“Sviluppo di modelli 3D bioibridi del cancro per test

in vitro avanzati”

Ing. Serena Danti, PhD

Dr. Claudio Ricci, PhD

XXXIV Scuola Annuale di Bioingegneria

Bressanone, 21-24 Settembre 2015

s.danti@med.unipi.it

24/09/2015 2

Modelli in-vitro - 1

Mattei G., et al. 2014

I modelli in vitro, qualsiasi sia il loro scopo, devono replicare il più possibile le caratteristiche,

biochimiche fisiche morfologiche e fsiologiche, del sistema in studio per poter essere predittivi

24/09/2015 3

Modelli Tumorali

Ricci C., et al. 2013

24/09/2015 4

Modelli Murini in-vivo

Esistono diversi approcci per creare un modello tumorale murino

24/09/2015 5

Motivi etici: Responsabilità morale nei confronti degli

animali;

Motivi scientifici: Sperimentazione animale soggetta a

variabilità ed a difficoltà di estrapolazione

alla specie umana;

Motivi economici: Tempi e costi.

• Bisogna adottare ogni metodo scientifico che

Rimpiazzi gli animali superiori (vertebrati senzienti)

Riduca il numero degli animali

Raffini le tecniche di sperimentazione per diminuire la sofferenza.

Modelli Murini in-vivo

24/09/2015 6

Modelli in vitro 3D – 1 (Classico)

Sferoidi Umani Tumorali

Gli sferoidi sono i modelli 3D più ampiamente utilizzati,

un piccolo aggregato cellulare (20 μm – 1 mm)

strettamente legato che tende a formarsi quando

cellule trasformate sono mantenute in condizioni non

aderenti.

Esistono differenti metodi per la realizzazione, quello più utilizzato

è lo spinner flask, in cui il fluido è messo in turbolenza in questo

modo previene l’adesione e promuove l’aggregazione cellulare

Questi modelli hanno vari problemi tra cui un pessimo gradiente di diffusione (i farmaci sono sono più

grossi di molecole come O2) e la mancanza di mezzi accurati per test vitalità cellulare in coltura 3D

24/09/2015 7

Modelli in vitro 3D – 2 (Avanzato)

Gel Embedding

COLLAGENE

ALGINATO

BD Matrigel™

Basement Membrane Matrix

derived from mouse

sarcoma that contains:

Collagen type IV

Laminin

ECM molecules

And various soluble signal

L’insuccesso degli sferoidi nel mimare

ECM ha portato a nuovi modelli i

quali prevedono l’uso di gel biologici

come substrato per la crescita degli

sferoidi

In questi modelli abbiamo un’ architettura che simula

ECM e su cui le cellule possono organizzarsi.

Comunque rimangono i limiti degli sferoidi in quanto

le cellule tendono ad aggregarsi lo stesso perche’

questi gel non hanno un rigido crosslinken networks

e quindi soffrono della limitazione del trasporto

24/09/2015 8

Modelli in vitro 3D – 3 (Avanzati)

L’utilizzo di polimeri più complessi per formare una vera architettura e in cui è possibile variare le proprietà

chimico-fisiche e meccaniche.

Dhiman et al. studiano la crescita

della MCF-7 all’interno di di uno

scaffold con porosità differenti a

seconda della deacetilazione della

chitina.

Labhasetwar & Mooney separatamente

studiano il tumore del seno (linee cellulari

MCF-7) e del cavo orale all’interno di

microparticelle porose composte da acido

poli-lattico (PLA) o copolimeri di Acido

Lattico e Glicolico (PLGA).

Anche Fischbach utilizza PLGA ma

questa volta con dimensione non di

microparticelle ma un disco di

diametro di ≈ 8mm e spessore 1 mm

in cui a seminato una linea di

carcinoma squamoso del cavo orale.

24/09/2015 9

Modello 3D in vitro - 4

Gli elementi fondamentali per un modello

tumorale:

1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)

2) Stimoli Chimico/Fisici (fattori di crescita,

stimoli meccanici)

3) Supporto 3D poroso (scaffold)

Modello 3D tumorale

24/09/2015 10

Tecnologie di fabbricazione per scaffold 3D

Visti i precedenti modelli lo scopo è quello di creare uno scaffold ad hoc in cui si possa

ricreare un’architettura simile alla matrice extracellulare e dove le cellule tumorali

possano organizzarsi.

Tecnologie utilizzate

1) Elettrofilatura (Electrospinning)

2) Stampaggio per compressione e lisciviazione di particolato

(Compression Molding & Particle Leaching)

4) Emulsione e Liofilizzazione

(Emulsion & freeze-drying)

3) Prototipazione rapida (Rapid Prototyping)

24/09/2015 11

Elettrofilatura – 1

L’electrospinning è un processo

produttivo che consente di

ottenere filamenti continui di

materiale sintetico del diametro

straordinariamente piccolo,

inferiore al micron. Il getto

polimerico viene stirato

all’interno di un elevato campo

elettrico. I filamenti così prodotti

raggiungono diametri

dell’ordine di 100 nm.

24/09/2015 12

Elettrofilatura – 2

Micrografie elettroniche (SEM) a vari ingrandimenti di

uno scaffold ottenuto tramite elettrofilatura. E’

possibile vedere la struttura delle fibre ultrafini e le

loro dimensioni.

24/09/2015 13

Rapid Prototyping - 1

La tecnica di Prototipazione Rapida è largamente utilizzata per fabbricare scaffold polimerici. E’

molto versatile e molto precisa in quanto è controllata tramite PC e quindi è possibile creare vari tipi

di forme, grandezze e strati che si alternano dando luogo a strutture porose con un’ottima

riproducibilità

Pfister A. et al., 2004

24/09/2015 14

Rapid Prototyping - 2

Tra queste, la Modellazione per Deposizione dal Fuso (FDM) permette di avere fibrose 3D (3D Fiber

Deposition). Esistono anche tecniche di deposizione di fibre da soluzione.

Moroni L., et al. 2005

Gli scaffold vengono caratterizzati attraverso il diametro della fibra ottenuta (che può essere variato

variando il diametro dell'ugello o la velocità di deposizione), la spaziatura tra le fibre nello stesso strato, la

spessore dello strato, e la configurazione delle fibre depositate entro l'intera architettura.

24/09/2015 15

Compression Molding & Particle Leaching

Materiale (Polimero fuso,

monomero o molecola da reticolare)

Particelle idrosolubili

(NaCl)

Dispersione

Stabilizzazione (solidificazione o reticolazione) nell’apposito stampo

Lavaggio delle particelle in acqua distillata per

ottenere una struttura porosa

24/09/2015 16

Emulsione & Liofilizzazione

Emulsione: è una dispersione, più o meno stabile, di un fluido sotto forma di minutissime

goccioline o bollicine (fase dispersa) in un altro fluido non miscibile (fase continua o fase

disperdente o veicolo).

Alcol polivinilico

(PVA)

Soluzione acquosa di

gelatina

Emulsione: microbolle, si crea una schiuma

Liofilizzazione: l’acqua viene

sublimata

Dopo il processo di congelamento il PVA

reticola e l’acqua evaporata dà luogo ad

un supporto spugnoso con molti pori

interconnessi

+

24/09/2015 17

Modelli Tumorali

Gli elementi fondamentali per un modello

tumorale:

1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)

2) Stimoli Chimico/Fisici (biochimici,

meccanici)

3) Scaffold

Modello 3D tumorale

Le colture preparate direttamente da un tessuto si dicono colture primarie; le cellule isolate da un

qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro,

dopodiché vanno incontro a degenerazione e morte. Tale fenomeno avviene indipendentemente dalla

presenza di metaboliti appropriati per la crescita e si indica come senescenza.

In genere il numero di “cicli” che una cellula è in grado di effettuare in vitro dipende anche dall’età

dell’animale.

Le linee cellulari continue derivano da singole cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno

annullato il programma genetico della senescenza.

Si dicono perciò immortali: proliferano in modo continuo in presenza degli opportuni metaboliti. Molte

linee cellulari continue sono state ottenute a partire da tessuti tumorali (es. HeLa).

Le cellule trasformate, invece, presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose: sono

immortali, proliferano in vitro fino a raggiungere una densità maggiore delle cellule normali e, spesso,

crescono senza aderire ad alcuna superficie.

Le colture si distinguono a seconda che le cellule siano in sospensione o aderenti.

Le cellule di origine emopoietica, che normalmente crescono in mezzo fluido, crescono in

sospensione e si moltiplicano in vitro senza aderire.

Le cellule che, invece, fanno parte di tessuti solidi crescono in vitro aderendo alla superficie delle

piastre da coltura.

Colture Cellulari

24/09/2015

18

24/09/2015 19

Tumori

I TUMORI o NEOPLASIE rappresentano l’insieme di una popolazione di cellule somatiche dell’organismo

avente quasi sempre origine monoclonale, con capacità replicativa illimitata e indipendente.

Crescita cellulare non regolata da stimoli esterni (autonoma), capacità di invadere i tessuti e di metastatizzare e colonizzare siti a distanza.

Neoplasia Maligna

Carcinoma Sarcoma

Tessuto Epiteliale (Es. Adenocarcinoma Duttale del

Pancreas, Carcinoma Mammella,

Carcinoma Squamoso del Polmone o

del testa\collo)

Tessuto Mesenchimale (Es. Adiposo – Liposarcoma, Muscolare

Striato – Rabdomiosarcoma , Osso –

Osteosarcoma)

24/09/2015 20

Tumori - 2

I Tumori sono patologie a carattere genetico il cui livello di espressione è la singola cellula: sono ereditabili

ma nella maggior parte avvengono mutazioni nelle cellule somatiche con errori intrisechi nella replicazione

del DNA o esposizione ad agenti cancerogeni

24/09/2015 21

Tumori - 3

All’interno della cellula

sono molti i punti in cui

è possibile intervenire

per inibire i percorsi

biochimici (pathways)

compromessi.

24/09/2015 22

Tumori - 4

Negli ultimi anni il ruolo del miroroambiente tumorale (TME) si è dimostrato essere fondamentale per

capire come si sviluppa il tumore e per cercare nuovi target terapeutici e prognostici, infatti sono molti gli

elementi cellulari (Sistema Immunitario, fibroblasti etc. ) e le proteine coinvolte nello sviluppo tumorale

Joyce J., et al. 2013

24/09/2015 23

Tumori - 5

Fattori e processi importanti che portano dal tumore in-situ alla metastasi sono la transizione epiteliale-

mesenchimale (epithelial-mesenchymal transition, EMT), gli esosomi (in cui all’interno si accumulano miRNA), le

proteine di mobilità ed il rimodellamento della matrice extracellulare

Quail DF., et al. 2013

24/09/2015 24

Adenocarcinoma Duttale del Pancreas (PDAC)

Nel 75% dei pazienti il PDAC viene diagnosticato in una fase già molto avanzata per la mancanza

di marker, quindi la sopravvivenza dal momento della diagnosi è molto bassa (5-18 mesi)

La chemioterapia mostra un beneficio solo nel 20% dei pazienti ma non è risolutiva.

24/09/2015 25

Microambiente PDAC

Il microambiente del PDAC è molto complesso: oltre alle cellule epiteliali sono presenti le cellule staminali tumorali e le cellule stellate, il cui ruolo è

ancora non chiaro, i fibroblasti e tutto il pool di

proteine implicate nel rimodellamento della matrice

extracellulare

24/09/2015 26

Avere colture primarie di tumore può essere

fondamentale per ricreare un sistema realistico del

tumore in vitro

Colture Primarie

Micro-dissezione Laser

Isolamento e coltura

24/09/2015 27

24/09/2015 28

24/09/2015 29

Colture Primarie

Nelle colture primarie, rimane

la morfologia del tessuto

tumorale insieme a tutte le

componenti cellulari.

24/09/2015 30

24/09/2015 31

Modelli Tumorali

Gli elementi fondamentali per un modello

tumorale:

1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)

2) Stimoli Chimico/Fisici (biochimici,

meccanici)

3) Scaffold

Modello 3D tumorale

24/09/2015 32

Stimoli Chimico/Fisici

1) Fattori di Crescita: molecole solubili addizionate nel terreno di

coltura, molecole del microambiente.

2) Bioreattori: sistemi che provocano una movimentazione del

liquido di coltura ed agiscono sulle cellule tramite campi di forza.

3) Stimoli topografici: caratteristiche apportate sulle superfici di

adesione delle cellule per stimolarne il differenziamento,

l’orientazione o semplicemente l’adesione.

24/09/2015 33

Investigare colture primarie di

adenocarcinoma con vari tipi di

scaffold per capire quale supporto

e quale tecnologia sia la migliore

per sviluppare un modello in vitro.

Modelli Avanzati

24/09/2015 34

ISSID-2013

Scaffold

PEOT/PBT (poly(ethylene ossi) terephthalate

– poly(butylene) terephthalate)

PVA/Gelatina (polyvinilalcohol)

1) Elettrofilatura

Sterilizzazione

Cellule

2) Compression Molding & Particle

Leaching

Etanolo, lavaggi con antibiotici/antifungini

Colture primarie di PDAC

Metabolismo cellulare (AlamarBlue)

Istologia (ematossilina & eosina)

PEOT/PBT (poly(ethylene ossi) terephthalate

– poly(butylene) terephthalate)

3) Emulsione & Liofilizzazione

Campagna Sperimentale

Analisi SEM (microscopia a scansione elettronica)

DISC

CM

PVA

Immunoistochimica

24/09/2015 35

Resezione Chirurgica, DCP Duodenopancreasettomia

totale.

Ricci C., et al. 2013

Diagramma Sperimentale

24/09/2015 36

Morfologia degli Scaffold

PVA CM DISC

24/09/2015 37

Colonizzazione cellulare degli Scaffold

CM DISC

Scaffold

Cellule

PVA

24/09/2015 38

Scaffold

Cellule

Colonizzazione cellulare degli Scaffold

24/09/2015 39

Attività Metabolica

PVA

CM

DISC

24/09/2015 40

• Fissazione

• Processazione

• Inclusione in

paraffina

• Taglio

• Colorazione

Analisi Istologica

24/09/2015 41

2 g

iorn

i 4X 10X 20X 40X

5 g

iorn

i 8

gio

rni

15 g

iorn

i Ematossilina & eosina

24/09/2015 42

Ematossilina & eosina

24/09/2015 43

CM DISC

Formazioni di dotti

Ematossilina & eosina

24/09/2015 44

PVA

Ematossilina & eosina

Marcatori molecolari (IHC) Tempo (giorni)

EGF-R Pan-CK TGF-β MMP-9 ACTINA DESMINA

2 3 3 3 3 1 0

5 3 3 3 3 2 0

8 3 3 3 3 0/1 0

15 3 3 3 3 0 0

45 24/09/2015

EPIDERMAL GROWTH FACTOR

RECEPTOR

CITOCHERATINA PANCREATICA TRANSFORMING GROWTH FACTOR METALLOPROTEINASI-9 ACTINA DESMINA

Immunoistochimica

24/09/2015 46

Immunoistochimica MMP-9

PVA CM

Coltura 2D Tumore

DISC

controllo

24/09/2015 47

Immunoistochimica MMP-2

PVA CM

Coltura

2D

Tumore

DISC

3) Ha permesso di osservare la transizione epiteliale/mesenchimale

Il modello 3D avanzato per lo studio del PDAC in vitro ha permesso di

identificare il tipo di scaffold più idoneo per queste cellule, cioè quello

che dà luogo alla rigenerazione di strutture simil-tumorali (PVA).

Infatti:

2) Ha permesso di valutare la migrazione cellulare delle colture di PDAC

48

CONCLUSIONI - 1

24/09/2015

1) È risultato fattibile e riproducibile

Lo studio di modelli 3D avanzati di tumore in vitro può generare nuova

conoscenza indispensabile per sviluppare nuovi farmaci e sconfiggere

queste patologie.

24/09/2015 49

University of Pisa

Prof. Boggi Ugo Prof. Campani Daniela

Dr. Funel Niccola Dr. Danti Serena Dr. Trombi Luisa

Dr. D’Alessandro Delfo

University of Twente

Prof. Moroni Lorenzo

Ringraziamenti

Dr. Giovannetti elisa

Cancer Center

Amsterdam

“Sviluppo di modelli 3D bioibridi del cancro per test in vitro avanzati”

Ing. Serena Danti, PhD - Dr. Claudio Ricci, PhD

XXXIV Scuola Annuale di Bioingegneria

Bressanone, 21-24 Settembre 2015

s.danti@med.unipi.it

GRAZIE PER

L’ATTENZIONE