trabajo de grado -galns- (corregido 13-01-11)
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PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA N-ACETIL-
GALACTOSAMINA-6-SULFATASA RECOMBINANTE EXTRACELULAR PRODUCIDA EN E. coli BL21/PGEX-GALNS
ANGELA ROCIO MOSQUERA AREVALO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar a los títulos de:
BACTERIÓLOGA Y
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BOGOTÁ, D.C. NOVIEMBRE
2010
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA N-ACETIL-
GALACTOSAMINA-6-SULFATASA RECOMBINANTE EXTRACELULAR PRODUCIDA EN E. coli BL21/PGEX-GALNS
ANGELA ROCIO MOSQUERA AREVALO
APROBADO
_______________________________ CARLOS JAVIER ALMÉCIGA-DÍAZ. QF. Ph.D.
Director
_______________________________ ALEXANDER RODRIGUEZ LOPEZ. Lic. Química
Asesor
________________________________
RAÚL POUTOU PIÑALES. M.Sc. PhD. Evaluador
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA N-ACETIL-
GALACTOSAMINA-6-SULFATASA RECOMBINANTE EXTRACELULAR PRODUCIDA EN E. coli BL21/PGEX-GALNS
ANGELA ROCIO MOSQUERA AREVALO
APROBADO
_______________________________ INGRID SCHULER .Ph.D.
Decana académica Facultad de Ciencias
_______________________________
DIANA PATIÑO C. M.Sc. Directora carrera Bacteriología
_______________________________ JANETH ARIAS PALACIOS M.Sc. Directora carrera Microbiología Industrial
NOTA DE ADVERTENCIA
ARTÍCULO 23 DE LA RESOLUCIÓN No.13 DE JULIO DE 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al
dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar
verdad y justicia”
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y mi hermanito que son el motor de mi vida, gracias por su
comprensión, entrega incondicional y ayuda en los momentos difíciles.
A Jorge Andrés por creer en mí y haberme acompañado en cada uno de los
procesos de este trabajo.
Al Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, al Dr. Luis Alejandro Barrera
por la oportunidad y confianza, a Jenny, Ninna, Magda, Rochi, Linita, Juanita,
Olguita, Maria Lu, Ines Stella, Andrea y Estelita por brindarme su completo
apoyo, por depositar entera confianza en mí, por ayudar a sentirme útil y
perseverante.
Al Dr. Javier Alméciga; más que mi director, mi maestro en la ciencia.
Al profe Alex y Joko, porque siempre buscaron hacer de mi una gran persona
y por abrirme las puertas en el momento oportuno.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION 13
1. MARCO CONCEPTUAL 15
1.1 MUCOPOLISACARIDOSIS 15
1.2 SÍNDROME DE MORQUIO A 16
1.3 N-ACETIL-GALACTOSAMINA-6-SULFATO SULFATASA 20
1.4 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES 21
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 24
3. OBJETIVO GENERAL 25
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25
4. ASPECTOS METODOLÓGICOS 26
4.1 OBTENCIÓN DE LA PROTEINA RECOMBINANTE 26
4.2 PURIFICACION DE LA ENZIMA GALNS RECOMBINANTE 26
4.2.1 Protocolo tratamiento No.1 26
4.2.2 Protocolo de tratamiento No. 2 27
4.2.3 Métodos Cromatográficos 27
4.2.4 Evaluación de la purificación 28
4.2.4.1 Cuantificación de proteína por método Bradford 28
4.2.4.2 Actividad Enzimática de GALNS 29
4.2.4.3 Electroforesis en SDS-PAGE 29
4.3 ANALISIS DE ESTABILIDAD DE LA ENZIMA RECOMBINANTE 29
GALNS
4.3.1 Efecto de la temperatura 29
4.3.2 Efecto del pH 30
4.3.3 Estabilidad en suero humano 30
4.4 EVALUACION IN VITRO DE LA ENZIMA GALNS RECOMBINANTE 30
4.4.1 Cuantificación de proteína por método Folin-Lowry 31
5. RESULTADOS 32
5.1 PURIFICACIÓN DE LA PROTEINA RECOMBINANTE GALNS 32
5.1.1 Protocolo de tratamiento No. 1 32
5.1.2 Protocolo de tratamiento No. 2 33
5.1.3 Métodos Cromatográficos 35
5.2.3.1 Columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow 35
5.2.3.2 Columna de intercambio catiónico Macro-Prep® CM Support 38
5.2.3.3 Columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High 40
Resolution
5.3 ANALISIS DE ESTABILIDAD DE LA ENZIMA RECOMBINANTE 44
GALNS
5.3.1 Estabilidad a diferente pH 44
5.3.2 Estabilidad a diferentes temperaturas 44
5.3.3 Estabilidad en suero 45
5.4 EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ENZIMA RECOMBINANTE 46
GALNS
6. DISCUSIÓN 48
7. CONCLUSIONES 54
8. RECOMENDACIONES 55
9. BIBLIOGRAFÍA 56
ANEXO 1 61
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1: Proteína y actividad enzimática volumétrica y específica de alícuotas de cada paso del protocolo 1 de tratamiento.
Figura 2: SDS-PAGE de alícuotas de cada paso del protocolo de tratamiento No1.
Figura 3: Proteína y actividad enzimática de alícuotas de cada paso del protocolo 2 de tratamiento.
Figura 4: SDS-PAGE de alícuotas de cada paso del protocolo de tratamiento No 2.
Figura 5: Proteína y actividad enzimática de alícuotas de cada paso del protocolo escogido para continuar el proceso de purificación.
Figura 6: Ensayo en columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow con diferentes volúmenes de muestra.
Figura 7: Ensayo en columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow con buffer y muestra en diferente pH.
Figura 8. a) Cromatograma de columna Q-SepharoseTM Fast Flow. b y c). SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de intercambio aniónico.
Figura 9: Ensayo columna Q-SepharoseTM Fast Flow con diferente volumen de muestra inyectado en columna de intercambio catiónico.
Figura 10: a) Cromatograma de columna de intercambio catiónico Macro-Prep® CM Support. b) SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de intercambio catiónico.
Figura 11: Proteína y actividad enzimática producto de la separación por columna de exclusión molecular de las fracciones de pico 2 separados por columna de intercambio aniónico.
32 33 34 34 35 36 37 38 39 40 41
Figura 12: a) Cromatograma de columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High Resolution b y c) SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de exclusión molecular .
Figura 13: Resumen del proceso completo de purificación. SDS-PAGE con tinción de nitrato de plata.
Figura 14: Proteína y actividad enzimática de la enzima recombinante GALNS en diferentes condiciones de pH.
Figura 15: Proteína y porcentaje de actividad volumétrica de la enzima recombinante GALNS en diferentes condiciones de temperatura.
Figura 16: Porcentaje de actividad volumétrica de la enzima recombinante GALNS en incubación con suero de individuos normales.
Figura 17: Evaluación de la capacidad de la enzima recombinante GALNS de ser capturada por células HEK 293.
42 43 44 45 46 47
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1: Clasificación MPS (adaptada de Rodríguez F, et al 2003)
Tabla 2: Resumen purificación de la enzima recombinante GALNS producida en E.coli
16 43
RESUMEN
La mucopolisacaridosis IV A (Enfermedad de Morquio A) es causada por la
deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) y
actualmente no existe un tratamiento específico. En éste trabajo se purificó y
caracterizó la enzima recombinante N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa
(GALNSr) obtenida producida en E. coli BL21/pGEX-GALNS.
La enzima se purificó mediante un proceso que involucró etapas de filtración,
ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de
exclusión molecular. Se evaluó la estabilidad de la enzima a pH 3,0; 4,0; 5,0;
5,5 y 7,0; a temperaturas de 4, 37 y 45 ºC, y en suero. Adicionalmente, se
evaluó la capacidad de ser capturada por células HEK 293 en
concentraciones de enzima de 10, 50 y 100 nM.
El proceso de purificación permitió un 21 % de recuperación de la enzima
con una actividad específica final de 0,29 nmol/mg/h. La enzima fué estable a
4 ºC hasta por 8 días y en suero hasta 4 horas, su máxima actividad
enzimática fué a pH 5,5, y el ensayo in vitro en células HEK 293 mostró que
la enzima no fue capturada por las células.
En conclusión, este trabajo aporta información importante sobre la
purificación, su estabilidad y capacidad de captura por células para este tipo
de proteína recombinantes producidas en E. coli.
ABSTRACT
Mucopolysaccharidosis IV A (Morquio A syndrome) is caused by a deficiency
of the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS); currently
no vital therapies for the syndrome exist. In this work a recombinant enzyme
(N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase produced in E. coli BL21/pGEX-
GALNS and free in culture medium) was characterized.
The enzyme was purified by a process involving stages of filtration,
ultrafiltration, anion-exchange chromatography and size exclusion
chromatography. The stability of the enzyme was evaluated at pH 3,0; 4,0;
5,0; 5,5 y 7,0; temperature of 4, 37 y 45 ºC and in human serum. Additionally,
the enzyme in vitro uptake was evaluated in HEK 293 cells at concentrations
of the enzyme of 10, 50, 100 nM.
The purification process allowed a 21% recovery of the enzyme with a final
specific activity of 0.29 nmol/mg/h. The enzyme was stable at 4 ºC during 8
days and in serum during 4 hours. The maximum enzyme activity was
observed at pH 5,5. In vitro uptake assay in HEK 293 cells showed that the
cells did not capture the enzyme.
In conclusion, this work provides important information about the purification,
stability and cell uptake of this type of recombinant proteins produced in E.
coli.
13
INTRODUCCIÓN
La mucopolisacaridosis IVA o enfermedad de Morquio A (OMIM # 230500) es
producida por la deficiencia de la enzima N-acetil-galastosamina-6-sulfato
sulfatasa (GALNS) y tiene una frecuencia de presentación a nivel mundial de
un caso por cada 40.000 a 200.000 nacidos vivos. En la actualidad no se
dispone de un tratamiento específico y su manejo es sintomático. La terapia
de reemplazo enzimático (TRE) promete ser una alternativa de tratamiento al
proporcionar la enzima activa al paciente y así disminuir la acumulación de
las sustancias no degradadas en lisosomas por la deficiencia de la enzima
GALNS. Adicionalmente, los resultados observados en otras
mucopolisacaridosis que cuentan con TRE soportan la idea de desarrollar
este tipo de terapia para la enfermedad de Morquio A.
Durante los últimos años el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo
(IEIM) ha trabajado en la producción de enzimas recombinantes en
microorganismos como Escherichia coli y Pichia pastoris. Adicionalmente,
se han realizado algunos estudios conducentes a la separación y purificación
de estas proteínas recombinantes, como es el caso de la Iduronato 2-sulfato
sulfatasa (IDS). Para el caso específico de la enzima GALNS recombinante
se ha logrado su producción en E.coli BL21 a escala de 100mL y 3L,
empleando diferentes tipos de cultivo (lote y lote alimentado). Sin embargo,
hasta el momento la enzima obtenida no había sido purificada o
caracterizada con el objetivo de evaluar de forma más completa el modelo de
producción propuesto.
Teniendo en cuenta que la expresión de GALNS recombinante en E.coli
BL21 ha mostrado ser un método viable para la producción de dicha enzima,
14
en el presente trabajo se purificó y realizó una caracterización preliminar de
esta enzima recombinante con el fin de conocer algunas de sus propiedades
y evaluar la posibilidad de usar esta enzima para el tratamiento de la
enfermedad de Morquio A.
15
1. MARCO CONCEPTUAL
1.1 MUCOPOLISACARIDOSIS
Los Errores Innatos del Metabolismo (EIM) son trastornos de origen genético
del metabolismo de los carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, proteínas y
hormonas, que conducen a síntomas graves en el neonato, infante y adulto
(Barrera L A, 2009). Se conocen hasta el momento cerca de 600 EIM con
una prevalencia global de 1/600 recién nacidos vivos. Entre los EIM se
encuentran las mucopolisacaridosis (MPS) que son un grupo de
enfermedades originadas por la alteración en el metabolismo de los
glucosaminoglicanos (GAG), también llamados mucopolisacáridos. Estos
compuestos se encuentran presentes en el lisosoma y participan en la
formación de los huesos, tendones, cartílago, córnea, piel y tejido conectivo
(Muenzer J, 2004). Las MPS son clasificadas en 9 tipos dependiendo de la
enzima que se encuentra alterada (Tabla 1).
Para la valoración de una MPS la clínica del paciente arroja un diagnóstico
presuntivo que posteriormente se confirma mediante pruebas de laboratorio.
La aproximación desde el laboratorio se inicia con un tamizaje de
mucopolisacáridos en orina para identificar la acumulación de los GAG con
pruebas cualitativas como la albumina ácida y el cloruro de cetilpiridinio
(CPC) o pruebas cuantitativas como el azul de 1,9-dimetilmetileno (Echeverri
O, 1995). El siguiente paso es la identificación del GAG que se excreta en
exceso por medio de electroforesis en gel de agarosa o cromatografía en
capa fina. Finalmente, el diagnóstico confirmatorio se realiza con el estudio
de la actividad enzimática en plasma, leucocitos o fibroblastos. En la
actualidad se puede hacer la determinación de la mutación correspondiente
la cual en algunas ocasiones permite hacer una relación fenotipo-genotipo.
(Tomatsu S et al, 2005 y Tomatsu S et al, 2009)
16
Tabla 1: Clasificación MPS (adaptada de Rodríguez F et al, 2003) Tipo de MPS Epónimo Enzima Deficiente GAG acumulado
MPS IH Enfermedad de Hurler α-L-iduronidasa
MPS IS Enfermedad de Scheie α-L-iduronidasa
MPS IH/S Enfermedad de Hurler-Scheie α-L-iduronidasa
MPS II grave Enfermedad de Hunter grave Iduronato sulfatasa
MPS II atenuada Enfermedad de Hunter menos
grave Iduronato sulfatasa
Dermatán Sulfato,
Heparán Sulfato
MPS III A Enfermedad de Sanfilippo A Heparán N-sulfatasa
MPS III C Enfermedad de Sanfilippo C Acetil CoA: α-
glucosaminidotranferasa
MPS III D Enfermedad de Sanfilippo D N-acetilglucosamina-6-
sulfatasa
Heparán Sulfato
MPS IV A Síndrome de Morquio A N-acetilgalactosamina-6-
sulfatasa
Queratán Sulfato,
Condroitin Sulfato
MPS IV B Síndrome de Morquio B β-galactosidasa Queratán Sulfato
MPS VI Síndrome de Marotaux-Lamy N-acteilgalactosamina-4-
sulfatasa (Arilsulfatasa B) Dermatán Sulfato
MPS VII Enfermedad de Sly β-D-Glucoronidasa Dermatán Sulfato,
Heparán Sulfato
MPS IX Deficiencia de Hialorunidasa Hialorunidasa Acido Hialurónico
1.2 SÍNDROME DE MORQUIO A
El síndrome de Morquio tipo A (MPS IVA, OMIM # 230500) fue descrito
inicialmente por el pediatra uruguayo Luis Morquio en 1929 como una
enfermedad de depósito lisosomal (EDL) con herencia autosómica recesiva
que afecta tanto a hombres como a mujeres. Es causado por una mutación
en el gen que codifica para la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa
(GALNS), ubicado en el cromosoma 16q24.3. Cerca de 150 mutaciones han
sido descritas en el gen GALNS, mostrando una gran heterogeneidad en las
mutaciones asociadas a una amplia variabilidad clínica. (Tomatsu S et al,
2005)
17
La deficiencia de la enzima GALNS impide la degradación del queratán
sulfato (QS) y condroitin sulfato (CS). La acumulación de QS se relaciona
clínicamente con la aparición de opacidad corneal y alteraciones
esqueléticas sin alteración neurológica. El crecimiento y desarrollo de los
pacientes es normal durante el primer o segundo año de vida, por lo que el
diagnóstico es realizado frecuentemente entre los 2 y 4 años de edad. Por lo
general, son niños con talla baja, macrocefalia, cuello corto, maxilar
prominente con gran espacio entre los dientes, displasia de cadera, genu
valgum, hiperlaxitud de articulaciones, sordera, insuficiencia aórtica y
hepatomegalia leve. La esperanza de vida es variable, dependiendo del
espectro de gravedad de la enfermedad, pero la mayoría de los pacientes
mueren entre la segunda y tercera década de vida por problemas
cardiopulmonares (Lankester B et al, 2006).
Montaño A, et al (2008) demostraron que la altura media aproximada de los
niños es de 52,6 cm y de las niñas 52,1 cm y para hombres y mujeres
mayores de 18 años es de 122,4 ± 21,5 y 113,1 ± 22,6 cm, respectivamente.
Además, el peso medio de los niños es de 3,59 ± 0,58 kg y el de las niñas
3,5 ± 0,7 Kg. El índice de masa corporal para hombres y mujeres mayores de
18 años es de 24,7 ± 6,1 y 25,6 ± 5,4 kg/m2, respectivamente. Valores que se
encuentran por debajo de los observados en niños y adultos sanos.
En la actualidad no existe una cura o tratamiento específico para esta
enfermedad. El tratamiento se limita al manejo de los diferentes síntomas en
los sistemas afectados con el fin de mejorar la calidad de vida del paciente y
su familia (Montaño AM, et al 2007). Aunque el transplante de médula ósea
es una opción de tratamiento en algunas mucopolisacaridosis, presenta un
beneficio limitado en la enfermedad de Morquio A, adicional a la alta tasa de
mortalidad asociada con este procedimiento (Prassad V et al 2010). La
terapia génica, explorada ampliamente en modelos animales de
mucopolisacaridosis (Sands M et al, 2006) ha mostrado ser una alternativa
18
viable para el tratamiento de la enfermedad de Morquio A (Toietta G et al
2001; Gutiérrez M et al, 2008; Alméciga-Díaz et al, 2010). Sin embargo, esta
alternativa aun se encuentra en etapas iniciales y se requieren trabajos
adicionales antes de que pueda ser aplicada a humanos. Otras terapias
como la reducción de síntesis de sustrato o el uso de chaperonas
farmacológicas actualmente en estudio para el tratamiento de algunas
enfermedades lisosomales (Parenti G et al, 2009), aun no han sido
exploradas en la enfermedad de Morquio A.
En la actualidad la alternativa principal de tratamiento para este tipo de
enfermedades es la Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE), la cual fue
planteada a mediados de los años 60 cuando se demostró que la aplicación
directa de una enzima purificada en cultivos celulares producía una
disminución de los niveles de GAG (Barrera L.A. 2009). El objetivo es
suministrarle al paciente una enzima activa que reemplace la afectada, la
cual deberá ser capturada por las células para que ocurra la degradación del
material acumulado. Las enfermedades de Gaucher tipo I, Fabry, Hurler
(MPS I), Marotaux-Lamy (MPS VI), Pompe y Hunter (MPSII), cuentan con
TRE aprobadas que han permitido disminuir las manifestaciones sistémicas
de la enfermedad y mejorar significativamente la calidad de vida de los
pacientes ( Lemes A et al, 2006; Lim-Melia ER et al, 2009)
Las proteínas recombinantes de interés terapéutico son biofármacos
obtenidos mediante la inserción del gen que expresa la proteína de interés en
bacterias, hongos, células animales, levaduras, entre otros, lo que permite
obtener altas cantidades de la proteína recombinante (Gamboa et al, 2009).
En la mayoría de los casos, estas moléculas presentan mayor acción
terapéutica y menos reacciones secundarias, al ser prácticamente
homólogas a las producidas por el organismo.
Para el caso de la MPS IVA la TRE ha sido evaluado en el modelo murino de
la enfermedad (Tomatsu S et al, 2008), empleando dos enzimas
19
recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino (CHO) una
nativa y otra activada con SUMF1, las cuales tienen un tiempo de vida media
de 2,4 y 3,3 min, respectivamente. Con dosis intravenosas de 250 U/g de
peso corporal se observó un aumento de la actividad enzimática en hígado,
bazo, hueso y medula ósea y las concentraciones de QS en suero
disminuyeron a niveles normales luego de 12 semanas de tratamiento. Por
tanto, se demostró que la enzima es capaz de llegar a sus sitios de destino y
actuar sobre QS, lo cual aporta importante datos preclínicos para el
desarrollo de la TRE como tratamiento de la MPS IVA. En la actualidad la
TRE para la MPS IVA se encuentra en fase clínica I/II empleando una enzima
producida en células CHO.
Durante los últimos 10 años el IEIM ha realizado avances significativos en la
producción de enzimas lisosomales en Pichia pastoris (Córdoba-Ruíz HA et
al, 2009; Landázuri P et al, 2009) y Escherichia coli (Landázuri P et al, 2003;
Poutou RA et al, 2010), mostrando la posibilidad de producir enzimas activas
en estos sistemas de expresión. Recientemente, se reportó la producción de
la enzima GALNS recombinante en E. coli BL 21 transformada con el
plásmido pGEX-3X-GALNS (Rodríguez A et al, 2010). La producción de la
enzima fue realizada en un cultivo lote a escalas de 100 mL y 3 L. Los
resultados mostraron que los mayores niveles de actividad específica GALNS
estaban en la fracción soluble luego de 2 a 4 horas de inducción con valores
de 0,067 y 0,078 nmol/mg/h respectivamente. Aunque se observó mayores
cantidades de enzima recombinante en los cuerpos de inclusión (71% del
total de GALNS recombinante), la actividad enzimática mostró valores
inferiores a los observados en la fracción soluble, sugiriendo que el proceso
de solubilización y replegamiento de los cuerpos de inclusión tiene un efecto
negativo sobre la actividad enzimática. El análisis por Western blot mostró
una banda de 50 kDa tanto en el lisado celular como en los cuerpos de
inclusión, similar a lo observado con la enzima producida en células CHO.
20
Con el objetivo de aumentar los niveles de producción de la enzima
recombinante GALNS, se empleó un sistema de cultivo en lote alimentado el
cual permitió aumentar hasta en 5 veces los niveles de producción de la
enzima (Leonardi F, 2010). Un hallazgo importante en este estudio fue la
detección de actividad enzimática GALNS en el medio de cultivo, lo cual
concuerda con lo observado en trabajos previos adelantados en el IEIM
(Leonardi F, Rodríguez A, Alméciga-Díaz CJ, Sánchez O, datos sin publicar).
Aunque se desconoce el mecanismo por el cual la enzima recombinante es
detectada en el medio de cultivo, estos resultados representan evidencias a
favor de la posibilidad de hacer la purificación de la enzima a partir del medio
de cultivo.
1.3 N-ACETIL-GALACTOSAMINA-6-SULFATO SULFATASA
GALNS (E.C.3.1.6.4), es una enzima capaz de hidrolizar los grupos 6-sulfato
de las unidades de N-acetil-D-galactosamina 6-sulfato del CS y las unidades
de D-galactosa 6-sulfato del QS (BRENDA, 2010). GALNS está codificada
por el gen GALNS ubicado en el cromosoma 16q24,3.
La enzima es estable a 4ºC, con un pH óptimo entre 3,5 y 5,2 (Glôssl J,
1979) y con un punto isoeléctrico entre 5,5 y 6,5 (Bielicki J et al. 1995).
Según Tomatsu S. et a l (2007), la enzima presenta mejor actividad a pH 5,5
(4,8 y 5,3) pues a 6,5 y 7,5 hay pérdida de actividad y tiene una vida media
de 2,9 minutos.
Escherichia coli es uno de los modelos más simples para la producción de
proteínas recombinantes como las sulfatasas, pues es capaz de expresar
proteínas solubles o en forma de agregados intracelulares (cuerpos de
inclusión) (Demain AL et al, 2009). La principal desventaja de este sistema
de expresión es que no dispone de mecanismos para la glicosilación de las
proteínas, lo cual puede tener efectos sobre la estabilidad y actividad de la
21
proteína (Henry CA et al, 2003; Gamboa et al, 2009; Demain AL et al 2009).
Sin embargo, el efecto de la ausencia de esta modificación postraduccional
sobre la estabilidad, actividad y acción terapéutica no puede ser generalizado
y parece ser un proceso específico de cada proteína (Walsh G et al, 2006; Li
H et al, 2009). Para el caso específico de sulfatasas humanas producidas en
E. coli, estudios previos han mostrado que la glicosilación parece no ser
necesaria para la producción de una enzima activa (Landázuri P et al, 2003;
Poutou RA et al, 2010; Rodrigez A et al, 2010), aunque sus efectos sobre la
estabilidad y captura celular no han sido evaluados.
1.4 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
El objetivo de la purificación es aumentar la actividad específica de una
muestra hasta un valor igual al de la actividad específica esperada para la
proteína pura. En este proceso es importante el porcentaje de recuperación
del producto, que consiste en obtener la mayor cantidad de producto con
respecto al inicial, con la menor pérdida posible y la pureza exigida como
mínima para el producto. En caso de proteínas terapéuticas, en el mayor de
los casos, la pureza final debe ser mayor al 99% (Gamboa et al. 2009). La
mayoría de protocolos de purificación requieren más de un paso para
alcanzar el nivel deseado de pureza del producto. Los procesos de
concentración y purificación comprenden en general procesos de
centrifugación, decantación, filtración, ultrafiltración y separación por
cromatografía de afinidad, de intercambio iónico o en gel de exclusión
molecular hasta aislar el producto.
La necesidad de preparación de la muestra antes de la cromatografía
depende del tipo de muestra. Así, en algunos casos un paso clave en el
aislamiento de una enzima es la separación de sólidos de líquidos que se
puede llevar a cabo por centrifugación o filtración. Para esto se ponen en uso
diferentes tamaños de poros en membranas que permitan separar la proteína
22
de interés. Para concentrar la proteína tradicionalmente se ha empleado la
precipitación de proteínas mediante sales como el sulfato de amonio debido
a su alta solubilidad, a la ausencia de toxicidad para la gran parte de enzimas
y a su bajo costo. Sin embargo, la precipitación con sulfato de amonio resulta
productiva en ensayos a pequeña escala, pero puede ser no apto para la
preparación de gran escala. De igual forma, la diálisis y otros métodos
comunes usados para el ajuste de las condiciones de la muestra son
inadecuados para muestras muy grandes o muy pequeñas (Protein
purification, Amersham Biosciences).
La cromatografía permite aislar o separar proteínas de otras moléculas de
características similares, algunos tipos de cromatografía son:
1. La cromatografía de exclusión molecular, permite separar mezclas de
proteínas por tamaño. Generalmente con columnas rellenas de
polímeros como el Sephadex (Polímeros de dextrano), Sephacryl
(Dextrano bisacrilamida), Superdex (agarosa y dextrano), la columna
es equilibrada con un buffer de corrido y es inyectado 0,5-5% del
volumen de columna.
2. La cromatografía de intercambio iónico consiste en una matriz porosa
que puede ser puede ser de Sephadex o Sepharose (Agarosa) con
grupos cargados (positiva o negativamente) que se unen a muestras
de carga opuesta. La elución se logra con aumento de la
concentración de sal en la solución eluyente o por cambio de pH.
3. La cromatografía de interacción hidrofóbica se basa en la interaccione
de los grupos hidrofóbicos de la proteína con un soporte igualmente
hidrofóbico (matriz de agarosa con ligandos butil o fenil). Se carga la
columna con la proteína disuelta en una solución de fuerza iónica
elevada favoreciendo su interacción con el soporte hidrofóbico y se va
disminuyendo la fuerza iónica (con eluyentes como sulfato amónico)
eluyendo las proteínas en función de su hidrofobicidad.
23
4. La cromatografía de afinidad es más selectiva pues se genera una
interacción específica entre el soporte y la proteína, esta afinidad
puede ser dada por anticuerpos, por grupos funcionales, por enzimas,
por glicoproteínas, entre otras etc.
24
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
En la actualidad el tratamiento para esta enfermedad está basado en el
manejo sintomático, sin cambios definitivos en el progreso de la enfermedad.
Diferentes grupos de investigación a nivel mundial trabajan en otras formas
de tratamiento como el trasplante de médula ósea, la terapia génica y la
TRE. Ensayos preclínicos de TRE han permitido plantear la posibilidad de
mejorar la calidad de vida de los pacientes con la producción de la enzima
GALNS recombinante en células eucariotas. Recientemente se demostró la
posibilidad de realizar la producción de una enzima GALNS recombinante en
E. coli BL21. A pesar de ser posible la obtención de una enzima GALNS
recombinante activa, aun no se ha realizado la purificación, caracterización y
evaluación en cultivos celulares.
En consecuencia, la caracterización de la enzima GALNS recombinante
permitirá exponer la magnitud del avance conseguido con el modelo de
producción procariota de GALNS en E.coli BL21 permitiendo conocer
algunas de sus características como sus rangos de estabilidad de pH y
temperatura y conocer si la enzima es capaz de ser capturada por células.
Adicionalmente, este trabajo permitirá conocer de manera indirecta el efecto
de las glicosilaciones sobre la estabilidad y captura de la proteína. El uso de
una enzima producida en un modelo procariota podría tener un impacto
importante en los costos de producción en comparación con los observados
en modelos de células eucariotas, lo cual puede reducir los costos de
tratamiento, beneficiando a una población cuyas necesidades médicas no
están incluidas en los programas de salud mundiales.
25
3. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar la enzima extracelular recombinante N-acetil-galactosamina-6-
sulfato sulfatasa producida por E. coli BL21/pGEX-GALNS.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Purificar la enzima recombinante GALNS obtenida extracelularmente en
Escherichia coli BL21/pGEX-GALNS.
2. Evaluar el efecto de la temperatura y el pH en la actividad de la enzima
recombinante GALNS.
3. Evaluar la captura de la enzima recombinante GALNS por células HEK
293.
26
4. ASPECTOS METODOLÓGICOS
4.1 OBTENCIÓN DE LA PROTEINA RECOMBINANTE
La enzima recombinante fue producida en un trabajo previo mediante cultivo
en lote alimentado a una escala de 3 L de la cepa E. coli BL21/pGEX-GALNS
(Leonardi F, 2010). La inducción se realizó con 1,5mM de isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido (IPTG), durante 4 h, al cabo de las cuales se recolectó
la totalidad de la biomasa y el extracto crudo, adicionalmente, la biomasa se
separó por centrifugación a 10000 rpm por 15 min y 4ºC.
Análisis preliminares mostraron que el extracto crudo se encuentra
conformado principalmente por una proteína con un peso molecular similar al
reportado en el lisado celular de E.coli BL21/pGEX-GALNS y con actividad
enzimática alta (Leonardi F, Rodriguez A, Alméciqa-Díaz CJ, Sánchez O,
datos sin publicar).
4.2 PURIFICACION DE LA ENZIMA GALNS RECOMBINANTE
4.2.1 Protocolo tratamiento No.1 El medio de cultivo (300 mL) se filtró por papel de filtro Whatman No1 y
membrana estéril de 0,45 µm y 0,2 µm (PALL Life Science). Posterior a la
filtración se ajustó el pH a 5,5 con ácido acético. La muestra filtrada se
ultrafiltró a través de una membrana de 30 kD (Millipore) hasta llegar a un
volumen aproximado de 15 mL. Finalmente, el retentato fue dializado contra
buffer acetato de sodio 25 mM pH 5,5; haciendo tres cambios de buffer en 20
horas a 4ºC y con agitación constante.
27
4.2.2 Protocolo de tratamiento No. 2
El medio de cultivo (800 mL) se filtró por papel de filtro Whatman No1 y
No42, se ajustó el pH a 5,5 con ácido acético y se continuó la filtración por
membrana estéril de 0,45 µm y 0,2 µm (PALL Life Science). Posterior a la
filtración, aproximadamente 200 mL de muestra fueron sometidos a
precipitación con sulfato de amonio puro hasta saturación (aproximadamente
42%). El precipitado se resuspendió en 1,5mL de acetato de sodio 25 mM pH
5,5 y se dializó contra buffer acetato de sodio 25 mM pH 5,5 haciendo tres
cambios de buffer en 20 horas a 4ºC y con agitación constante.
4.2.3 Métodos Cromatográficos Aproximadamente 800 ml de medio fueron filtrados y ultrafiltrados como se
describió previamente, hasta alcanzar un volumen final aproximado de 20 ml.
Esta muestra fue almacenada a 4 ºC y fue empleada para la evaluación de
los diferentes métodos cromatográficos.
El proceso de captura se realizó usando el sistema de cromatografía de baja
presión BioLogic LP (Bio-Rad). En este sistema se evaluó la purificación de
la proteína recombinante mediante cromatografía de intercambio iónico y de
exclusión molecular. Para esto se empleó una columna de intercambio
aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences), de intercambio
catiónico Macro-Prep® CM Support (Biorad) y una columna de exclusión
molecular SephacrylTM S-200 High Resolution (Amersham Biosciences). El
tamaño de las columnas fue de 3 mL para las de intercambio iónico y de 20
mL para la de excusión molecular y el flujo del sistema fue de 5,0 mL/min y
0,5 mL/min para columnas de intercambio iónico y exclusión molecular,
respectivamente.
En la columna de intercambio aniónico se evaluó el volumen de muestra
inyectado de 1,5; 3 y 6 mL en el sistema y el pH del buffer de carga
empleado Tris HCl 25 mM pH 7,0 y 7,5. En la columna de intercambio
28
catiónico se evaluó el volumen de muestra inyectado de 1,5; 3 y 6 mL en el
sistema y el buffer de carga usado fue acetato de sodio 25 mM pH 5,0.
En las columnas de intercambio iónico el proceso de separación consistió en
pasar la solución de carga indicada en cada columna aproximadamente 10
veces el volumen de columna empacado, luego se inyectó la muestra en el
sistema y cuando se observó aumento en la absorbancia se recolectó el
volumen completo del pico (fracción no unida) hasta que la absorbancia
regresó a su estado basal. Posteriormente, se realizó la elución de las
proteínas con buffer de carga enriquecido con NaCl 0,5 M. A diferencia de la
fracción no unida, la fracción unida fue recolectada en alícuotas de 1 mL.
En la columna de exclusión molecular se inyectaron 6 mL de muestra y el
buffer empleado fue Tris HCl 25 mM pH 7,0 con NaCl 0,01 M. La columna fue
equilibrada con 10 volúmenes de columna. Una vez adicionada la muestra, la
recolección se realizó empleando el mismo buffer de carga y se recolectaron
alícuotas de 1 mL. Finalmente, las muestras con mayor actividad se
liofilizaron a 0,28 mbares y -80 ºC por 5 horas en el liofilizador Freezone 12.0
(LABCONCO). Los liofilizados, se reconstituyeron en 1 mL de buffer Tris HCl
25mM pH 5,5 y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.
4.2.4 Evaluación de la purificación Alicuotas de 1 mL se tomaron en cada una de las etapas del proceso para
cuantificación de proteína por método de Bradford, actividad enzimática
GALNS y electroforesis en SDS-PAGE.
4.2.4.1 Cuantificación de proteína por método Bradford En microplaca de 96 pozos (Nunc Maxisorp) se agregaron 4 µL de muestra y
196 µL de reactivo de Bradford (Biorad) dilución 1:5. La mezcla se incubó
por 5 minutos a temperatura ambiente y la absorbancia se leyó a 595 nm en
lector de placas Anthos 2020 Reader (Biochrom Anthos). La concentración
de proteína fue calculada empleando una curva de albumina de suero bovino
29
(BSA) de 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 y 1 mg/mL preparadas en solución salina al
0,85%.
4.2.4.2 Actividad Enzimática de GALNS Para evaluar la actividad enzimática de GALNS se agregaron 20 µL del
sustrato 4-metilumbeliferilβ-‐D-‐Galactopiranosido-6-sulfato de sodio 2mM
(TRC) y 10 µL de la muestra en tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. La
mezcla se incubó por 17 horas a 37ºC en baño serológico. Posteriormente,
se adicionaron 2 µL de β-galactosidasa de Aspergillus orizae (Sigma) 10
mg/mL, incubando la reacción por 2 horas a 37ºC en baño serológico.
Finalmente, la reacción se detuvo con buffer glicina carbonato pH 9,8 y se
leyó la fluorescencia en fluorómetro Modulus (Turner Biosystems) a λex 365
nm y λem 460 nm..
4.2.4.3 Electroforesis en gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
La electroforesis en gel de poliacrilamida se realizó en un gel de
poliacrilamida al 10 % en condiciones reductoras diluyendo las muestras en
buffer Laemmli (BioRad) con 2-mercaptoetanol (Sigma). Se mantuvieron las
condiciones de corrido a 120V, 60 mA durante 1,5 horas. Los geles se
tiñeron con azul de Coomassie (Sigma) o tinción de plata (Ausubel FM et al,
1999).
4.3 ANALISIS DE ESTABILIDAD DE LA ENZIMA RECOMBINANTE GALNS
4.3.1 Efecto de la temperatura Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la enzima, 20
µL de la enzima purificada fue incubada a 4 ºC (nevera), 37 ºC (baño
serológico) y 45 ºC (baño seco) durante 1, 2, 4, 6,12, 96, 120 y 192 horas. Al
cabo de esta incubación se realizó determinación de actividad enzimática y
medición de proteína. Los ensayos fueron realizados por duplicado.
30
4.3.2 Efecto del pH
Para evaluar el efecto del pH sobre la estabilidad de la enzima, 10 µL de la
enzima purificada fueron incubados con 10 µL buffer citrato de sodio 50 mM
pH 3,0; buffer acetato de sodio 50mM pH 4,0; 5,0 u 6,0; o Tris HCl 50 mM pH
7,0 u 8,0. Las muestras se incubaron a 37 ºC por 1 hora. Al cabo de esta
incubación se realizó determinación de actividad enzimática y medición de
proteína. Los ensayos fueron realizados por duplicado.
4.3.3 Estabilidad en suero humano Para evaluar la estabilidad de la proteína en suero humano 10 µL de la
enzima purificada fueron incubados por 1 hora a 37 ºC con 10 µL de un pool
de suero humano obtenido de individuos sanos previa firma de
consentimiento informado (Anexo 1). Al cabo de esta incubación se realizó
determinación de actividad enzimática. Los ensayos fueron realizados por
duplicado.
4.4 EVALUACION IN VITRO DE LA ENZIMA GALNS RECOMBINANTE
La capacidad de la enzima GALNS recombinante de ser capturada por
células fue evaluada en cultivos de células HEK 293 (ATCC CRL1573). Estas
células corresponden a una línea celular permanente de riñón embrionario
humano transformadas con ADN del adenovirus humano tipo 5 (Ad5),
empleada en la producción y evaluación de proteínas recombinantes
(Thomas P y Smart TG, 2005). Las células fueron cultivadas en DMEM con
suero fetal bovino al 15 % v/v, L-glutamina 2 mM y 100 mg/mL de
estreptomicina/penicilina; a 37 ºC en atmósfera de CO2 al 5 % v/v.
Veinticuatro horas antes de adicionar la enzima, 1 x 105 células por pozo
fueron sembradas en placas de 12 pozos para cultivo celular (TPP) y el
medio de cultivo se reemplazo por medio fresco 2 horas antes de realizar el
experimento. La enzima purificada fue adicionada a 500 µL del medio de
31
cultivo para lograr una concentración final de 10, 50 o100 nM. Al cabo de 5
horas de incubación a 37 ºC de en atmósfera de CO2 al 5 % v/v se retiró el
medio de cultivo, el cual fue almacenado a -20 ºC para posteriores análisis y
las células fueron lavadas tres veces con PBS 1x (Composición por litro: 8 g
NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g NaH2PO4, 0,24 g KH2PO4; pH 7,2), tripsinizadas y
finalmente resuspendidas en buffer de lisis (acetato de sodio 25 mM pH 5,5;
Triton X-100 1 %, β-glicerolfosfato 1 nM). Las células fueron lisadas mediante
3 ciclos de congelación (-80 ºC) y descongelación (37 ºC) y finalmente,
centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos. La actividad enzimática fue
determinada en el lisado celular y en el medio de cultivo mediante el método
fluorométrico previamente descrito. La proteína del lisado celular fue
cuantificada por el método de Follin-Lowry.
4.4.1 Cuantificación de proteína por método Folin-Lowry Se agregaron 10 µL de cada muestra en un tubo de vidrio, 100 µL de SDS
(dodecil sulfato de sodio) al 1 % y 100 µl de reactivo de cobre. Se mezclaron
los tubos y se dejó en incubación a temperatura ambiente durante 10 min.
Transcurrido este tiempo se adicionaron 400 µl de reactivo de Folin
Cicolteau al 6,5 %. La mezcla se incubó en baño serológico por 5 minutos a
56 °C y posteriormente se detuvo la reacción por incubación durante 5
minutos en 4 °C. Las absorbancias se leyeron a 610 nm en
espectrofotómetro (BioSpec–1601 Shimadzu). La concentración de proteína
fue calculada contra una curva de BSA de 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; 2,7;
4,0 mg/mL preparadas en solución salina al 0,85%.
32
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
Filtro W 1 Filtro 0,45μm Filtro 0,22μm Ajuste de pH Retentato Ultrafiltrado Dializado
Proteina
y Ac-vida
d En
zimá-
ca
Proteina (mg/ml) AcNvidad Específica (nmol/mg/ml)
5. RESULTADOS
5.1 PURIFICACIÓN DE LA PROTEINA RECOMBINANTE GALNS
5.1.1 Protocolo de tratamiento No. 1 La muestra filtrada y ultrafiltrada fue concentrada 20 veces pasando de un
volumen inicial de 300 mL a un volumen final de 15 mL de retentato. Como
se observa en la figura 1, la actividad específica no varió durante los
procesos de filtración. Sin embargo, el proceso de ultrafiltración produjo una
disminución marcada en la actividad específica del retentato obtenido. Luego
de la diálisis la concentración de proteína disminuye levemente, mientras que
en la actividad enzimática se observó una marcada disminución. En la
electroforesis se observó la presencia de una banda por encima de 37 kD en
los primeros pasos del protocolo, mientras que en las muestras de retentato y
dializado se observan bandas por encima de 53 kD (Figura 2). La
concentración de proteína final fue de 1,19 mg/mL y la actividad específica
de 0,052 nmol/mg/h.
Figura 1: Proteína y actividad enzimática volumétrica y específica de alícuotas de cada paso del protocolo 1 de tratamiento.
33
Figura 2: SDS-PAGE de alícuotas de cada paso del protocolo de tratamiento No. 1 (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras). 1) Filtro Whatman No 1; 2) Filtro 0,45μm, 3 y 8) Filtro 0,2μm; 4) Ajuste de pH a 5,5; 5) Retentato 30kD; 6) Ultrafiltrado 30kD; 7) Dializado.
5.1.2 Protocolo de tratamiento No. 2 La muestra filtrada y precipitada con sulfato de amonio permitió reducir
aproximadamente 100 veces el volumen inicial pasando de 200 mL a 2 mL.
En la figura 3 se observa que la concentración de proteína se mantuvo
constante durante las etapas de filtración, observándose una caída en la
actividad y un aumento en la concentración de proteína tras el proceso de
precipitación. Similar a lo observado en el protocolo Nº1, en el dializado se
observó una leve disminución en la concentración de proteína y una marcada
disminución de actividad enzimática. En la electroforesis se observó un
patrón similar al visto en el protocolo Nº1, con una banda por encima de
37kD en los primeros pasos del protocolo (Figura 4a), y con bandas por
encima de 53kD en las muestras de el precipitado resuspendido en acetato
de sodio y el dializado, señaladas en la Figura 4b y 4c. La concentración final
de proteína fue de 1,60 mg/mL, con una actividad específica 0,16 nmol/mg/h.
198kD 115kD 96kD 53kD 37kD 29kD Marcador de PM
34
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
Filtro W 1 Filtro W 42 Filtro 0,45μm Filtro 0,2μm Precipitado resuspendido
Dializado
Proteína y AcNvidad EnzimáN
ca
Proteína (mg/mL) AcNvidad Específica (nmol/mg/ml)
Figura 3: Proteína y actividad enzimática de alícuotas de cada paso del protocolo 2 de tratamiento.
Figura 4: SDS-PAGE de alícuotas de cada paso del protocolo de tratamiento No. 2 (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras). a). 1) Filtro Whatman No 1; 2) Filtro Whatman 42; 3) Ajuste de pH a 5,5; 4) Filtro 0,45 μm;5) Filtro 0,2 μm; 6) Filtro 0,2 μm (sin
a b
c
198kD
115kD 96kD
53kD
37kD
29kD
PM
a
198kD
115kD 96kD
53kD
37kD
29kD
PM
35
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
Filtro W 1 Filtro W 42 Filtro 0,45μm Filtro 0,2μm Retentato
Proteina y AcNvidad EnzimáN
ca
Proteina (mg/ml) AcNvidad Específica (nmol/mg/h)
ajuste de pH); 7) Ultrafiltrado 30 kDa. b). 1) Retentato 30 kDa 2 y 3) Ajuste de pH a 5,5; 4) Sobrenadante de precipitación 5) Precipitado resuspendido en acetato de sodio 6) Precipitado resuspendido en acetato de potasio 7) Primer cambio de buffer acetato de sodio en la diálisis. c). 5 y 6) Producto de diálisis en buffer acetato de sodio 7) Retentato 30 kDa 8) Ultrafiltrado 30 kDa.
Figura 5: Proteína y actividad enzimática de alícuotas de cada paso del protocolo escogido para continuar el proceso de purificación.
5.1.3 Métodos Cromatográficos
5.2.3.1 Columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow
Usando un volumen de columna de 3 mL y un flujo de 5 mL/min, inicialmente
se evaluaron volúmenes de muestra de 1,5; 3 y 6mL. Las muestras fueron
cargadas con tris HCl 25 mM pH 7,0 y eluidas con Tris HCl 25 mM pH7,0 con
NaCl 0,5 M. Como se observa en la figura 6 los mejores valores de proteína y
actividad específica se observaron con un volumen de muestra inyectado de
1,5 mL pues sus variaciones son leves en comparación a un volumen de
muestra de 6 mL en donde la a pesar de ver elevada proteína, su actividad
específica presenta una importante disminución. Sin embargo, con un
volumen de 3 mL se obtiene un valor medio de proteína que permitirá
observarse en electroforesis y un valor de actividad que está en una fracción
comparable con el obtenido en un volumen de 1,5 mL.
36
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Pico 1 1 2 3 4 5 6 7 Ac-vida
d Espe
cífica nm
ol/m
g/h
Pico 2 (Fraccionado 1 a 7)
Vol: 1,5mL Vol: 3mL Vol: 6mL
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
Pico 1 1 2 3 4 5 6 7
Proteina
mg/ml
Pico 2 (Fraccionado 1 a 7)
Vol: 1,5mL Vol: 3mL Vol: 6mL
Figura 6: Ensayo en columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow con diferentes volúmenes de Muestra. a) Proteína en mg/mL de el pico 1 (proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1 mL cada una (1 a 7); b) Actividad enzimática específica (nmol/mg/h) de el pico 1 (proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1 mL cada una (1 a 7).
Adicionalmente, se evaluaron diferentes valores de pH: 5,5; 7,0 y 7,5 del
buffer Tris HCl 25 mM, usando muestras ajustadas a cada pH y un volumen
de muestra igual al tamaño de la columna (3 mL). Comparando el
comportamiento de la actividad enzimática durante la cromatografía a
diferentes valores de pH se observa una mayor estabilidad a pH 7,0 (Figura
7b).
a
b
37
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Pico 1 1 2 3 4 5 6 7
Ac-vida
d Espe
cífica nm
ol/m
g/h
Pico 2 (Fraccionado 1 a 7)
pH de Muestra y Buffer 5,0 pH de Muestra y Buffer 7,0 pH de Muestra y Buffer 7,5
0.000
0.001
0.001
0.002
0.002
0.003
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
Pico 1 1 2 3 4 5 6 7
Prtoteína (m
g/ml)
Mue
stra pH 7,0 y 7,5
Proteina (m
g/ml)
Mue
stra pH 5,0
Pico 2 (Fraccionado 1 a 7)
pH de Muestra y Buffer: 5,0 pH de Muestra y Buffer 7,0 ph de Muestra y Buffer: 7,5
Figura 7: Ensayo en columna de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow con buffer y muestra en diferente pH. a) Proteína en mg/ml de el pico 1 (Proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1mL cada una; b) Actividad enzimática específica (nmol/mg/h) de el pico 1 (Proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1 mL cada una. La figura 8a muestra el cromatograma típico obtenido en las purificaciones
con la columna de intercambio aniónico, en donde el primer pico corresponde
a la fracción no unida y el segundo a la fracción eluida con NaCl 0,5 M. En la
electroforesis de una muestra con volumen de 3 mL y pH 7,0 (Figura 8b) se
observa en el pico 1 una banda que migra a la altura de 37 kDa y en el pico 2
se observan bandas por encima de 53 kDa y 37 kDa, y entre a 29 kDa y 37
kDa.
b
a
38
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Absorba
ncia
Tiempo (Minutos)
Figura 8. a) Cromatograma de columna Q-SepharoseTM Fast Flow. EL primer pico corresponde a la fracción no unida, mientras que el pico 2 corresponde a la fracción eluida con NaCl 0,5 M. b y c). SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de intercambio aniónico (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras).b). Muestra producto de la ultrafiltración. 1) Pico1 (Proteína no unida a la columna), 2-9) Pico 2 (Eluido) c). Muestra precipitada y dializada. Pico 1 (Proteína no unida a la columna) 1-7) Eluido en fracciones 1 al 7. Adicionalmente, el precipitado en sulfato de amonio resuspendido en acetato
de sodio fue purificado en la columna de intercambio aniónico resultando en
fracciones de pico 2 sin actividad enzimática. Sin embargo, la electroforesis
(Figura 8c) mostró un patrón comparable con las bandas de migración que
tiene la enzima recombinante GALNS producida en células CHO, con banda
por debajo de 29 kDa, bandas por encima de 37 kDa y 53 kDa. 5.2.3.2 Columna de intercambio catiónico Macro-Prep® CM Support En ésta columna se evaluó el volumen de muestra inyectado en el sistema
de 1,5; 3,0 y 6,0 mL usando un buffer acetato de sodio 25 mM pH 5,0 y como
a
b c
Proteína no unida
Proteína Eluida
198kD
115kD 96kD
53kD
37kD
29kD
PM
39
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Pico 1 1 2 3 4
AcNvidad Espe
cífica nm
ol/m
g/h
Pico 2 (Fraccionado 1 a 4)
Vol:1,5mL Vol: 3mL Vol: 6mL
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Pico 1 1 2 3 4
Proteina
(mg/ml)
Pico 2 (Fraccionado 1 a 4)
Vol: 1,5mL Vol: 3mL Vol: 6mL
buffer de elución acetato de sodio 25 mM con NaCl 0,5 M a pH 5,0. El pH de
la muestra fue ajustado a 5,5 con el objetivo de favorecer la interacción con
la columna. En la figura 9 se observa que la proteína fue obtenida en la
fracción no unida (Pico 1) y que no se detectó proteína en la fracción eluida.
A pesar de que se observó actividad enzimática en los fraccionados 1 y 3 del
pico 2, con la electroforesis se confirmó la ausencia de proteínas en las
fracciones del pico 2. A diferencia de lo observado con la columna de
intercambio aniónico, el cromatograma mostró un leve aumento de
absorvancia en la fracción eluida y en la electroforesis se observaron bandas
entre 53, 37 y 29 kDa en el pico 1 (Figura 10).
Figura 9: Ensayo con diferente volumen de muestra inyectado en columna de intercambio catiónico. a) Proteína en mg/mL del pico 1 (Proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1 mL cada una; b) Actividad enzimática específica (nmol/mg/h) del pico 1 (Proteína no unida) y pico 2 (eluido) recogido en fracciones de 1 mL cada una.
a
b
40
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
0 2 4 6 8 10 12
Absorba
ncia
Tiempo (Minutos)
Figura 10: a) Cromatograma de columna de intercambio catiónico Macro-Prep® CM Support. El primer pico corresponde a la fracción no unida, mientras que el pico 2 corresponde a la fracción eluida con NaCl 0,5M b) SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de intercambio catiónico (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras).De izquierda a derecha: Pico 1 y fracciones 1 y 2 de pico 2 con muestra de 1,5mL de volumen inyectado. Pico 1 y fracciones 1, 2 y 3 de pico 2 con muestra de 3mL de volumen inyectado. Pico1 y fracción 2 de pico 2 con muestra de 6mL de volumen inyectado. 5.2.3.3 Columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High
Resolution De las muestras separadas por columna de intercambio aniónico se
escogieron las fracciones con mayor actividad enzimática para ser separadas
por columna de exclusión molecular. La columna se empacó a un volumen
de 20 mL y se inyecto 1 mL de muestra. El buffer de usado fue Tris HCl 25
mM pH 7,0 con NaCl 0,15 M a un flujo de 0,5 mL/min. Con la columna de
198kD
115kD 96kD
53kD
37kD
29kD
PM
a
b
Proteína no unida
Proteína Eluida
41
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
0 5 10 15 20 25
AcNvidad Espe
cífica (nmol/m
g/ml)
Proteina (m
g/ml)
No de Fracciones recogidas
Proteina (mg/ml) AcNvidad Específica (nmol/mg/ml)
exclusión molecular las muestras cercanas al vial No 20 de recolección
presentaron los mayores niveles de actividad específica (Figura 11). Este
resultado concuerda con lo observado en la electroforesis, pues permitió
eliminar gran cantidad de proteínas contaminantes evidentes en la
electroforesis de las diferentes fracciones recolectadas (Figura 12). En la
electroforesis (Figura 12b y 12c) se observa que entre los viales 18 y 26 se
observan bandas por encima de 31 y 45kDa y por debajo de 21 kDa patrón
similar al expresado por GALNS producida en células CHO en condiciones
reductoras.
Figura 11: Proteína y actividad enzimática producto de la separación por columna de exclusión molecular de las fracciones de pico 2 separados por columna de intercambio aniónico. Finalmente, en la separación por columna de exclusión molecular los viales
con mayor actividad enzimática correspondientes a la enzima GALNS
recombinante fueron liofilizados y reconstituidos en Tris HCl 25 mM pH 5,5
en un volumen de 1 mL con una actividad específica final de 0,29 nmol/mg/h
(Tabla 2). En la figura 13a y 13b se observa claramente el efecto de cada
uno de los procesos aplicados en la purificación siendo notoria la
42
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
0.12 0.14 0.16 0.18
0 20 40 60 80 100 120 140
Absorba
ncia
Tiempo ( Minutos )
concentración de proteínas en el carril del retentato. Además, en el pico 1
obtenido en columna de intercambio aniónico las bandas sobresalientes no
corresponden únicamente al patrón de GALNS bajo condiciones reductoras,
caso contrario, a lo observado en el pico 2 donde se observa un perfil similar
al reportado para la enzima GALNS recombinante producida en células CHO
con bandas entre 21 y 14 kDa, y bandas por encima de 31 kDa y 45 kDa.
.
Figura 12: a) Cromatograma de columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High Resolution. El recuadro corresponde a las fracciones 16 a 20 con mejor actividad (Figura 11) b y c) SDS-PAGE de muestras purificadas en columna de exclusión molecular (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras). Pool pico 2) Fracciones de pico 2 separados por columna de intercambio aniónico con mejor actividad.1-26). Fracciones de separación
b c
a
200kD 116kD 97kD 66kD 45kD 31kD 21kD 14,6kD PM
200kD
116kD 97kD
66kD
45kD
31kD
21kD
14,6kD PM
43
Tabla 2: Purificación de la enzima recombinante GALNS producida en E.coli
Figura 13: Resumen del proceso completo de purificación. SDS-PAGE con tinción de nitrato de plata (Gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras). a). 1) Medio de cultivo sin biomasa 800mL; 2) Filtro Waltman No 1; 3) Filtro Waltman 42; 4) Filtro Milipore 0,45µm; 5) 4) Filtro Milipore 0,2µm; 6) Retentato 30 kDa (20 mL); 7) Pico 1 de separación en columna de intercambio iónico; 8) Mezcla de fracciones de pico 2 de separación en columna de intercambio iónico 9) Liofilizado de pool de separación en columna de exclusión molecular. b). 1) Filtro Milipore 0,2µm; 2) Retentato (20 mL); 3) Pico 1 de separación en columna de intercambio iónico; 4) Mezcla de fracciones de pico 2 de separación en columna de intercambio iónico 5) Liofilizado de mezcla de fracciones de separación en columna de exclusión molecular.
Proceso Volumen (ml)
Actividad Volumétrica (nmol/h/ml)
Proteína (mg/ml)
Actividad Específica
(nmol/mg/h)
% recuperación
Extracto crudo 800 0,57 0,34 1,66 100 Extracto crudo filtrado 0,2μm
670 0,54 0,27 1,97 94,1
Retentato Membrana 30kD
20 0,66 3,64 0,17 114,7
Purificacion Q-‐Sepharose
7 0,08 1,08 0,06 13,1
Liofilizado Sephacryl Pool 4-‐
17
1,5 0,12 0,42 0,29 21,1
200kD
116kD 97kD 66kD
45kD
31kD
21kD 14,6kD
PM
a b
44
0
200
400
600
800
1000
1200
0
50
100
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 AcNvdad Enzim
áNca RelaN
va (%
)
Proteina y AcNvidad EnzimáN
ca
RelaNva (%
)
pH Proteina (mg/ml) AcNvidad Volumétrica (nmol/ml/h) AcNvidad Específica (nmol/mg/h)
5.3 ANALISIS DE ESTABILIDAD DE LA ENZIMA RECOMBINANTE
GALNS 5.3.1 Estabilidad a diferente pH El producto final del proceso de purificación de la enzima recombinante
GALNS fue sometido a condiciones de pH entre 3 y 8 con incubaciones de 1
hora a 37 ºC. Como se observa en la figura 14, la actividad específica
aumentó a valores de pH entre 3,0 y 4,0. Sin embargo la concentración de
proteína presentó una marcada disminución en los mismos rangos de pH, lo
que produjo un falso positivo al aumentar los valores de actividad específica.
Por el contrario, cuando los valores de actividad fueron expresados por mL
(actividad volumétrica) se observó un máximo de actividad a pH 5,5
disminuyendo rápidamente a pHs inferiores o superiores.
Figura 14: Proteína y actividad enzimática de la enzima recombinante GALNS en diferentes condiciones de pH
5.3.2 Estabilidad a diferentes temperaturas
La estabilidad de la enzima recombinante GALNS purificada fue evaluada a
4, 37 y 45 ºC con tiempos de incubación entre 1 y 192 horas. Presentando un
comportamiento inestable a condiciones elevadas de temperatura después
45
0
200
400
600
800
1000
1200
0
100
200
300
400
500
600
0 24 48 72 96 120 144 168 192 AcNvidad Espe
cífica Re
laNva (%
)
Proteina RelaN
va (%
)
Horas de Incubación
Proteina 4ºC Proteina 37ºC Proteina 45ºC
AcNvidad 4ºC AcNvidad 37ºC AcNvidad 45ºC
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Proteina y AcNvidad espe
cífica
RelaN
va (%
)
Horas de Incubación
Proteina 4ºC Proteina 37ºC Proteina 45ºC AcNvidad 4ºC AcNvidad 37ºC AcNvidad 45ºC
de 12 horas de incubación. Sin embargo, a 4 ºC la proteína presentó una
estabilidad del 100 % aún luego de 8 días de incubación.
Figura 15: Proteína y porcentaje de actividad volumétrica de la enzima recombinante GALNS en diferentes condiciones de temperatura a). Tiempo de 0 a 12 horas de incubación b). Tiempo de 0 a 192 horas de incubación. 5.3.3 Estabilidad en suero Con el objetivo de evaluar la estabilidad de la enzima purificada en
condiciones fisiológicas, el producto de purificación fue incubado 1 hora a 37
ºC en suero fresco obtenido de individuos sanos. Como se observa en la
a
b
46
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 4 6
% de Ac-vida
d Vo
lumétrica
Horas de Incubación
figura 16, la actividad presentó un comportamiento oscilante en la actividad
de la enzima durante el tiempo de incubación. Sin embargo, no se observó
disminución en la actividad enzimática sugiriendo que la enzima
recombinante GALNS producida en E. coli es estable en suero, bajo las
condiciones estudiadas.
Figura 16: Porcentaje de actividad volumétrica de la enzima recombinante GALNS en incubación con suero de individuos normales. Línea punteada: Representa el porcentaje de actividad observado en el suero antes de la adición de la enzima recombinante.
5.4 EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ENZIMA RECOMBINANTE GALNS
Las células HEK 293 fueron cultivadas para evaluar la capacidad de la
enzima recombinante GALNS de ser capturada por dichas células. La enzima
recombinante adicionada en concentraciones de 10, 50 y 100 nM no produjo
aumento en la actividad de los lisados celulares. Por el contrario, la actividad
enzimática del medio de cultivo de las células que fueron expuestas a la
enzima recombinante mostró un aumento con respecto al control negativo,
sugiriendo que la enzima no fue capturada por las células (Figura 17).
47
0.54 0.56 0.58 0.6 0.62 0.64 0.66 0.68 0.7
0.72
Células CN Células 10nM Células 50nM Células 100nM AcNvidad Vo
lumétrica (n
mol/
ml/h)
0
0.005
0.01
0.015
0.02
Medio CN Medio 10nM Medio 50nM Medio 100nM
AcNvidad Vo
lumétrica
(nmol/m
l/h)
Figura 17: Evaluación indirecta de la capacidad de la enzima recombinante GALNS de ser capturada por células HEK 293. a) Actividad volumétrica de GALNS en lisado de células HEK 293. b) Actividad volumétrica de GALNS en medio de cultivo DMEM.
a
b
48
6 DISCUSIÓN
La enfermedad de Morquio A, es una enfermedad rara de depósito lisosomal
(EDL) que afecta en promedio a 1:250.000 nacidos vivos (Montaño et al,
2007). A pesar de que no se cuenta con cifras sobre la incidencia de esta
enfermedad en Colombia, estudios preliminares señalan que este podría ser
uno de los países con mayor número de individuos afectados por esta
enfermedad (Barrera et al, 2007). En la actualidad no se dispone de un
tratamiento específico, siendo manejada exclusivamente mediante
correcciones quirúrgicas y tratamiento farmacológico (Montaño et al, 2007).
MPS IVA es una excelente candidata para su tratamiento por terapia de
reemplazo enzimático (TRE), terapia génica o terapia de reducción de
sustrato debido a la ausencia de síntomas sobre el sistema nervioso central.
Estudios preliminares han mostrado la posibilidad de producir una enzima
recombinante GALNS en forma activa en E. coli (Rodríguez et al, 2010;
Poutou R et al, 2006). Sin embargo, hasta el momento esta enzima no había
sido purificada o caracterizada, limitando su aplicación en el desarrollo de
una TRE para esta enfermedad. En el presente trabajo 1) se purificó una
enzima recombinante GALNS producida por E. coli BL21 mediante
cromatografías de intercambio iónico y exclusión molecular, 2) se caracterizó
su estabilidad a diferentes pHs y temperaturas y en condiciones fisiológicas
en suero humano y 3) se evaluó in vitro la capacidad de esta enzima de ser
internalizada por células.
La enzima recombinante GALNS producida en E.coli BL21/PGEX-GALNS al
ser liberada al medio de cultivo facilita el proceso de purificación, siendo
útiles métodos físicos de separación como la filtración y ultrafiltración
permitiendo la eliminación de proteínas contaminantes y la concentración del
49
medio que contiene la enzima de interés. La práctica mostró que la velocidad
de los procesos de filtración está relacionada con la etapa de centrifugación
para separar la biomasa y el extracto crudo. En este caso una centrifugación
de 10000 rpm por 30 min permitió obtener un extracto crudo sin exceso de
biomasa, listo para ser filtrado por membranas de diferentes tamaños de
poro. Finalmente el paso por una membrana de 30 kDa permitió eliminar
algunas proteínas contaminantes y concentrar el medio de cultivo,
conservando la proteína de interés de aproximadamente 120 kDa reportada
por Massue M et al (1991).
Durante las etapas de filtración y ultrafiltración no se observó pérdida de la
enzima recombinante. De hecho, en el retentato se observó un leve aumento
en el porcentaje de recuperación (Tabla 2). Si bien es cierto que con el
método descrito por van Diggelen O. et al, (1990) para evaluación de la
actividad enzimática de GALNS se puede evaluar dicha actividad por unidad
de concentración de proteína, la práctica muestra que el uso de
concentraciones de proteína muy bajas pueden llegar a falsear los valores
reales de actividad perdiendo la linealidad de la prueba, teniendo en cuenta
que los estándares usados por van Diggelen O. et al, (1990) están en
concentraciones de proteína de 0,5-1 mg. Esto se observa en el caso de la
actividad inicial del ensayo de estabilidad de temperatura con 0,30 mg/mL de
proteína y 0,19 nmol/mg/h de actividad específica; finalmente a las 192
horas de incubación la proteína es de 0,12 mg/mL y su actividad 0,99
nmol/mg/h (Datos no mostrados).
El protocolo de tratamiento No. 2, en donde se realizó la precipitación con
sulfato de amonio, permitió concentrar casi 100 veces el volumen de la
muestra, lo que mejoró los valores de proteína y actividad. Sin embargo, la
evaluación de actividad de las fracciones obtenidas en columna de
intercambio aniónico no mostraron actividad, limitando la aplicación de este
protocolo. Estudios adicionales se deben realizar para esclarecer la causa de
50
la perdida de actividad, pues este método parece tener importantes
beneficios desde el punto de vista de concentración de la proteína.
Paso siguiente a la ultrafiltración se realizó la purificación por columna de
intercambio iónico obteniendo dos picos de separación correspondientes a
las proteína no unidas (Pico 1) y a las proteínas eluidas de la columna (Pico
2). Estas últimas al tener un punto isoeléctrico (PI) inferior al pH del buffer de
corrido (5,5 a 6,5 para GALNS) presentan una carada negativa que permiten
su unión a los grupos funcionales de la columna cargados positivamente.
(Figuras 8a y 10a). La evaluación de parámetros como el pH y el volumen de
muestra, permitió definir que al usar en la columna de intercambio iónico un
buffer a pH 7,0 y un tamaño de muestra igual al volumen de columna
empacado se obtiene una adecuada separación de proteínas en la muestra.
De esta forma, con la columna de intercambio aniónico Q-Sepharose TM
Fast Flow se logró separar las muestras en dos fracciones, siendo la
segunda la de mayor interés, debido a que bajo las condiciones de pH
utilizadas y teniendo en cuenta el PI de la proteína entre 5,5 y 6,5 (Bielicki J
et al, 1995) ésta va a ser encontrada en la fracción eluida. Para facilitar la
separación de la enzima recombinante el pico 2 fue recolectado en alícuotas
de 1 mL, lo cual permitió seleccionar las muestras con mayor actividad que
fueron concentradas por liofilización. Dichas muestras presentan gran
cantidad de proteínas contaminantes como se observa en la figura 13a carril
8, por lo que fue necesaria una segunda purificación de esta muestra por
columna de exclusión molecular.
La columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High Resolution, se
usó con muestras separadas previamente por columna de intercambio
aniónico, logrando separar por tamaño las proteínas con PI cercano al de la
enzima recombinante GALNS. Esta segunda cromatografía permitió eliminar
gran cantidad de proteínas contaminantes evidentes en la electroforesis de
las diferentes fracciones recolectadas (Figura 12). Adicionalmente, se
51
observaron bandas con un peso inferior a 60 kDa y a la altura de 38 y 20 kDa
(Figura 13b) similar al patrón observado para las proteínas recombinantes
producidas por células CHO descritas por Bielicki J et al (1995), Tomatsu S
et al( 2007) y Dvorak-Ewell M et al (2010).
La purificación de la enzima recombinante GALNS producida en E. coli tuvo
un porcentaje de recuperación final de 21,1%, el cual es inferior al 37 y 56 %
reportado por Tomatsu S et al (2007) y Dvorak-Ewell M et al (2010),
respectivamente, en la purificación de GALNS recombinante secretada e el
medio por células CHO. En trabajos previos realizados en el IEIM,
conducentes a la purificación de la enzima recombinante Iduronato 2-Sulfato
Sulfatasa (IDS), producida en E. coli y secretada al medio, Saenz, H. (2005)
obtuvo un porcentaje de recuperación inferior al 1%. La misma proteína
producida en el sistema P. pastoris se obtuvo con un porcentaje de
recuperación menor al 2%. En un trabajo posterior, Rodríguez, A. (2008),
reportó la pérdida de actividad enzimática de la IDS, obtenida de agregados
intracelulares en P. pastoris, después de realizar el proceso de captura por
cromatografía.
Futuros trabajos deben estar enfocados a la optimización de las condiciones
de purificación planteadas en este trabajo, a la evaluación de nuevas
condiciones, que permitan aumentar el porcentaje de recuperación.
La actividad específica final obtenida del proceso de purificación de la
enzima recombinante GALNS en un modelo procariota fue de 0,29
nmol/mg/h, más baja que la producida en CHO por Tomatsu S et al (2007) en
donde la actividad final es de 170.000 nmol/mg/h. Sin embargo, la actividad
de la enzima purificada en el presente trabajo se encuentra tan solo un orden
de magnitud por debajo de la enzima producida en células CHO por Dvorak-
Ewell M et al (2010) quienes reportaron valores de actividad de 2 nmol/mg/h.
El proceso de purificación de la enzima recombinante GALNS desarrollado
en el presente trabajo permitió describir su comportamiento bajo diferentes
52
condiciones de pH y temperatura, siendo GALNS estable a 4 ºC por
aproximadamente 8 días, resultado similar al obtenido por Tomatsu et al
(2007). Sin embargo, cabe resaltar el hecho de que el aumento en actividad
como se había comentado anteriormente puede ser un falso positivo, por
tanto debe evaluarse detalladamente este fenómeno. Pues se observó que a
45 ºC después de 6 horas los valores de proteína disminuían, perdiéndose el
70 % de proteína durante las primeras 96 horas y un comportamiento similar
fue observado cuando la proteína fue incubada a 37 ºC, aunque en menor
proporción, en ambos casos alcanzo cerca de un 900% de elevación en la
actividad específica relativa. (Figura 15).
Sin embargo, se observó que a 45 ºC después de 6 horas los valores de
proteína disminuían, perdiéndose el 70 % de proteína durante las primeras
96 horas. Un comportamiento similar fue observado cuando la proteína fue
incubada a 37 ºC, aunque en menor proporción (Figura 15).
Adicionalmente, la enzima recombinante GALNS presentó una mejor
actividad a pH 5,5 y a pesar de disminuir su actividad a pH 6,0; éste se
mantiene estable hasta pH 8,0 (Figura 14). Al someter a GALNS hasta 6
horas en suero de individuos sanos presenta un comportamiento oscilante
sin disminución de la actividad inicial que la hace estable por 4 horas, aunque
presenta una ligera elevación de la actividad a las 6 horas, aunque faltaría
evaluar la enzima por periodos de tiempo más largos (Figura 16).
Finalmente, el ensayo en células HEK 293 arrojó información importante
sobre la capacidad que tiene GALNSr de ser capturada, en donde la escasa
variación en la actividad del lisado de células incubadas con concentraciones
10, 50 y 100 nM sugiere que la enzima recombinante no fue capturada por
las células, confirmando dicho comportamiento de manera indirecta con la
elevación de la actividad base en el medio de cultivo (Figura 17). Sin
embargo, es necesario evaluar concentraciones más altas de enzima y
variaciones en el tiempo de incubación.
53
En resumen, los resultados presentados en el presente trabajo constituyen la
primer evidencia de la purificación de GALNS humana recombinante
producida en E. coli, aportando información importante para este tipo de
proteínas sobre su estabilidad y capacidad de captura por células.
Adicionalmente, estos resultados muestras que las glicosilaciones en GALNS
son necesarias para la captura celular de la enzima, mientras que parecen no
estar involucradas en la producción de una enzima activa o en la estabilidad
de la proteína. Aunque se requieren estudios adicionales tanto en la etapa
de producción como de purificación, estos resultados representan evidencia
valiosa para el desarrollo de TRE para enfermedades lisosomales,
empleando enzimas recombinantes producidas en E. coli
54
7. CONCLUSIONES
Se purificó la enzima recombinante GALNS producida por E. coli
BL21/PGEX-GALNS a partir del medio de cultivo mediante procesos de
filtración, ultrafiltración por membrana de 30 kDa, cromatografía por columna
de intercambio aniónico Q-SepharoseTM Fast Flow y cromatografía por
columna de exclusión molecular SephacrylTM S-200 High Resolution.
La enzima recombinante GALNS producida extracelularmente por E.
coli BL21/PGEX-GALNS es estable a 4 ºC hasta por una semana y presentó
mejor actividad a pH 5,5. En suero la enzima tiende a ser estable con una
leve elevación de su actividad luego de 6 h de incubación.
La evaluación in vitro mostró que la enzima recombinante no es
capturada por células HEK 293, sugiriendo que las glicosilaciones en GALNS
son necesarias para la captura celular de la enzima, mientras que parecen no
estar involucradas en la producción de una enzima activa o en la estabilidad
de la proteína.
Este trabajo constituye la primer evidencia de la purificación de
GALNS humana recombinante producida en E. coli, aportando información
importante para este tipo de proteínas sobre su estabilidad y capacidad de
ser internalizada por células.
55
8. RECOMENDACIONES
1. Los resultados obtenidos en los procesos de purificación por otros autores
demuestran el uso positivo de columnas de intercambio catiónico, por
ende es necesario realizar ensayos en una columna de intercambio
catiónico que permita evaluar la separación.
2. La disminución marcada de la concentración de la enzima a 45 ºC
promueve la realización de ensayos de estabilidad a temperaturas
superiores y el estudio de su estructura para conocer los cambios
generados por el calentamiento.
3. Es necesario realizar estudios empleando otras líneas celulares, mayores
concentraciones de enzima y sistemas de entrega que faciliten la entrada
de la proteína a la célula.
56
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61
ANEXO 1
I. INFORMACION DADA AL ENCUESTADO PARA ACEPTAR O RECHAZAR LA PARTICIPACION EN LA INESTIGACIÓN (PREVIO CARTA CONSENTIMIENTO)
La siguiente investigación tiene la intención de evaluar la estabilidad de la
enzima recombinante GALNS producida en E. coli BL21/pGEX-GALNS en
muestras de suero de individuos sanos (sin enfermedad de Morquio A). Para
este fin el voluntario será sometido a una veno-punción en antebrazo que
permitirá extraer sangre venosa. Al obtenerse el suero por medio de
centrifugación se procederá a realizar un pool con dichos suero, con el fin
de obtener una mezcla más homogénea y paso previo será la realización del
ensayo con la enzima recombinante. El material sanguíneo no usado se
descartará la muestra siguiendo protocolo de descarte de muestras de riesgo
biológico seguido por la Pontificia Universidad Javeriana.
II. CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPAR EN PROYECTO INVESTIGATIVO TITULADO: PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA N-ACETIL-
GALACTOSAMINA-6-SULFATASA RECOMBINANTE PRODUCIDA EN E.coli BL21/PGEX-GALNS Y LIBERADA AL MEDIO DE CULTIVO
Lugar y Fecha: __________________________________
62
Por medio de la presente acepto participar en el proyecto de
investigación Titulado: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________
El objetivo del estudio es:
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Se me ha explicado que mi participación consistirá en:
_____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________
Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios derivados de mi participación en el estudio, que son los siguientes:
El Investigador Responsable se ha comprometido a darme información
oportuna sobre cualquier duda o molestia generada por la encuesta, así
como a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que le plantee
acerca de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios
o cualquier otro asunto relacionado con la investigación.
63
Entiendo que conservo el derecho de no permitir la extracción de sangre total
en cualquier momento en que lo considere conveniente.
El Investigador Responsable me ha dado seguridades de que no se me
identificará en las presentaciones o publicaciones que deriven de este
estudio y de que los datos relacionados con mi privacidad serán manejados
en forma confidencial. También se ha comprometido a proporcionarme la
información actualizada que se obtenga durante el estudio, aunque esta
pudiera cambiar de parecer respecto a mi permanencia en el mismo.
Nombre y firma del paciente: _____________________________________________ _____________________________________________
Nombre y firma del Investigador Responsable: _______________________________________ ________________________________________