Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng

nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis

Nguyễn Thành Đạt

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: GS-TS Đỗ Ngọc Liên

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: phương pháp gây

đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELIS, phương pháp tinh sạch IgG từ

huyết thanh chuột, kỹ thuật Western Blot … Tạo kháng thể đa dòng kháng

lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein

này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). Kiểm tra khả năng phản ứng

của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus

anthracis.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Kháng thể; Vi khuẩn than

Content I. TỔNG QUAN

Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học đã

được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng

thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong cuộc sống như trong Y học điều

trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh, phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc

chất, ma túy, khoa học hình sự, phát hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như

ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh

dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng

thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.

Ngày nay, các vi sinh vật nguy hiểm trong đó có vi khuẩn than (B. anthracis ) đã và đang

được sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố. Hiện nay, trên thế giới đã xuất

hiện nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch đã được thương mại hóa. Chúng có ưu điểm là thời

gian cho kết quả nhanh chóng, độ chính xác cao, nhưng giá thành của các loại test này còn ở mức

cao và thời gian nhập khẩu lâu. Mặt khác, ở Việt Nam, các vi sinh vật này chủ yếu được phát hiện

qua các phương pháp PCR, ELISA...Nhược điểm của các phương pháp này là cần một thời gian lâu

để cho kết quả. Do đó, cần phải có công cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát hiện sớm sự có mặt các tác

nhân vi sinh vật này.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B.

anthracis.”

Mục tiêu của đề tài bao gồm:

Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn

Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp)

Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào

tử vi khuẩn Bacillus anthracis.

Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản

xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ -Tổng cục Hậu cần Kỹ

thuật-Bộ Công An.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

- Chuột chủng dòng Swiss Mus musculus, được mua ở Viện Vệ sinh dịch tễ TW.

- Chủng vi khuẩn B. anthracis (Viện vệ sinh phòng dịch Quân đội)

- Cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP. (Hãng GE Healthcare)

- Kháng nguyên: Kháng nguyên là protein BclA tái tổ hợp, được tinh sạch qua cột Talon

(Niken) do nhóm nghiên cứu thuộc Phòng 3 Viện H57 Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật thực hiện.

- Kháng thể: Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Alkaline Phosphatase antibody produced in goat,

Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Peroxidase antibody produced in goat.

- BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt), NBT (Nitrotetrazolium Blue

chloride) được mua của hãng Sigma. Các hóa chất còn lại đều được đặt mua của các hãng nổi

tiếng như: Merck, BCE…đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên

chuột, Kỹ thuật ELIS, Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột, Kỹ thuật Western Blot….

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch

Trước khi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của

protein BclA tái tổ hợp nhằm tránh khả năng làm giảm hiệu suất tạo kháng thể đa dòng kháng lại

protein quan tâm theo phương pháp điện di SDS-PEGE 12.5%.

Mẫu BclA tái tổ hợp được pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing và

50μl β – mercaptothanol). Mẫu được đun nóng 950C trong 5-10 phút và được đổ vào giếng. Cài đặt

máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút.

Hình 1: Kết quả điện di protein BclA tái tổ hợp trên gel 12.5%

M: Marker prestain (Fermentas)

1: Mẫu BclA tái tổ hợp chưa tinh sạch qua cột Talon (Niken) HP

2: Mẫu rửa qua cột Talon (Niken) HP

3,4,5,6: Các phân đoạn qua cột

116 kDa

66 kDa

45 kDa

35 kDa

25 kDa

18.5 kDa

1 3 4 5 6 M

Kết quả điện di SDS-PAGE ở hình 1 cho thấy: ở cột thứ nhất tương ứng với dung dịch

protein tổng số có xuất hiện một băng khá đậm có kích thước vào khoảng 35kDa, đây là kích thước

của protein BclA, điều đó cho ta thấy trong dung dịch protein tổng số có chứa protein mong muốn.

Cột thứ hai tương ứng với dịch rửa qua cột Niken chỉ xuất hiện các băng rất mờ đó là các protein

không bám cột được đẩy ra bằng đệm rửa cột, tại vị trí 35kDa hầu như protein đã được giữ lại cột.

Từ cột thứ ba đến cột thứ 6, là các phân đoạn tinh sạch chỉ bao gồm một băng duy nhất có trọng

lượng 35kDa tương ứng với kích thước trọng lượng phân tử protein BclA được đẩy khỏi cột bằng

đệm đẩy Imidazol. Như vậy, protein BclA qua cột Niken có độ tinh sạch và hiệu suất qua cột cao.

Kháng nguyên BclA chỉ xuất hiện một băng duy nhất có trọng lượng khoảng 35 kDa đã đảm bảo

cho quá trình gây đáp ứng miễn dịch tiếp theo.

3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch

Chuột dùng cho thí nghiệm được kiểm tra miễn dịch trước khi gây đáp ứng miễn dịch để

đảm bảo lô chuột gây đáp ứng không bị nhiễm B. anthracis . Chúng tôi tiến hành thu 200µl máu

toàn phần của chuột theo phương pháp lấy máu từ tĩnh mạch đuôi chuột, sau đó để đông trong tự

nhiên rồi tiến hành thu huyết thanh.

Chúng tôi tiến hành cộng hợp huyết thanh của chuột với dung dịch hạt vàng nano có kích

thước 40nm, OD 15 để kiểm tra xem sự có mặt của kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp

cũng như dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký

miễn dịch.

Kết quả thử nghiệm như hình 2. Trên các que thử số 1 và số 2, tại các vị trí T1 và T2, tương

ứng với vị trí được trải protein BclA tái tổ hợp và dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than, không thấy xuất

hiện vạch mầu đỏ hồng. Điều đó cho thấy trong huyêt thanh của lô chuột thử nghiệm không chứa

kháng thể kháng protein BclA dạng tái tổ hợp cũng như dạng tự nhiên. Như vậy, lô chuột trước khi

gây đáp ứng miễn dịch đã đảm bảo không bị nhiễm bệnh bởi vi khuẩn B. anthracis, từ đó cho phép

chúng tôi tiến hành những bước nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại

protein tái tổ hợp BclA.

Hình 2: Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh

1: T1 được trải với mẫu protein BclA

2: T2 được trải với dịch phá vỏ bào tử

3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột.

Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với

BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể

kháng BclA tái tổ hợp với quy trình như sau: kháng nguyên BclA sau khi được tinh sạch bằng cột

Talon (Niken) được hòa với đệm PBS và tá dược Freund’s (toàn phần và không toàn phần) rồi tiêm

dưới da bụng chuột. Việc gây kháng thể ở chuột được thực hiện với hai lần tiêm, trong đó lần tiêm

đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dược toàn phần, lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng với tá dược không

toàn phần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 2 tuần. Sau lần tiêm thứ hai 2 tuần chúng tôi tiến hành

thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu

kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch hoặc theo phương

pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch.

Thu nhận kháng huyết thanh từ lô chuột gồm 06 con được gây miễn dịch bằng BclA và

kiểm tra hoạt độ của kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA

Goat anti mouse

(C) T2

1 2

T1

Hình 3: Biểu đồ Elisa về quá trình gây đáp ứng miễn dịch

Kết quả ở hình 3 cho thấy, lượng IgG của chuột tăng dần theo các tuần gây đáp ứng miễn

dịch. Đặc biệt, sau khi tiêm nhắc lại với hỗn hợp tá dược không đầy đủ và kháng nguyên BclA vào

tuần thứ 2 thì lượng IgG tăng nhanh và ổn định vào tuần thứ 4 và tuần thứ 5. Điều đó chứng tỏ lô

chuột được gây đáp ứng miễn dịch đã có phản ứng tích cực với kháng nguyên đưa vào và từ biểu đồ

Elisa cũng cho chúng tôi biết thời điểm tiến hành thu máu tổng số của chuột được gây đáp ứng

miễn dịch.

Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành cộng hợp dung dịch huyết thanh của chuột theo các tuần

theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với

OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây

đáp ứng miễn dịch.

Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh 4) cho thấy kháng thể có

mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano

40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và

mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm.

Hình 4: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA

Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse

Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp

1: Huyết thanh thu tuần 1

2: Huyết thanh thu tuần 2

3: Huyết thanh thu tuần 3

4: Huyết thanh thu tuần 4

Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng

lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. Tại vị trí C

chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích

kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano

40nm. Tại que thử nhứ nhất, chúng ta thấy xuất hiện mầu hồng nhạt tại vị trí T cho ta thấy sau khi

tiêm kháng nguyên vào lô chuột gây đáp ứng miễn dịch thì ngay tuần thứ nhất chuột đã có phản ứng

đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên lạ khi tiêm vào dưới da chuột. Tại que thử thứ 2 vào tuần thứ

2 của quá trình gây đáp ứng miễn dịch đã có sự chững lại về lượng kháng thể sinh ra, bằng chứng

1 2 3 4

Goat anti mouse (C)

BclA (T)

của của kết luận trên là cường độ màu chỉ thị trên que ở vị trí T hầu như chênh rất ít so với tuần thứ

nhất. Tại que thử thứ 3, tại thời điểm này chúng tôi tiến hành tiêm nhắc lại với lô chuột thí nghiệm.

Tại que thử này đã thấy rõ sự khác nhau về màu sắc kết quả tại vị trí T với các que thử thứ nhất và

thứ 2, cho ta thấy rằng quá trình tiêm nhắc lại đã cho kết quả tốt về đáp ứng miễn dịch với chuột. Ở

que thử số 4, qua kết quả chỉ thị màu tại vị trí T, chúng tôi thấy rằng lượng kháng thể có tăng lên

nhưng không nhiều. Do đó, chúng tôi tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành

thu huyết thanh chuột và tinh sạch kháng thể để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái

tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi các loại thuốc gây nghiện là THC,

Morphine để kiểm tra đánh giá khả năng phản ứng chéo và khả năng phong bế (block) các hạt vàng

của dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano

.

Hình 5: Que thử miễn dịch kiểm tra khả năng phản ứng chéo và block hạt vàng

Kết quả (Hình 5) thu được cho phép kết luận rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA

không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). Mặt khác, trên

que thử tại hai vạch T1 và T2 không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung

dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các

liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác.

Goat anti mouse (C) BSA conjugated THC (T1) BSA conjugated Morphine (T2)

Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng

kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công

3.4. Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp

Tuy đã thu được huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với

Protein BclA tái tổ hợp, nhưng thực tế trong huyết thanh vẫn còn rất nhiều các protein không mong

muốn khác. Vì vậy, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP

(hãng GE Healthcare) để loại các protein không mong muốn, nhằm thu được kháng thể IgG kháng

Protein BclA tinh sạch.

Cột HiTrap™ Protein G HP (1x5ml) được cân bằng với đệm rửa cột sodium phosphate 20

mM, pH 7.0. Dung dịch huyết thanh sau khi điều chỉnh pH về pH 7.0 được đưa lên cột với tốc độ là

1ml/phút. Rửa cột bằng đệm sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 để loại các protein không đặc hiệu

với cột với thể tích đệm rửa bằng 5 lần thể tích cột

Sau đó, tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein G-Sepharose) bằng đệm

Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7. Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng được trung hòa về pH

7.0 bằng bằng cách bổ sung 200 μl thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 9.0 trên 1ml phân đoạn, nhằm

tránh cho kháng thể bị biến tính và tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp

Bradford khi đo độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Kết quả thu được ở Hình 6 cho thấy các

phân đoạn cũng chứa các protein (protein không hấp phụ) nhưng với một lượng nhỏ, trong khi đó

phần dịch rửa chiết cho một đỉnh protein rất rõ rệt.

Hình 6: Đồ thị đẩy cột HiTrap™ Protein G HP bằng Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7

Để khẳng định độ tinh sạch của kháng thể thu được, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra

phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu được từ cột protein G-Sepharose bằng kỹ thuật điện di biến tính

SDS-PAGE 12.5%. Kết quả (Hình 7) cho thấy đỉnh protein mà chúng tôi thu được (phân đoạn được

Protein

(A280)

rửa chiết bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7) có hai băng protein duy nhất với khối lượng phân

tử lần lượt là 53kDa và 25kDa, tương ứng với khối lượng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể

IgG. Kết quả này chứng tỏ kháng thể thu được là tinh sạch.

Hình 7: Kết quả điện di tinh sạch kháng thể đa dòng kháng protein BclA

1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder

2: Phân đoạn tinh sạch kháng thể đa dòng

Chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh sạch bằng phương pháp định lượng

protein theo phương pháp Bradford. Kết quả nồng độ kháng thể chúng tôi thu được là 1.3mg/ml.

3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ

thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch

53kDa

25kDa

1 2

6.0kDa

115.5kDa 181kDa

82.2kDa

64.2kDa 48.8kDa

37.1kDa

25.9kDa

19.4kDa

14.8kDa

Với mục đích tạo được kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng nhận biết

được protein BclA tự nhiên có trên vỏ bào tử B. anthracis , chúng tôi tiến hành phá vỏ bào tử B.

anthracis bằng cách cho bào tử vi khuẩn B. anthracis vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu

âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá

vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Trải các thành phần bao gồm: Goat

anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử lên màng Nitrocellulose, ủ màng ở 37oC trong

khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành lắp các thành phần lên que thử. Kết quả tiến hành thử nghiệm được

trình bày ở hình 8.

Hình 8: Kết quả thử nghiệm trên que thử miễn dịch với dịch phá vỏ bào tử.

C: Vạch đối chứng (kiểm tra sự hoạt động của que thử)

T1: Kết quả hiện màu với protein tái tổ hợp

T2: Kết quả hiện màu với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than

Từ kết quả trên cho chúng tôi thấy rằng, bước đầu chúng tôi đã tạo thành công kháng thể đa dòng

bắt được kháng nguyên tự nhiên của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis bằng cách tạo kháng nguyên

trên vỏ bào tử (BclA) theo con đường tái tổ hợp. Để khẳng định một lần nữa kết quả trên chúng tôi

Goat anti mouse (C)

BclA tái tổ hợp (T1)

Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn (T2)

tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng thể đa dòng với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi

khuẩn B. anthracis theo phương pháp Western blot.

3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng

phƣơng pháp Western blot.

Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ

bào tử vi khuẩn than tự nhiên trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí

nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng nguyên- kháng thể giữa kháng thể đa dòng kháng

protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) bằng phương pháp

western blot. Đây là một bước quan trọng để có thể khẳng định được quá trình gây tạo kháng thể đa

dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng bắt cặp được với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử

vi khuẩn B. anthracis.

Hình 9: Kết quả lai chuyển thấm kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể

1: Huyết thanh trước khi gây đáp ứng miễn dịch

2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis có trọng lượng khoảng 70kDa

1 2 3 4

6.0kDa

115.5kDa

181kDa

82.2kDa

64.2kDa

48.8kDa

37.1kDa

25.9kDa

19.4kDa

14.8kDa

3: Protein BclA tái tổ hợp

4: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder

Kết quả lai chuyển thấm miễn dịch ở hình 9 cho thấy: ở giếng 1 tương ứng với huyết thanh

của chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch, không thấy xuất hiện băng điện chuyển nào. Điều này

chứng tỏ kháng thể có trong huyết thanh chuột trước khi được gây đáp ứng miễn dịch không có khả

năng nhận ra hay phản ứng chéo với protein BclA tái tổ hợp. Từ đó cho phép chúng tôi nhận định

rằng trong lô chuột thử nghiệm không bị nhiễm vi khuẩn than trước khi gây đáp ứng miễn dịch.

Mặt khác, kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch ở độ pha

loãng 1000 lần có khả năng nhận biết đặc hiệu với băng chứa BclA tái tổ hợp có kích thước vào

khoảng 35kDa (giếng 3). Ngoài ra, kết quả còn cho thấy kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết

một băng tương tự của dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than có kích thước vào khoảng 70kDa (giếng 2)

tương ứng với kháng nguyên BclA tự nhiên . Kết quả thu được cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận

rằng:

+ Thứ nhất: Việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ

hợp trên chuột bạch đã thành công.

+ Thứ hai: Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng bắt cặp với

kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn than.

3.7. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các

chủng vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B.thuringiensis B. subtilis trên que thử dạng sắc ký

miễn dịch.

Như chúng ta đã biết, thành phần protein BclA có trong vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn

là B. anthracis , B.cereus, B. thuringiensis (hình 5) và chủng vi khuẩn không có protein BclA là B.

subtilis. Do đó sau khi đã tinh sạch kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái

lực Hitrap protein G- Sepharose HP, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng bắt cặp kháng

nguyên kháng thể của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn B.

anthracis , B.cereus, B. thuringiensis.

Chúng tôi tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B. thuringiensis, B.

subtilis bằng cách cho bào tử vi khuẩn của bốn loại vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu

âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá

vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Tiếp theo, trải các thành phần bao

gồm: goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử của 3 chủng vi khuẩn lên màng

Nitrocellulose, ủ màng ở 37oC trong khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành nắp các thành phần lên que

thử.

Tiến hành thử nghiệm trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết quả (Hình 10) như

mong đợi.

Hình 10: Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các

chủng vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B.thuringiensis, B. Subtilis.

1: Dịch phá vỏ bào tử B. subtilis

2: Dịch phá vỏ bào tử B. cereus

3: Dịch phá vỏ bào tử B. thuringiensis

4: Dịch phá vỏ bào tử B. anthracis

1 2 3 4

Goat anti mouse (C)

BclA tái tổ hợp (T1)

Dịch phá vỏ bào tử (T2)

Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử của vi khuẩn B. subtilis, cho kết quả âm tính điều đó

chứng tỏ rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với các

protein trên vỏ bào tử của B. subtilis. Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn

B. subtilis không có chứa thành phần protein BclA trên vỏ bảo tử. Mặt khác, thử nghiệm trên que

thử nhanh với các chủng vi khuẩn B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, chúng tôi đều thu được

kết quả phản ứng tốt giữa kháng thể đa dòng với các dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn

này. Trên que thử kết quả phản ứng cho một màu đỏ nâu, điều đó một lần nữa có thể khẳng định

chúng tôi đã chế tạo thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng

phản ứng lại được với protein BclA tự nhiên. Trên cơ sở đó, từ việc sản xuất thành công kháng thể

đa dòng kháng lại protein BclA trên vỏ của bào tử vi khuẩn than, chúng ta có thể tiến hành những

nghiên cứu tiếp theo để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng lại BclA trên vỏ bào tử của vi

khuẩn Bacillus anthracis

KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

KẾT LUẬN:

Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận

như sau:

1. Bằng phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch, đã sản xuất thành công kháng

thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp.

2. Đã tinh sạch được kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng hệ thống cột

sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP.

3. Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự

nhiên có mặt trong dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than.

HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ

hợp và kháng thể này có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên. Do đó, trong hướng nghiên

cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo

kháng thể đơn dòng kháng lại BclA của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis.

References A. Tiếng Việt

1. Đỗ Ngọc Liên (2004), Thực hành Hóa sinh miễn dịch, Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Hà Nội.

2. Nguyễn Văn Mùi (2001), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

B. Tiếng Anh

3. Abrami, L. N. Reig, and F. G. van der Goot (2005), “Anthrax toxin: the long and

winding road that leads to the kill”. Trends Microbiol, 13:72-78

4. Antibody purification, Handbooks from Amersham Biosciences

5. Aronson, A. I., and P. Fitz-James (1976), “Structure and morphogenesis of the

bacterial spore coat”, Bacteriol. Rev, 40:360-402.

6. Burns R. (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol.

295, 3rd ed, Humana Press.

7. Charlton, S., A. J. Moir, L. Baillie, and A. Moir (1999), “Characterization of the

exosporium of Bacillus cereus”, J. Appl. Microbiol, 87:241-245.

8. Christopher Steichen, Ping Chen, John F. Kearney, and Charles L. Turnbough, Jr.

(2002), Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus

anthracis Exosporium, Department of Microbiology, University of Alabama at

Birmingham, Birmingham, Alabama 3529.

9. Cote, C. K., C. A. Rossi, A. S. Kang, P. R. Morrow, J. S. Lee, and S. L. Welkos

(2005), “The detection of protective antigen (PA) associated with spores of Bacillus

anthracis and the effects of anti-PA antibodies on spore germination and macrophage

interactions”, Microb. Pathog, 38:209-225.

10. Edwards, K. A., H. A. Clancy, and A. J. Baeumner (2006), “Bacillus anthracis:

toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods”, Anal. Bioanal. Chem. ,

384:73-84.

11. Holtzhauer M. (2006), Basic Methods for the Biochemical Lab, Springer.

12. Petosa C., Collier R. J., Klimpel K. R., Leppla S. H., Liddington R. C. (1997),

"Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.", Nature, 385 (6619): 833–838.

13. Rapid Lateral Flow Test Strips, Handbooks from www.millipore.com/diagnostics.

14. Redmond C., L. W. Baillie, S. Hibbs, A. J. Moir, and A. Moir (2004),

“Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis”, Microbiol., 150:355-

363.

15. Ronald E. (2003), Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley &

Sons, Inc.

16. Sylvestre P., E. Couture-Tosi, and M. Mock (2002), “A collagen-like surface

glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium”, Mol.

Microbiol, 45:169-178.

17. Sylvie Salamitou, Ignacio Garcia-Verdugo, David J. S. Hulmes, Richard Chaby

and Anita Lewit-Bentley (2004), The Crystal Structure of the Bacillus anthracis Spore

Surface Protein BclA Shows Remarkable Similarity to Mammalian Proteins, The

American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

18. Tijssen (1985), Practice and theory of enzyme immunoassays, Laboratory

techniques in biochemistry and molecular biology 4th, 15: 242 - 246.

19. Todd S. J., A. J. Moir, M. J. Johnson, and A. Moir (2003), “Genes of Bacillus

cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium”, J. Bacteriol.,

185:3373-3378.

20. Turnbough, C. L., Jr. (2003), “Discovery of phage display peptide ligands for

species-specific detection of Bacillus spores”, J. Microbiol. Methods, 53:263-271.

21. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme

conjugates.". FEBS Letters, 15 (3): 232–6

22. Welkos S., S. Little, A. Friedlander, D. Fritz, and P. Fellows.(2001), “The role of

antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early

stages of infection by anthrax spores”, Microbiology, 147:1677-1685.