t p nº 9 enzimas pécticas
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GUA DE TRABAJOS PRCTICOSENZIMAS PCTICAS
Ctedra Qumica y Bioqumica de los AlimentosCarrera Ingeniera de los AlimentosBqca. Emilce R. Zubreski, LQI. Nancy E. Cruz; Dra. Mara A. Martos
1. OBJETIVOS
1. Medir la actividad pectinoltica total, actividad poligalacturonasa y actividad pectinesterasa de
los extractos enzimticos producidos por cepas de microorganismos autctonos mediante
fermentacin en medio lquido.
2. Estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad poligalacturonasa .
2. INTRODUCCION
2. 1. SUSTANCIAS PECTICAS
Las sustancias pcticas pueden ser definidas como polisacridos estructurales de elevado peso
molecular, presentes principalmente en la lmina media y en la pared celular primaria de las
plantas superiores, estn qumicamente unidas y mecnicamente inmersas dentro de otros
constituyentes de la pared celular vegetal como celulosa y hemicelulosa,. Aunque estn presentes
en cantidades que generalmente no exceden el 1% del peso fresco, son responsables de la
integridad y coherencia de los tejidos de las plantas. La lmina media es la capa cementante que
se encuentra entre las clulas en los tejidos de las plantas y contienen principalmente, al igual que
la pared celular primaria protopectina. La protopectinaes el nombre dado a las sustancias pcticas
insolubles en agua y que estn fijas en el tejido vegetal, ligada a los componentes celulsicos de
las paredes celulares.
Las sustancias pcticas, estn formadas por unidades de cido D-galacturnico unidas por enlaces
glicosdicos -1,4 con los grupos carboxilos esterificados con metanol (Figura 1).
Figura 1: Estructura de la molcula de pectina.
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La esterificacin de los grupos carboxilos del cido galacturnico (AG) con metanol es una
caracterstica muy importante que le confiere a la pectina sus propiedades estructurales y
funcionales. El grado de metilacin (GM) se define como los moles de metanol presentes cada 100
moles de cido galacturnico. Las pectinas con valores de GM > 50 se las denomina de alto
contenido de metoxilo (ctricos, manzanas) y, con GM
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Enzimas depolimerizantes
Poligalacturonasas (PG):
Endopoligalacturonasas (endo-PG) (EC 3.2.1.15): Producen ruptura al azar de los enlaces
glicosdicos -1,4 del cido pctico (Fig.1), liberando monmeros de AG u oligmeros de dos o
tres restos. Las endo-PG se miden por reduccin de vioscosidad, ya que producen hasta un 50 %de cada en la viscosidad de una solucin de pectina.
Exopoligalacturonasas (exo-PG) (EC 3.2.1.67): Hidrolizan las uniones -1,4 de los enlaces
glicosdicos a partir del extremo no reductor de la cadena de cido pctico, dando cido
galacturnico como producto mayoritario de la reaccin (Fig. 2).La actividad exo-PGasa se mide
con el mtodo colorimtrico del 3,5-dinitrosalicilico, por el incremento de los grupos reductores.
Pectinliasas (PL) (EC. 4.2.2.10): Rompen los enlaces glicosdicos -1,4 de la molcula de cido
pctico por un mecanismo de -eliminacin, descubierto por Albersheim y col., 1960, formando
un doble enlace entre los carbonos 4 y 5 por cada enlace glicosdico roto (Fig.2). Los mejores
sustratos para esta enzima son las pectinas altamente esterificadas.
El mtodo ms conveniente para medir la actividad de las pectinliasas es medir el incremento de
la absorbancia a 235 nm a partir del aumento producido por la formacin del doble enlace.
Figura 2:Modo de accin de las enzimas pcticas
Urnido
Oligmero
Pectina
Ac poligalacturnicoAc. galacturnico
PL
PE
PG
PG
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2.2.2 Aplicaciones industriales de las enzimas pcticas
Las pectinasas microbianas son ampliamente utilizadas en el procesamiento industrial de frutas y
vegetales, para facilitar la extraccin del jugo y en la clarificacin de jugos de frutas y vinos.
En los jugos ctricos, son responsables de la prdida de turbidez, siendo adems usadas para
clarificar jugos de manzana y uva.
Algunas pectinasas (protopectinasas) tienen la capacidad de liberar sustancias pcticas
cementantes de la pared celular de las plantas, produciendo la maceracin de los tejidos vegetales
En el proceso de maceracin, la pectina insoluble presente en la laminilla media es degradada, con
la consiguiente liberacin de clulas individuales y agregados celulares. Para tal propsito,
nicamente el material cementante intercelular y parte de la pared celular primaria de las plantas
debe ser degradado, sin daar la pared celular secundaria, a los efectos de evitar la lisis celular.
Este mtodo presenta ventajas sobre la disgregacin mecnica ya que conserva intactos el flavor,
los pigmentos y los componentes celulares, propiedades sumamente interesantes en ciertos
productos alimenticios.Los procesos enzimticos de maceracin complementan a los procesos clsicos mecnicos y
trmicos ya que estos generan pulpas y jugos de calidad no satisfactoria.
La incorporacin de enzimas macerantes mejora la calidad de los productos a consecuencia del
suave tratamiento enzimtico. Estos tratamientos son de inters en la produccin de nctares de
frutas, en la elaboracin de purs vegetales (papa, zanahoria, etc.) y de alimentos infantiles en
general as como tambin en el tratamiento preliminar del caf, cacao y fibras de plantas con el fin
de eliminar la pulpa de fruta no deseada
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3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Extractos enzimticos: se utilizarn los extractos enzimticos producidos mediante
fermentacin en medio lquido por dos microorganismos pectinolticos aislados en la ctedra de
Biotecnologa: A. niger y Picchia anmala.
3.2. Determinacin de la actividad pectinoltica total (PT) por reduccin de viscosidad
La actividad PT (PG; PE y PL) de los extractos enzimticos se determinar por reduccin de
viscosidad de una solucin estandar de pectina, utilizando un viscosmetro de Cannon-Fenske
serie 100.
Tcnica enzimtica: Colocar el viscosmetro 8,4 ml de la solucin de pectina de citrus al 0,5 %
en buffer actico/acetato pH 5,0 y 0,6 ml del extracto enzimtico diluido apropiadamente . Incubar
la mezcla de reaccin a 37 C y medir la reduccin de viscosidad cada 5 min, hasta los 30 min.
El porcentaje de reduccin de la viscosidad (% RV) se calcular a partir de la siguiente
ecuacin:
Donde:
Fs= tiempo de flujo en segundos de la solucin de pectina y la enzima inactivada por calor.
Fm= tiempo de flujo en segundos de la solucin de pectina y la enzima.
Fb= tiempo de flujo en segundos del buffer y la enzima inactivada trmicamente.
Una unidad de PT se define como la actividad que produce una reduccin de viscosidad del 50
% bajo las condiciones de ensayo
Resultados
Tiempo de
reaccin (min)
Tiempo de medida
de la viscosidad (seg)
% R V
5
10
15
20
25
30
( )100
-
-
%RVFbFs
FmFs
=
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Graficar - Sacar conclusiones
3.3 Determinacin de actividad pectinoltica cualitativa por el mtodo del Hoyo (cup-plateassay)
Tcnica del hoyo:
Se realizar un ensayo cualitativo y semi-cuantitativo para la determinacin de la actividad
pectinoltica mediante la tcnica del hoyo (cup-plate assay) de los extractos enzimticos obtenidos
a partir de cultivo en medio lquido de los microorganismos mencionados
Procedimiento: Se preparan placas conteniendo un medio agarizado compuesto de: cido
poligalcturnico y agar. Utilizando un sacabocado se realizan hoyos de 5 mm de dimetro y 4
mm de profundidad, los que se llenan con el filtrado enzimtico. Las cajas se incuban en cmara
hmeda
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, a 35 C durante 24 , 48 y 72 h. Luego de este tiempo se inundan con HCl. Se mide eldimetro de los halos de hidrlisis formados.
Cmara hmeda: las placas se incuban en cmara hmeda a los efectos de evitar el desecamiento
del medio durante el tiempo de incubacin. La cmara hmeda se prepara colocando en el fondo
de un recipiente una capa fina de algodn humedecido con agua. Las placas se colocan sobre la
capa de algodn, el recipiente se cierra hermticamente y se coloca cuidadosamente en estufa.
3.4 Determinacin de la actividad poligalacturonasa (PGasa)
* Por Determinacin de grupos reductoresLa actividad PGasa se medir por determinacin de los grupos reductores liberados con el
mtodo del DNS, usando cido galacturnico como referencia.
Tcnica enzimtica
Sustrato: cido poligalcturnico (APG) en buffer acetato-cido actico pH 5,0.
Reactivo DNS: cido 3,5- dinitrosaliclico (D-0550, Sigma).
Procedimiento:1. Rotular los tubos correspondientes ( 2 tubos por muestra y 1 blanco de sustrato).
2. Colocar el sustrato (APG) en cada tubo, los mismos se mantendrn en bao de agua-hielo.
3. Agregar a los tubos, el extracto enzimtico (menos a los blancos).
4. Incubar los tubos a 37 C, durante 10 min.
5. Sacar los tubos del bao y colocarlos en un bao de agua-hielo.
6. Agregar a los blancosla misma cantidad del extracto enzimtico.
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7. Agregar el reactivo DNS a cada tubo.
8. Llevar a ebullicin (100C) durante 15 min.
9. Agregar a cada tubo sal de Rochelle
10. Las soluciones resultantes se llevarn a temperatura ambiente.
11. Medir absorbancia a 575 nm.
Utilizando la curva de calibracin (Absorbancia vs Acido Galacturnico) se determinar la
concentracin de cido galacturnico producido.
Una unidad de la actividad PGasa fue definida como la cantidad de enzima que libera un mol de
acido galacturnico por minuto bajo las condiciones de ensayo.
3.3.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad PGasa
Dentro de ciertos lmites, la velocidad de reaccin aumenta con la temperatura. En general la
velocidad se duplica a cada incremento de unos 10C y viceversa. Existe una temperatura ptima,
por encima de esta, la velocidad decrece rpidamente por desnaturalizacin de la enzima. La
temperatura de mxima actividad no corresponde necesariamente a la temperatura de mxima
estabilidad.
El efecto de la temperatura sobre la actividad PGasa se determinar, incubando la mezcla de
reaccin a diferentes temperaturas entre 5C min - 37 C -45C - 55 C, durante 10 min.
Procedimiento:
1. Rotular los tubos correspondientes a cada temperatura ( 2 tubos por muestra y 1 blanco):
5C - 37 C -45C - 55 C.
2. Idem tcnica medida actividad poligalactuornasa por grupos reductores, pero incubar
a las temperaturas correspondientes(5C - 37 C -45C - 55 C.)
durante 10 min.
Resultados
Temp.de
reaccin
Absorbancia
Muestra
Abs.Muestra Abs.
Blco.
Producto de reaccin
(cido galacturnico)
mg/l
UE/ml*
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Conclusiones
4. Determinacin de la actividad Pectinesterasa:
La determinacin de la actividad pectinesterasa se realizar en forma cualitativa observando el
cambio de color de una solucin de pectina con verde de bromocresol (pHinicial 5,0).
Por accin de la pectinesterasa, se produce la liberacin de grupos carboxilicos de la molcula
de pectina, provocando una disminucin de acidez de la solucin de pectina, esto conlleva a un
cambio de color de la solucin de verde de bromocresol que pasa de azul (pH: 5,0) a amarillo (pH
menor 4).
Procedimiento:
1. Colocar en un tubo de ensayo la solucin de pectina
2. Agregar la enzima sin diluir y a pH 5,0
3. Incubar a 37 C hasta cambio de color.
Resultados - Conclusiones