STANOVENÍ STRUKTURY LÁTEK

1nm 10 102 103 104 105 106 107

(the wave) X-ray UV/VIS Infrared Microwave Radio Frequency

(the transition) electronic Vibration Rotation Nuclear(spectrometer) X-ray UV/VIS Infrared/Raman NMR

Fluorescence

Možnosti

• RTGsouřadnice atomů, mezimolekulové interakce, 80 %

struktur v databázi• Elektronový mikroskop

velké komplexy, elektronový obal, nízké rozlišení• NMR

torzní úhly, nepřímé stavení meziatomové vzdálenosti H-H pomocí rezonance, dynamická informace • FRET

meziatomové vzdálenosti

RTG strukturní analýza – proč???

• Elektromag. záření interaguje s objekty jejichž velikost je srovnatelní s vlnovou délkou λ

• Limit rozlišení RTG analýzy je λ/2• Používaná vlnová délka 0.1 – 10 nm• Vzdálenost atomů v krystalu 0.1 – 0.3 nm

Vzdálenosti mezi atomy:C−C 1.54 ÅC=C 1.23 ÅC−N 1.45 Å

RTG strukturní analýza

• Max von Laue, Walter Friedrich a Paul Knipping (1912) ozářili krystal modré skalice svazkem RTG a zjistili, že rozptýlená energie se od krystalu šíří pouze v určitých směrech, zatímco v jiných vyhasíná.

RTG strukturní analýza

• Nedestruktivní interakce RTG záření s krystalickými materiály.

• Jedna z nejdůležitějších metod pro určení struktury.• V RTG difrakčním obrazci je zakódována informace o

vnitřní struktuře (William L. Bragg)

RTG strukturní analýza

• NC za chemii (1962) – výzkum struktury globulárních proteinů J.C. Kendrew a M.F. Perutz

RTG strukturní analýza

• NC za lékařství (1962) – za určení molekulární struktury nukleových kyselin – F.H.C. Crick, J.D. Watson a M.H.F. Wilkins

• Za sto let vývoje metody – 12 NCRosalind E. Franklin

RTG strukturní analýza - princip

• Až na defekty uvnitř krystalové mříže je krystal upořádán trojrozměrně periodicky (větší podjednotka ribozomu 64 tisíc atomů!) → krystalová struktura (nepřesně krystalová mřížka) → aproximace – prostorová mřížka → elementární buňka

• Elementární buňky jsou identické co do rozměrů tak hmotné náplně a jejich orientace v prostoru.

• Stanovení krystalové struktury znamená určení a upřesnění souřadnic a parametrů teplotních pohybů všech atomů v elementární buňce.

RTG strukturní analýza - princip• 230 prostorových grup

Základní buňka

Záření se rozptyluje na elektronech → tato interakce je příliš slabápro detekci rozptylu na jedné molekule → použití krystalů s triliony molekul v identické orientaci.

RTG strukturní analýza - principKrystal ozářen monochromatickým RTG zářením

Difrakční obraz

Dopadající primární záření se pružně rozptyluje na elektronech měřeného krystalu (vznik sekundárního – difraktovanéhozáření).

RTG strukturní analýza - princip

• Difrakce (reflexe) a interference• Braggův zákon

2dsinθ = nλ

Známe úhel a vlnovou délku → určíme vzdálenost d mezi rovinami, které lze prokládat krystalovou strukturou

RTG strukturní analýza - princip

• Reflektující roviny v krystalu se rozlišují hodnotami Millerových indexů hkl

• Každý bod obsahuje informaci o všech atomech!• Difrakční vzor obsahuje informace o velikosti buňky a

symetrii. Ze systematického vyhasínání určíme prostorovou grupu.

• Strukturní informace je určena z intenzity bodů (přesná poloha atomů a teplotně-vibrační faktory).

• Pro obdržení dostatečného množství informací je pořízeno více snímků z rozdílných úhlů.

RTG strukturní analýza - princip

• Pozice atomů je určena výpočtem mapy distribuce elektronové hustoty. Maxima mapy (těžiště elektronových obalů těžkých atomů) dobře souhlasí s pozicemi jader izolovaných atomů.

• Pozice se upřesňují pomocí více měření.

RTG strukturní analýza - nevýhody

• Výchozí materiál – monokrystal nebo polykrystalický materiál (práškový - u malých molekul)

• RTG podává statickou informaci• Krystalová struktura je prostorově zprůměrovaná do jedné

elementární buňky a časově do délky trvání difrakčního experimentu → přicházíme o informace o defektech reálné kryst. struktury (lze řešit pomocí metody difrakčního kontrastu).

• Lze, ale sledovat měnící se strukturu látky během chemické reakce in situ (časově rozlišená RTG krystalografie)

RTG strukturní analýza

• Dosažený stupeň rozlišení závisí na kvalitě monokrystalu.• Počet difrakcí nutných k řešení souvisí se složitostí

měřeného krystalu (od několika desítek u krystalu kovů až po několik milionů u krystalu virů).

• Doba sběru dat od hodin po několik dnů.• Měření se provádí za chlazení (většinou dusíkem) – 100-

150 K (potlačení teplotně-vibračních pohybů a ochrana před radiačním poškozením)

RTG strukturní analýza – elektronová hustota

• K výpočtu jsou potřeba i údaje o fázových úhlech difraktovaných paprsků (nejsou dostupné z experimentu)

• Úvodní neznalost fází – fázový problém• Hodnoty fází lze extrahovat ze souboru

naměřených intenzit tzv. přímými metodami -aplikací vztahů založených na nerovnostech, statistice a počtu pravděpodobnosti → na základě vztahů se vybere nejvíce pravděpodobné fázování reflexí a to se použije pro výpočet mapy elektronové hustoty a určení pozic atomů

• Amplitudy a fáze jsou zakódované přímo v paprscích záření rozptýlených atomy krystalu

• Amplituda s rovná druhé odmocnině intenzity rozptýleného záření (změřeno difrakčním experimentem)

• Fáze rozptýlené vlny nemůže být změřena přímo (fázový problém)

Fázový problém

• Přímá metoda – pro malé systémy, založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi

• Metoda molekulárního nahrazení - na základě podobnosti s již určenou strukturou, vzrůstající popularita se vzrůstajícím počtem struktur

• Metoda těžkých atomů - experimentálně pomocí anomálního rozptylu těžkých atomů (Hg, Fe, Pb, I, Se …) obsažených ve zkoumané molekule (například MAD – multiple wavelengthanomalous dispersion – použitím vícečetné nebo jednoduché anomální difrakce MIR – Multiple isomorphous replacement použitím vícečetného

isomorfního nahrazení )• Upřesnění proteinové struktury se provádí výpočetně a

manuálně s využitím speciálních programů (SOLVE, SHELL-X, Phaser)

Proteinová krystalografie

• Nutnost vysoké koncentrace• Údaje o primární struktuře – z nukleotidových sekvencí

kódujících nukleových kyselin• Kvartérní struktura – elektronová mikroskopie• Sekundární a kvarterní struktura – RTG analýza až s

rozlišením 1 Å

Vstupní struktura

Vstupní struktura• Původní organismus

přirozená forma včetně všech modifikací malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy,

složitá izolace …

• Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení možné problémy s modifikacemi postranních řetězců

• Chemická syntéza velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným

sbalením proteinu

• In-vitro translace vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení drahé, posttranslační modifikace

Proteinová krystalografie - krystalizace• Hledání vhodných podmínek (koncentrace

proteinu a srážedla, teplota, pH, čistota vzorku proteinu, použitá metodika …)

• Zavádění robotizace a automatizace• Difrakční kvalita je často nedostatečná a

proměnlivá• Nutnost velkého množství krystalů

Difrakční experiment• Velikost základní buňky desítky

až stovky Å• Nízká úroveň uspořádanosti• Nutnost použít silný zdroj záření

(rotační anoda nebo zdroj synchrotronového záření)

• omezení radiačního poškození proteinových monokrystalů použitím nízké teploty (80-120 K)

RTG strukturní analýza - rozlišení

5Å - helixy jsou obtížně viditelné (jen obecné vlastnosti molekuly)3Å - peptidový řetezec, postranní řetězce pouze jeli známa sekvence2Å - konformace postranních řetězců

Krystalové kontakty

• Mezi atomy jsou velké kanálynaplněné rozpouštědlem

• Kontakty molekul v rámci krystalumohou a nemusí mít vliv na strukturu → záleží na pozicikontaktu

Teplotní B-faktor• Popisuje lokání nepřesnost v elektronové hustotě• Vysoký B-faktor → více nepřesná pozice atomu• Ideální B < 20 - 30 Ų

Důvody vysokých hodnot B-faktoru:1. Termální pohyb atomů2. Rozdílná konformace postranních řetězců3. Neuspořádanost proteinu

Kontrola struktury • Ramachandranův

graf WHATIFMOLPROBITY

• Free R value (Brünger 1992)‚Test set‘ of reflection is omitted in the modelling and refinement process (5-10 %).

Nukleární magnetická rezonance• Nukleární – nukleární spin a nukleární magnetický

moment

• Magnetická – jádro v magnetické poli → precesní pohyb jader a Larmorova frekvence, Zeemanův jev a Boltzmanova distribuce

• Rezonance – rezonance jader v magnetickém poli

Vlastnosti jader• Nukleární spin – vlastní moment hybnosti jádra daného izotopu

∑ (orbitální + spinový moment nukleonu)• pouze jádra s nenulovým spin mohou absorbovat/emitovat

elektromagnetické záření• (1) hmotnostní číslo M liché → poločíselný spin• (2) hmotn. číslo M sudé + počet protonů A sudý → nulový spin

nulový magn. moment - nepoužitelné v NMR (např. )• (3) hmot.číslo M sudé + počet protonů A lichý → celočíselný spin

• Skoro každý prvek má nějaký stabilní isotop s nenulovým spinem.(Výjimky: Ar, Tc, Ce, Pm)

O168

W0(MHz) 0 30 75 121 280 300 320 Nucleus 15N 13C 31P 19F 1H 3H

Nukleární magnetická rezonancevysoké přirozené zastoupení vysoká citlivost (1.00) malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)

velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.11 %) nízká citlivost (1.76⋅10−4); po 100% isotopovém obohacení 1.59⋅10−2

střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) nízké přirozené zastoupení (0.37 %) nízká citlivost (3.85⋅10−6); po 100% isotopovém obohacení 1.04⋅10−3

speciální účely

1H

13C

15N

2H

Nukleární magnetická rezonance• měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-

chemických vlastností prostředí • sledování průběhu biochemických dějů • vysoce selektivní odezva na úrovni atomů

Omezení:velikost molekuly:• do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA] – lze řešit přímo kombinací COSY,

TOCSY a NOESY experimentů • do 20 kDa [< 180 AA] – nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N • –do ~100 kDa – 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo

úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)

• větší proteiny – přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura

koncentrace vzorku – alespoň 0,2 mMdlouhodobá stabilita vzorku – několik týdnů

Nukleární magnetická rezonance - vzorek

• koncentrace proteinu alespoň 0,2–0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe)

• filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění

• úprava pH pufrem (pH typicky 4–8) • vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků

s molekulami vody a ztrátu signálů • přidání redukčních činidel (R–SH) • zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení

vzorku • přidání 5–10 % D2O • referenční jádro pro spektrometr (lock)

Potlačení signálu vody• jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O• fyziologické prostředí • při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za

deuterium → tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O → její signál je 104–105x intensivnější než signály měřené látky

Jednodimensionální 1H NMR spektrumproteinu• obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v

daném proteinu • k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají

všechna jádra: 1H, 13C a 15N

Vícedimenzionální spektrarozlišení informací obsažených v 1D spektrech • korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N • propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin • pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít

izotopové obohacení

NMR – ověření kvality proteinuSbalený proteinNesbalený protein

NMR - přiřazení• přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule

(nutnost znát sekvenci)1. přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO) 2. přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)

Páteřpro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů • přenos magnetizace pomocí skalárních interakcí (1J, 2J)

NMR - Páteř

Postranní řetězce

Strukturní parametry

• NOE - meziatomová vzdálenost

• skalární interakční konstanta - dihedrální úhel

• chemický posun - chemické okolí

• residuální dipolární interakce - vzájemná orientace vazeb

• vodíkové vazby - detailní lokální struktura

Nukleární Overhauserův efekt (NOE) • přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy A a B vlivem

křížové relaxace • hlavní zdroj informace o struktuře proteinu.• Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a

jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule.

• Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů.

• Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity.

• Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å.

Skalární interakce – dihedrální úhly

Chemický posun

Vodíkové vazby

NMR shrnutí určení struktury• Postranní řetězce

COSY, NOESY, 3D-NMR• Sekundární struktura

chemické posuny (páteř)dipolární interakceJ-interakce (torze)

• Terciální strukturaNOE intenzity

Elektronový mikroskop • Optický přístroj, kde fotony jsou nahrazeny elektrony a

skleněné čočky elektromagnetickými čočkami• Elektromagnetická čočka – cívka co vytváří tvarované

magnetické pole

• TEM (transmisní elektronový mikroskop)• SEM (rastrovací elektronový mikroskop)

TEM (NC 1986, objev 1932 Ruska)• Zobrazuje pomocí prošlých elektronů (transmisní –

elektrony projdou skrz vzorek a až pak jsou detekovány)• Vysoké urychlovací napětí elektronů (100-400 kV)• Pro tenké vzorky (do 100 nm)

SEM• Zobrazuje povrch vzorku pomocí sekundárních elektronů

nebo zpětně odražených elektronů• Urychlovací napětí elektronů (0.1-30 kV)• Rastrovací - elektronový svazek se pohybuje po vzorku

řádek po řádku v jakémsi neviditelném rastru a výsledný obraz se vytváří postupným skenováním

• Snadná příprava vzorku• Snadná interpretace

Kryo-elektronová tomografie• 200kDa – 400 MDa umožňuje zobrazení velkých struktur,jako jsou buňky a organely v téměř nativním stavu• Zahrnuje šokové zmrazení• Rozlišení 15 – 30 Å

Kryo-elektronová mikroskopie• používá pro „jednotlivé částice“ především na bázi

makromolekulárních komplexů, které byly izolovány a purifikovány (vyčištěny) biochemickou cestou.

FRET – Fluorescence (Förster) resonance energy transfer• rezonanční přenos energie z donoru v excitovaném stavu

na akceptor (mezi dvěma chromofory)• hybridizace DNA, konformační změny, interakce

biomolekul, senzory.

Chemický posun

NOE

Skalární interakce