MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA

CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS

UNIDAD 2

INTRODUCCIÓN

Todas los microorganismos en microbiología

presentan una morfología y tamaño muy variables,

así como distintos sistemas de agrupación. El

conocer este tipo de características propias de

cada grupo microbiano se consigue por medio de

diferentes métodos de examen.

LA MEDIDA DE LOS MICROORGANISMOS

MICROSCOPIA

• Lente convexa• Punto focal

AUMENTO DE LA

IMAGEN

• Diferencia en la intensidad de la luz

• Uso de ColorantesCONTRASTE

• Poder de resolución• Tamaño de la primera lente de aumento• Longitud de onda de luz usada y espécimen• Índice de refracción

RESOLUCIÓN

AUMENTO

AUMENTO TOTAL

MICROSCOPIO LENTE OBJETIVO

LENTE OCULAR

AMPLIACIÓN TOTAL

Microscopio óptico

Débil 10X 10X 100X

Fuere seco 40X 10X 400X

Acetite de inmersión

100X 10X 1000X

Microscopio electrónico

Transmisión (MET)

200 000X

Barrido (MEB) 10 000X

RESOLUCIÓN

ACEITE DE INMERSIÓN

• IR 1.5• Aumenta la

resolución

APERTURA NUMÉRICA (AN)

• Grabado en la lente del objetivo del microscopio

• Tamaño de la lente

• Uso de aceite de inmersión

d = longitud de onda 2AN

DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE OBSERVACIÓN

USO DEL ACEITE DE INMERSIÓN

MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

MIC

RO

SC

OP

IO

ELEC

TR

ON

ICO

DE

TR

AN

SM

ISIÓ

N

MIC

RO

SC

OP

IO D

IGIT

AL

CO

N P

AN

TA

LLA

(LC

D)

USOS DEL MICROSCOPIOTIPOS DE

MICROSCOPIACARACTERISTICA

CLAVEASPECTO DE LA

IMAGENPRINCIPAL

APLICACIÓN

Microscopia óptica

Campo claro El contraste se logra por absorción

Imagen clara Las muestras requieren tinción.

Contraste de fases El contraste se consigue por

interferencia; las diferencias en el

índice de refracción cambian la fase de la

luz

Imágenes claras y detalladas

rodeadas de un halo

No requiere tinción; se pueden observar

preparación en fresco de células

vivas

Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la

muestra entra en el objetivo,

produciéndose un contraste elevado

Imagen brillante contra un fondo

oscuro

Para observar células vivas o

flagelos demasiado finos para la

microscopia de contraste de fases;

pocos detalles internos

TIPOS DE MICROSCOPIA

CARACTERISTICA CLAVE

ASPECTO DE LA IMAGEN

PRINCIPAL APLICACIÓN

Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir

luz visible que tienen los

especímenes fluorescentes cuando se les ilumina con luz

ultravioleta

Espécimen coloreada

(luminosa) contra un fondo oscuro

Utilizando anticuerpos

fluorescentes se pueden identificar tipos específicos

de microorganismos presentes en una mezcla compleja

Microscopia electrónica

Transmisión (MET)

Hace pasar un haz de electrones a

través de la preparación,

produciendo un gran aumento útil

Imágenes muy ampliadas con

gran detalle

Para poder observar virus , no se puede observar organismos vivos, las preparaciones

son desecadas

TIPOS DE MICROSCOPIA

CARACTERISTICA CLAVE

ASPECTO DE LA IMAGEN

PRINCIPAL APLICACIÓN

Barrido (MEB) Barre los especímenes con

un chorro de electrones,

produciendo la salida de electrones

secundarios que crean una señal,

que, a su vez, genera una imagen

por ordenarlos

Imagen tridimensional

Para ver estructuras de

organismos intactos, y

estructuras con detalles reales se ocupan muestras

desecadas

PREPARACIONE

S EN FRESCO

1. PREPARACIÓN

EN FRESCO SIMPLE

2. PREPARACIÓN

EN GOTA PENDIENTE

M.O. VIVOS

CONDICIONES DE UNA PREPARACIÓN EN FRESCO

1. La muestra debe ser representativa

2. Muestras recogidas en condición de esterilidad

3. Distribución adecuada en el portaobjeto,

homogénea

4. Cantidad de agua y colorante adecuada

5. Si necesita calor no debe calentarse demasiado

6. Evitar la contaminación

MÉTODO DE EXAMEN EN FRESCO ENTRE PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS

1. Se prepara un portaobjeto y cubreobjetos limpio y desengrasado

2. En el portaobjeto se deposita una gota de agua estéril3. Con el asa de siembra previamente estéril o flameado,

se toma un poco de muestra del microrganismo y se realiza una suspensión de estas en la gota

4. Se extiende y homogeniza la gota de muestra, se coloca sobre esta un cubreobjetos formando un ángulo de 45°, evitando burbujas de aire y corrientes

5. Se sellan con parafina los bordes del cubreobjetos para disminuir la evaporación y evitar corrientes en a preparación

6. Observar al microscopio inicialmente con objetivo de 40 aumentos

MÉTODO DE EXAMEN EN FRESCO SOBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO

1. Se utiliza en este caso un cubreobjetos adecuadamente limpio y desengrasado, se coloca una gota de la suspensión microbiana con una asa de siembra inicialmente estéril

2. Se colocara vaselina en los bordes del pocillo del portaobjetos excavado

3. El cubreobjetos se invertirá sobre el portaobjetos excavado perfectamente limpio, colocándolo encima del área cóncava del portaobjetos

4. Se invertirá la preparación5. Se observa al microscopio con objetivo inicialmente

de 40 aumentos

TINCIONES

Colorantes vitales

Fijación por calor

Fijación química

Fijación

Extensión

FACTORES QUE AFECTAN LA TÉCNICA DE TINCIÓN

1. Fuerza del colorante

2. pH del colorante

3. Conservación del colorante

4. Elaboración

5. Técnicas empleadas

6. Temperatura

7. Cantidad de muestra

8. Realizar correctamente el frotis

9. Soluciones mordientes

10. Tiempos de tinción

TIPOS DE COLORANTES

BASICO • Ion cargado positivamente

ACIDOS • Ion cargado negativamente

MORDIENTES• Dan

afinidad a la célula

BASICO

ACIDO

MORDIENTES

Safranina, fucsina básica, cristal violeta y

azul de metileno

Tejidos animales afectados por m.o.

Eosina, fucsina acida y rojo Congo

Engrosan las estructuras externas de las células, iodo , lugol

TÉCNICAS USUALES DE TINCIÓN PARA BACTERIAS

TINCION USO TECNICATinción simple Un colorante proporciona

contraste para observar mejor un organismo

completo

Se tiñe con un colorante básico durante 5 minutos.

Se aclara con agua, todas las bacterias se

tiñen, la mayoría de los tejidos no

Tinción diferencial (Tinción de Gram)

Dos o mas colorantes, distingue entre bacterias

Gram (+,-)

Se cubre la preparación de bacterias fijas con cristal violeta, iodo, se

decolora con acetona al 95%, las Gram positivas permanecen teñidas de cristal violeta, las Gram

negativas de rosa

TINCION USO TECNICA

Tinción de alcohol-acido(Ziehl-Neelsen)

Dos colorantes; distingue entre las mico bacterias

(acido-alcohol resistencia) y el resto de las bacterias

Se tiñen las células con fucsina básica y se

calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas la

bacterias se tiñen de rojo. Se decolora brevemente

con una mezcla de alcohol- HCl. Las

bacterias resistentes se tiñen de rojo, todas las

demás se decoloran. Se trata con el colorante de

contraste azul de metileno. Las bacterias

alcohol-acido resistentes continúan teñidas de rojo, las otras se tiñen de azul

TINCION USO TECNICA

Tincion especificas(Tincion de esporas de

Wirtz-Conklin)

Tiñe selectivamente las endosporas

Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de

vapores durante 60 segundos. Se lava con

agua durante 30 segundos y se tiñe con

safranina. Las endosporas retienen el

color verde, el resto de la célula toma el color rosa

Tincion de flagelos de Leifson

Permite observar los flagelos

A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de acido único

(mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los

flagelos y el colorante los tiñe

TINCION USO TECNICA

Tinción negativa Revela la presencia de capsulas

Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación en

fresco del espécimen. Las partículas de

colorante no pueden penetrar en la capsula, que se observa como

una región clara alrededor de la célula

TINCIÓN SIMPLE1. Si la muestra es solida tomarla con una asa bacteriológica

estéril2. Si la muestra es liquida tomarla con una pipeta Pasteur estéril3. Extender ambas de manera uniforme y homogénea por un

portaobjetos 4. Dejar que la muestra se seque al aire, una vez seca se fija con

calor, haciendo pasar la muestra de 2 a 3 veces a la llama del mechero

5. Cubrir el portaobjeto con un correspondiente colorante, que para esta tinción suele ser azul de metileno, o azul de toluidina dejándose actuar por 5 minutos

6. Transcurrido el tiempo, se verterá agua abundante en la preparación, para eliminar restos de colorante

7. Dejar secar la preparación al aire8. Observar al microscopio con objeto de inmersión

TINCIÓN GRAM1. Realizar la preparación con la correspondiente fijación por el método ya

explicado2. Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante que corresponderá a cristal

violeta durante 1 minuto, o violeta de genciana durante 2 minutos3. Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de

colorante4. Añadir mordiente, el lugol, que actuara fijando el colorante anterior a las

bacterias, aplicándose durante 1 minuto5. Se vuelve a eliminar el exceso mediante u lavado con abundante agua

destilada6. Decolorar con alcohol del 96° unos 20 segundos o hasta arrastrar todos los

restos.7. Lavar con agua abundante8. Cubrir el portaobjetos con el segundo colorante o colorante de contraste

(safranina) durante 1 minuto9. Lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar10. Observar con objetivo de inmersión11. Gram positivas cristal violeta12. Gram negativas rojo-rosado

La tinción de ácido-alcohol resistencia se utiliza para identificar a Mycobacterium, ya que esta bacteria posee ceras en su pared

celular que resisten la decoloración. La microfotografía muestra masas de células de M. leprae en el interior de sus células

hospedadoras. Las mico-bacterias permanecen teñidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul

del colorante de contraste.

Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus es una bacteria esporulada. Las endosporas

mantienen la tinción primaria verde, mientras que las otras células se observan teñidas con la coloración de contraste rosa. (b) La tinción de

Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.

MÉTODOS DE CONTROL PARA EL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS

Esterilización

Desinfección

Antisepsia Asepsia

Microbiostasis

Microbiocida

Tratamiento para el control de microorganismos

Tratamiento Efecto Modo de acción Aplicación

METODOS FISICOS

Calor seco Esteriliza Desnaturaliza proteínas

Material seco

Calor húmedo Material liquido

Pasteurización Mata ciertos m.o.

Elimina patógenos, productos alimenticios

Frio Hace lento o detiene el

crecimiento de m.o.

Disminuye velocidad de reacción de

químicas

Conserva productos perecederos y m.o.

Radiación

Luz UV Esteriliza Daña el DNA Se esterilizan superficies

Rayos X, gamma Expulsa electrones de átomos

Material plástico y frutas y verduras

Filtración Elimina m.o. celulares

Elimina células Medios de cultivo, antibióticos

Desecación

Evaporación o calor

Mata muchos m.o.

Distorsiona la membrana

Conservación de alimentos

Sublimación o liofilización

Detiene el crecimiento m.o.

Detiene reacciones químicas

Conservación de cultivos

Tratamiento para el control de microorganismos

Tratamiento Efecto Modo de acción Aplicación

AGENTES QUIMICOS

Fenoles Matan la mayoría de m.o.

Desnaturalización de proteínas

Germicida

Compuestos fenólicos

Desinfectante, antiséptico

Desinfecta superficies, piel, termómetrosAlcoholes

Halógenos Oxida compuestos bioquímicos esenciales

Desinfecta superficies, piel, tratamiento de aguas

Peróxido de hidrogeno

Antiséptico para la piel

AGENTES SURFACTANTES

Jabón y detergente

Elimina m.o. Elimina físicamente m.o

Desinfecta superficies, mesas antiséptico de piel

Sales de amonio cuaternario

Alteran membranas Agente esterilizante

AGENTES ALQUILANTES

Formaldehido y glutaraldehido

Mata m.o. Inactiva enzimas Conservación de tejidos, vacunas y equipo quirúrgico

Oxido de etileno Gas utilizado para material sensible, hospitales

ESTERILIZACIÓN

Eliminación de todos los microorganismos, todos los aparatos y material deben ser esterilizado para obtener cultivos axénicos.

• Medio• Sustancias liquidas, solidas• Matraces• Tubos de ensayo• Placas • Pipetas etc.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR

Húmedo 121°C1 atm

Volumen 20 minutos

AUTOCLAVE ESCOLAR

1. Tornillos móviles para el cierre hermético 2. Material a esterilizar 3. Vaciado de la caldera 4. Fuente de calor 5. Gas 6. Agua 7. Apoyo para alejar el material del agua 8. Caldera 9. Manómetro 10. Cierre de la tapa 11. Válvula de seguridad 12. Espita

USO DE INDICADORES BIOLÓGICOS

• Control de autoclave con

respecto a la capacidad

• Caldo nutritivo

• Azúcar

• Indicador de pH

• Esporas de Geobacillus

stearothermophilus ATCC

7953

• 60 ± 2 °C, 48 hrs

• Violeta rojizo transparente

(negativo)

• Amarillo naranja (positivo)

CONTROL DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO

ACTIVIDAD POR CORRIDA

DIARIO SEMANAL MENSUAL

Registrar la temperatura, presión de esterilización

X

Utilice cinta testigo para control de la esterilización

X

Utilizar indicadores biológicos de esterilización para verificar

la eficacia

X

Registro de uso X

Chequeo de nivel de agua X

Chequeo del funcionamiento de válvulas de seguridad

X

Limpieza interior y exterior X

Verificación del manómetro X

Limpieza del drenaje y sellos X

TRATAMIENTO PARA CONTROL DE M.O

FACTORES PARA LIMPIEZA EFECTIVA

1. Elección adecuada del producto de limpieza 2. Temperatura del agua 3. Dureza del agua 4. pH del agua utilizada 5. Período de contacto 6. Método de aplicación del detergente (por espuma, aspersión,

etc.)

COMO TRABAJA UN SANITIZANTE

1. Destructor de membrana celular: hipoclorito de sodio, acido peracético

2. Eliminación de la alimentación bacteriana y eliminación de desechos: amonio cuaternario

3. Inactivación de enzimas criticas: compuestos fenólicos

PRUEBA DE RETO BACTERIANO NMX-BB-SCFI-1999

Cepas: 1. Staphylococus aureus2. Escherichia coli3. BHI ó Soya Tripticaseina

Remover crecimiento con 3 ml de solución salina al 0.85%

Obtener suspensión que leída a 580 nm, de una lectura de 3 a 5% de %T

• Incubación de 20 a 24 h• Temperatura de 35 a 37

°C

• Resembrar tubo inclinado con 12 ml de agar nutritivo

Determinar el numero de UFC/ml y precisar el %T de una suspension de 75 a 125 X 108 UFC/ml

PR

EPA

RA

CIÓ

N D

E M

.O. D

E

PR

UEB

A

DETERMINACIÓN DE CUENTA VIABLE INICIAL

A un matraz Erlenmeyer que contenga 99 mL de la solución amortiguadora de fosfatos diluida estéril, transferir 1 mL de la suspensión de los microorganismos de prueba y efectuar las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan cada una entre 25 y 250 colonias

Colocar en cajas de petri estériles, por duplicado1 mL de cada dilución, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL de agar para métodos estándar, homogeneizar y dejar solidificar invertirlas cajas de petri e incubar durante 48 h a 303 K - 308 K (30°C - 35°C). Contar las colonias contenidas en cada una de las cajas, en un cuenta colonias

DETERMINACIÓN DE CÉLULAS SOBREVIVIENTES

Para cada uno de los microorganismos de prueba, medir exactamente y por duplicado 99 mL del producto o su dilución, transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapón de rosca estériles

Agitar los matraces, suspender la agitación, justamente antes de la inoculación, para que en el momento de la misma, aún exista movimiento residual del líquido y así facilitar la incorporación del inóculo. Inocular en forma individual cada matraz con cada uno de los microorganismos de prueba en el centro de la superficie del líquido, evitando tocar con la pipeta, el cuello o las paredes del matraz

Agitar el matraz con la muestra inoculada y exactamente 30 s después de la inoculación, transferir 1 mL de la misma, a un tubo de ensayo conteniendo 9 mL de la solución neutralizante diluida o del caldo neutralizante, mezclar y transferir por duplicado alícuotas de 1,0 mL a cajas de petri estériles y continuar diluyendo hasta tener las diluciones necesarias para obtener placas que contengan de 25 a 250 colonias, agregar a cada placa de 15 mL a 18 mL del medio agar para métodos estándar con neutralizante, homogeneizar, permitir que solidifique, invertir las placas e incubar durante 48 h entre 308 K a 310 K (35°C a 37°C). Después del período de incubación, contar el número de UFC en las placas

Obtener resultados:

Donde:

S= Celulas sobrevivientesC.V.= Cuetna viable inciial

Interpretación de resultados:

Un producto etiquetado como germicida, debe tener un por ciento de reducción de la cuenta viable de 99,999 % en 30 s de contacto a la concentración de uso recomendada, cuando la cuenta viable inicial se encuentra entre 75 y 125 X 108 UFC / mL

LAVADO DE MATERIAL• pH • Azul de Bromotimol

al 4%• 16 de NaOH 0.01 N • 1 g de ABT

• Cloro residual• Almidón-Yoduro• 2 g almidón en 100 ml de

agua• 8 g de KI• Formaldehido ó cloroformo• 2 a 3 semanas de

estabilidad

Color Cloro residual (mg/litro)

Incoloro 0.0

Celeste 0.1 a 0.3

Azul oscuro > 0.3

CEPARIO

1. Cepas Estándar de Control de Calidad

2. Colecciones de cepas

• ATCC: American Type Collection USA

• NCIC: National Collection of Industrial Bacteria INGLATERRA

• JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism JAPON

• CCTM: Colección Nacional FRANCIA

• RIA: Reseac Institute for Antibiotics USSR

• NCIB: Colección Nacional Industrial ESCOCIA

• DSM: Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen ALEMANIA

3. Requisitos de las cepas

• Características típicas

• Características estables

• Reproducibilidad

CONSERVACION DE CEPAS EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL

• Agar de Cebrero-Corazón

• Agar Mueller-Hinton

• Esterilizar aceite a 15 lb de presión por

45 minutos

• Incubación por 24 h a 35 °C

• 1 ml de aceite mineral

• Cultivos viables por 2 años

• Control de calidad de trabajo diario

• Cultivos jovenes de 24 o 48 h antes

• Resiembra dos veces por semana

• Cepas semistock

• Etiquetado de cepas

MEDIOS DE CULTIVO

Tipos de medio de cultivo:

1. Medios definidos

2. Medios complejos

3. Medios selectivo

4. Medios diferenciales

5. Medios selectivos-

diferenciales

6. Medias de

enriquecimiento

TIPO DE MEDIO CARACTERISTICA

Medios definidos Es aquel del cual se conoce su composición exacta, ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros

Medios complejos Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo, se preparan a partir de extractos de productos

naturales tales como carne, sangre, caseína, levadura o soja

Medio selectivo Favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros, se utilizan para aislar especies particulares a parir de mezclas complejas

Medios diferenciales Se identifican colonias de un determinado microrganismo

Medios selectivos diferenciales

Actúan como un tamiz grosero que disminuye el campo de identificación.

Medios de enriquecimiento

Aíslan u tipo particular de microrganismo a partir de una población mixta de gran tamaño

CONTROL DE CALIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO

CARACTERISTICAS

• Higroscópicos• Temperatura ambiente• Protegidos de luz y humedad• Vida útil de 2 años

CARACTERISTICAS DE CALIDAD

• pH • Prueba de promoción de crecimiento• Prueba de funcionalidad• Esterilidad• Validación de medios de cultivo

FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

• Valor de pH incorrecto• Turbidez o precipitación• Oscurecimiento• Gel reblandecido• Crecimiento pobre• Control de suplementos

pH Antes y Después de la esterilización

Prueba de promoción de crecimiento

Tubos o Cajas recién esterilizadasCepas de trabajo diario E. Coli,

Enterobacter aerogenes método por estría

Prueba de funcionalidad

Inhibición del crecimiento de diferentes m.o. y favorecen el crecimiento de otras, se inoculan microorganismos que deben

ser inhibidos

Esterilidad Un par de tubos o cajas se incuban sin ser inoculados de 48 a 72 h se hace por lote

preparado

Validación de medios de

cultivo

1. Técnica ecométrica de Mossel y Col2. Técnica de Nefelómetro de Mac Farland3. Índice de Recuperación

ESCALA MAC FARLAND

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% U.F.C/ml

1 0,1 9,9 3,0x108

2 0,2 9,8 6,0x108

3 0,3 9,7 9,0x108

4 0,4 9,6 1,2x109

5 0,5 9,5 1,5x109

6 0,6 9,4 1,8x109

7 0,7 9,3 2,1x109

8 0,8 9,2 2,4x109

9 0,9 9,1 2.7x109

10 1,0 9,0 3,0x109

ESCALA MAC FARLAND

OBTENCION DE CULTIVOS AXENICOS Y MIXTOS

Axénico: consiste en una sola especie microbiana proveniente de una sola

célula (laboratorio)

Mixto: viven diferentes especies de forma continua

(naturaleza)

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Técnicas Indirectas

• Turbidez • Peso seco• Cultivos Continuos

Técnicas Directas

• Recuento directo al microscopio (vivas y muertas)

• Siembra por estría• Vaciado en placa • Extensión en placa• Recuento en tubo múltiple• Filtración

Espectrofotómetro mide la cantidad de

luz transmitida de una solución o

cultivo liquido de células microbianas.

Cuanto mayor masa de células tenga

un cultivo, mayor será su turbidez, se

transmitirá menos luz y la lectura en el

espectrofotómetro será mayor.

El espectro se utiliza para estimar un

cultivo denso, y registrar el crecimiento

de una población microbiana, para ello

necesitamos una curva patrón.

PESO SECO

1. Las células de un cultivo se pueden medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una célula individual. El peso seco de las células se determina separándolas del medio, desecándolos y pesándolas.

2. Se hace por centrifugación, ultra centrifugación, luego las células se re suspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo.

3. Después las células del segundo lavado se secan en horno a 105 °C por 24 h y luego se enfrían en el desecador

CULTIVO CONTINUO (QUIMIOSTATO)

Mantiene una población microbiana en un estado de crecimiento constante

CAMARA LIBRE DE OXIGENO

CAMARA LIBRE DE OXIGENO

PARA ANAERO

BIOS ESTRICT

OS

CÁMARA DE RECUENTO PETROFF-HAUSER

METODO DE AISLAMIENTO DE SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA

METODO DE

EXTENSION EN PLACA

Y VACIADO EN

PLACA

TÉCNICA DE NMP Ó TUBO

MÚLTIPLE

Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres

diluciones sucesivasNMP

Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres

diluciones sucesivasNMP

0 1 0 0,18 5 0 0 2,3 1 0 0 0,20 5 0 1 3,1 1 1 0 0,40 5 1 0 3,3 2 0 0 0,45 5 1 1 4,6 2 0 1 0,68 5 2 0 4,9 2 1 0 0,68 5 2 1 7,0 2 2 0 0,93 5 2 2 9,5 3 0 0 0,78 5 3 0 7,9 3 0 1 1,1 5 3 1 11,0 3 1 0 1,1 5 3 2 14,0 3 2 0 1,4 5 4 0 13,0 4 0 0 1,3 5 4 1 17,0 4 0 1 1,7 5 4 2 22,0 4 1 0 1,7 5 4 3 28,0 4 1 1 2,1 5 5 0 24,0 4 2 0 2,2 5 5 1 35,0 4 2 1 2,6 5 5 2 54,0 4 3 0 2,7 5 5 3 92,0

5 5 4 160,0

TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

FROTIS EN SUPERFICIES

VIVAS E INERTES

MétodoMicroorganismos para los

que se utilizaTipo de

recuentoUsos / Limitaciones

IndirectoTurbidez La mayoria de las

bacterias y levadurasTotal Determina la turbidez con un

espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión

debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se

requiere una curva patrónPeso seco Cualquier microorganismo Total Tedioso y requiere un cierto

tiempo, pero preciso y reproducible

DirectoRecuento

microscópicoCualquier microorganismo

unicelularTotal Muy útil para el recuento de un

tipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no

es adecuado para cultivos diluidos

Recuento electrónico

Cualquier microorganismo unicelular

Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico;

rápido y preciso

MétodoMicroorganismos para

los que se utilizaTipo de

recuento Usos / Limitaciones

Recuento en placa

Cualquier microorganismo unicelular viable

Viables Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran

número de coloniasNumero más

problableCualquier

microorganismo viableViables Utilizado para

microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido y para

determinar contaminación por Escherichia coli en

aguas; requiere un cierto tiempo

Filtración Cualquier microorganismo viable

Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede

recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de

un líquido o de un gas

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1. IMVIC• Indol• Rojo de Metilo• Voges Proskauer• Citrato2. Enzimáticas• Oxidasa• Catalasa• Coagulasa• Ureasa3. Reducción Nitratos• B-D Galactosidasa • Descarboxilasa4. Otras• Agar TSI• Óxido - Fermentativa o de Hugh-Leifson• Ácidos y gases• Hidrolisis Gelatina5. Índice Analítico de Perfil6. Enlaces externos

PRUEBAS

BIOQUÍMICAS COMUNES

1. Granados P. Raquel, “Microbiología Tomo 1”, 1° edición 2002, Editorial Thomson Paraninfo, SA de CV, México DF

2. Lansing M. Prescott, “Microbiología”, 5° edición, Editorial Mc Graw Hill, México DF

3. Michael T. Madigan, “Biología de los Microorganismos”, 10° edición, Editorial Prentice Hall, México DF

4. Patrick R. Murray, “Microbiología Medica”, 5° edición 2006, Editorial Elservier España , SA de CV, Madrid España

BIBLIOGRAFÍA