sandra m. Živković · univerzitet u niŠu prirodno – matematiČki fakultet departman za...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sandra M. Živković
Antimikrobna aktivnost rakija dobijenih iz plodova samoniklog
bilja sa područja Srbije
Master rad
Niš, 2015.
2
UNIVERZITET U NIŠU
Prirodno-matematički fakultet
Departman za biologiju i ekologiju
Antimikrobna aktivnost rakija dobijenih iz plodova samoniklog
bilja sa područja Srbije
MASTER RAD
Kandidat:
Sandra M. Živković
Broj indeksa 8
Mentor:
Prof. Dr. Tatjana Mihailov–Krstev
Niš, 2015.
3
Mom deki Draganu
4
Zahvala
Srdačno se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Tatjani Mihajilov – Krstev
na pomoći prilikom izbora teme i realizacije rada
Zahvaljujem se i svim profesorima Prirodno-matematičkog fakulteta u
Nišu koji su svojom stručnošću i zalaganjem doprineli uspešnom završetku
mojih studija
Posebnu zahvalnost dugujem svojoj porodici.
SADRŽAJ
LISTA SLIKA........................................................................................................................................................ 7
LISTA TABELA.................................................................................................................................................... 8
1. UVOD ................................................................................................................................................................ 9
2. OPŠTI DEO .................................................................................................................................................... 10
2.1. Kazani za destilaciju ............................................................................................................................ 10
2.1.1. Sprski domaći kazan ......................................................................................................................................... 10
2.2. Postupak hidrodestilacije ili ''pečenja rakije'' .................................................................................. 10
2.2.1. Priprema voća za fermentaciju ......................................................................................................................... 10
2.2.2. Vrenje – alkoholna fermentacija kljuka ............................................................................................................ 11
2.2.3. Destilacija – pečenje rakije .............................................................................................................................. 12
2.2.4. Odležavanje i sazrevanje pića .......................................................................................................................... 12
2.3. Rakija kao lek ...................................................................................................................................... 12
2.4. Plodovi samoniklih biljnih vrsta iz kojih može da se dobije rakija ..................................................... 12
2.4.1. Rubus fruticosus L. (subelasta kupina) ............................................................................................... 12
2.4.2. Vaccinium myrtillus L. (borovnica) .................................................................................................... 13
2.4.3. Cornus mas L. (dren) .......................................................................................................................... 14
2.4.4. Prunus spinosa L.(crni trn) ................................................................................................................. 14
2.5. Mikroorganizmi ....................................................................................................................................... 15
2.5.1. Korisna uloga mikroorganizama – fermentacija ........................................................................... 16
2.5.1.1. Alkoholna fermentacija (alkoholno vrenje) ................................................................................................... 16
2.5.2. Mikroorganizmi zdravog čovečijeg tela .......................................................................................... 18
2.5.3. Štetna uloga mikroorganizama ........................................................................................................ 19
2.5.3.1. Patogeni mikroorganizmi ................................................................................................................ 19
2.5.3.2. Patogeni mikroorganizmi i bolesti koje izazivaju ............................................................................ 20
Rod Staphilococcus .................................................................................................................................................... 21
Rod Streptococcus ...................................................................................................................................................... 21
Rod Bacillus ............................................................................................................................................................... 22
Rod Clostridium ......................................................................................................................................................... 22
Rod Listeria ................................................................................................................................................................ 22
Rod Escherichia ......................................................................................................................................................... 22
Rod Salmonella .......................................................................................................................................................... 23
Rod Pseudomonas ...................................................................................................................................................... 23
Rod Enterobacter ....................................................................................................................................................... 23
Rod Shigella ............................................................................................................................................................... 23
Rod Klebsiella ............................................................................................................................................................ 24
2.6. Mehanizam antimikrobnog delovanja ................................................................................................... 24
2.7. Antioksidativna aktivnost ........................................................................................................................ 25
2.7.1. Slobodni radikali ................................................................................................................................ 25
2.7.2. Antioksidansi....................................................................................................................................... 26
6
2.7.3. Mehanizam delovanja antioksidanasa ............................................................................................ 28
3. CILJEVI RADA ............................................................................................................................................. 29
4. MATERIJAL I METODE .............................................................................................................................. 30
4.1. Biljni materijal i postupak dobijanja rakije ................................................................................................ 30
4.2. Izolovanje aroma-mirisnih sastojaka rakija ................................................................................................ 30
4.3. Gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) ................... 30
4.4. Identifikacija aroma-mirisnih sastojaka rakija ..................................................................................... 30
4.5. Antimikrobna aktivnost........................................................................................................................... 31
4.5.1. Kulture mikroorganizama ................................................................................................................... 31
4.5.2. Testiranje antimikrobne aktivnosti ..................................................................................................... 31
Mikro-diluciona metoda ............................................................................................................................... 31
4.6. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti .................................................................................... 32
4.6.1. Ukupna redukciona moć (Ekvivalent askorbinske kiseline u µg/mL) ................................................. 32
4.6.2. DPPH metoda ..................................................................................................................................... 32
4.6.3. ABTS metoda ...................................................................................................................................... 33
4.7. Statistička obrada podataka .................................................................................................................... 33
5. REZULTATI I DISKUSIJA .......................................................................................................................... 34
5.1. Hemijski sastav rakije.............................................................................................................................. 34
5.2. Antimikrobna aktivnost........................................................................................................................... 42
5.3. Antimikrobna aktivnost suvih ostataka rakija ...................................................................................... 43
5.4. Antimikrobna aktivnost dominantnih jedinjenja rakija ...................................................................... 44
5.5. Antioksidativna aktivnost rakija ............................................................................................................ 45
6. ZAKLJUČAK ................................................................................................................................................. 46
7. SUMMARY ..................................................................................................................................................... 47
8. LITERATURA ............................................................................................................................................... 48
BIOGRAFIJA ...................................................................................................................................................... 50
7
LISTA SLIKA
Slika 2.1. Izgled domaćeg srpskog kazana……………………..………....…10
Slika 2.2. Rubus fruticosus L. ........................................................................13
Slika 2.3. Vaccinium myrtillus L. ...................................................................13
Slika 2.4. Cornus mas L. ................................................................................14
Slika 2.5. Prunus spinsa L. ............................................................................14
Slika 2.6. Hemizam alkoholne fermentacije kvasca........................................17
Slika 2.7. Hemizam alkoholne fermentacije bakterije Z. Mobilis..................18
Slika 2.8. Mesta na bakterijskoj ćeliji i mehanizmi antibakterijskog delovanja
rakije……………………………………………………..………..24
Slika 2.9. Nastajanlje slobodnih radikala........................................................26
Slika 2.10. Najpoznatiji prirodni antioksidansi................................................27
Slika 4.1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom,
tretirana serijom razblaženja uzoraka..............................................31
8
LISTA TABELA
Tabela 4.1. Prikaz testiranih mikroorganizama.......................................31
Tabela 5.1. Oznake analiziranih voćnih rakija........................................34
Tabela 5.2. Hemijski sastav rakija...........................................................34
Tabela 5.3. Antimikrobna aktivnost rakija od divljeg voća i etanola
(MIC/MBC izražena u µL/mL)…………………………….42
Tabela 5.4. Antimikrobna aktivnost suvih ostataka rakija na izolate iz
urogenitalnog i gastrointestinalnog trakta i na izolate iz rana
(MIC/MBC izražena u µL/mL)………………………….....43
Tabela 5.5. Antimikrobna aktivnost dominantnih jedinjenja rakija i
antibiotika (pozitivna kontrola)………………………….....44
Tabela 5.6. Antioksidativna aktivnost uzoraka rakija, ispitivana uz pomoć
metode određivanja ukupne redukcione moći, DPPH i ABTS
metode...................................................................................45
9
1. UVOD
Još u IV veku pre nove ere Aristotel je zapisao da bi morska voda kao i vino i druge
tečnosti mogli da se pretvore u pijaću vodu kada bi se podvrgli procesu destilacije. Ovakav
zaključak nije korišćen sve do VIII i IX veka nove ere, kada su arapski alhemičari osmislili
„alambike“ koje su koristili za dobijanje osnova parfema.
Znanje o procesu destilacije brzo se širilo Evropom i u mnogim zemljama započela je
proizvodnja destilovanih alkoholnih pića koji su nazvana „Voda života“. U XV veku počinje
proizvodnja „nacionalnih pića“ u zemljama Evrope i to džina u Engleskoj, šnapsa u
Nemačkoj, vodke u Rusiji i Poljskoj i rakije na Balkanu.
Reč rakija je arapskog porekla i potiče od reči „al-rak“ (znoj). U naše krajeve stigla je
sa Turcima u XIV ili XV veku i označavala je piće arak. U Srbiji se rakija proizvodila od
različitog voća, najčešće šljive i to tek krajem XIX veka, nakon uništenja vinograda i
smanjenja proizvodnje vina.
U srpskom narodu rakija je oduvek imala poseban značaj kako u svakodnevnom
životu, svečanim trenucima, prilikom obreda, tako i kao prevencija i lek. Smatra se da jedna
čašica rakije deluje preventivno na mnoge bolesti kao što su stres, depresija, dijabetes, angina
pektoris, hepatitis A, kamen u bubregu, reumatični artritis, osteoporoza, poboljšava pamćenje
i otvara apetit.
U ovom radu je vršeno ispitivanje hemisjkog sastava, antioksidativne i antimikrobne
aktivnosti rakija dobijenih tradicionalnom metodom destilacije od plodova samoniklog bilja:
divlje kupine (Rubus fruticosus, L.), borovnice (Vaccinium myrtillus, L.), drena (Cornus mas,
L.) i trnjine (Prunus spinosa, L.), kao potencijalnih prirodnih izvora antioksidativnih i
antimikrobnih materija za prevenciju i lečenje infektivnih i kancerogenih bolesti.
10
2. OPŠTI DEO
Rakija spada u žestoka alkoholna pića. Po svojim osobinama slična je vodki i
brendiju. U naše krajeve stigla je sa Turcima u XIV ili XV veku i do dan danas je ostala
utkana u tradiciju našeg naroda. Dobija se postupkom hidrodestilacije u tzv. kazanima za
pečenje rakije.
2.1. Kazani za destilaciju
Domaći kazani vode poreklo od primitivnih mongolskih kazana. Oni su se zagrevali
otvorenom vatrom. Poklopac im je od drveta sa dužom lulom preko koje se vrši kondenzacija
usled vazdušnog hlađenja. Kasnije je uveden hladnjak. Naši domaći kazani se razlikuju po
konstrukciji i mestu postanka. Dele se na srpske, bosanske i makedonske. Oni pripadaju grupi
primitivnih kazana.
2.1.1. Sprski domaći kazan
Srpski domaći kazan je izrađen od bakra, zapremine od 75-150 litara. Cela aparatura
se sastoji od: kazana i kondenzatora koji su spojeni bakarnim cevima i imaju odvodne i
dovodne cevi (slika 2.1.). Kazan je oblika zarubljene kupe. Dno kazana je izrađeno od
debelog lima, a debljina je srazmerna zapremini kazana. Na otvoru se nalazi proširenje za
držanje kapka (poklopca). Zagreva se ogrevnim drvetom. Destilacija na ovom kazanu traje 5-
6 sati.
Slika 2.1. Izgled domaćeg srpskog kazana
2.2. Postupak hidrodestilacije ili ''pečenja rakije''
Postupak hidrodestilacije ili ''pečenja rakije'' se odvija u četiri koraka i to su:
1. priprema voća za fermentaciju;
2. vrenje, odnosno alkoholna fetmentacija kljuka (komine);
3. destilcija – pečenje rakije;
4. odležavanje – sazrevanje rakije.
2.2.1. Priprema voća za fermentaciju
Za proizvodnju voćnih rakija mogu poslužiti sve voćne sirovine koje imaju dovoljnu
količinu šećera. Šećer se tokom fermentacije transformiše u alkohol. Procenat ukupnog šećera
u voću je direktno proporcionalan količini etil-alkohola koji će nastati. Zbog maksimalnog
11
sadržaja šećera i najbolje sortne arome, berba plodova (ručno ili mehanički) se vrši kada su
oni u punoj zrelosti, po suvom vremenu.
Priprema voća za fermentaciju obuhvata: pranje plodova, uklanjanje nejestivih
delova, usitnjavanje ili muljanje, a kod koštičavog voća i uklanjanje koštica.
Pranje plodova. Ukoliko su plodovi jako uprljani najpre ih treba oprati vodom. Tako
se sa površine plodova otklanjaju mehaničke nečistoće koje mogu da daju strani miris rakiji.
Pranjem se otklanjaju i štetni mikroorganizmi (bakterije i kvasci) koji bi mogli vrenje voćnog
kljuka da usmere u pogrešnom pravcu ili, čak, da prouzrokuju njegovo kvarenje.
Usitnjavanje ili muljanje. Celi plodovi se nikada ne stavljaju u vrione sudove jer bi
se fermentacija odvijala suviše sporo, a šećer ne bi u potpunosti prevreo. Muljanjem voća
dobija se kljuk. Ukoliko je dobijeni kljuk isuviše suv, može mu se dodati voda kako bi se
dobila kaša. Dobijena kaša se zatim stavlja u vrioni sud.
Uklanjanje koštica. Koštice mogu da daju proizvodu specifična senzorna svojstva, a
mogu da sadrže cijano-vodoničnu kiselinu i etil-karbamat koji su štetni po zdravlje ljudi.
2.2.2. Vrenje – alkoholna fermentacija kljuka
Nakon muljanja, dobijeni voćni kljuk se stavlja u vrione sudove. Sudovi su različitih
dimenzija i mogu biti izrađeni od različitih materijala: drvene kace, drvena burad, plastična
burad od polietilena. Nakon toga se dodaju selekcionisani kvasci (Saccharomyces cerevisiae)
koji iniciraju i ubrzavaju proces vrenja jer uzimaju glavnu ulogu u pretvaranju šećera u
alkohol. Fermentacija može da se vrši i pod dejstvom kvasaca koji prirodno nastanjuju
površinu ploda. Sudovi ne smeju potpuno da se napune, već se ostavlja 25-30% praznog
prostora, jer bi u toku vrenja došlo do vrijenja i prosipanja kljuka. Alkoholna fermentacija se
odvija u zatvorenim sudovima (anaerobni uslovi) i to po formuli:
C6H12O6(šećer) → 2C2H5OH(etanol)+2CO2(ugljen-dioksid) + 22kcal
Tokom vrenja stvara se ugljen-dioksid koji ukoliko se ne ukloni može da izazove
eksploziju. Ustaljeni način je otvaranje vrionih sudova pri čemu se vrši i dodatno mešanje
sadržaja. U ovom slučaju masa koja fermentiše dolazi u kontakt sa kiseonikom i nepoželjnim
mikroorganizmima koji mogu dovesti do nepoželjnih promena. Bolji način je kada se na
poklopac montira gumeno crevo čiji se izlazni deo uranja u čašu napunjenu vodom. Ovako
dolazi do sigurnog ispuštanja ugljen-dioksida, pri čemu je ulazak kiseonika u vrioni sud
onemogućen. U kljuku koji predstavlja slabo kiselu sredinu se mogu razviti nepoželjni sojevi
mikroorganizama, kao što su Acetobacter, Lactobacilli, bakterije buterne kiseline. Iz tog
razloga se preporučuje korekcija kiselosti do pH=3.2 uz pomoć sumporne ili fosforne kiseline.
Pri ovoj kiselosti dolazi do stvaranja 30% manje metanola bez gubitka etil alkohola.
U alkoholnoj fermentaciji kljuka razlikuju se tri faze: početak vrenja, burno (glavno)
vrenje i tiho vrenje. U prvoj fazi kvasac počinje da se razmnožava i oslobađa se veoma mala
količina ugljen-dioksida i stvara mala količina alkohola. U toku burnog vrenja produkcija
alkohola se dosta povećava, ugljen-dioksid se intenzivno oslobađa zbog čega se uzdižu čvrsti
delovi kljuka u vidu klobuka, a često se stvara i pena. U ovoj fazi se oslobađa i toplota koja
povišava temperaturu kljuka (Jović, 2006). U fazi tihog vrenja fermentišu i poslednje količine
šećera, a količina ugljen-dioksida koji se oslobađa je veoma mala.
Kraj vrenja je označen prestankom stvaranja ugljen-dioksida i spuštanjem nastalog
„klobuka“ ili se može odrediti pomoću Ekslovog širomera. Ekslov širomer određuje sadržaj
šećera u voćnom kljuku na bazi različitih gustina.
Prevreli voćni kljuk bi trebalo što pre destilisati, jer može doći do većeg gubitka
alkohola, povećanja sadržaja kiselina ili do razvoja plesni na površini kljuka. Sve ovo bi
uticalo na smanjenje kvaliteta buduće rakije, pa ukoliko se kljuk čuva određeni period do
pečenja, potrebno ga je konzervisati i zaštititi.
12
2.2.3. Destilacija – pečenje rakije
Destilacija prevrelog kljuka je proces odvajanja isparljivih sastojaka od sirovine koja
se destiliše, putem isparavanja i kondenzacije i njihovo prevođenje u tečnost – rakiju.
Isparljive sastojke čini veliki broj jedinjenja, a najzastupljenjiji su voda i etil alkohol.
Međutim, za kvalitet rakije veoma su bitne i ostale komponente koje prelaze u destilat, kao
npr. aromatične materije, isparljive kiseline, estri, etri, viši alkoholi itd. To znači da
destilacijom ne želimo da dobijemo samo alkohol, tj. neutralni destilat u pogledu arome i
ukusa, već da, pored vode i alkohola, u destilat pređu i „primese“ ali samo u količini
dovoljnoj da daju karakter piću i ne naruše njegov kvalitet(Jović, 2006).
2.2.4. Odležavanje i sazrevanje pića
Tokom procesa odležavanja i sazrevanja svežeg destilata dolazi do niza reakcija koje
dovode do formiranja jedinstvene arome voćne rakije, koja je kao takva spremna za
konzumiranje.
Količina alkohola u rakijama najbrže i najjednostavnije se određuje uz pomoć
alkohometra. Izražava se u zapreminskim delovima ili vol% koji označavaju broj litara čistog
alkohola koji se nalazi u 100 litara pića. U narodu se popularno jačina rakije meri u gradima.
Jedan grad približno je jednak 2,5 vol%, odnosno 25% alkohola.
2.3. Rakija kao lek
Rakija se koristi u medicinske svrhe još od davnina. Još na početku XX veka uočena je
veza između umerenog konzumiranja alkohola i smanjenja rizika od kardiovaskularnih
oboljenja. Ljudi koji povremeno piju, po nekim istraživanjima, zdraviji su i duže žive od onih
koji nikada ne piju ili od alkoholičara. Takođe, umereno konzumiranje alkoholnih pića
smanjuje mogućnost visokog krvnog pritiska, oboljenja perifernih arterija, Alchajmerove
bolesti ili srčanog udara. Jedna čašica rakije dnevno deluje preventivno na dijabetes,
reumatični arthritis, osteoporozu, kamen u bubregu, stres i depresiju, Parkinsonovu bolest,
hepatitis A, anginu pectoris, a dobra je i za pamćenje.
Prema medicinskim istraživanjima alkoholna pića ne utiču na povećanje telesne mase.
Sam alkohol sadrži kalorije, ali po mnogim dugogodišnjim istraživanjima dovodi čak do
malog smanjenja težine kod žena koje ograničeno konzumiraju alkoholna pića. Unošenjem
alkohola primetno se ubrzava metabolizam što uzrokuje sagorevanje više kalorija u odnosu na
one koje se unose pićem. Alkoholna pića ne sadrže masti ni holesterol, ali različita pića imaju
različite nutritivne vrerdnosti.
Preterivanje u piću izaziva cirozu jetre, povećava mogućnost malignih oboljenja.
Umereno konzumiranje po mnogim studijama poboljšava zdravlje i produžava život.
Postoji više vrsta rakija. Rakija od krompira-vodka, od pirinča-sake i druge. U Srbiji,
međutim najpopularnije su tzv. voćne rakije kao što su:Lozovača, Kajsijevača, Viljamovka,
Dunjevača, Klekovača, Šljivovica i druge.
2.4. Plodovi samoniklih biljnih vrsta iz kojih može da se dobije rakija
U prirodnim ekosistemima Srbije evidentirano je oko 100 divljih vrsta voćaka
(Mratinić i Kojić, 1998).
2.4.1. Rubus fruticosus L. (subelasta kupina)
Familija:Rosaceae, Sinonimi:R. candicans Weihe., R. montanus,Lieb., R.
thyrsoideus,Wine
13
Slika 2.2. Rubus fruticosus L.
Morfološke karakteristike: Žbun je bujan, visok i jak. Izdanci su u početku
uspravni, a pred kraj leta su povijeni, slabo odrveneli. Sporadično su trnoviti, sa
karakterističnim trnovima koji su najčešće dugačke osnove, a neki su i srpasto povijeni.
Lišće je složeno, prstasto, sastavljeno od pet listića. Lice liske je glatko, a naličje
maljavo ili beličasto dlakavo.
Cvetovi su dvopolni, sitni, sakupljeni u dugačku i gustu cvast-gronju. Kruniči listići
su vrlo sitni, bele ili izrazito crvene boje.
Plod je zbirna koštunica, crne boje.
Ekološke i fiziološke karakteristike: Rubus fruticosus je česta vrsta montanskih
šuma. Sreće se po brdskim terenima, utrinama i svetlijim šumama. Cveta od maja do jula, a
plodovi sazrevaju u avgustu i septembru.
Opšterasprostranjenje: Srednja Evropa, od istočne Francuske do Poljske i Češke,
Balkansko i Apeninsko poluostrvo.U Srbiji je česta vrsta montanskih šuma (Mratinić i Kojić,
1998).
2.4.2. Vaccinium myrtillus L. (borovnica)
Familija:Vacciniaceae, sinonimi:V. montanum,Sal., V.angulosum,Dul., Myrtillus
niger,Gil., M.silvatica,Bub.
Slika 2.3. Vaccinium myrtillus L.
Morfološke karakteristike: Borovnica je drvenast, višegodišnji, razgranat žbun,
visine do 50 cm. Stabalca su uspravna, gola, zelene boje i razgranata.
Lišće je jajastog, izduženog oblika, sa testerasto nazubljenim ivicama. Na obe strane
je slabo maljavo, svetlozeleno, sjajno, naizmenično postavljeno i skoro sedeće. U jesen
postaje crvenkasto i opada (Mratinić i Kojić, 1998).
Cvetovi su pojedinačni i nalaze se u pazuhu listova. Cvetovi su dvopolni. Krunični
listići su srasli pa imaju zvonastu formu.
Plod je ljubičastoplava bobica. Na vrhu ploda se nalazi pupak koji predstavlja ostatak
čašičnih listića.
Ekološke i fiziološke karakteristike: Borovnica je rasprostranjena na visokim
planinama, na visinama od 900 do 2000 m.n.v. Raste ne kiselim tipovima zemljišta (pH-4.5).
Cveta od sredine maja do sredine juna, a plodovi sazrevaju od kraja jula do kraja avgusta.
14
Rasprostranjenje vrste: Sreće se u južnoj, srednjoj i severnoj Evropi, na Kavkazu,
u Maloj Aziji, Mongoliji, severnoj Aziji i Severnoj Americi.
2.4.3. Cornus mas L. (dren)
Familija:Cornaceae, sinonimi:Cornusmascula,Lam., Cornus vernalis,Salisb., Cornus
nudiflora,Dum.
Slika 2.4. Cornus mas L.
Morfološke karakteristike: Dren je grm, visine 3-5 metara.
Listovi su prosti, eliptičnog ili jajasto-eliptičnog oblika, naspramno raspoređeni. Sa
obe strane liske su prekriveni gustim maljama. Nervatura lista je zrakasta.
Cvetovi su dvopolni. Od jednog cvetnog pupoljka formira se štitasta cvast od 10-23
cvetova. I čašica i krunica su žute.
Plod je monokarpna koštunica, varijabilne po boji, veličini, obliku ploda i koštice.
Ekološke i fiziološke karakteristike: Dren je vrlo adaptivna vrsta. Raste na
nadmorskim visinama od 100 do 1000 metara. Dren je termofilna i kserofilna vrsta. Cveta u
rano proleće pre listanja. Plodovi sazrevaju od kraja avgusta do početka oktobra.
Opšterasprostranjenje–Apeninsko i Balkansko poluostrvo, deo srednje Evrope,
Mala Azija, Krim i Kavkaz. U Srbiji je rasprostranjen na celoj teritoriji sa sadašnjim ili
ranijim hrastovim šumama.
2.4.4. Prunus spinosa L.(crni trn)
Familija:Rosaceae
Slika 2.5. Prunus spinsa L.
Morfološke karakteristike: Crni trn je najčešće žbun visine 1-3 metara.
Listovi su naizmenični, imaju peteljke, jajoliki su, nazubljenog oboda, dlakavi na
naličju.
Cvetovi su dvopolni, petočlani, rastu pojedinačno na kratkim drškama, a cvetaju pre
listanja. Latice su bele.
Plod je tamnoplava, sitna koštunica.
15
Ekološke i fiziološke karakteristike: Rasprostranjen je u zoni hrastovih šuma.
Sreće se na visinama do 1000 metara. Cveta u martu i aprilu. Plodovi sazrevaju krajem
avgusta, a mogu ostati na grani sve do proleća.
Opšterasprostranjenje: širom Evrope, u Tunisu, Maloj Aziji, Iranu. U našoj zemlji
je široko rasprostranjena u pojasu hrastove šume.
2.5. Mikroorganizmi
Mikroorganizmi predstavljaju heterogenu grupu organizama. U mikroorganizme
spadaju virusi, bakterije, alge, gljive, lišajevi i protozoe. Sam naziv-mikroorganizmi ukazuje
da se radi o organizmima mikroskopskih veličina, koji su nevidljivi golim okom. Međutim,
postoje predstavnici koji dostižu makroskopske razmere (neke višećelijske alge, neke gljive).
Mikroorganizmi mogu biti jednoćelijski ili višećelijski ili da nemaju ćelijsku građu-acelularni
(virusi). Celularni predstavnici mogu imati prokariotski tip ćelije (bakterije, modrozelene
alge), ali i eukariotski (protozoe, gljive, lišajevi, alge).
Od svih mikroorganizma bakterije su najzastupljenije u prirodi. Mogu imati loptast,
štapićast, izvijen i nitast oblik, a po načinu ishrane su uglavnom paraziti i saprofiti, mada ima
i autotrofnih predstavnika. One su kosmopolitski organizmi koji naseljavaju sve životne
sredine. Ima ih u vodenoj, vazdušnoj sredini, zemljištu, pa čak i u sredinama gde drugi
organizmi ne bi opstali (sredine sa visokim salanitetom, termalni izvori, jako kisele ili bazne
sredine). Kao kosmopoliti igraju važnu ulogu u stvaranju, održavanju i funkcionisanju
različitih ekosistema. U svim sredinama koje naseljavaju njihova aktivnost se odvija u stalnoj
interakciji sa različitim biotičkim i abiotičkim faktorima (Petrović et al., 2007).
U biogeohemijskim ciklusima kruženja materije na našoj planeti mikroorganizmi
igraju važnu ulogu. Biljke u toku fotosinteze stvaraju ogromnu količinu organske materije
koju u svojoj ishrani koriste životinje i ljudi. Uginućem biljaka i životinja organska materija
dospeva na zemljište i u zemljište. Transformaciju mrtve organske materije do mineralnih
oblika mogu da vrše samo mikroorganizmi. Na taj način omogućena je ishrana biljaka i
stvaranje nove organske materije, čime je omogućeno neprekidno kruženje materije u prirodi
(Jarak, Govedarica, 2003). Kada ne bi bilo mikroorganizama, mrtva organska materija bi se
nakupljala na površini zemljišta, postojeće rezerve biljnih asimilativa bi se vremenom
istrošile, nestalo bi biljaka, a nakon toga životinja i čoveka.
U poljoprivredi gde su biljni i životinjski organizmi (njihov porast i razvoj) pod
kontrolom čoveka, životna aktivnost mikroorganizama je od posebnog značaja. Oni imaju
aktivnu ulogu u stvaranju zemljišta i njegove plodnosti, tako što iz žetvenih ostataka vrše
sintezu humusa, a iz humusa mineralizacijom oslobađaju biljne asimilative. Selekcionisani
sojevi mikroorganizma se koriste za đubrenje i zaštitu biljaka.
Važnu ulogu imaju i u stočarstvu. Kod domaćih životinja su značajni u procesima
varenja hrane jer omogućavaju transformaciju celuloze i drugih polisaharida, pomažu varenje
proteina, proizvode vitamine. Na ovaj način se organizmu obezbeđuje izgradnja tkiva,
neophodna energija koja se troši na razne sinteze, održavanje temperature i mehanički rad,
kao i stvaranje hranljivih materija koje imaju fiziološku ulogu, jer organizmu služe za
kontrolu i regulaciju preocesa metabolizma.
Izučavanje prirodnih procesa dovelo je do toga da aktivnosti mikroorganizma kao što
su fermentacija, antimikrobno delovanje, uticaj na poboljšanje senzornih svojstava i
probiotički učinak, zauzima značajno mesto u prehrambenoj industriji i to u proizvodnji
hleba, mlečnih proizvoda, alkoholnih pića. U mikroorganizme sa ovakvom aktivnošću se
ubrajaju Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, Lactobacillus casei, Streptococcus
thermophilus, Saccharomices cerevisiae, Torulopsis elipsoides, itd.
Pored brojnih korisnih uloga mikroorganizma u farmaceutskoj, poljoprivrednoj i
prehrambenoj industriji, oni mogu biti i jako štetni jer predstavljaju rizik po zdravstvenu
bezbednost ljudi, životinja i biljaka. Spontana aktivnost mikroorganizama izaziva pojavu
16
biogenih amina i kvarenja, a samim tim i smanjenja upotrebne vrednosti hrane. U
mikroorganizme koji izazivaju pojavu biogenih amina i kvarenje hrane ubrajaju se bakterijski
rodovi Microccocus, Pseudomonas, Xantomonas, Achomobacter, Aerobacter, Bacillus,
Seratia, Streptococcus, Clostridium, i plesni: Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Mucor,
Rhizopus, Alterneria, Monilia, Oidium, i dr. Mikroorganizmi mogu dovesti i do produkcije
raznih toksičnih materija u zemljištu što negativno utiče na ostvarenje prinosa u
poljoprivrednoj proizvodnji.
Poznavanjem aktivnosti mikroorganizma čovek ima mogućnost da njihovu primenu i
kontrolu usmeri prema svojim potrebama čime bi korisnu ulogu pojedinih sojeva iskoristio u
praktičnoj primeni, a ujedno sprečio razvoj štetnih mikroorganizma koji dovode do neželjenih
posledica.
2.5.1. Korisna uloga mikroorganizama – fermentacija
Mikroorganizmi imaju veliki značaj u proizvodnji nekih namirnica i proizvoda
značajnih za čoveka. Mikroorganizmi su prisutni u životu čoveka od davnina – pečenje hleba,
pravljenje jogurta, sira, raznih pića, turšija itd. nije moguće bez određenih mikroorganizama.
Mikroorganizmi se koriste u prehrambenoj, hemijskoj, farmaceutskoj industriji, u rudarstvu, u
dobijanju energije, u medicini (Petrović et al., 2007)
Bakterije kao mikroorganizmi poseduju tri vrste metaboličkih procesa pri kojima
dolazi do oslobađanja energije, a to su: respiracioni procesi, fermentativni procesi i
fotosinteza. Kod ovih metaboličkih grupa postoje mnogi putevi i mehanizmi koji dovode do
oslobađanja i dobijanja energije. Iako su putevi u načelu isti, oni se ipak međusobno razlikuju,
pre svega što su to enzimski procesi, a svaka vrsta mikroorganizma ima svoj specifičan
enzimski sastav. Tako će te različite grupe mikroorganizama i enzima koristiti različite
supstrate za svoj energetski metabolizam i formiraće intermedijarne i krajnje produkte toga
metabolizma koji se međusobno razlikuju. Supstrat takođe, može na različite načine biti
razgrađen i odati iz sebe energiju. Svi ti procesi mogu dovesti do odavanja manje ili veće
količine energije, a pri tim procesima mogu se obrazovati različiti međuprodukti i krajnji
produkti koji će se međusobno razlikovati (Petrović et al., 2007).
U procesu fermentacije oksido-redukcionim reakcijama se obrazuje nestabilni
molekul čija se fosfatna grupa (sadrži mnogo slobodne energije) prenosi na molekul ADP-a
što dovodi do stvaranja molekula ATP-a.
Fermentacije mogu biti:
1) Anaerobne fermentacije-odvijaju se u anaerobnim uslovima (bez prisustva
kiseonika). Oksidacija supstrata zaustavlja do nekog organskog jedinjenja, a ATP se formira
na nivou supstrata. Neke od anaerobnih fermentacija su alkoholna, mlečno – kiselinska,
buterna, propionska i aceton – butilna.
2) Aerobne fermentacije se odvijaju u prisustvu kiseonika. Kod fermentacije ovog
tipa ATP se formira na respiratornom lancu u toku oksidativne fosforilacije. Proces oksidacije
ide do kraja, do CO2 i H2O. Poznate aerobne fermentacije su sirćetna, limunsko – oksalna,
fumarno – ćilibarna i glukonska (Petrović et al., 2007).
Glavni energetski značaj fermentacije je obezbeđivanje 2 molekula ATP-a.
2.5.1.1. Alkoholna fermentacija (alkoholno vrenje)
Alkoholno vrenje predstavlja fermentisanje ugljenih hidrata po uticajem
mikroorganizama do etil alkohola i CO2, sa obrazovanjem manjih količina nekih
međuprodukata. Centralni intermedijer je pirogrožđana kiselina, tj. njen aktivan oblik piruvat
– jon. Dekarboksilacijom pirogrožđane kiseline formiraju se CO2 i acetaldehid, koji se potom
redukuje do etanola. Ovaj tip fermentacije ostvaruju kvasci, mukorne gljive i neke bakterije.
17
Vrenje se odigrava u kiseloj sredini (pH=4.0 – 4.5), zato što kisela sredina ugušuje i
sprečava razvitak prateće mikroflore. Optimalna temperatura je oko 30 C, a koncentracija
šećera 10 – 15%, jer povećan sadržaj šećera otežava vrenje, a pri 30 – 35% ono se i prekida.
Alkoholna fermentacija se koristi za proizvodnju alkohola, glicerina, raznih vina, piva
konjaka, ali i u pekarskoj industriji. Ishodna sirovina za dobijanje alkohola su ugljeni hidrati
različitog porekla (krompir, žitarice). Proces alkoholnog vrenja ide po EMP putu.
Alkoholna fermentacija je značajna u industriji alkohola za proizvodnju vina, piva i
alkoholnih pića. Osim toga, čist etanol dobija se industrijskom proizvodnjom. Etanol je
značajan kao rastvarač i osnovna sirovina sa širokom upotrebom u različitim granama
industrije. Poslednjih godina, naročito je značajna upotreba etanola kao biogoriva.
Na komercijalnom nivou, etanol može da se proizvodi hemijskom sintezom
(katalitičkom hidratacijom etilena) ili mikrobiološkim putem primenom alkoholne
fermentacije pomoću mikroorganizama. Danas se etanol industrijski dobija, uglavnom,
mikrobiološkim procesima.
Etanol je produkt metabolizma mnogih prokariotskih i eukariotskih organizama ali
se za industrijsku proizvodnju, najčešće, koriste kvasci roda Saccharomyces, ali se sve češće
koriste i bakterija Zymomonas mobilis. Plesni, takođe, mogu da produkuju etanol ali se ne
koriste u industriji za dobijanje etanola jer sporije katabolišu šećere u odnosu na kvasce i
bakterije.
Mnogi kvasci imaju sposobnost alkoholne fermentacije ali za industrijsko dobijanje
etanola najznačajniji su kvasci roda Saccharomyces. U okviru roda Saccharomyces postoji 30
različitih vrsta kvasaca. Kvasci roda Saccharomyces predstavljaju heterogenu grupu
organizama koji se međusobno razlikuju po sposobnosti razgradnje šećera i po krajnjim
produktima metabolizma. Razmnožavaju se bespolno, pupljenjem, a pod određenim uslovima
formiraju askospore za polno razmnožavanje.
Hemizam alkoholne fermentacije kvasca - alkoholna fermentacija je anaerobni
metabolitički put razgradnje ugljenih hidrata. Kvasci 1 molekul glukoze oksiduju
glikolitičkim putem do 2 molekula piruvata (pirogrožđana kiselina) uz sintezu 2 molekula
ATP pri čemu se 2 NAD+ koenzima redukuju u 2NADH koenzima. ATP se u glikolizi
sintetiše fosforilacijom na nivou supstrata od molekula ADP i neorganskog fosfata. Kako je
NAD+ koenzim neophodan za glikolizu i dobijanje energije, nastali piruvat ulazi u alkoholnu
fermentaciju. Na piruvat deluje enzim piruvat dekarboksilaza i u reakciji se dobija acetaldehid
uz oslobađanje CO2. Nastali acetaldehid je supstrat za enzim alkoholna dehidrogenaza koja
katališe reakciju redukcije acetaldehida do etanola. U ovoj reakciji se reoksiduje NADH
koenzim u NAD+ koenzim koji može opet da se uključi u glikolizu. Alkoholnom
fermentacijom kvasaca od 1 molekula glukoze nastaju 2 molekula etanola, 2 molekula CO2 i 2
molekula ATP.
Slika 2.6. Hemizam alkoholne fermentacije kvasca
18
Prednosti korišćenja kvasaca za industrijsko dobijanje etanola su visok stepen
konverzije šećera u etanol (preko 90%) kao i dobijanje visoke koncentracije etanola (18%).
Međutim, visoka koncentracija etanola (5%) inhibira rast kvasaca i produkciju etanola (6-
10%). Osim toga, pri niskim koncentracijama šećera, kvasci metabolišu etanol pod aerobnim
uslovima što smanjuje konačan prinos etanola i efikasnost procesa. Zato alkoholna
fermentacija mora da se prekine u određenom trenutku ili da se koncentracija šećera održava
tokom fermentacije.
Bakterije roda Zymomonas su gramnegativne bakterije, fakultativno anaerobne,
pokretne sa polarnim flagelama. Rastu na supstratima sa niskom pH vrednošću (pH 4) kao i u
prisustvu 5% etanola. Prirodna staništa ovih bakterija su kiseli, šećerni i alkoholni supstrati,
najčešće, biljni sokovi. Za industrijsko dobijanje etanola, najčešće, se koriste sojevi vrste Z.
mobilis.
Hemizam alkoholne fermentacije bakterija iz roda Zymomonas je sličan alkoholnoj
fermentaciji kvasaca. Razlika je jedino u reakcijama oksidacije glukoze do piruvata koje se
kod zimomonasa ne odvijaju klasičnim glikolitičkim putem. U gornjem delu biohemijskog
puta glukoza se fosforiliše i oksiduje do 2-keto-deoksi-6-fosfo-glukonata na koji deluju
enzimi aldolaze. Delovanjem aldolaza dobija se piruvat i gliceraldehid-3-fosfat.
Gliceraldehid-3-fosfat ulazi u donji deo glikolitičkog puta pri čemu nastaje piruvat. Oba
piruvata se dalje fermentišu do etanola na isti način kao kod kvasaca. Ovaj put katabolizma
glukoze naziva se Entner-Dourdofov metabolitički put.
Slika 2.7. Hemizam alkoholne fermentacije bakterije Z. mobilis
Prednosti korišćenja bakterije Z. mobilis za industrijsko dobijanje etanola u odnosu
na kvasce su veći prinos etanola (za 5-10%) i veća brzina potrošnje šećera i produkcije
etanola (oko 2,5 puta). Osim toga, bakterija Z. mobilis je tolerantniji na povećan osmotski
pritisak (fermentišu šećere u koncetraciji do 400 g/l) i etanol (do 120 g/l) u odnosu na kvasce.
Takođe, zahtevi za nutritijentima su manji u odnosu na kvasce (pored šećera, neki sojevi
zahtevaju samo još pantotenat i biotin) dok je pH optimum širi (5-7), a temperatura
fermentacije viša (30C). Glavni nedostatak korišćenja zimomonasa za industrijsko dobijanje
etanola je rast na malom broju šećera (glukoza, fruktoza i saharoza) tako da se samo manji
broj sirovina može koristiti.Osim bakterija iz roda Zymomonas, i druge bakterije se, danas,
izučavaju kao mogući producenti etanola ali još uvek se ne koriste u industriji. U tim
istraživanjima veliki potencijal pokazale su bakterije iz roda Clostridium koje mogu da rastu
na celuloznim i skrobnim sirovinama.
2.5.2. Mikroorganizmi zdravog čovečijeg tela
Mikroorganizmi mogu naseljavati različite delove čovekovog tela boraveći na njemu
privremeno ili stalno. Tako se mikroorganizmi mogu naći na površini kože, u usnoj duplji, u
digestivnom traktu gde postoji stalna flora mikroorganizama koja produkuje enzime,
vitamine, kiseline i tako omogućava normalno funkcionisanje digestivnog trakta čoveka.
Takođe, mikroorganizama ima i u respiratornom i urogenitalnom traktu čoveka.
Mikroorganizmi svojom aktivnošću doprinose fiziološkom i zdravstvenom stanju
čoveka tako što:
19
- čiste organizam od nepotrebnih produkata metabolizma čoveka koristeći ih kao
nutrijente;
- produkuju biološki aktivne materije tipa vitamina, aminokiselina, koje doprinose
aktivnosti domaćina;
- metaboličkom aktivnošću negativno deluju na patogene te igraju važnu ulogu u
zaštiti od njih.
Pored niza pozitivnih efekata koje imaju, mikroorganizmi predstavljaju jedan od
medicinskih problema, jer su većinom patogeni za čoveka.
2.5.3. Štetna uloga mikroorganizama
Mikroorganizmi izazivaju različita oboljenja biljaka, životinja i ljudi, a utiču i na
kvarenje namirnica za ljudsku i stočnu ishranu. Čovek se različitim sredstvima i postupcima
bori protiv štetnog delovanja mikroorganizama u prirodi. Radi uništavanja ili zaustavljanja
njihovog razvoja u namirnicama, pronađena su brojna sredstva i postupci koji neće uticati na
kvalitet i hranjivu vrednost namirnica.
Poznavanjem aktivnosti mikroorganizama čovek ima mogućnost da njihovu primenu
i kontrolu usmeri prema svojim potrebama čime bi korisnu ulogu pojedinih sojeva iskoristio u
praktičnoj primeni, a ujedno sprečio razvoj štetnih mikroorganizama koji dovode do
neželjenih posledica (Samardžija et al., 2007).
2.5.3.1. Patogeni mikroorganizmi
Uzroci oboljenja ljudi i životinja su mnogobrojni, a jedan od njih su svakako
mikroorganizmi.
Patogen je svaki mikroorganizam koji može da prouzrokuje oboljenje, a sama
sposobnost da uzrokuje oboljenje naziva se patogenost. Kvantitativno izražen stepen
patogenosti je virulencija. Virulencija se izražava kao broj bakterijskih ćelija potreban da
usmrti 50% populacije laboratorijskih životinja. Minimalan broj ćelija patogena koji je
potreban da uzrokuje oboljenje 50% članova populacije laboratorijski životinja naziva se
infektivna doza (Petrović et al., 2007).
Virulencija je rezultat mogućnosti mikroorganizma da adherira za domaćina, izvrši
invaziju i luči toksine.
Patogenost mikroorganizama je genetski determinisana, postojana osobina date vrste
mikroorganizma, a virulentnost je kvantitet tih kvaliteta kod pojedinih sojeva određene vrste.
Među patogenima se mogu uočiti dve velike grupe mikroorganizama, a to su
patogeni paraziti i patogeni saprofiti. Patogeni paraziti za svoju ishranu koriste žive ćelije ili
esencijalne metabolite svoga domaćina, od koga su stalno ili povremeno potpuno zavisni.
Patogeni saprofiti žive u okolnoj sredini i u organizam domaćina dospevaju pasivnim putem,
najčešće u vidu spora preko rana ili konzumiranjem zaražene vode ili hrane. Neki od njih kao
što je Clostridium botulinum, Clostridium tetani, produkuju veoma jake toksine, i zbog toga
se oboljenja koja izazivaju patogeni saprofiti nazivaju intoksikacije.
Tokom evolucije, patogeni mikroorganizmi su razvili različite mehanizme putem
kojih deluju na domaćina, a to su:
obrazovanje spora (tetanusni i antraksni bacili), kapsula (pneumokoke, diplokoke i
dr.), organela za kretanje (enterobakterije, vibrionikolere, spirohete i dr.);
izlučivanje enzima (streptokinaza – protiv fibrinske barijere, hijaluronidaza –
protiv hijaluronske kiseline vezivnih tkiva, neurominidaza – razgrađuje mukopolisaharide
ćelijskog omotača epitela disajnih puteva, hemolizini, fibrinolizini, plazmokoagulaza i dr.);
izlučivanje toksičnih materija – ekzotoksina, sa afinitetom za određena tkiva
(tetanusni, difterijalni, botulin toksin), i endotoksina, koji prouzrokuju opštu intoksikaciju i
alergijske reakcije (endotoksini enterobakterija, šigela, salmonela, rikecija i dr.). egzotoksini
20
se izlučuju pri životnim procesima bakterija, a endotoksini prilikom njihovog liziranja (Radev
et al., 1988).
Svi navedeni faktori patogene aktivnosti mikroorganizama se mogu grupisati u dve
grupe, jedna grupa im obezbeđuje invazivnost, a druga toksičnost.
Invazivnostje mogućnost organizma da prodre u tkivo domaćina, umnoži se u
velikom broju, inhibira njegovo funkcionisanje i širi se dalje u organizmu. Faktori
invazivnosti mikroorganizama su enzimi koji oštećuju tkivo i antifagocitni faktori, koji
sprečavaju efikasnost odbrambenih mehanizama domaćina (Petrović et al., 2007).
Faktori olakšavaju invazivnost su:
kapsula – površinska stuktura koju produkuje bakterijska ćelija, a koja je štiti od
štetnih uticaja sredine, a u tkivima domaćina od fagocitoze. Kapsule ometaju adherenciju
fagocita za bakteriju, npr. Kod S.pneumoniae, K. pneumoniae, B. antracis, itd. Fagociti mogu
da fagocitiraju intrakapsularne bakterije, ali ne mogu da ih razgrade. Oni ih putem krvi
raznose do ostalih delova tela domaćina, tako da pospešuju širenje patogenih bakterija;
kinaze –bakterije ih luče u cilju lize ugrušaka fibrina koji nastaju kao reakcija
organizma na mestu infekcije sa funkcijom lokalizacije i sprečavanja daljeg širenja
mikroorganizma;
koagulaza – prevode fibrinogen u fibrin i stvaraju krvne ugruške, u cilju zaštite
bakterije od odbrambenih snaga domaćina (Staphylococcus aureus);
hijaluronidaza – razara hijaluronsku kiselinu koja je vezivna komponenta tkiva
domaćina i omogućava prodor mikroorganizma u dublje slojeve tkiva (Streptococcus,
Staphylococcus, Clostridium);
kolagenaza – luče je uzročnici gasne gangrene (rod Clostridium), razara kolagen
vezivnog tkiva.
Toksičnost je sposobnost mikroorganizma da produkuje toksine koji oštećuju ili
ubijaju ćelije domaćina. U zavisnosti od toga da li ih izlučuje u spoljašnju sredinu ili ih čuvaju
vezane za ćelijsku supstancu, toksini bakterija dele se na egzotoksine i endotoksine.
Egzotoksini su proteinske supstance koje bakterije luče u spoljašnju sredinu, a koje
imaju toksičan efekat na ćelije domaćina. Zajednička karakteristika egzotoksina je da su
termolabilni, veoma toksični i imunogeni. Dezintegraciju egzotoksina vrše svi oni faktori koji
vrše denaturaciju proteina, visoka temperatura, UV zračenje, jake kiseline ili baze,
proteolitički enzimi. Oni su odlični antigeni, jer u organizmu domaćina stimulišu produkciju
veliku količinu specifičnih antitoksina. Ukoliko se egzotoksini podvrgnu delovanju visoke
temperature, oni gube toksičnost, ali zadržavaju antigenost. Detoksikovani egzotoksini se
označavaju kao toksoidi, a značajni su za veštačku imunizaciju protiv nekih zaraznih bolesti,
npr. difterija, tetanus.
Prema načinu delovanja, egzotoksini şe mogu podeliti na citotoksine (hemolizini,
leukocidin, itd), neurotoksine (toksini vrsta Cl. botulinum i Cl. tetani) i enterotoksine.
Endotoksini predstavljaju spoljašnji slok spoljašnje membrane bakterija. Ovi toksini
su sastavni deo ćelije i oslobađaju se tek nakon smrti i lize bakterija. Endotoksini su
kompleksna jedinjenja velikih molekula koji su termostabilni, slabo toksićni i slabo
imunogeni. Toksični efekat se ispoljava pojavom groznice, smanjenjem broja belih krvnih
zrnaca i trombocita, oslobađanjem citokina, generalizovanom inflamacijom, a u nekim
slučajevim i hemoragičnim šokom i nekrozom tkiva. Endotoksini ne pokazuju izrazit afinitet
prema pojedinim vrstama tkiva i zbog toga ne izazivaju specifične kliničke simptome.
(Petrović et al., 2007).
2.5.3.2. Patogeni mikroorganizmi i bolesti koje izazivaju
U odnosu na ukupan broj do sada opisanih mikroorganizama, uzročnici oboljena
čoveka i životinja čine relativno mali broj. U daljem tekstu biće opisane pojedine vrste čiji su
21
sojevi poznati kao glavni uzročnici velikog broja bolesti od značaja za humanu i veterinarsku
medicinu.
Rod Staphilococcus
Stafilokoke su grampozitivne bakterije, loptastog oblika, obično sakupljene u
nepravilne grupe u vidu grozdova. Mogu biti aerobne ili fakultativno anaerobne. Nepokretne
su, ne formiraju endospore, a samo neke poseduju kapsulu. Stafilokoke mogu biti nepatogene
i u tom slučaju ne poseduju koagulazu i patogene-poseduju koagulazu. Od ugljenih hidrata
fermentišu glukozu i maltozu, a većina petogenih sojeva fermentiše mantiol i hidrolizuje
želatin.
Patogene stafilokoke produkuju sledeće toksine: hemolizin (vrši lizu životinjskih
eritrocita), leukocidin (uništava ljudske leukocite), dermotoksin, eritrogeni toksin,
enterotoksin. Od enzima produkuju koagulazu, hijaluronidazu, fibrinolizin (stafilokinaza),
proteaze, lipaze, fosfataze i beta laktamaze.
Za humanu medicinu najznačajnije su sledeće vrste:Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus.
Kod ljudi najčešće izazivaju gnojna oboljenja kože koja se manifestuju kao apces,
furunkula, itd. Ukoliko stafilokoke prodru iz ovih žarišta u razne druge lokacije, mogu se
javiti znaci teških oboljenja kao što su meningitis, artritis, stafilokokne sepse (prodor
stafilokoka u krv).
Enterotoksini vrste S.aureus izazivaju zapaljenske procese u gastro-intestinalnom
traktu. Prilikom ovog tipa trovanja hranom smrtnost je retkaali može izazvati poremećaje
centralnog nervnog sistema.
Rod Streptococcus
Streptokoke su grampozitivne, loptastog oblika, raspoređene u vidu kraćih ili dužih
lanaca. Fakultativni anaerobi su. Nepokretne su i ne sintetišu enzim katalazu.
Streptokoke su veoma heterogena grupa bakterija. Mnogi bakteriolozi su pokušali da
ih sistematizuju. Prvi je 1891. godine Lingelshelm sistematizovao na osnovu izgleda kolonija
i morfologije. U periodu od 1902. do 1905. Hiss i Gordon su izvršili podelu streptokoka na
osnovu fermentativnih sposobnosti. 1919. Brown je na osnovu hemolize na krvnom agaru,
podelio streptokoke u tri grupe: , , hemolitičke streptokoke.
Sherman je izvršio podelu streptokoka na osnovu njihovih fizioloških osobina i to na
osnovu rasta u alkalnoj sredini i u hipertoničnom rastvoru NaCl, rasta u različitoj
koncentraciji žuči, prema osetljivosti na razne temperature i prema njihovim fermentativnim
osobinama. Sherman je formirao 4 grupe streptokoka: Streptococcus pyogenus, Streptococcus
viridans, Streptococus lactis i Enterococcus.
Rebeka Lancefield je 1933. godine izvršila novu podelu beta-hemolitičkih
streptokoka u serološke grupe. Podela je izvršena na osnovu sastava ćelijskog zida i njegovog
antigena. Mnoge streptokoke u ćelijskom zidu poseduju polimere ugljenih hidrata tzv. C –
supstanca, čija se građa razlikuje kod različitih streptokoka.
Streptococcus pneumoniae (pneumokok) - ne luči pravi egzotoksin, već produkuje
pneumolizin. Kapsula pneumokoka nije toksična, ali ima ulogu u njihovoj patogenosti i
virulentnosti, zato što ih štiti od fagocitoze. Pneumokoke nastanjuju sluzokožu gornjih
disajnih puteva, gde pripadaju normalnoj bakterijskoj flori. Usled drugih infekcija, kao što su
grip ili slabost odbrambenog sistema, može doći do njihovog preteranog razmnožavanja i
širenja, tako da nastaje infekcija. Mogu izazvati pneumonije (zapaljenje pluća), zapaljenje
uva, sinuzitis, meningitis, sepsu. Pneumokoknim pneumonijama često prethodi septikemija, a
kasnije se često javljaju komplikacije kao što su perikarditis, endokarditis, meningitis, artritis.
Streptococcus pyogenes (piogeni streptokok) – produkuje veći broj biološki aktivnih
materija među kojima su:
22
streptolizini –O i S tip, uništavaju ćelijsku membranu eritrocita i druge ćelije
organizma; citotoksični su;
streptokinaza - enzim koji razlaže fibrin;
eritrogeni toksin – deluje na endotel kapilara i izaziva ospu;
hijaluronidaze - razlaže međućelijske supstance kao što su glikozaminoglikani u
koje spada i hijaluronska kiselina;
dezoksiribonukleaza - enzim koji razlaže DNK;
proteaze
neuraminidaze, itd.
Izaziva bolesti označene kao streptokokoze. Bolest se prenosi kapljičnim putem sa
bolesnika. Moguće su eksplozivne epidemije streptokokne angine ili šarlaha nakon
konzumiranja zagađene hrane, prvenstveno mleka i mlečnih proizvoda. Kao neposredna
posledica infekcije streptokokom su streptokokna upala nosa i ždrela, streptokokna angina,
šarlah, upala bronhija i pluća, gnojne infekcije kože. Takođe, mogu izazvati upalu moždanih
ovojnica i negnojne komplikacije u obliku reumatske groznice i glomerulonefritisa.
Rod Bacillus
To su krupne, grampozitivne, štapićaste bakterije koje se javljaju pojedinačno, u
parovima ili u vidu lanca. Veoma su pokretne i formiraju endospore, a neke i kapsulu. Mogu
biti aerobi ili fakultativni anaerobi. Mnoge vrste imaju sposobnost da sintetišu ekstracelularne
enzime i antibiotike.
Sa medicinskog aspekta je Bacillus antracis koji produkuje tri vrste toksina: letalni
faktor (LF), edemski faktor (EF) i protektivni antigen (PA). Uzročnik je antraksa, fatalne
septikemije ljudi i životinja, koja se javljaju kao kožna, plućna ili crevna forma (Petrović et
al., 2007).
Rod Clostridium
Klostridije su sporogeni, grampozitivni do gram varijabilni štapići, koji formiraju
endospore postavljene centralno ili na jednom kraju ćelije, većeg dijametra od širine ćelije.
Većina su striktni anaerobi. Važna karakteristika u okviru ovog roda jeste mogućnost
razgradnje šećera i proteina (Petrović et al., 2007).
Clostridium botulinum – produkuje neurotoksine koji uzrokuju botulizam nakon
konzumiranja kontaminirne hrane.
Clostridium perfrigenes - ova bakterija može produkovati α – toksin (odgovoran za
gasne gangrene) koji se inkorporira u ćelijske plazma membrane izazivajući promene u njenoj
strukturi i funkciji. Zatim θ – toksin koji ima slične hemolitičke i nekrotičke efekte, DNAze i
hijaluronidaze, kao i kolagenaze koje razlažu kolagen u potkožnim tkivima i mišićima.
Klostridijalni termostabilni enterotoksin je čest uzrok alimentarnih intoksikacija (prisutan je u
kontaminiranoj hrani i fecesu) i dovodi do dijareje za 6 – 8 sati (Jawetz et al., 2007).
Rod Listeria
Bakterije ovog roda su mali, grampozitivni štapići. Pokretni su, fakultativno
anaerobni.
Listeria monocytogenes – poseduje katalazu, fosfatazu, stvara kiselinu bez gasa iz
glukoze, maltoze i salicina, a ne stvara kiselinu iz saharoze i manita. Uzrokuje listeriozu ljudi
(trudnica i novorođenčadi) i životinja (meningitis, sepsa…).
Rod Escherichia
Predstavnici ovog roda su gramnegativne, štapićaste. Većina je pokretna i kreće se
peritrihalnim flagelama, ali ima i nepokretnih. Mogu biti aerobi ili fakultativni anaerobi.
23
Escherichia coli - naseljava creva čoveka i životinja. Predstavlja deo crevne flore i
neophodna je za procese varenja i sinteze nekih supstanci (vitamini B12 i K). Glavni je
uzročnik infekcija crevnog trakta, septikemije i meningitisa.
Poznata su pet serološka tipa E. Coli i to su:
1) Enterotoksične E. coli (ETEC) – enterotoksični sojevi E. coli koloniziraju gornje
delove tankog creva, bez penetracije crevne sluzokože i nisu invazivni. Izlučuju enterotoksine
koji prouzrokuju gubitak tečnosti i elektrolita iz intestinalnih ćelija.
2) Enteroinvazivne E. coli (EIEC) – dizentriformni sindrom. Ne produkuju
enterotoksine već penetriraju u epitelne ćelije sluzokože kolona i u njima se razmnožavaju.
Infekcija se odlikuje tipičnim dizenteričnim krvavo – sluzavim stolicama.
3) Enteropatogene E. coli (EPEC) – ovi sojevi izazivaju akutni gastroenteritis kod
odojčadi i male dece. Sojevi nisu invazivni, mada prouzrokuju patološko histološke promene
crevnog epitela. Mehanizam patogenog dejstva nije dovoljno poznat.
4) Enterohemoragične E. coli (EHEC) – ovi sojevi su odgovorni za sindrom opisan
kao hemoragični kolitis nastao usled alimentarne intoksikacije. Sojevi nisu invazivni, ali
produkuju velike količine citotoksina (verotoksin) sličan šiga – toksinu, koji oštećuju
intestinalne ćelije i dovodi do njihove nekroze.
5) Enteroadherentne E. coli (EAEC) – izazivaju akutnu i hroničnu dijareju. One
produkuju toksin sličan ST – toksinu, kao i hemolizin.
Rod Salmonella
Predstavnici ovog roda su gramnegativni štapići, najčešće pokretni. Nemaju kapsulu.
Fermentišu glukozu uz oslobađanje gasa, a ne fermentišu laktozu, ne razlažu ureu, a većina
stvara H2S. Za salmonele su karakteristični O-somatski antigen, H-flagelarni i Vi antigen koji
obavija somatski i može da ga maskira.
Salmonella enteridis – izazivač toksiko infekcije čiji su uobičajeni simptomi
mučnina, povraćanje i dijareja, koja se javlja kao rezultat iritacije crevnog zida od strane
endotoksina. Pojavi ove bakterije obično prethode loši sanitarni uslovi i nedostatak termičke
obrade namirnica.
Rod Pseudomonas
Bakterije ovog roda su gramnegativni, asporogeni štapići. Pokretne su-kreću se uz
pomoć jedne ili nekoliko monopolarnih flagela. Predstavnici ovog roda su aerobi, katalaza i
oksidaza pozitivni. Ne fermentišu ugljene hidrate.
Pseudomonas aeroginosa- simptomi infekcije su generalizovane upale i sepse.
Infekcija ovim bakterijskim sojem napada sledeće organe: pluća, bubrege i mokraćne kanale i
može imati smrtni ishod.
Rod Enterobacter
Ovaj rod obuhvata prave gramnegativne štapiće koji su pokretni peritrihama. Ove
bakterije su asporogene. Mogu biti aerobne i fakultativno anaerobne.
Vrste iz roda Enterobacter izazivaju oportunističke infekcije u slučaju prolazne i
trajne imunodeficijencije domaćina kolonizacija tkiva i porasta virulencije. Najčešće izazivaju
infekcije urinarnog trakta, mada nisu retke ni primarne ili sekundarne infekcije respiratornog
sistema.
Rod Shigella
To su gramnegativne bakterije, štapićastog oblika, koje su nepokretne i ne formiraju
spore. Nemaju flagele i bez kapsule su, mada neki sojevi poseduju ovojnicu. Mogu biti
aerobne i fakultativno anaerobne. Ne fermentišu laktozu. Sve šigele produkuju endotoksin
(identičan O – antigenu) koji je polisaharidno –lipidno – peptidni komleks i otporan je na
visoke temperature, a neke produkuju i egzotoksin – šiga toksin, koji je proteinske prirode i
24
termolabilan je. Primarno dejstvo mu je na sitne krvne sudove CNS – a, izazivajući paralize i
neurološke lezije.
Svi serotipovi Shigella su patogeni za čoveka i izazivaju oboljenja bacilarnu
dizenteriju i šigelozu. To je infektivno oboljenje koje može imati akutni, subakutni i hronični
oblik. Najčešći način izazivanja zaraze ovim bakterijskim sojem je preko neispravne vode za
piće ili namirnicma koje su kontaminirane neispravnom vodom, kao što su krompir, riba,
testenine, živinsko meso, mlečni proizvodi i dr. Bolest šigelom manifestuje se bolom u
stomaku, grčevima, dijarejom, groznicom, povraćanjem i krvavom i sulznom stolicom. Vreme
inkubacije bolesti je od 12 – 50 sati i može biti vrlo neugodno, a u nekim slučajevima i sa
smrtnim ishodom.
Rod Klebsiella
Rod je dobio ime prema Edvinu Klebsu koji ih je prvi opisao kao grupu bakterija.
To su ravni, inkapsularni, nepokretni, gramnegativni štapići koji pripadaju grupi
fakultativnih anaeroba. Ima ih u ljudskom izmetu, vodi, voću, povrću i zemljištu.
Izazivaju infekcije respiratornog, urogenitalnog trakta, a kod dece mogu izazvati
infekciju digestivnog trakta. Glavni predstavnik je Klebsiella pneumoniae koja izaziva
oboljenja respiratornog i urogenitalnog trakta. Ove infekcije se javljaju kod
imunodeficijentnih osoba. Takođe, izaziva infekcije i baktermije urinarnog trakta, naročito
kod hospitalizovanih osoba. Kod dece često dovodi do enteritisa ili enteropolitisa.
2.6. Mehanizam antimikrobnog delovanja
Antibakterijska aktivnost rakije je konstatovana, ali nije detaljno objašnjen njen
mehanzam delovanja. Može se predpostaviti da se njen aktivnost ne bazira na jednom
specifičnom mehanizmu već da postoje nekoliko ciljnih mesta delovanja. Ta mesta su
prikazana na slici 2.8.
Slika 2.8.Mesta na bakterijskoj ćeliji i mehanizmi antibakterijskog delovanja rakije:
degradacija ćelijskog zida; oštećenje citoplazmatske membrane; oštećenje membranskih
proteina; curenje ćelijskog sadržaja; koagulacija citoplazme i promena protka protona (Burt,
2004)
25
2.7. Antioksidativna aktivnost
Istraživanje antioksidativne aktivnosti u različitim uzorcima veoma je značajno radi
brzog i efikasnog utvrđivanja delotvornosti određenog antioksidansa u borbi protiv mnogih
oboljenja izazvanih slobodnim radikalima.
U literaturi se pojam „antioksidans“ definiše na više načina. Reč antioksidans, kao
što i sam naziv pokazuje, znači „ono što se suprostavlja oksidaciji“. Antioksidans se
suprostavlja oksidaciji ili inhibira reakcije izazvane kiseonikom ili peroksidima. Mnoge od
ovih supstanci se koriste za konzervisanje prirodnih proizvoda: masti, ulja, hrane, itd. Sa
biološkog aspekta antioksidans je prirodna ili sintetska supstanca, koja se dodaje proizvodima
i sprečava ili odlaže njihovo propadanje uzrokovano kiseonikom iz vazduha. U biohemiji i
medicini antioksidansi su enzimi ili organske supstance, kao što je vitamin E ili beta-karoten,
koje su sposobne da reaguju u slučajevima štetnog uticaja oksidacije u ljudskom i
životinjskom tkivu.
U ljudskom organizmu se u svakom momentu odigravaju oksidacioni procesi koji su
osnova za normalno funkcionisanje organizma. Za vreme odvijanja oksidacionih procesa
nastaju veoma reaktivne čestice- slobodni radikali. Za neutralisanje nagomilanih slobodnih
radikala potrebna je određena količina antioksidanasa. Efikasnost datog antioksidansa se
ogleda u njegovoj sposobnosti da “hvata” slobodne radikale i da prekine lančane reakcije koje
se dešavaju između kiseonika i supstrata, a uzrokuju autoksidaciju ciljnih molekula u
organizmu, kao što su proteini, nukleinske kiseline, lipidi, itd. i dovode do promene njihove
strukture i funkcije, a samim tim i do pojave oboljenja (Huang, 2005).
2.7.1. Slobodni radikali
Slobodni radikali su neutralne intermedijerne čestice visoke reaktivnosti, koje
nastaju homolitičkim raskidanjem kovalentnih veza (termički i fotolitički) i tako sadrže barem
jedan nespareni elektron. Mogu da reaguju međusobno (radikal-radikal interakcija) ili sa
drugim molekulima (radikal-molekul interakcija).
Velika reaktivnost slobodnih radikala ogleda se u njihovoj težnji ka sparivanju svojih
elektrona zbog čega lako stupaju u reakcije i prisvajaju elektrone sa bilo kog mesta. Posledica
takvog vezivanja je deficit elektrona u napadnutom molekulu, tj. stvaranje novog radikala.
Slobodno radikalske reakcije se ne zaustavljaju na jednom koraku već su lančanog karaktera,
pokreću niz složenih i nekontrolisanih reakcija koje najčešće dovode do oštećenja ćelijskih
zidova, DNK ili drugih delova ćelije.
Iako se smatra osnovnim molekulom i simbolom života na planeti, kiseonik je
ujedno i najtoksičniji prirodni polutant (Emsley, 2001). Kiseonik koriste svi aerobni
organizmi u procesu respiracije za dobijanje energije, pri čemu se on redukuje do vode, a
složeni organski molekuli (lipidi, ugljeni hidrati, proteini) podležu oksidativnoj degradaciji.
Od ukupne količine kiseonika u ćeliji, jedan mali deo (2–3%) se transformiše u toksične
oblike koji se nazivaju reaktivnim oblicima kiseonika (ROS).
Reaktivni oblici kiseonika (ROS) predstavljaju metabolite nastale iz molekulskog
kiseonika (Mimić, 1999), koji sadrže atome kiseonika i poseduju veću reaktivnost od
kiseonika u osnovnom molekulskom stanju (Hu, 2001).
Kiseonik može biti toksičan i u sledećim oblicima:
redukovani kiseonični radikali koji nastaju u ćeliji u toku mnogobrojnih
metaboličkih procesa,
aktivirani oblici kiseonika, nastaju u fotohemijskim ili termičkim reakcijama
molekulski kiseonik (Cadenas, 2000)
26
Nekoliko snažnih oksidanasa se formira u toku odvijanja metaboličkih procesa, u
krvnim i drugim ćelijama oranizma: superoksidni anjon radikal (O2•-), vodonik peroksid
(H2O2), peroksil radikal (ROO•) i hidroksil radikal (OH•).
Slika 2.9. Nastajanlje slobodnih radikala
2.7.2. Antioksidansi
Antioksidansi su prirodne ili veštačke supstance koje imaju sposobnost da se
suprotstave oksidaciji ili da inhibiraju reakcije koje iniciraju reaktivne vrste. Tokom
višegodišnjeg istraživanja otkriveno je da različiti oblici reaktivnih kiseoničnih (ROS) i
azotnih vrsta (RNS) učestvuju u oksidativnoj degradaciji prehrambenih proizvoda i u
patogenezi nekih humanih oboljenja: ateroskleroza, dijabetes melitus, hronične upale,
neurodegerativni poremećaji i određene vrste raka.
Zaštitni efekti antioksidanata u odnosu na oksidacijom izazvane reakcije, danas se
ispituju sa velikom pažnjom, naročito u medicini, biologiji, hemiji, prehrambenoj tehnologiji,
itd. Istraživanje obuhvata postojanje jednostavne, pogodne i pouzdane analitičke metode (in
vitro) za brzo određivanje antioksidativnog kapaciteta čistog jedinjenja ili kompleksa u hrani
ili u biološkim uzorcima. Neke od najčešće korišćenih metoda za in vitro određivanje
antioksidativnog kapaciteta biće opisane u tekstu.
U zavisnosti od oblasti primene, mete koje antioksidansi štite su različite. Na primer
u hemijskoj industriji to su najčešće proizvodi od plastike i gume. Efikasan antioksidans je
onaj koji interaguje sa reaktivnim vrstama i prekida autooksidaciju. Sterno zaklonjeni fenoli i
amini pokazuju takve osobine i često se koriste kao antioksidansi u proizvodnji plastike i
gume. Naročito su značajni antioksidansi u prehrambenoj industriji, jer sprečavajući neželjene
reakcije i omogućavaju normalno odvijanje mnogih procesa u organizmu.
Antioksidans je supstanca koja može efikasno da smanji štetno dejstvo pro-
oksidansa, a da istovremeno dovede do formiranja proizvoda bez ili sa niskim nivoom
štetnosti. Oni uspevaju da zaštite biloške mete od lošeg uticaja.
Zaštita bioloških meta se zasniva na sledećim mehanizmima (Magalhaes, 2007):
inhibicija stvaranja i hvatanje ROS i RON
redukcioni kapacitet
metal-helatni kapacitet
27
aktivnost antioksidativnih enzima (superoksid dismutaze, katalaze, glutation
peroksidaze)
inhibicija oksidativnih enzima (NOS sintaze, ksantin oksidaze, ciklooksigenaze)
Vitamin C Vitamin E (α- tokoferol)
β- karoten Koenzim Q10(ubihinon)
Polifenoli Rutin Kvercetin
Slika 2.10. Najpoznatiji prirodni antioksidansi (vitamin C, vitamin E, -karoten,
ubihinon, polifenoli, rutin, kvercetin)
Biološki antioksidansi podrazumevaju enzimske antioksidanse i neenzimske
antioksidanse (Huang, 2005).
Prema načinu delovanja u ljudskom organizmu antioksidansi su podeljeni na:
1. preventivne antioksidanse– antioksidansi koji sprečavaju nastanak slobodnih
radikala i iniciranje lančane reakcije peroksidacije dekompozicijom vodonik peroksida i
lipidnih hidroperoksida, kompleksiranjem jona metala i eliminacijom ROS.
2. "skevindžer" antioksidanse– antioksidansi koji poseduju sposobnost da "hvataju"
slobodne radikale i tako inhibiraju inicijaciju i prekidaju propagaciju reakcije lipidne
oksidacije, pa se nazivaju i "prekidači" lančanih radikalskih reakcija. Prema rastvorljivosti ovi
antioksidansi dele se na:
- hidrosolubilne- rastvorljive u vodi (vitamin C, mokraćna kiselina, bilirubin,
albumin, glutation, neki polifenoli)
- liposolubilne- ne rastvorljive u vodi a rastvorljivi u lipidima (vitamini E i A,
karotenoidi, neki polfenoli) (Vaya, 2001).
3. "reparacione" antioksidanse– ovi antioksidansi deluju posebnim mehanizmima,
obnavljajući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog
stresa.
Antioksidansi značajni za ljudski organizam dele se na endogene i egzogene.
Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu i
izgrađuju sistem antioksidansne zaštite organizma. Tu spadaju: enzimski sistemi (superoksid
dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza), mokraćna kiselina, bilirubin, tioli (glutation,
28
lipolna kiselina, N-acetil cistein), koenzim Q10 (ubihinon), proteini koji kompleksiraju jone
metala. Antioksidansi koji se u organizam unose putem hrane ili lekova predstavljaju
egzogene antioksidanse (vitamin C, vitamin E, karotenoidi (β-karoten), oksikarotenoidi
(likopen), polifenolna jedinjenja (flavonoidi, fenolne kiseline, proantocijanidoli), itd (Percival,
1998).
2.7.3. Mehanizam delovanja antioksidanasa
Primarna antioksidativna zaštita - Enzimski sistemi koji učestvuju u primarnoj
antioksidativnoj zaštiti su superoksid dismutaza, glutation peroksidaza i katalaza. Superoksid
dismutaza (SOD) katalizuje dismutacije među superoksid anjon radikalima uz produkciju
H2O2 i kiseonika. Neutralizaciju nastalog H2O2 vrše glutation peroksidaza ili katalaza.
Pored ovih enzima, postoji i niz drugih sa sličnom funkcijom kao što su selen
nezavisna GSHPx, glutation reduktaza, redukovani glutation (GSH) i glukozo-6-fosfat
dehidrogenaza.
U sistem primarne antioksidantne zaštite ubrajaju se i neenzimske supstance kao što
su proteini transferin i ceruloplazmin koji imaju bitnu ulogu u transportu metalnih jona, zatim
albumin, mokraćna kiselina i bilirubin (Primiano, 1997).
Sekundarna antioksidativna zaštita - Sistem sekundarne antioksidativne zaštite čine
brojna niskomolekularna jedinjenja različitog porekla i karaktera, kao što su ubihinon, L-
askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi, fenoli i njihove kiseline, flavonoidi, derivati
hidroksicinamata i dr.(Mimica-Dukic, 1997; Arora, 1998; Powers, 1999; Draper, 2000). Kako
je struktura ovih jedinjenja veoma raznovrsna, tako su različiti i mehanizmi kojima ona
ostvaruju svoju aktivnost u sistemu antioksidantne zaštite. Najčešće su to hvatači
(“skevindžeri” ) slobodnih radikala, donori protona, inhibitori enzimskih sistema, helatori
jona prelaznih metala, itd. (Hoult, 1996; Packer, 1999; Lebeau, 2000). U sistem sekundarne
antioksidantne zaštite mogu se ubrojiti i enzimi koji aktivno učestvuju u otklanjanju
oksidativnih oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina, kao što su: endo- i
egzonukleaze, DNK polimeraze i ligaze, fosfolipaza A2, GSHPx i fosfolipid-zavisna GSHPx,
glikozilaze, kao i brojni proteolitički enzimi. Ovi enzimi “popravljaju” oštećene molekule
DNK, uklanjaju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i kroz procese resinteze
obnavljaju oksidovane aminokiseline i proteine (Božin, 2009).
29
3. CILJEVI RADA
Prilikom istraživanja su definisani sledeći ciljevi rada:
- Prikupljanje polodova divlje kupine (Rubus fruticosus L.), borovnice
(Vaccinium myrtillus L.), drena (Cornus mas L.) i trnjine (Prunus spinosa L.)
sa lokaliteta na teritoriji Republike Srbije opisanih u literturi;
- fermentacija i destilacija rakije prema tradicionalnoj proceduri;
- Ispitivanje hemijskog sastava dobijenih rakija;
- Ispitivanje antimikrobne aktivnosti dobijenih destilata protiv odgovarajućih
izolata iz patološkog materijala pacijenata;
- Ispitivanje antioksidativne aktivnosti dobijenih destilata tj. rakija;
- Interpretacija dobijenih rezultata u skladu sa objavljenim rezultatima u
naučnoj literaturi u fitoterapeutske svrhe.
30
4. MATERIJAL I METODE
4.1. Biljni materijal i postupak dobijanja rakije
Plodovi divlje kupine (Rubus fruticosus L.) brani su krajem jula meseca 2011. godine
kada su potpuno zreli. Plodovi borovnice (Vaccinium myrtillus L.) brani su krajem avgusta
meseca 2011. godine; drenjine (Cornus mas L.) brani su početkom septembra meseca 2011.
godine kada su potpuno zreli, a trnjine (Prunus spinosa L.) početkom meseca oktobra 2011.
godine. Determinacija biljnog materijala je izvršena klasičnim metodama. Za pripremu rakije
5 kg plodova je ostavljeno da fermentiše 30 dana na 18 0C, a zatim je od te fermentisane
smeše tradicionalnim postupkom hidrodestilacije u kazanu ''ispečena rakija'', proceđena kroz
gazu i ostavljena da ’’sazri’’.
4.2. Izolovanje aroma-mirisnih sastojaka rakija
Osamdeset mililitara rakije pomešano je, u erlenmajeru od 300 mL, sa 80 mL
destilovane vode i 40 mL CH2Cl2. Dodato je 8 g NaCl, a zatim je smeša 30 minuta mešana na
magnetnoj mešalici. Slojevi su razdvojeni u levku za razdvajanje i organski sloj je sušen iznad
anhidridovanog MgSO4. Ekstrakt je na vakuum uparivaču ukoncentrovan do 1 mL i direktno
analiziran gasnom hromatografijom i kombinacijom gasne hromatografije i masene
spektrometrije (GC-MS) (Tesević i sar., 2005).
4.3. Gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija-masena spektrometrija
(GC-MS)
Sve GC-MS analize (3 injektovanja) su vršene na aparatu Hewlett-Packard 6890N, na
kapilarnoj koloni 30 m x 0,25 mm, sa stacionarnom fazom DB-1 (100% dimetilpolisiloksan,
Agilent Technologies, USA), debljine filma 0,25 μm. Gasni hromatograf je bio direktno
kuplovan sa masenim detektorom MSD 5975B iste kompanije. Temperatura injektora i
detektora su održavane na 250 i 300 °C, dok je temperatura peći programirana linearno od 50
do 300 °C brzinom od 5 °C/min, a u toku poslednjih 10 min temperatura je održavana na 300
°C. Helijum je korišćen kao noseći gas, a brzina protoka je bila 1 mL/min. Uzorci,
pripremljeni kako je prethodno opisano, su injektovani u split modu (split ratio je bio 40:1).
Jonizacija je vršena u EI modu, elektronima energije 70 eV, a maseni spektri su beleženi za
m/z u opsegu od 35 do 500 (vreme skeniranja 0,32 s). GC (FID) analiza je rađena pod istim
eksperimentalnim uslovima koristeći kolonu iste polarnosti koja je bila opisana za GC-MS.
Procentualni sastav je dobijen integraljenjem hromatograma bez korišćenja korekcionih
faktora.
4.4. Identifikacija aroma-mirisnih sastojaka rakija
Sastojci rakija su identifikovane na osnovu poređenja njihovih masenih skenova,
nakon dekonvolucije programom AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and
Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2002), sa masenim spektrom standarda i/ili
masenim spektrima iz Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 biblioteka i iz MS biblioteke
napravljene na osnovu čistih supstanci. Identifikacija je takođe ostvarena poređenjem njihovih
linearnih retencionih indeksa, računatih po Van Den Doolu i Kratzu (Van den Dool, 1963), a
na osnovu retencionih vremena homologe serije n-alkana C6-C36 na DB-1 koloni, sa
literaturnim vrednostima (Adams., 2007). Kada je god to bilo moguće, identifikacija je
potvrđivana koinjektiranjem sa standardom.
31
4.5. Antimikrobna aktivnost
4.5.1. Kulture mikroorganizama
Za ispitivanje in vitro antimikrobne aktivnosti dobijenih rakija korišćeni su sledeći
izolati iz patološkog materijala (tabela 4.1.).
Tabela 4.1. Prikaz testiranih mikroorganizama
Patogeni mikroorganizmi
Iolati iz urina Izolati iz fecesa Izolati iz rana
Klebsiella pneumoniae
Morganella sp
Proteus mirabilis
Enterobacter faecalis
Salmonella enteritidis
Shigella sonnei
Listeria moncytogenes
Enterobacter faecalis
Escherichia coli
Candida albicans
Acinetobacter sp
Enterobacter sp
Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella oxytoca
Staphylococcus aureus
Proteus mirabilis
Escherichia coli
4.5.2. Testiranje antimikrobne aktivnosti
Mikro-diluciona metoda
Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne
koncentracije (MBC) rakije korisćena je mikrodiluciona metoda. Od prekonoćnih kultura
ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom
fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta (zamucenosti) 0,5 McFarlanda koja
sardži 1,5x108 CFU /ml bakterija (NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory
Standards, 2003). Zatim je napravljena serija duplih razređenja uzoraka (pripremljeno u
mikrotitar ploči sa 96 udubljenja, slika 4.1.) u rasponu od 500 - 0,02 l/ml. Ukupna zapremina
u bunariću je iznosila 100 l, a gustina suspenzije 2x106 CFU/ml. Mikrotitarske ploče su
inkubirane na 37 0C u trajanju od 24 h. Postupak je izveden u dva ponavljanja.
Slika 4.1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom
razblaženja uzoraka
Mikrobiološki rast je očitavan uz pomoć 20 μL 0,5 % vodenog rastvora trifenil
tetrazolijum hlorida (TTC) (Sartoratto et al., 2004). Koncentracija u kojoj nema vidljivog
rasta (nema crveno obojenih kolonija bakterija) predstavlja minimalnu inhibitornu
koncentraciju (MIC). Da bi se odredila minimalna baktericidna koncetracija (MBC) iz svih
bunarića u kojima nije bilo rasta, tj. iz onih koji se nalaze do bunarića sa minimalnom
32
inhibitornom koncentracijom, sadržaj je prenesen na nove petri-ploče sa odgovarajućim
čvrstim MH podlogama (Miler-Hinton agar). Nakon toga ploče su inkubirane na 24 časa na
37 °C. Nakon inkubacije vršeno je brojanje poraslih kolonija.
MIC/MBC se definiše kao najniža koncentracija aktivne supstance koja ubija 99,5%
bakterija (NCCLS standard – National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003).
4.6. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti
4.6.1. Ukupna redukciona moć (Ekvivalent askorbinske kiseline u µg/mL)
Redukciona moć svih ekstrakata je izražena preko redukcione moći askorbinske
kiseline kao pozitivne kontrole (AEAC- Ascorbate Equivalent Antioxidant Capacity).
Reakcione smeše su pripremljene mešanjem 10 µL pripremljenog ekstrakta sa po 1 ml 1%-
tnog rastvora K3[Fe(CN)6] i 1 mL pufera NaH2PO4-Na2HPO4. Smeše su inkubirane na
5000C 30 minuta i nakon toga je dodato 1 mL 10%-tne trihlorsirćetne kiseline. Smeše su
zatim centrifugirane na 3000 rmp 10 minuta. Nakon centrifugiranja uzimano je po 1 mL
frakcija suplemenata i mešano sa 1 mL destilovane vode i 0.2 mL 0.1%-tnog rastvora FeCl3.
Apsorbancije tako dobijenih smeša merene su na talasnoj dužini od 700 nm. Povećane
apsorbancije reakcionih smeša ukazuju na veću redukcionu moć. Ukupna redukciona moć
ovih ekstrakata je računata primenom sledeće jednačine:
AEAC=(CA ∙ AS)/AA
gde je:
CA-konačna koncentracija askorbinske kiseline u µg/mL
AS- apsorbancija uzorka
AA-apsorbancija askorbinske kiseline
4.6.2. DPPH metoda
Određivnje potencijalne antioksidativne sposobnosti DPPH testom rađeno je
spektrofotometrijski, metodom po Blois-u (Blois, 1958). Napravljen je rastvor DPPH radikala
u metanolu koncentracije tolike da apsorpcija na 517 nm bude malo preko jedinice
(koncentracija oko 5 µM), kako bi u reakciji sa potencijalnim antioksidansom (ispitivanim
jedinjenjima) pala na vrednosti od 0.2 do 0.8 (usled potrošnje DPPH u reakciji).
Koncentracije rastvora ekstrakata i ulja se biraju na osnovu probnih testova sa rastvorom
DPPH po datom postupku. Ekstrakti se rastvaraju do odgovarajuće koncentracije (najčešče 1
mg/ml) i serijom razblaženja se dobijaju odgovarajući radni rastvori čija se apsorbanca meri
spektrofotometrijski uz pomoć UV-Vis Shimadzu, PC 1650 spektrofotometra. Kao reagens se
koristi 2,2-difenil, 1-pikril hidrazil (DPPH) u metanolu u koncentraciji 0.04 mg/ml. Postupak
se sastoji u tome da se u 1800 µl rastvora DPPH doda 200 µl ispitivanog rastvora, promućka
se i ostavi da stoji 30 min u mraku na sobnoj temperaturi. Nakon 30 min boravka na tamnom
mestu mere se apsorpcije rastvora na talasnoj dužini 517 nm. Posle postavljanja bazne linije
meri se apsorpcija slepe probe odnosno samog DPPH rastvora (A0). U kivetu se sipa 200 μl
uzorka i 1800 μl rastvora DPPH (A1). Sve koncentracije se rade u tri ponavljanja, a na isti
način su tretirani vitamin C i BHA, poznati antioksidansi.
Smanjenje apsorpcije DPPH se izražava u %, a izračunava se preko sledeće formule:
% smanjenja apsorpcije (na 517 nm) = (A0- A1) x 100/ A0
A0 - srednja vrednost apsorpcije slepe probe;
A1 - srednja vrednost apsorpcije uzorka
33
Koncentracije koje smanjuju apsorpciju DPPH rastvora za 50% (EC50) su dobijene sa
kalibracione krive gde je predstavljena zavisnost apsorpcije DPPH rastvora na 517 nm i
koncentracije za svaki uzorak i kontrole. Za određivanje ovih vrednosti korišćen je Origin 7.0
softver (Džamić, 2010).
4.6.3. ABTS metoda
Za dobijanje radne smeše korišćeno je 19.2 mg ABTS-a i 5 ml rastvora K2O8S2.
Rastvor K2O8S2 se dobija tako štose 33.3 mgK2O8S2 doda u destilovanu vodu do 50 ml. Smeša
se ostavi da stoji 12-16 sati u mraku na sobnoj temperaturi. Pre svake analize vrši se probno
merenje na talasnoj dužini od 734 nm. Tek onda dolazi do mešanja 75 μl razblaženog uzorka i
3 ml smeše ABTS-a (Miller i Rice-Evans, 1997).Sadržaj je izmešan na vorteksu, a epruvete su
pokrivene i ostavljene 30 minuta na 30º u vodeno kupatilo. Osnovni standard vitamina C
dobijen je rastvaranjem 50 mg vitamina C (Mr 176.12 g/mol) u 1 ml destilovane vode. Zatim
se uzima 10 μl rastvora vitamina C i dodaje se destilovana voda do 10 ml. Rastvor vitamina C
čuva se na ledu. Koncentracije 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.25, 1.5 i 2 mg/ml su korišćeni za
konstrukciju kalibracione krive. Za kalibracionu krivu mereno je 6, 15, 30, 60, 75, 90 i 120 μl
standardnog rastvora vitamina C i smeše ABTS-a. Slepa proba, umesto 75 μl uzorka, sadrži
75 μl destilovane vode.
Na spektrofotometru su merene apsorbance na talasnoj dužini 734 nm prema blanku.
Apsorbanca slepe probe je prethodno merena prema destilovanoj vodi.
Koncentracija antioksidanata u originalnim uzorcima u ppm (mg/l) ekvivalentima
vitamina C (VitC) su izračunate tako što su koncentracije dobijene na osnovu kalibracione
krive pomnožene sa faktorom razblaženja.
4.7. Statistička obrada podataka
Svi rezultati su statistički obrađeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od tj.
sa 95% (p≤0,05).
34
5. REZULTATI I DISKUSIJA
Nakon prikupljanja odgovarajućeg voća, njegove fermentacije i hidrodestilacije
dobijene su rakije (tabela 5.1.) jačine 30 gradi (mereno gradmetrom koji se tradicionalno
koristi). Kako je 1 grad = 2.46 vol % alkohol u rakijama je bio 73.8 vol %.
Tabela 5.1. Oznake analiziranih voćnih rakija
Oznaka Voće Familija
S1 Drenjina (Cornus mas L.) Cornaceae
S2 Kupina (Rubus fruticosus L.) Rosaceae
S3 Borovnica (Vaccinium myrtillus L.) Ericaceae
S4 Trnjina (Prunus spinosa L.) Rosaceae
5.1. Hemijski sastav rakije
Nakon odgovarajuće pripreme uzoraka uz pomoć gasne hromatografije (GH) i
kombinacijom gasne hromatografije i masene spektrometrije (GH – MS) izvršena je hemijska
analiza. Dobijeni rezultati su prikazani u tabeli 5.2.
Tabela 5.2. Hemijski sastav rakija
Noa RIb Naziv jedinjenja Klasa S1 S2 S3 S4 Metoda
identifikacije
1 612 2-Methyl-1-propanol AL /c / 5,3 trd RI, MS, CoIe
2 630 3-Methylbutanal AL / / tr tr RI, MS, CoI
3 639 1-Butanol AL tr tr / 0,1 RI, MS, CoI
4 639 2-Methylbutanal O / / tr / RI, MS
5 639 3-Methoxy-3-methyl-1-butenef O / / 0,9 / MS
6 646 1-Ethoxy-1-methoxyethane O / / / tr RI, MS
7 661 1-Penten-3-olg AL / / / / RI, MS
8 661 2-Pentanone O / / 0,2 / RI, MS
9 664 2,3-Pentadioneh O tr tr 0,1 0,1 RI, MS
10 670 Pentanal O / / / 0,1 RI, MS, CoI
11 675 2-Hydroxy-3-butanoneh
(syn. Acetoin)
O 0,1 1,3 tr 0,7 RI, MS, CoI
12 680 3-Pentanolg AL / / / / RI, MS, CoI
13 684 2-Pentanol AL / / / / RI, MS
14 693 Ethyl propanoateh E tr tr tr tr RI, MS, CoI
15 695 Propyl acetate E / tr / 0,5 RI, MS, CoI
16 698 Propanoic acidh FA tr tr / 0,1 RI, MS, CoI
17 706 Methyl butanoatei E / / / / RI, MS, CoI
18 712 3-Penten-2-one O / / tr / RI, MS
19 716 1,1-Diethoxyethaneh O tr / tr tr RI, MS, CoI
20 717 3-Methyl-1-butanol AL 38,5 41,0 40,2 24,1 RI, MS, CoI
21 720 2-Methyl-1-butanol AL 19,0 13,9 16,8 11,8 RI, MS, CoI
22 728 1,1-Dimethoxy-2-methylpropanef O / / tr / RI, MS, CoI
23 734 2,4,5-Trimethyl-1,3-dioxolaneg O / / / / RI, MS
24 736 1-Methoxy-3-methyl-2-butene O / / 0,7 0,1 MS
25 739 2-Methylpropanoic acidh FA 0,2 0,6 0,3 / RI, MS, CoI
26 739 Ethyl 2-methylpropanoate E / / / 0,1 RI, MS, CoI
27 744 1-Pentanolh AL tr 0,2 0,1 0,5 RI, MS, CoI
28 747 (Z)-2-Penten-1-olf AL / / tr / RI, MS
35
29 750 2-Methylpropyl acetateh E 0,1 0,5 tr tr RI, MS, CoI
30 754 2-Methyl-2-buten-1-ol AL / / / / RI, MS
31 754 3-Ethoxypropanalh O tr / / tr RI, MS
32 757 2,2-Diethoxypropaneh O tr / 0,1 tr RI, MS, CoI
33 760 2-Ethyltetrahydrofuranl O / / / / RI, MS, CoI
34 763 2-Hexanonei O / / / / RI, MS
35 764 3-Ethoxy-2-butanoneh, j O tr / / / RI, MS
36 768 3-Hydroxy-3-methyl-2-butanonek O / tr / / RI, MS
37 771 Ethyl 2-oxopropanoatei E / / / / RI, MS
38 772 Hexanal O / tr tr 0,4 RI, MS, CoI
39 773 4-Methyl-3-pentene-2-onef O / / 0,4 / RI, MS, CoI
40 776 2-Hydroxypentan-3-onek O / tr / / MS
41 780 Ethyl butanoateh E tr / 0,1 0,1 RI, MS, CoI
42 782 2-Hexanol AL / / / / RI, MS
43 792 Ethyl lactate (syn. ethyl 2-
hydroxypropanoate)
E 0,2 1,2 2,1 0,7 RI, MS, CoI
44 795 Butyl acetate E / / / / RI, MS, CoI
45 802 2-Furancarboxaldehyde (syn. furfural)h O tr 0,3 1,3 1 RI, MS, CoI
46 804 1,1-Diethoxypropanem O / / / tr RI, MS, CoI
47 808 1-(1-Ethoxyethoxy)propanem O / / / tr RI, MS, CoI
48 810 Butanoic acid FA / / / tr RI, MS, CoI
49 815 3-Ethoxy-1-propanolh AL tr tr / 0,1 RI, MS
50 819 (E)-Ethyl 2-butenoatei E / / / / RI, MS
51 823 (E)-2-Hexenal O / / tr 0,1 RI, MS
52 825 3-Methyl-1-pentanol AL / tr / / RI, MS, CoI
53 826 3-Methylbutanoic acidh FA 0,1 2,5 0,1 2,2 RI, MS, CoI
54 829 Furfuryl alcoholg O / / / / RI, MS, CoI
55 830 1-Methylbutyl acetatei E / / / / RI, MS, CoI
56 830 (E)-3-Hexen-1-olh AL 0,1 tr 1,3 / RI, MS, CoI
57 831 Ethyl 2-methylbutanoate E / / / tr RI, MS, CoI
58 833 Ethyl 3-methylbutanoate E / / tr / RI, MS, CoI
59 834 (Z)-3-Hexen-1-ol AL 0,2 tr 10,3 1,6 RI, MS, CoI
60 835 2-Methylbutanoic acid FA tr 0,3 0,5 tr RI, MS, CoI
61 843 Methyl tiglate E / / / / RI, MS, CoI
62 844 (E)-2-Hexen-1-ol AL / tr / / RI, MS
63 846 1,1-Diethoxy-2-methylpropane O tr / / / RI, MS, CoI
64 848 1-Hexanol AL 1,3 3,5 1,2 0,8 RI, MS, CoI
65 854 3-Methylbutyl acetate E 0,5 3,3 1,2 1,8 RI, MS, CoI
66 856 γ-Butyrolactoneh O tr / tr tr RI, MS
67 857 2-Methylbutyl acetateh E 0,2 1,1 0,6 0,6 RI, MS, CoI
68 858 1-(1-Ethoxyethoxy)-2-methylpropaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
69 863 4-Heptanolm AL / / / tr RI, MS
70 864 2-Heptanone O / tr / tr RI, MS
71 870 Methyl 2-hydroxy-3-methylbutanoatef E / / 0,1 / RI, MS
72 876 Heptanal O / tr tr 0,1 RI, MS, CoI
73 878 2-Butylfurang O / / / / RI, MS
74 880 Ethyl pentanoate E / tr / tr RI, MS, CoI
75 882 2-Heptanolh AL tr 0,8 / tr RI, MS
76 886 Pentanoic acidi FA / / / / RI, MS, CoI
77 892 1,1-Diethoxybutane O / / / tr RI, MS, CoI
78 895 Pentyl acetate E / tr / / RI, MS, CoI
79 902 3-Methyl-2-heptanonem O / / / tr RI, MS
80 904 Prenyl acetatei E / / / / RI, MS, CoI
81 904 Ethyl senecioateg E / / / / RI, MS
82 905 Methyl 2-hydroxy-2-methylbutanoate E / / tr / RI, MS
36
83 907 Methyl hexanoate E / / / tr RI, MS, CoI
84 911 Ethyl 3-hydroxybutanoate E / / / / RI, MS
85 912 (E)-3-Hepten-2-onei O / / / / RI, MS
86 917 Ethyl angelatei E / / / / RI, MS, CoI
87 920 Ethyl tiglatei E / / / / RI, MS, CoI
88 921 α-Thujene T / / 0,1 tr RI, MS
89 928 Benzaldehyde SM tr tr / 20,5 RI, MS, CoI
90 938 2-Methylpropyl butanoatei E / / / / RI, MS, CoI
91 942 1,1-Diethoxy-3-methylbutane O tr tr / tr RI, MS, CoI
92 944 1,1-Diethoxy-2-methylbutaneh O tr / / / RI, MS
93 944 3,3-Diethoxy-2-butanone O / tr / / RI, MS
94 944 (Z)-4-Hepten-1-oll AL / / / / RI, MS
95 945 Ethyl 2-hydroxy-3-methylbutanoate E / / 0,2 tr RI, MS
96 946 2-Methylpropyl lactate E / tr / / RI, MS, CoI
97 950 3-Methylbutyl propanoatel E / / / / RI, MS, CoI
98 951 1-Heptanolh AL tr tr / tr RI, MS, CoI
99 960 1-(1-Ethoxyethoxy)-3-methylbutaneh O 0,2 / / tr RI, MS, CoI
100 960 2,2,6-Trimethyl-6-
vinyltetrahydropyran
T / / 0,1 0,2 RI, MS
101 960 6-Methyl-5-hepten-2-one O / tr / / RI, MS
102 961 1-Octene-3-ol AL tr / / / RI, MS
103 963 Sabinene T / / 0,1 tr RI, MS
104 965 Hexanoic acidh FA tr 0,4 0,1 0,2 RI, MS, CoI
105 966 Methoxymethylbenzene SM / / / / RI, MS, CoI
106 967 Methyl 2-hydroxy-4-
methylpentanoateg
E / / / / RI, MS
107 967 β-Myrcenei T / / / / RI, MS
108 967 β-Pinene T / / 0,1 0,1 RI, MS
109 974 6-Methyl-5-heptene-2-ol O / 1,0 / / RI, MS
110 974 Methyl 2-hydroxy-3-
methylpentanoatei
E / / / / RI, MS
111 978 (E)-Herboxidem T / / / tr RI, MS
112 980 Octanali O / / / / RI, MS, CoI
113 980 Ethyl hexanoate E 0,1 0,7 0,4 0,5 RI, MS, CoI
114 984 Ethyl (E)-3-hexenoate E / / 0,3 / RI, MS
115 985 2-Octanol AL / / / / RI, MS
116 986 1,1-Diethoxypentane O / tr / tr RI, MS, CoI
117 986 (E)-3-Hexenyl acetate E / / 0,4 / RI, MS
118 992 (E)-3-Hexenoic acidg FA / / / / RI, MS
119 992 (Z)-Herboxide T / / tr 0,1 RI, MS
120 994 Hexyl acetateh E tr 0,5 0,1 tr RI, MS
121 997 3-Methylbutyl 2-methylpropanoateh E tr tr / / RI, MS, CoI
122 998 2-Butyl-4-methyl-1,3-dioxolane O / / tr 0,1 RI, MS
123 1003 1,4-Cineolem T / / / 0,1 RI, MS
124 1003 3-δ-Caren T / / 0,2 0,1 RI, MS
125 1005 Benzyl alcohol SM / tr / 1,3 RI, MS, CoI
126 1006 γ-Hexalactonei O / / / / RI, MS
127 1008 Benzeneacetaldehyde SM tr 0,4 0,1 tr RI, MS, CoI
128 1010 p-Cymenel T / / / / RI, MS, CoI
129 1013 2,6,6-Trimethylcyclohexanonem O / / / tr RI, MS
130 1013 2-Ethylhexanolh AL tr tr / tr RI, MS, CoI
131 1018 3-Methyl-2-cyclohexenonei O / / / / RI, MS
132 1018 1,8-Cineolem T / / / tr RI, MS, CoI
133 1019 Limonene T / / 0,1 0,1 RI, MS, CoI
134 1021 Ethyl (E)-2-hexenoatei E / / / / RI, MS
135 1022 Ethyl furan-2-carboxylate O / / / tr RI, MS
136 1022 Ethyl 4-hydroxybutanoateh, j E tr / / / RI, MS
37
137 1025 Butyl 2-methylbutanoatel E / / / / RI, MS, CoI
138 1026 2-Heptyl acetatei E / / / / RI, MS
139 1027 Methyl 3-hydroxyhexanoatei E / / / / RI, MS
140 1030 4-Methoxy-2,5-dimethyl-3(2H)-
furanonei
O / / / / RI, MS
141 1031 (E)-2-Octen-1-al O / / / tr RI, MS
142 1033 Acetophenoneh SM tr / / / RI, MS, CoI
143 1034 1-Phenylethanol SM / / / / RI, MS, CoI
144 1038 Diethyl malonateh E tr tr tr / RI, MS, CoI
145 1038 Ethyl 2-hydroxy-4-methylpentanoate E / / / 0,1 RI, MS
146 1047 cis-Sabinene hydratei T / / / / RI, MS
147 1047 γ-Terpinene T / / tr tr RI, MS
148 1047 3-Methylbutyl lactate E / tr / / RI, MS, CoI
149 1050 (E)-2-Octen-1-oll AL / / / / RI, MS
150 1053 1-Octanol AL 0,2 0,4 tr 0,2 RI, MS, CoI
151 1055 cis-Linalooloxide (furanoid) T tr 0,9 0,2 0,4 RI, MS, CoI
152 1055 p-Cresolg SM / / / / RI, MS
153 1060 o-Guaiacol SM / / / tr RI, MS
154 1061 1,1,3-Triethoxypropaneh O tr tr / tr RI, MS
155 1067 Methyl benzoate SM / / / tr RI, MS, CoI
156 1070 trans-Linalooloxide (furanoid) T / 0,4 0,1 0,4 RI, MS, CoI
157 1070 2-Nonanonei O / / / / RI, MS
158 1071 p-Cymenenek T / tr / / RI, MS
159 1073 Heptanoic acidi FA / / / / RI, MS, CoI
160 1076 (E)-6-Methyl-3,5-heptadien-2-onel O / / / / RI, MS
161 1077 α-Terpinolenek T / tr / / RI, MS
162 1079 Ethyl heptanoate E / tr / / RI, MS, CoI
163 1081 Nonanal O tr tr / tr RI, MS, CoI
164 1083 1,1-Diethoxyhexanei O / / / / RI, MS, CoI
165 1083 Linalool T / tr tr 1,2 RI, MS, CoI
166 1084 2-Phenylethanol SM 12,4 10,6 6,1 6 RI, MS
167 1090 3-Methylbutyl 2-methylbutanoate E / / / / RI, MS, CoI
168 1090 2-Nonanoli AL / / / / RI, MS
169 1095 Heptyl acetatei E / / / / RI, MS, CoI
170 1096 cis-Rose oxideg T / / / / RI, MS
171 1096 1-(1-Ethoxyethoxy)hexanel O / / / / RI, MS, CoI
172 1098 endo-Fencholi T / / / / RI, MS
173 1095 Myrcenolm T / / / tr RI, MS
174 1104 Ethyl 3-hydroxyhexanoatei E / / / / RI, MS
175 1105 Butyl 3-hydroxybutanoatel E / / / / RI, MS
176 1106 Methyl octanoate E / tr tr tr RI, MS, CoI
177 1111 2,6-Dimethyl-5-hepten-1-oll O / / / / MS
178 1112 trans-Rose oxideg T / / / / RI, MS
179 1113 2-Ethylhexanoic acidg FA / / / / RI, MS, CoI
180 1114 2-Methylacetophenonef SM / / 0,1 / RI, MS
181 1115 Lilac aldehyde Ag T / / / / RI, MS
182 1118 1-Terpinenol T / / / 0,1 RI, MS
183 1121 trans-Pinocarveoli T / / / / RI, MS
184 1124 Lilac aldehyde Bg T / / / / RI, MS
185 1124 cis-β-Terpineolm T / / / 0,4 RI, MS
186 1126 1-(1,4-Dimethylcyclohex-3-
enyl)ethanonek
O / tr / / RI, MS
187 1130 Ocimenol T / / tr tr RI, MS
188 1132 Benzyl acetate SM / tr / 0,2 RI, MS, CoI
189 1134 (E)-2-Nonen-1-al O / tr / tr RI, MS
190 1136 Pinocarvonei T / / / / RI, MS
38
191 1136 4-Methylacetophenonef SM / / 0,1 / RI, MS
192 1136 Nerol oxide T / / / tr RI, MS
193 1136 (Z)-3-Nonen-1-oli AL / / / / RI, MS
194 1143 Ethyl benzoate SM / tr 0,3 1,1 RI, MS, CoI
195 1146 Borneol T / tr / / RI, MS, CoI
196 1147 4-Ethylphenol SM / / / / RI, MS
197 1149 Diethyl succinate E tr tr tr 0,2 RI, MS, CoI
198 1149 cis-Linalool oxide (pyanoid)g T / / / / RI, MS
199 1153 trans-Linalool oxideg (pyranoid) T / / / / RI, MS
200 1154 1-Nonanol AL 0,1 0,4 0,1 0,4 RI, MS, CoI
201 1156 trans-1,8-Menthadien-4-olk T / 0,3 / / RI, MS
202 1158 p-Cymen-8-olk T / 1,0 / / RI, MS
203 1159 4-Terpineolh T tr / 0,2 0,5 RI, MS
204 1160 Octanoic acid FA tr / 0,4 0,8 RI, MS, CoI
205 1165 2-Methoxy-4-methylphenolg SM / / / / RI, MS
206 1166 Myrtenali T / / / / RI, MS
207 1167 Methyl salicylate SM / / / tr RI, MS, CoI
208 1169 α-Terpineol T 0,2 1,5 1 8,4 RI, MS, CoI
209 1171 β-Fenchyl alcoholi T / / / / RI, MS
210 1172 Safranalg O / / / / RI, MS
211 1173 Methyl chavicoll SM / / / / RI, MS
212 1177 γ-Terpineolm T / / / 0,2 RI, MS
213 1179 Myrtenol T / tr / / RI, MS
214 1179 Ethyl octanoate E 0,9 0,7 0,7 1 RI, MS, CoI
215 1183 Decanalj O tr / / / RI, MS, CoI
216 1183 α-Campholenol T / tr / tr RI, MS
217 1186 Hexyl lactateg E / / / / MS
218 1193 Octyl acetate E / tr / / RI, MS, CoI
219 1194 2,3-Dihydrobenzofurang SM / / / / RI, MS
220 1194 1-(4-Methylphenyl)ethanoll SM / / / / MS
221 1196 trans-Carveol T / tr / / RI, MS
222 1199 3-Phenyl-1-propanol SM / / / / RI, MS
223 1201 3,7-Dimethyloct-1-ene-3,7-diol T / / / tr RI, MS
224 1207 Diethoxyphenylmethane O / / / tr RI, MS, CoI
225 1209 β-Citronellolh T 0,1 tr / 0,1 RI, MS
226 1212 Ethyl 2-phenylacetate SM tr 0,5 0,1 1 RI, MS
227 1220 Hexyl 2-methylbutanoatel E / / / / RI, MS, CoI
228 1221 2-Nonanyl acetatei E / / / / RI, MS
229 1224 2-Phenylethyl acetate SM 0,5 2,3 / / RI, MS
230 1226 Carvenone T / tr 3,4 / RI, MS
231 1229 Chavicol SM / / / / RI, MS
232 1231 Methyl 3-hydroxyoctanoatei E / / / / RI, MS
233 1234 Geraniolh T tr 0,3 tr 0,2 RI, MS, CoI
234 1235 (E)-2-Decenal O / / / tr RI, MS
235 1238 cis-Myrtanoli T / / / / RI, MS
236 1238 (Z)-4-Decen-1-oll AL / / / / RI, MS
237 1243 Ethyl salicylate SM / tr / 0,1 RI, MS, CoI
238 1246 Phellandrali T / / / / RI, MS
239 1251 4-Ethylguaiacol SM / / / / RI, MS
240 1255 1-Decanol AL 0,6 tr tr 0,1 RI, MS, CoI
241 1256 Nonanoic acid FA / / / tr RI, MS, CoI
242 1262 p-Cymen-7-oli T / / / / RI, MS
243 1264 trans-Linalool oxide acetate
(pyranoid)g
T / / / / RI, MS
244 1266 Vitispiraneh O tr tr 0,1 tr RI, MS
39
245 1266 (Z,Z)-2,4-Decadienal O / / / tr RI, MS
246 1268 Benzyl 2-methylpropanoateg SM / / / / RI, MS, CoI
247 1270 Methyl (Z)-cinnamatei SM / / / / RI, MS
248 1271 2-Hydroxy-2-phenylacetonitrilem SM / / / tr RI, MS
249 1271 Methyl myrtenatei T / / / / RI, MS
250 1272 2-Undecanoneh O tr / / / RI, MS
251 1272 cis-p-Mentha-1,8-diolm T / / / 0,1 MS
252 1274 Perilla alcohol T / tr / / RI, MS
253 1275 4-Undecanoli AL / / / / RI, MS
254 1277 trans-Pinocarvyl acetatei T / / / / RI, MS
255 1278 Ethyl nonanoateh E tr tr / tr RI, MS, CoI
256 1280 Dihydroedulan Ig O / / / / RI, MS
257 1286 2-Undecanolh AL tr / / / RI, MS
258 1287 (E,E)-2,4-Decadienal O / / / 0,1 RI, MS, CoI
259 1291 4-Ethyl-1,2-dimethoxybenzenei SM / / / / RI, MS
260 1292 Nonanyl acetatek E / tr / / RI, MS, CoI
261 1300 1,1-Diethoxy-2-phenylethane O / tr / tr RI, MS
262 1302 (E)-2-Undecen-4-onei O / / / / MS
263 1303 Myrtenyl acetatei T / / / / RI, MS
264 1303 Hexyl 3-hydroxybutanoatel E / / / / RI, MS
265 1303 Methyl anthranilatei SM / / / / RI, MS, CoI
266 1305 Ethyl 3-hydroxyoctanoatei E / / / / RI, MS
267 1306 Methyl decanoate E tr tr / tr RI, MS, CoI
268 1309 Hexyl tiglate E / / / / RI, MS, CoI
269 1310 Dihydroedulan IIg O / / / / RI, MS
270 1315 γ-Nonalactone O / / / tr RI, MS
271 1317 Ethyl 3-phenylpropionate SM / tr / / RI, MS
272 1326 Eugenol SM / / / 0,7 RI, MS, CoI
273 1334 Ethyl myrtenatei T / / / / MS
274 1335 Geranic acidg T / / / / RI, MS
275 1338 3-Phenylpropyl acetate SM / tr / / RI, MS
276 1339 Dihydroeugenolg SM / / / / RI, MS
277 1341 Ethyl (Z)-cinnamatei SM / / / / RI, MS
278 1345 Butyl benzoatel SM / / / / RI, MS, CoI
279 1347 Methyl (E)-cinnamatei SM / / / / RI, MS
280 1349 Vanillinm SM / / / tr RI, MS, CoI
281 1356 Decanoic acid FA 0,8 0,2 0,1 2,4 RI, MS, CoI
282 1359 (E)-β-Damascenone O / tr / tr RI, MS
283 1359 2-Methylpropyl 2-phenylacetatel SM / / / / RI, MS, CoI
284 1366 Ethyl 9-decenoateh E tr / / tr RI, MS
285 1366 Ethyl (E)-4-decenoatel E / / / / RI, MS
286 1369 Methyl eugenoli SM / / / / RI, MS
287 1373 1,1-Diethoxynonaneh O tr tr / tr RI, MS
288 1377 Ethyl anthranilatei SM / / / / RI, MS
289 1378 Ethyl decanoate E 2,0 0,5 0,2 0,5 RI, MS, CoI
290 1391 Decyl acetateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
291 1405 Ethyl 2-hydroxy-3-phenylpropanoateg SM / / / / RI, MS
292 1411 trans-Caryophyllene T / / tr tr RI, MS, CoI
293 1417 Hydroxydihydroedulang O / / / / RI, MS
294 1420 γ-Decalactone O / / / tr RI, MS
295 1428 2-Methylbutyl octanoatel E / / / / RI, MS, CoI
296 1429 Ethyl (E)-cinnamateh SM tr tr / 0,2 RI, MS
297 1434 6,10-Dimethyl-5,9-undecadien-2-oll O / / / / RI, MS
298 1436 Methyl 3-hydroxydecanoatei E / / / / RI, MS
40
299 1446 δ-Decalactoneg O / / / / RI, MS
300 1457 1-Dodecanol AL 0,6 / / tr RI, MS, CoI
301 1457 3-Methylbutyl 2-phenylacetatel SM / / / / RI, MS, CoI
302 1459 (E)-β-Iononem O / / / tr RI, MS, CoI
303 1461 2-Methylbutyl 2-phenylacetatel SM / / / / RI, MS, CoI
304 1461 2-Phenylethyl 3-methylbutanoateg SM / / / / RI, MS, CoI
305 1468 10,11-epoxy-Calamenenek T / tr / / RI, MS
306 1474 2-Tridecanonei O / / / / RI, MS
307 1477 3,4-Dimethyl-5-pentyl-5H-furan-2-
oneg
O / / / / RI, MS, CoI
308 1487 2-Tridecanolh AL tr / / / RI, MS
309 1494 (E,E)-α-Farnesenel T / / / / RI, MS
310 1506 Methyl dodecanoate E tr tr / / RI, MS, CoI
311 1509 Ethyl 3-hydroxydecanoatei E / / / / RI, MS
312 1510 δ-Cadinenej T tr / / / RI, MS
313 1523 α-Calacoreneh, j T tr / / / RI, MS
314 1528 2-Methylpropyl decanoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
315 1545 (E)-Nerolidol T 0,1 / / / RI, MS
316 1548 Caryophyllene oxideg T / / / / RI, MS, CoI
317 1551 Dodecanoic acid FA 0,8 tr / 0,5 RI, MS, CoI
318 1574 3-Hydroxy-β-damasconeg O / / / / RI, MS
319 1577 Ethyl dodecanoate E 2,7 0,9 0,1 0,2 RI, MS, CoI
320 1608 γ-Dodecalactoneg O / / / / RI, MS
321 1609 1-epi-Cubenolk T / tr / / RI, MS
322 1611 1-Methylethyl dodecanoateh E tr tr / / RI, MS, CoI
323 1620 epi-α-Murrololk T / tr / / RI, MS
324 1630 Intermedeol T / / / / RI, MS
325 1633 δ-Dodecalactoneg O / / / / RI, MS
326 1643 Apiole SM / / 0,1 tr RI, MS
327 1659 1-Tetradecanol AL tr / / tr RI, MS, CoI
328 1669 (Z)-6,7-Dihydrofarnesolh, j T tr / / / RI, MS
329 1677 2-Pentadecanone O tr tr / / RI, MS
330 1683 2-Octyl benzoate SM tr / / / MS
331 1698 (2Z,6E)-Farnesol T 0,3 / / tr RI, MS
332 1705 Methyl tetradecanoate E tr tr / / RI, MS, CoI
333 1727 2-Methylpropyl dodecanoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
334 1745 Ethyl (Z)-9-tetradecenoateh, j E 0,2 / / / RI, MS
335 1751 (Z)-9-Tetradecenoic acidh, j FA 0,2 / / / RI, MS, CoI
336 1760 (E)-9-Tetradecenoic acidh, j FA tr / / / RI, MS
337 1775 Ethyl tetradecanoate E 0,9 0,4 / tr RI, MS, CoI
338 1826 3-Methylbutyl dodecanoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
339 1861 1-Hexadecanolh, j AL 0,1 / / / RI, MS, CoI
340 1875 Ethyl pentadecanoateh, j E tr / / / RI, MS
341 1882 Methyl (Z)-9-hexadecenoateh, j E tr / / / RI, MS
342 1906 Methyl hexadecanoate E 0,1 tr / tr RI, MS, CoI
343 1946 Ethyl (E)-11-hexadecenoateh, j E tr / / / RI, MS
344 1951 Ethyl (Z)-9-hexadecenoateh E 1,2 0,2 / tr RI, MS
345 1960 Ethyl (E)-9-hexadecenoateh E tr / / 0,2 RI, MS
346 1976 Ethyl hexadecanoate E 3,3 1,1 0,1 / RI, MS, CoI
347 2008 1-Methylethyl hexadecanoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
348 2022 Kaureneh, j T 0,1 / / / RI, MS
349 2068 Methyl (Z,Z)-9,12-octadecadienoate E tr tr / / RI, MS, CoI
350 2072 Methyl (Z,Z,Z)-9,12,15-
octadecatrienoateh, j
E tr / / / RI, MS, CoI
351 2076 Ethyl heptadecanoateh, j E tr / / / RI, MS
352 2077 Methyl (Z)-9-octadecenoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
41
353 2096 (E)-Phytolh, j T tr / / / RI, MS
354 2135 Ethyl (Z,Z)-9,12-octadecadienoate E 3,2 0,7 / 0,1 RI, MS, CoI
355 2141 Ethyl (Z,Z,Z)-9,12,15-
octadecatrienoateh
E 2,4 0,5 / 0,1 RI, MS, CoI
356 2146 Ethyl (Z)-9-octadecenoate E 1,2 0,7 tr 0,1 RI, MS, CoI
357 2151 Ethyl (E)-9-octadecenoateh, j E tr / / / RI, MS
358 2175 Ethyl octadecanoate E tr tr / / RI, MS, CoI
359 2226 3-Methylbutyl hexadecanoateh, j E tr / / / RI, MS, CoI
360 2300 Tricosaneh O tr / / / RI, MS, CoI
361 2400 Tetracosaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
362 2500 Pentacosaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
363 2600 Hexacosaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
364 2700 Heptacosaneh O tr tr / tr RI, MS, CoI
365 2800 Octacosaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
366 2806 (all E)-Squaleneh T tr tr / tr RI, MS, CoI
367 2900 Nonacosaneh O tr tr / tr RI, MS, CoI
368 3000 Triacontaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
369 3100 Hentriacontaneh O tr / / / RI, MS, CoI
370 3200 Dotricontane O / / / / RI, MS, CoI
371 3300 Tritriacontaneh O tr / / tr RI, MS, CoI
Ukupno [%]
Broj identifikovanih komponenti
96,0
126
98,0
115
99,7
81
99,2
151
Alkoholi (AL)
60,7
(20)
60,2
(16)
75,3
(11)
39,7
(17)
Jedinjenja šikimatnog puta (SM)
12,9
(8)
13,8
(12)
6,9
(7)
31,1
(16)
Fenil-propanoidi
tr
(1)
tr
(3)
0,1
(1)
0,9
(3)
C6C1
tr
(2)
tr
(5)
0,3
(1)
23,2
(9)
C6C2
12,9
(5)
13,8
(4)
6,5
(5)
7,0
(4)
Estri (E)
19,2
(45)
13
(36)
6,6
(22)
6,8
(30)
Etil estri
18,3
(25)
7,6
(18)
4,2
(14)
3,9
(21)
Acetati
0,8
(5)
5,4
(7)
2,3
(5)
2,9
(5)
Masne kiseline (FA)
2,1
(10)
4
(7)
1,5
(6)
6,2
(9)
Terpeni (T)
0.8
(13)
4,4
(20)
5,6
(17)
12,7
(31)
Ostalo (O)
0,3
(30)
2,6
(24)
3,8
(18)
2,7
(48)
1 Jedinjenja su navedena po redosledu eluiranja sa DB1 kolone (RI – eksperimentalno određeni retencioni
indeksi na pomenutoj koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C6-C36); 2 MI- metoda identifikacije
jedinjenja: RI – poređenjem retencionih indeksa sa literaturnim vrednostima, MS – poređenjem njihovih masenih
spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3 i interne MS biblioteke, Col – koinjekcijom
odgovarajućeg standarda; 3 tr – trag; 4syn. – sinonim; 5 u zagradi je dat broj komponenti koje pripadaju određenoj
klasi.
U rakiji dobijenoj od drenjina identifikovano je 126 različitih jedinjenja. Najzastupljeniji
su bili alkoholi, jedinjenja šikimatnog puta, estri i masne kiseline. Najzastupljenija su
jedinjenja: 3-metil-1-butanol sa 38,5%, 2-metil-1-butanol sa 19%, 2-fenil etanol sa 12,4%,
etil-dekanoat sa 2% i 1-heksanol sa 1,3%.
42
U rakiji dobijenoj od plodova divlje kupine identifikovano je 115 različitih jedinjenja od
čega su najzastupljeniji bili različiti alkoholi, jedinjenja šikimatnog puta, estri, masne kiseline
i terpeni. Dominantna jedinjenja su: 3-metil-1-butanol sa 41%, 2-metil-1-butanol sa 13,9%, 2-
fenil etanol sa 10,6%, 1-heksanol sa 3,5%, 3-metil-butil acetat sa 3,3%, 3-metilbutanska
kiselina sa 2,5%, 2-feniletil acetat sa 2,3% i α-terpineol sa 1,5%.
U rakiji dobijenoj od plodova borovnice identifikovano je 81 različito jedinjenje od čega
su najzastupljeniji bili različiti alkoholi, jedinjenja šikimatnog puta, estri i terpeni.
Dominantna jedinjenja su: 3-metil-1-butanol sa 40,2%, 2-metil-1-butanol sa 16,8%, 3-heksen-
1-ol sa 10,3%, 2-fenil etanol sa 6,1%, 2-metil-1-propanol sa 5,3%, karvenon sa 3,4%, etil
laktat sa 2,1%, 1-heksanol sa 1,2% i 3-metilbutil acetat sa 1,2%.
U rakiji dobijenoj od plodova trnjine izolovano je 151 različito jedinjenje od kojih su
najzastupljeniji bili alkoholi, jedinjenja šikimatnog puta, estri, masne kiseline i terpeni.
Dominantna jedinjenja su: 3-metil-1-butanol sa 24,1% , benzen aldehid sa 20,5%, 2-metil-1-
butanol sa 11,8%, α-terpineol sa 8,4%, 2-fenil etanol sa 6%, dekanska kiselina sa 2,4%, 3-
metilbutanska kiselina sa 2,2%, 3-metilbutil acetat sa 1,8% i 3-heksen-1-ol sa 1,6%.
5.2. Antimikrobna aktivnost
U našoj zemlji se rakija tradicionalno koristi za ispiranje i dezinfekciju rana i kao
preventiva za gastrointestinalne i urinarne infekcije. Zbog toga su u ovom radu ispitivane
antimikrobne aktivnosti dobijenih rakija na patogene bakterije koje su izolovane iz urina,
fecesa i iz rana pacijenata.
Ispitivanja su vršena na multirezistentnim sojevima bakterija. Izolati iz rana su
rezistentni na 10-tak od 15 testiranih antibiotika (sojevi koji su u Novom Sadu testirani za
potrebe lečenja pacijenata).
Uzorci rakija od drenjine, kupine, borovnice i trnjine testirani su u koncentracijama od
0.2-1000 µL/mL. Kao negativna kontrola korišćen je 70% etanol.
Tabela 5.3. Antimikrobna aktivnost rakija od divljeg voća i etanola (MIC/MBC
izražena u µL/mL)
Test mikroorganizmi S1 S2 S3 S4 Etanol
(70 % v/v)
Izolati iz urina
Proteus mirabilis >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 500/>1000
Klebsiella pneumoniae 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000
Morganella sp 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000
Enterobacter faecalis 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 500/>1000
Izolati iz fecesa
Escherichia coli 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 500/>1000
Listeria monocytogenes 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000
Shigella sonnei 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 500/>1000
Salmonella enteritidis 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000
Staphylococcus aureus 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000 250/>1000
Candida albicans 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000 500/>1000
Izolati iz rana
Acinetobacter sp 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 Klebsiella oxytoca 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 Enterobacter sp 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 Staphylococcus aureus 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 1000/>1000 Pseudomonas aeruginosa >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 1000/>1000 Proteus mirabilis >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 1000/>1000 Escherishia coli >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 >1000/>1000 1000/>1000
43
Sve rakije delovale su u opsegu koncentracija od 25 % - 50 %.Sve rakije pokazale su
potpuno istu aktivnost, koja je u većini slučajeva ista kao aktivnost etanola. Etanol je pokazao
bolju aktivnost na izolate iz urogenitalnog trakta, sojevi P. mirabilis i E. faecalis, kao i na
izolate iz gastrointestinalnog trakta, sojevi E. coli i Sh. sonnei. Najbolju inhibitornu aktivnost
rakije su pokazale na izolate iz gastrointestinalnog trakta. Najosetljiviji sojevi su L.
monocytogenes, S. enteritidis i S. aureus. Generalno gledano baktericidna aktivnost rakija je u
većini slučajeva izostala.
5.3. Antimikrobna aktivnost suvih ostataka rakija
Suvi ostaci rakija (kojima je uklonjen alkohol i šećeri) rastvoreni su u 10%-nom
DMSO (dimetilsulfoksid) i testirani su u koncentracijama od 0.2-50 µL/mL.
Tabela 5.4. Antimikrobna aktivnost suvih ostataka rakija na izolate iz urogenitalnog i
gastrointestinalnog trakta i na izolate iz rana (MIC/MBC izražena u µL/mL)
Suvi ostaci delovali su u koncentracijama od 3,13-50 µL/mL.
Suvi ostaci rakije od plodova drenjine najbolje su delovali na izolate iz
gastrointestinalnog trakta. Najosetljiviji soj je S. aureus. Sličnu aktivnost suvi ostaci su imali i
na izolate iz urogenitalnog trakta. Suvi ostaci rakije od drenjina najslabije su delovali na
izolate iz rana. Najbolja inhibitorna aktivnost suvih ostataka pokazana je prema soju S.
aurens, ali je baktericidna aktivnost bila je jako slaba.
Suvi ostaci rakije od plodova kupine supokazali su jako lošu antimikrobnu aktivnost
na sve izolate (iz rana, urina i fecesa).
Suvi ostaci rakije od plodova borovnice najbolju aktivnost pokazali su na izolate iz
gastrointestinalnog trakta. Najosetljiviji sojevi bili su L. monocytogenes i S. aureus. Nešto
lošiju aktivnost pokazuju na izolate iz urogenitalnog trakta gde je najosetljiviji soj Morganella
sp. Najslabiju aktivnost suvi ostaci rakije od borovnice pokazuju prema izolatima iz rana.
Suvi ostaci rakije od plodova trnjine najbolju antimikrobnu aktivnost pokazuju na
izolate iz urogenitalnog trakta. Najosetljiviji soj je Morganella sp. Na izolate iz
Test mikroorganizmi S1 S2 S3 S4
Izolati iz urina
Proteus mirabilis 25,0/>50,0 50,0/>50,0 25,0/>50,0 25,0/>50,0 Klebsiella pneumoniae 6,25/50,0 25,0/>50,0 6,25/50,0 12,5/>50,0 Morganella sp 12,5/25,0 25,0/25,0 6,25/25,0 12,5/12,5 Enterobacter faecalis 12,5/50,0 25,0/>50,0 12,5/50,0 25,0/50,0
Izolati iz fecesa
Escherichia coli 25,0/50,0 50,0/>50,0 25,0/25,0 25,0/50,0 Listeria monocytogenes 6,25/25,0 25,0/50,0 6,25/12,5 25,0/25,0 Shigella sonnei 25,0/>50,0 25,0/>50,0 25,0/50,0 25,0/>50,0 Salmonella enteritidis 12,5/25,0 25,0/25,0 6,25/25,0 25,0/50,0 Staphylococcus aureus 6,25/12,5 12,5/50,0 6,25/12,5 12,5/25,0 Candida albicans 12,5/25,0 12,5/50,0 12,5/25,0 25,0/50,0 Izolati iz rana
Acinetobacter sp 6,25/>50,0 25,0/>50,0 6,25/50,0 25,0/>50,0 Klebsiella oxytoca 25,0/50,0 50,0/>50,0 12,5/50,0 25,0/>50,0 Enterobacter sp 25,0/>50,0 25,0/>50,0 25,0/50,0 25,0/>50,0 Staphylococcus aureus 3,13/>50,0 12,5/>50,0 6,25/50,0 25,0/>50,0 Pseudomonas aeruginosa 50,0/>50,0 >50,0/>50,0 50,0/50,0 25,0/>50,0 Proteus mirabilis 50,0/>50,0 >50,0/>50,0 50,0/>50,0 >50,0/>50,0 Escherishia coli 25,0/>50,0 25,0/>50,0 25,0/25,0 25,0/>50,0
44
gastrointestinalnog trakta, kao i na izolate iz rana, suvi ostaci rakije od trnjina pokazuju lošu
aktivnost, naročito baktericidnu.
Najbolju antimikrobnu aktivnost pokazali su suvi ostaci rakije od plodova borovnice.
Suvi ostaci rakije od plodova drenjine pokazali su nešto slabiju aktivnost od suvih ostataka
rakije od borovnice. Znatno slabiju aktivnost pokazuju suvi ostaci rakije od trnjina. Najslabiju
i jako lošu antimikrobnu aktivnost imaju suvi ostaci rakije od kupina. Baktericidna aktivnost
je generalno loša.
Suvi ostaci rakije od borovnice i drenjine pokazuju najbolju aktivnost na izolate iz
gastrointestinalnog trakta. Suvi ostaci rakije od trnjine najbolju aktivnost pokazuju na izolate
iz urogenitalnog traka. Suvi ostaci svih rakija najslabije delovanje pokazuju na izolate iz rana.
5.4. Antimikrobna aktivnost dominantnih jedinjenja rakija
Antimikrobna aktivnost dominantnih jedinjenja testirana je na izolate iz
gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta i na izolate iz rana.
Tabela 5.5. Antimikrobna aktivnost dominantnih jedinjenja rakija i antibiotika
(pozitivna kontrola)
Jedinjenje 3-metil-1-butanol bilo je najzastupljenije jedinjenje u sve četiri rakije.
Najbolju antimikrobnu aktivnost pokazuje na izolate iz gastrointestinalnog trakta, gde je
najosetljiviji soj S. aureus. Nešto lošiju aktivnost pokazuje na izolate iz urogenitalnog trakta,
dok na izolate iz rana 3-metil-1-butanol ima lošu aktivnost.
Jedinjenje 2-metil-1-butanol najbolju antimikrobnu aktivnost pokazuje na izolate iz
gastrointestinalnog trakta. Najosetljiviji je soj S. aureus. Soj L. monocytogenes je pokazao
veću osetljivost na 2-metil-1-butanol nego na kontrolni antibiotik (MIC/MBC=6,25/12,5 za 2-
metil-1-butanol, MIC/MBC=8,0/16,0 za antibiotik). Antimikrobna aktivnost je lošija na
izolate iz urina, gde su najosetljiviji sojevi Morganella sp. i E.faecalis. Antimikrobna
aktivnost 2-metil-1-butanola na izolate iz rana je jako loša.
Test mikroorganizmi 3-metil-1-
butanol
2-metil-1-
butanol
1-
heksanol
Benzil
alkohol
3-
heksen-
1-ol
2-fenil
etanol Antibiotik
Izolati iz urina
Proteus mirabilis 25,0/>50,0 25,0/50,0 25,0/25,0 25,0/>50,0 25,0/25,0 12,5/25,0 16,0/16,0
Klebsiella pneumoniae 6,25/50,0 6,25/25,0 12,5/12,5 6,25/25,0 12,5/12,5 6,25/12,5 8,0/8,0
Morganella sp 12,5/12,5 25,0/25,0 25,0/25,0 12,5/25,0 12,5/12,5 12,5/12,5 8,0/8,0
Enterobacter faecalis 25,0/25,0 6,25/25,0 25,0/25,0 6,25/12,5 25,0/25,0 6,25/12,5 4,0/8,0
Izolati iz fecesa
Escherichia coli 25,0/25,0 25,0/25,0 25,0/>50,0 12,5/12,5 25,0/>50,0 12,5/50,0 16,0/16,0
Listeria monocytog. 12,5/12,5 6,25/12,5 12,5/25,0 6,25/12,5 12,5/25,0 6,25/12,5 8,0/16,0
Shigella sonnei 12,5/>50,0 12,5/>50,0 12,5/50,0 12,5/12,5 25,0/50,0 50,0/>50,0 16,0/16,0
Salmonella enteritidis 6,25/12,5 6,25/12,5 12,5/25,0 6,25/12,5 12,5/25,0 6,25/6,25 4,0/8,0
Staphylococcus aureus 6,25/6,25 6,25/6,25 6,25/12,5 6,25/6,25 6,25/25,0 12,5/12,5 4,0/8,0
Candida albicans 6,25/>50,0 12,5/>50,0 3,13/>50,0 6,25/12,5 6,25/>50,0 25,0/>50,0 16,0/16,0
Izolati iz rana
Acinetobacter sp 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 25,0/50,0
Klebsiella oxytoca 25,0/50,0 50,0/50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/50,0 50,0/50,0
Enterobacter sp 50,0/50,0 50,0/50,0 50,0/>50,0 50,0/50,0 50,0/>50,0 50,0/50,0 25,0/50,0
Staphylococcus aureus 25,0/>50,0 12,5,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 12,5/>50,0 25,0/50,0
Pseudomonas aerug. 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 25,0/>50,0 50,0/100,0
Proteus mirabilis 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 100,0/100,0
Escherishia coli 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 50,0/>50,0 100,0/100,0
45
Jedinjenje 1-heksanol najbolju aktivnost pokazuje prema izolatima iz
gastrointestinalnog trakta.Najosetljiviji soj je S. aureus. Prema soju C. albicans 1-heksanol
pokazuje odličnu inhibitornu aktivnost, ali je baktericidna jako loša (MIC/MBC=3,13/>50,0).
Od izolata iz urogenitalnog trakta najosetljiviji soj Kl. pneumoniae. Antimikrobna aktivnost
na izolate iz rana je jako loša.
Jedinjenje benzil alkohol najbolju antimikrobnu aktivnost pokazuje na izolate iz
gastrointestinalnog trakta, gde je najosetljiviji soj S. aureus. Čak 4 soja (E. coli, Sh. sonnei, C.
albicans i L. monocytogenes) pokazuju veću osetljivost na benzil alkohol nego na kontrolni
antibiotik. Od izolata iz urogenitalnog trakta najosetljiviji je soj E. faecalis. Na izolate iz rana
pokazuje lošu aktivnost.
Jedinjenje 3-heksen-1-ol takođe najbolje deluje na izolate iz gastrointestinalnog trakta.
Najosetljiviji soj je S. aureus. Lošije dejstvo ima na izolate iz urogenitalnog trakta. Na izolate
iz rana aktivnost je jako loša.
Jedinjenje 2-fenil etanol najbolju aktivnost pokazuje na izolate iz urogenitalnog trakta.
Najosetljiviji soj iz urogenitalnog trakta je Kl. pneumoniae.Najosetljiviji soj iz
gastrointestinalnog trakta je S. enteritidis. Soj L. monocytogenes pokazuje veću osetljivost na
jedinjenje 2-fenil etanol nego na kontrolni antibiotik. Antimikrobna aktivnost na izolate iz
rana je jako loša.
Sva jedinjenja osim 2-fenil etanola pokazala su najbolju antimikrobnu aktivnost na
izolate iz gastrointestinalnog trakta i u svim slučajevima najosetljiviji soj je bio S. aurens. Soj
L. monocytogenes pokazuje veću osetljivost na 3 jedinjenja (2-metil-1-butanol, benzil alkohol
i 2-fenil etanol) nego na kontrolni antibiotik. Najbolju aktivnost na izolate iz
gastrointestinalnog trakta ima benzil alkohol. Jedinjenje 2-fenil etanol najbolju antimikrobnu
aktivnost pokazuje na izolate iz urogenitalnog trakta. Sva jedinjenja pokazuju jako lošu
aktivnost na izolate iz rana.
5.5. Antioksidativna aktivnost rakija
Rezultati ispitivanja antioksidativne aktivnosti uzoraka uz pomoć tri metoda su
sumiran iprikazani u tabeli 5.5. Rakija od plodova borovnice pokazuje najveću redukcionu
moć. Nešto manju redukcionu moć ima rakija od plodova drenjina. Rakija od plodova trnjine
ima još manju redukcionu moć.
Tabela 5.6. Antioksidativna aktivnost uzoraka rakija, ispitivana uz pomoć metode
određivanja ukupne redukcione moći, DPPH i ABTS metode
Uzorci DPPH metoda (%) ABTS metoda
(Troloks ekvivalent µmol/L)
Ukupna redukciona moć
(Askorbinska kiselina
ekvivalent μg/mL)
S1 0,77±0,05 1,72±0,16 55,25±0,56
S2 1,92±0,06 1,39±0,08 16,57±0,11
S3 4,23±0,05 3,31±0,05 66,30±0,85
S4 2,31±0,03 3,21±0,04 27,62±0,17
BHT 38,46±0,08 - -
BHT - Butylated Hydroxytoluene
Najmanju redukcionu moć ima rakija od plodova kupine. Antioksidativne aktivnosti suvih
ostataka su obrnuto proporcionalne EC50 vrednostima. U skladu sa tim, slobodno radikalski
antioksidativni kapaciteti dobijeni za suve ostatke pokazuju da najveći antioksidativni
kapacitet pokazuje drenjina, nešto manji kapacitet ima kupina, pa trnjina i borovnica.
Primenom ABTS metode najveću antioksidativnu aktivnost pokazala kupina. Neznatno lošiju
aktivnost imala je drenjina, dok je borovnica pokazala najnižu antioksidativnu aktivnost.
46
6. ZAKLjUČAK
U ovom radu ispitivan je hemijski sastav, antimikrobna aktivnost i antioksidativna
aktivnost rakija i suvih ostataka rakija dobijenih fermentacijom plodova drenjine (Cornus
mas), divlje kupine (Rubus fruticosus), borovnice (Vaccinium myrtillus) i trnjine (Prunus
spinosa), kao i dominantnih jedinjenja rakija (3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol, 1-
heksanol, 3-heksen-1-ol, benzil alkohol i 2-fenil etanol).
Hemijsko ispitivanje rakija vršeno je uz pomoć GHi GH-MS. Ustanovljeno je da su u
rakijama dominantna jedinjenja alkoholi, jedinjenja šikimatnog puta, estri, masne kiseline i
terpeni.
U rakiji dobijenoj od drenjina identifikovano je 126 različitih jedinjenja.
Najzastupljenija su bila jedinjenja: 3-metil-1-butanol sa 38,5%, 2-metil-1-butanol sa 19,0%,
2-fenil etanol sa 12,4%. U rakiji dobijenoj od plodova divlje kupine identifikovano je 115
različitih jedinjenja. Dominantna jedinjenja bila su: 3-metil-1-butanol sa 41,0%, 2-metil-1-
butanol sa 13,9% i 2-fenil etanol sa 10,6%. U rakiji dobijenoj od plodova borovnice
identifikovano je 81 različito jedinjenje. Dominantna jedinjenja su: 3-metil-1-butanol sa
40,2%, 2-metil-1-butanol sa 16,8%, 3-heksen-1-ol sa 10,3%. U rakiji dobijenoj od plodova
trnjine izolovano je 151 različito jedinjenje. Dominantna jedinjenja su: 3-metil-1-butanol sa
24,1%, benzen aldehid sa 20,5% i 2-metil-1-butanol sa 11,8%.
Rakije su delovale slabo inhibitorno i nisu imale baktrericidnu aktivnost.
Suvi ostaci delovali su u koncentracijama od 3.13-50 µL/mL. Najbolju antimikrobnu
aktivnost pokazali su suvi ostaci rakije od plodova borovnice dok su suvi ostaci rakije od
kupina pokazali najnižu aktivnost.
Suvi ostaci rakije od borovnice i drenjine pokazuju najbolju aktivnost na izolate iz
gastrointestinalnog trakta. Suvi ostaci rakije od trnjine najbolju aktivnost pokazuju na izolate
iz urogenitalnog trakta. Suvi ostaci svih rakija najslabije delovanje pokazuju na izolate iz
rana.
Sva dominanta jedinjenja osim 2-fenil etanola pokazala su najbolju antimikrobnu
aktivnost na izolate iz gastrointestinalnog trakta i u svim slučajevima najosetljiviji soj je bio
S. aureus. Soj L. monocytogenes pokazala je veću osetljivost na 3 jedinjenja (2-metil-1-
butanol, benzil alkohol i 2-fenil etanol) nego na kontrolni antibiotik. Najbolju aktivnost na
izolate iz gastrointestinalnog trakta ima benzil alkohol. Jedinjenje 2-fenil etanol najbolju
antimikrobnu aktivnost pokazuje na izolate iz urogenitalnog trakta. Sva jedinjenja pokazuju
jako lošu aktivnost na izolate iz rana.
Dobijeni rezultati pokazuju da je kako antimikrobna tako i antioksidativna aktivnost
rakije bazirana na jedinjenjima koja ulaze u njihov sastav, a ne na prisutnom etanolu.
Rezultati za ukupnu redukcionu moć ispitivanih suvih ostataka pokazuju sledeće:
rakija od plodova borovnice pokazuje najveću redukcionu moć, a zatim slede rakija od
plodova drenjina, od plodova trnjine i najslabiju redukcionu moć ima rakija od plodova
kupine.Najveći slobodno radikalski antioksidativni kapacitet pokazuje drenjina.Nešto manji
kapacitet imaju kupina, trnjina i borovnica.Primena ABTS metode pokazuju najveću
antioksidativnu aktivnost rakije kupine, zatim drenjine, trnjine i borovnice.
Buduća istraživanja bi trebalo vršiti na čistim komponentama i na njihovom
sinergističkom delovanju u cilju traženja prirodnih ineškodljivih antimikrobnih i
antioksidativnih materija za prevenciju i lečenje gastrointestinalnih, urogenitalnih infekcija,
kao i infekcija rana.
47
7. SUMMARY
In this paper was examinated the chemical composition, antimicrobial activity and
antioxidant activity of brandy and dry residues obtained by fermentation of fruit brandies
cornelian cherry (Cornus mas), wild blackberry (Rubus fruticosus), European blueberry
(Vaccinium myrtillus) and Blackthorn (Prunus spinosa), and the dominant compound of wild
fruits brandy (3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1-butanol, 1-hexanol, 3-hexen-1-ol, benzyl
alcohol, and 2-phenyl ethanol).
Chemical examination of the resulting brandies was performed using GC and GC/MS
analyses. It was concluded that the dominant compounds in brandies were alcohols, shikimate
metabolites, esters, fatty acids and terpenoids.
In the cornelian cherry brandy were identified 126 different compounds. The most
common are the compounds: 3-methyl-1-butanol with 38.5%, 2-methyl-1-butanol 19%, 2-
phenyl ethanol with 12.4%. In the blackberry brandy were identified 115 different
compounds. The dominant compounds are: 3-methyl-1-butanol with 41% 2-methyl-1-butanol
13.9%, 2-phenyl ethanol with 10.6%. In the European blueberry brendy were identified 81
different compounds. The dominant compounds are: 3-methyl-1-butanol, 40.2%, 2-methyl-1-
butanol with 16.8%, 3-hexen-1-ol is reacted with 10.3%. In the Blackthorns brandy isolated
151 different compounds. The dominant compounds are: 3-methyl-1-butanol with 24.1%,
with an aldehyde of benzene 20.5%, 2-methyl-1-butanol with 11.8%.
Brandies have poor inhibitory activity and they do not have bactericidal activity.
Dry residues were acting in concentrations of 3.13-50 uL / mL.
Dry residues from European blueberry brandy showes the best antimicrobical activity..
The lowest and the very poor antimicrobial activity have dry residues of blackberry brandy.
The bactericidal activity was generally poor.
Antimicrobial activity of dry remains of blueberry brandy and dry remains of
cornelian cherry show the best results against isolated bacterial strains from the
gastrointestinal tract. Dry remains of blackthorn brandy shows the best antimicrobial activity
against isolated bacterial strains from the urogenital tract. Dry remains of all brandies show
the poorest activity against isolated bacterial strains from the wounds.
All of the dominant compounds except the 2-phenyl ethanol show the best
antimicrobial activity against isolated bacterial strains from the gastrointestinal tract. In all
cases the most sensitive strain was S. aurens. A strain of L. monocytogenes show a higher
sensitivity to a compound of 3 (2-methyl-1-butanol, benzyl alcohol, and 2-phenyl ethanol)
than the control antibiotic. From the others, benzyl alcohol shows the best activity against the
isolated bacterial from the gastrointestinal tract. A compound of 2-phenyl ethanol shows the
best antimicrobial activity against isolated bacterial strains from the urogenital tract. All of the
compounds show a very poor activity against isolated bacterial strains from the wounds.
The results show that the antimicrobial and antioxidant activity of brandies are based
on compounds that make composition of brandy rather than the present ethanol.
Results for total reducing power show the following:dry remains of blueberry brandy
has the highest reducing capability, than dry remains of cornelian cherry brandy and dry
remains of blackthorn brandy. Dry remains of blackberry brandy has the least reducing
capability. Results for DPPH-method show the following: the highest antioxidant capacity has
dry remains of cornelian cherry brandy, than dry remains of blackberry and blackthorn
brandies. Dry remains of blueberry brandy show the least antioxidant capacity. Results for
ABST-method show the following: the highest antioxidant activity has dry remains of
blackberry brandy, than dry remains of cornelian cherry brandy, dry remains of blackthorn
brandy. Dry remains of blueberry brandy has the least antioxidant activity.
Research in future should be carried out on pure components and their synergistic
effect to seek natural and friendly antimicrobial and antioxidant substances for the prevention
and treatment of gastrointestinal, urogenital infections and wound infections.
48
8. LITERATURA
Adams RP (2007): Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass
Spectrometry, 4th edition, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL.
Božin B. (2009): Biohemijska i farmakološka ispitivanja vrsta roda Allium L. (Sect. Allium), Doktorska
disertacija, Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematicki fakultet, Novi Sad.
Cadenas E., Davies, J.A.K. (2000): Mitochondrial free radical generation, oxidative stress andaging.
Free RadicalBiology and Medicine, 29:222.
Hu J. (2001): Oxidative Stress and Aging, Free Radical and Radiation Biology Program, The
University of Iowa.
Huang D., Ou B., Prior R.L. (2005): The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 53.
Jawetz, Melnick, Adelberg (2007): Lange Medical Microbiology, 24th Edition: McGraw-Hill Medical,
832.
Jarak, M., Govedarica, M. (2003): Mikrobiologija. Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Novom Sad,
Novi Sad, 9-10.
Jović S. (2006): Priručnik za spravljanje rakije.
Karakašević, B. (1977): Mikrobiologija i parazitologija, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb.
Magalhaes M.L., Segundo A. M., Reis S., Lima L.F.C.J. (2008): Analytica chimica acta, 613:1.
Martinović E., Kojić M. (1998): Samonikle vrste voćaka Srbije.
Milardović S., Iveković D., Rumenjak V., Grabarić B.S. (2005): Use of DPPH⋅|DPPH Redox Couple
for Biamperometric Determination of Antioxidant Activity, Electroanalysis, 17:1847.
Mimić-Oka J., Simić D., Simić T. (1999): Free radicals in cardiovascular diseases, Facta Universitatis,
Series: Medicine and Biology, 6, 11-22.
Mimić-Oka J., Simić T., Đukanović L., Reljić Z., Davičević Z. (1999): Alteration in plasma antioxidant
capacity in various degrees of chronic renal failure, Clinical Nephrology, 51:233.
Mimica-Dukić N., Božin B., Soković M., Mihajlović B., Matavulj M. (2003): Antimicrobial and
antioxidant activities of three mentha species essential oils. Planta Medica, 69: 413-419.
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003): Performance standards for
anti-microbial susceptibility testing: eleventh informational supplement. Document M100-
S11.National Committee for Clinical Laboratory Standard, Wayne, PA, USA.
Percival M. (1998): Antioxidants, Clinical nutrition insights, Advanced Nutrition Publications.
Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente biologije.
Radev, M., Radkov, M., Jočev, S. (1988): Infektiozni bolesti, Medicina i fizkultura, Sofia.
49
Samardžija, D., Damjanović, S., Pogačić, T. (2007): Staphyloccocus aureus u siri. Mljekarstvo/Dairy,
57: 31-48.
Sartoratto, A., Machado, A.L.M., Delarmelina, C., Figueira, G.M., Duarte, M.C.T., Rehder, V.L.G.
(2004): Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in
Brazil. Braz J Microbiol. 35: 275–280.
Strohi, A.W., Rouse,H., Fisher, D.B. (2001): Microbiology. Lippincott Williams and Wilkins, USA.
Tadejević V., Jaković V. (1976): Poznavanje robe s osnovama nauke i tehnologije o ishrani.
Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka.
Tesević V., Nikičević N., Jovanović A., Djoković D., Vujisić Lj., Vučković I., Bonić M. (2005):
Volatile components from old plum brandies. Food Technol Biotechnol 43:367-372.
Van den Dool H, Kratz PD(1963): A generalization of the retention index system including linear
temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr 11:463-471.
Vitorović D. (1990): Hemijska tehnologija, Naučna knjiga, Beograd.
50
BIOGRAFIJA
Sandra Živković rođena je 05. februara 1988. u Nišu. Završila je osnovnu školu „Sveti
Sava“, zatim 2003. godine upisuje srednju školu Gimnazija „Bora Stanković“, društveno-
jezički smer.
Nakon srednje škole, 2007. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-
matematičkom fakultetu u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske
studije završava u roku sa zvanjem „biolog“. Godine 2010. upisuje master akademske studije
na smeru Biologija.
51
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: Мастер рад
Аутор, АУ: Сандра Живковић
Ментор, МН: Татјана Михајилов Крстев
Наслов рада, НР: АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ РАКИЈА ДОБИЈЕНИХ ИЗ
ПЛОДОВА САМОНИКЛОГ БИЉА СА ПОДРУЧЈА СРБИЈЕ
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2015.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
50 стр.; 8 поглавља; 11 слике; 7 табеле
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: микробиологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Антимикробна активност, антиоксидативна активност, хемијски састав, ракија,
Rubus fruticosus, Vaccinium myrtillus,Cornus mas, Prunus spinosa
УДК 663.241:615.015]:633.8(497.11)
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ:
У овом раду испитиван је хемијски састав, антимикробна активност и антиоксидативна активност ракија
и сувих остатака ракија добијених ферментацијом плодова дрењине (Cornus mas), дивље купине (Rubus
fruticosus), боровнице (Vaccinium myrtillus) и трњине (Prunus spinosa), као и доминантних једињења ракија.
Хемијско испитивање ракија вршено је уз помоћ GH и GH-MS. Установљено је да су у ракијама доминантна
једињења алкохоли, једињења шикиматног пута, естри, масне киселине и терпени. Ракије су деловале слабо
инхибиторно и нису имале бактерицидну активност. Најбољу антимикробну активност показали су суви
остаци ракије од плодова боровнице, док су суви остаци ракије од купине показали најнижу активност. Сва
доминантна јединњења осим 2-фенил етанола показала су најбољу активност на изолате из
гастроинтестиналног тракта. Једињење 2-фенил етанол најбољу активност показује на изолате из
урогениталног тракта. Ракија од плодова боровнице показује највећу редукциону моћ, а најслабију ракија од
плодова купине. Највећи слободно радикалски антиоксидативни капацитет показује дрењина, а најслабији
боровница. Примена ABTS методе показује највећу антиоксидативну активност ракије купине, а најслабије
боровнице. Добијени резултати показују да је како антимикробна тако и антиоксидативна активност ракије
базирана на једињењима која улазе у њихов састав, а не на присутном етанолу.
Датум прихватања теме, ДП: 09.09.2015.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Др Бојан Златковић
Члан:
Др Наташа Јоковић
M
ентор:
Члан: Др Наташа Јоковић
M
ентор:
Др
Татјана Михајилов
-
Крстев
Члан, ментор: Др Татјана Михајилов Крстев
Татјана Михајилов
-
Крстев
Татјана Михајилов
Образац Q4.09.13 - Издање 1
52
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Sandra Živković
Mentor, MN: Tatjana Mihajilov Krstev
Title, TI: Antimicrobial activity of brandy obtained from the fruits of
wild plants from Serbia
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2015.
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
50 p. ; 8 chapters; 11 photos; 7 tables
10 photos, 9 tables 10 photos, 9 tables
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: microbiology
Subject/Key words, S/KW: Antimicrobial activity, antioxidant activity, chemical composition, brandy, Rubus fruticosus, Vaccinium myrtillus,Cornus mas, Prunus spinosa
UC 663.241:615.015]:633.8(497.11)
Holding data, HD: library Note, N:
Abstract, AB: In this paper was examinated the chemical composition, antimicrobial activity and antioxidant activity of brandy
and dry residues obtained by fermentation of fruit brandies cornelian cherry (Cornus mas), wild blackberry (Rubus fruticosus),
European blueberry (Vaccinium myrtillus) and Blackthorn (Prunus spinosa), and the dominant compound of wild fruits brandy.
Chemical examination of the resulting brandies was performed using GC and GC/MS analyses. It was concluded that the
dominant compounds in brandies were alcohols, shikimate metabolites, esters, fatty acids and terpenoids. Brandies have poor
inhibitory activity and they do not have bactericidal activity. Dry residues from European blueberry brandy showes the best
antimicrobical activity. The lowest and the very poor antimicrobial activity have dry residues of blackberry brandy. All of the
dominant compounds except the 2-phenyl ethanol show the best antimicrobial activity against isolated bacterial strains from the
gastrointestinal tract. A compound of 2-phenyl ethanol shows the best antimicrobial activity against isolated bacterial strains
from the urogenital tract. Dry remains of blueberry brandy has the highest reducing capability. Dry remains of blackberry
brandy has the least reducing capability. Results for DPPH-method show the following: the highest antioxidant capacity has dry
remains of cornelian cherry brandy. Dry remains of blueberry brandy show the least antioxidant capacity. Results for ABST-
method show the following: the highest antioxidant activity has dry remains of blackberry brandy. Dry remains of blueberry
brandy has the least antioxidant activity. The results show that the antimicrobial and antioxidant activity of brandies are based
on compounds that make composition of brandy rather than the present ethanol.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09.09.2015.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: Dr Bojan Zlatković
Member: Dr Nataša Joković Member, Mentor: Dr Tatjana Mihajilov Krstev
Tatjana Miha j ilov - Krstev
Образац Q4.09.13 - Издање 1