:50mMDTT,1%NP-40,0.5%SDSenPBS

Electroforesis

Ácidosnucleicos

a. BufferTAE1X:40mMTrisbase,20mMácidoacético,1mMEDTA;pH8.4.

b. Bufferdecarga6X:0.25%Azuldebromofenol,0.25%Azuldexilencianol,30%Glicerol

Proteínas(agregarbuffer´sacrilamida,bis)

a. Buffer de carga 4X: 0.25M Tris – HCl pH 6.8, 40% Glicerol, 4% SDS, 4% 2-Mercaptoetanol,0.02%Azuldebromofenol

b. T inciónconCoomassieBlueb.1.SolucióndeCoomassieBlue:0.2%CoomassieBlueR-250,30%Etanol,7%Ácido acéticob.2.Solucióndecolorante:30%Etanol,7%Ácidoacético

c. T inción con nitrato de platac.1. Solución fijadora: 40% Etanol, 10% ácidoacético

ExpresióndelaproteínarecombinanteEgPCNArenEscherichiacoli

a. MedioLB(Luria–Bertani):1%Triptona,0.5%ExtractodeLevadura,1%NaCl,pH7.0

b. BufferExtracciónPeriplasma:0.5MSacarosa,20mMTris–HCl,pH8,0.25mg/mllisozima,0.1MEDTA,1mMPMSF.

c. Bufferdelisis:50mMTris–HCl,pH7.5,5%Glicerol,50mMNaCl

d. Bufferdesnaturalizante:40mMTris–HCl,pH7.5,8MUrea

CuantificacióndesondasmarcadasconDigoxigenina

a. Buffer1:100mMTris–HClpH7.5,150mMNaCl.

b. Buffer2:0.5%w/vagentedebloqueo(Boehringer)enbuffer1

89

c. Buffer3:100mMTris–HClpH9.5,100mMNaCl,50mMMgCl2.

d. Bufferderevelado:330μg/mlNBT(Amresco),167μg/mlBCIP(Amresco)enBuffer3

Hibridacióninsitusobrecriocortes.

a. PBS:8g/lNaCl,0.2g/lKCl,1.44g/lNa2HPO4,0.24g/lKH2PO4.SeajustaelpHa7.4yseesterilizaporautoclavado

b. PBSTx:PBS–0.5%Triton-X100

c. SSC20X:3MNaCl,0.3Mcitratodesodio

d. Denhart50X:1%Ficoll400,1%polyvinilpyrolidona,1%BSA

e. Solucióndeprehibridación:SSC5X,50%formamidadesionizada,10%sulfatodedextrano,1mg/mlARNtdelevadura,1XDenhardt

f. Solución1:SSC1X,50%formamida,0,1%Tween-20

g. Solución2:SSC1X-50%formamida.

h. MAB:100mMácidomaleico,150mMNaCl

i. Solución de bloqueo: 0.5% reactivo de bloqueo (Boehringer), 1% BSA y 5%suerodeoveja(Sigma-Aldrich)enbufferMAB

j. MABT:MAB–0.1%Tween-20

k. BufferAP:100mMTris–HClpH9.5,25mMMgCl2,150mMNaCl

l. ReactivoNBT//BCIP:Readytousetablets(Roche)disueltasenaguao330μg/mlNBT(Amresco),167μg/mlBCIP(Amresco))enBufferAP

m. PBSTw:PBS–0.1%Tween-20

Hibridaciónintotosobreorganismosenteros

a. Soluciónreductora:50mMDTT,1%NP-40,0.5%SDSenPBS

b. PBSTx:PBS–0.5%Triton-X100

90

c. ProteinasaK:2μg/ml(NewEnglandBiolabs)enPBSTxcon0.1%SDS

d. Solucióndeprehibridación:50%Formamida,5XSCC,1mg/mltRNA,1%Tween-20

e. Solución de hibridación: 1ng/μl de sonda desnaturaliza en buffer deprehibridacióncomplementadocon5%desulfatodedextrano.

f. Solucióndelavado1:UnapartedeSolucióndeprehibridaciónconunapartede2XSCC,0.1%TritonX-100.

g. Solucióndelavado2:2XSCC,0.1%TritonX-100

h. Solucióndelavado3:0.2XSCC,0.1%TritonX-100

i. MABT:1XMAB,0.1%Tween-20

j. Solucióndebloqueo:5%SuerodecaballoenMABT

k. BufferAP:100mMTris–HClpH9.5,100mMNaCl,50mMMgCl2.

l. ReactivoNBT//BCIP:Readytousetablets(Roche)disueltasenaguao330μg/mlNBT(Amresco),167μg/mlBCIP(Amresco)enBufferAP

Inmunohistoquímicasobrecriocortes

a. Solución de bloqueo: 1% BSA, 5% suero de oveja (Sigma – Aldrich), 0.05%Tween-20enPBS

Inmunohistoquímicasobreorganismosenteros.

a. PBSTx:0,1%TritonX-100enPBS

b. PBSTw:0,05%Tween-20PBS.

c. Solución de bloqueo: 1% seroalbúmina bovina (BSA) y 5% suero de oveja(Sigma-Aldrich,númerodecatálogoS-3772)enPBSTw

Purificación(eluciónproteínarecombinante)a.SoluciónA:6Murea,0.5MNaCl,10%glicerol,50mMTris–HCl(pH9.6)b.SoluciónB:1Murea,0.5MNaCl,10%glicerol,2.5mMglutatiónreducido,0.5mM

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glutatiónoxidado,50mMTris–HCl(pH9.0)c. Buffers de elución: 50mMTris –HCl pH 9.6, 0.15mMNaCl, 250mM Imidazol,0.01% Triton X100. g.2. 50mM Tris – HCl pH 9.6, 0.15mM NaCl, 250mMImidazol.g.3. 50mM Tris – HCl pH 9.6, 0.15mM NaCl, 250mM Imidazol, 8MUreag.4.50mMTris–HClpH9.6,0.15mMNaCl,250mMImidazol,1MUrea.