resistencia a bacterias fitopatogenas

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología Curso 2011

Resistencia a bacterias fitopatógenas mediante ingeniería genética

Alejandro Mentaberry

Sumario

Agrobiotecnología

Resistencia a bacterias fitopatógenas

Bacterias fitopatógenas

Interacciones planta-bacteria

Defensas inducibles en las plantas

Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética

- Péptidos antimicrobianos - Lisozimas- Tioninas- Genes de resistencia- Glucosa oxidasa- Ornitil carbamoil transferasa

Inhibición de la regulación de factores de virulencia

Referencias

Bacterias fitopatógenas

Agrobiotecnología


Génerosy especies de bacterias fitopatógenas

Agrobiotecnología


Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

iranicus, rathayi, tritici, michiganensis (subsp.michiganensis, insidiosus, nebraskensis, sepedonicus, tessellarius)

xyli (subsp. xyli, cynodontis)

ilicisArthrobacter

División Firmicutes(gram positivos)

División Gracillicutes(gram negativos)

Clase ProteobacteriaSubclase alfa

Familia Rhizobiaceae

fasciansRhodococcus

flaccumfaciensCurtobacterium

suberifaciensRhizomas

Familia (sin nombre)

rhizogenes, rubi, tumefaciens, vitis

Agrobacterium

ampelinusXylophilus

avenae (subsp. avenae, citrulli)

Acidovorax

Subclase betaFamilia Comamonadaceae

Especies Géneros

Clavibacter

Génerosy especies de bacterias fitopatógenas

Agrobiotecnología


Tomado de Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.


fastidiosaXylella


albilineans , campestris, fragariae, graminis, oryzae, populi

Xanthomonas

Subclase gamma

Familia Enterobacteriaceae

1) fuscovaginae, marginalis, tolaasii

2) amygdali

3) syringae, viridiflava

4) chicorii

5) corrugata

Pseudomonas

Familia Pseudomonadaceae

amylovora, nigrifluens, quercina, rubrifaciens, stewartii, tracheiphila, herbicola, ananas, carotovora (subsp. carotovora, atroseptica, betavasculorum), chrysanthemi, rhapontici

Erwinia

Spp.Streptomyces

Géneros de afiliaciónincierta

EspeciesGéneros


fastidiosaXylella


albilineans , campestris, fragariae, graminis, oryzae, populi

Xanthomonas

Subclase Gamma

Familia Enterobacteriaceae

fuscovaginae, marginalis, tolaasii

amygdali

syringae, viridiflava

chicorii

corrugata

Pseudomonas

Familia Pseudomonadaceae

amylovora, nigrifluens, quercina, rubrifaciens, stewartii, tracheiphila, herbicola, ananas, carotovora (subsp. carotovora, atroseptica, betavasculorum), chrysanthemi, rhapontici

Erwinia

Spp.Streptomyces

Géneros de afiliaciónincierta

EspeciesGéneros

Principales componentes de la ultraestructura de una bacteria fitopatógena típica

Esquema deuna bacteria fitopatógena

Agrobiotecnología


Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

β

Microscopía electrónica de Erwinia pyrifoliae, patógeno del peral. Pueden observarse el glicocálix y varios pili.

Microscopía electrónica de barrido de células de Pseudomas syringae.

Microscopía electrónica de células de Xhantomonascon un flagelo polar (arriba) y de Peudomonas con flagelos lofotricos (abajo)

Bacterias fitopatógenas Gram negativas y Gram positivas

Tom

ado

de: L

lace

ret

al.,

Pat

olog

ía V

eget

al, 1

996.

Filamentos ramificados, micelios aereos y cadenas de esporas características

de Streptomyces spp.

500 nm

La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de bastones cortos de 0,6-3,5 µm

de longitud y 0,5-1 µm de diámetro

Ciclo biológico de una bacteria fitopatógena con fase epifita

Agrobiotecnología


Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudandode los estomatas de hojas de cerezo infectadas

Microscopía de barrido de la superficiedel envés de una hoja de cítrico.

Se observan células de Xanthomonas citricolonizando la cavidad subestomática

Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales

Las bacterias fitopatógenas utilizan a los estomas y lenticelas como vías naturales de ingreso a la planta

Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci

en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.

Microscopía electrónica de Xanthomonascampestris colonizando una hojade Brassica. Las bacterias están

generalmente rodeadas de un polisacárido extracelular (EPS) y proliferan en estrecho contacto con las paredes celulares (CW)

La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se ac umula en el espacio extracelular o en el tejido vascular y utiliza esta vía y los tejidos conductivo

para colonizar diferentes órganos de la planta

A B A B

Muchas bacterias fitopatógenas se localizan en el apoplasma

Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Principales tipos de enfermedades bacterianas y síntomas que producen en el huésped

Clavibacter y Curtobacterium

P. solanacearumAlgunas Erwinias y Xanthomonas

Invasión del floema y xilema

MarchitamientoEnanismoPodredumbre en anilloManchas en ojo de pájaro

Marchitamientos en plantas herbáceas

Pseudomonassyringae pv. syringaeErwinia amylovora

Invasión del floema y xilema a través de heridas, yemas, cicatrices foliares, hojas jóvenes y flores

Necrosis de la cortezaMarchitamiento o desecamiento de brotes jóvenes y corimbos florales Necrosis de yemas Gomosis

Chancros y marchitamietoen plantas leñosas

Principales especies fitopatógenas de Pseudomonas y Xanthomonas

Espacios intercelulares y necrosis delparénquima

Necrosis con hidrocelesManchas angulares o alargadasManchas necróticas con haloPerdigonado de hojasClorosis de hojas jóvenesDesecamiento foliarManchas en frutosExudados

Manchas foliares y en frutos

PatógenosTejidos afectadosSíntomas Tipo de enfermedad

ClavibacterCurtobacterium

P. solanacearumAlgunas ErwiniasXanthomonas

Invasión del floema xilema

MarchitamientoEnanismoPodredumbre en anilloManchas en ojo de pájaro

Marchitamientos en plantas herbáceas

syringae pv. syringaeInvasión del floema xilema a través de heridas, yemas, cicatrices foliares, hojas jóvenes y flores

Necrosis de la cortezaMarchitamiento o de brotes jóvenes corimbos florales Necrosis de yemas Gomosis

Chancros marchitamietoen plantas leñosas

Principales especies fitopatógenas de PseudomonasXanthomonas

y necrosis delparénquima

Necrosis con hidrocelesalargadas

con haloPerdigonadoClorosis de hojas jóvenesDesecamientoManchas en frutosExudados

y en frutos


Xanthomonas axonopodis

Principales tipos de enfermedades bacterianas y síntomas que producen en el huésped

Microscopía electrónica de barrido de la

lesión del cancro

StreptomycesTejidos más externos epidérmicos, subepidérmicos y parenquimáticos

Necrosis eruptivas rugosas, con costras o pústulas y suberificadas

Roñas o costras

AgrobacteriumRhodococcus fasciansP. syringae pv. savastanoi

Estimulación anormal de la división celular y delcrecimiento de tejidos meristemáticos

Tumores en cuello y raízTumores en ramasHiperproliferación radicular

Hiperplasia y proliferación

Erwinias pectinolíticas y algunas Pseudomonas

Maceración de la lámina media y pared primaria celular

Pudrición blanda de tubérculos, bulbos o rizomasPie negro

Podredumbres blandas


StreptomycesTejidos más externos epidérmicos, subepidérmicos y parenquimáticos

Necrosis eruptivas rugosas, con costras o pústulas y suberificadas

Roñas o costras

Agrobacterium

P. syringae pv. savastanoi

Estimulación anormal de la división celular y delcrecimiento de tejidos meristemáticos

Tumores en cuello y raízTumores en ramasHiperproliferación radicular

Hiperplasia y proliferación

Erwinias pectinolíticas y algunas Pseudomonas

Maceración de la lámina media y pared primaria celular

Pudrición blanda de tubérculos, bulbos o rizomasPie negro

Podredumbres blandas


Síntomas de algunas enfermedades bacterianas

Infección de geranio por Xhantomonas hortorum pv pelargonii

(clorosis y necrosis foliar)

Infecciones de caña de azúcar porPseudomonas rubrilineas (bandas

necróticas; arriba derecha) y de Platycerium bifurcatum por

Pseudomonas gladioli (lesiones necróticas; derecha )

Infección por Xanthomonasaxonopodis(cancro de los cítricos)

Agrobiotecnología


Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.

Síntomas de cancrosis en frutos, hojas y ramas de Citrus.


Infección de peral (arriba) y de manzano (derecha) por Erwinia amylovora (tizones)


Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.

Arriba izquierda:Infección de tubérculos de papapor Streptomycesscabies (escaras)

Abajo izquierda:Infección de fruto de tomate porClavibactermichiganensis(cancros)

Derecha: Infección de tubérculos de papa por Erwinia carotovora subsp. atroséptica(podredumbre blanda)

Infección de una cucurbitácea por Erwinia tracheiphila(invasión del xilema con goma bacteriana)


• No existe control químico eficiente• Pulverizaciones a base de cobre

Métodos de control de bacteriosis en cultivos

Pulverización de citrus con un preparado a base de sulfato de cobre de para el control de cancrosis

• Erradicación y quema de las plantas infectadas

Métodos de control de bacteriosis en cultivos

Quema de citrus infectados con cancrosis


Agrobiotecnología


- La planta posee defensas preformadas o su sistema . defensivo reconoce moléculas presentes en la . superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares . asociados al patógeno) desencadenando una respuesta . de protección general (resistencia de no específica).

- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la . . planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica . Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial . de la infección. (resistencia específica).

- Las condiciones ambientales externas cambian y el . patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la . infección es irreversible.

- Las defensas preformadas son inadecuadas

- El patógeno es capaz de neutralizar las respuestas . defensivas de la planta y/o de retardar el inicio de las mismas

- Las condiciones externas son favorables para la infección

• Se produce enfermedad cuando:

La enfermedad resulta de la interacción entre el hospedante, el patógeno y el medio ambiente

Agrobiotecnología


• No se produce enfermedad cuando:

La especificidad del patógeno bacteriano y de los genes de resistencia de la planta determinan diferentes tipos de interacción

Agrobiotecnología


Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.

(variedades) (variedades)

Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.


Agrobiotecnología


Eventos de señalizació n que regulan la interacción planta-bacteria

Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno

Factores de patogenicidad: imprescindibles para general la enfermedad; no determinanlos síntomas en forma directa (ejemplo, proteínas hrp; proteínas vir)

Factores devirulencia:

Factores de virulencia: responsables de la sintomatología; modulan la gravedad de laenfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas degradadoras, fitohormonas)

Factores de Requeridos para el reconocimiento delavirulencia: patógeno por parte de la planta

Factores de patogenicidad: imprescindibles para general la enfermedad; no determinanlos síntomas en forma directa (ejemplo, proteínas hrp; proteínas vir)

Factores devirulencia:

Factores de virulencia: responsables de la sintomatología; modulan la gravedad de laenfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas degradadoras, fitohormonas)

Factores de Requeridos para el reconocimiento delavirulencia: patógeno por parte de la planta

Algunos factores bioquímicos producidos por las bacterias fitopatógenas que tienen una función en la virulencia y en la colonización de la planta huésped

SIDEROFOROS

EXOPOLISACARIDOS

EXOENZIMAS

BACTERIOCINAS

FITOHORMONAS

PROTEINAS NUCLEADORAS

FITOTOXINAS

BACTERIA

SIDEROFOROS

EXOPOLISACARIDOS

EXOENZIMAS

BACTERIOCINAS

FITOHORMONAS

PROTEINAS NUCLEADORAS

FITOTOXINAS

BACTERIA

Factores secretados por bacterias fitopatógenas

Sistemas de secresión en bacterias Gram negativas

Tomado de: Nature Reviews Microbiology, 2009.

Modelo de patogenia bacteriana que involucra la lib eración mediada por el sistema Hrp de factores de patogenicidad y factores de avirulencia d entro de la célula vegetal

Factores de compatibilidad (virulencia)- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros) - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de los símbolos rojos/verdes) - Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía: . Supresión de las defensas? . Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes

Factores de incompatibilidad (avirulencia) - Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R (símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran) - Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones virulentas (compatibles)

Pared celular

Parasitismo

HR y defensa

Nutrientes

Agua

Incremento de pH

Secresión de proteínas mediada por el sistema Hrp

La región de patogenicidad Hrp contiene:

- El agrupamiento conservado de genes hrp(subconjunto hrc en púrpura)

- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z amarilla)

- Multiples genes avr (cruzado) en regiones flanquentes variables

El sistema Hrp (tipo III) secreta:

-HrpZ al medio (parte del aparato de secresión extracelular?)

- Proteínas Avr directamente dentro de la célula vegetal (transferencia gatillada por contacto con el hospedante?)

Factores de compatibilidad (virulencia)- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros) - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de los símbolos rojos/verdes) - Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía: . Supresión de las defensas? . Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes

Factores de incompatibilidad (avirulencia) - Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R (símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran) - Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones virulentas (compatibles)

Pared celular

Parasitismo

HR y defensa

Nutrientes

Agua

Incremento de pH

Nutrientes

Agua

Incremento de pH

















El sistema de secreción de tipo III

Defensas inducibles en las plantas

Agrobiotecnología


Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémic a Adquirida (SAR) en el sistema de genes RPS2-avrRPt2 /RPM1-avrRPM1

La planta y su sistema defensivo

Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.

A

RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere resistencia a cepas que expresa el factor de avirulencia avrRpt2 . RPM1 de A. thaliana(Resistance to P. syringae pv maculicola 1) confiere resistencia a cepas que que expresan el gen de avirulencia avrRPM1 .

.

A

RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere resistencia a cepas que expresa el factor de avirulencia avrRpt2 . RPM1 de A. thaliana(Resistance to P. syringae pv maculicola 1) confiere resistencia a cepas que que expresan el gen de avirulencia avrRPM1 .

Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avrdel patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia

de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)

El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 19 40)El modelo gen por gen explica los casos de compatibilidad de incompatibilidad planta-patógeno

Agrobiotecnología


Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.

Localizaciónde proteínas de resistenciay esquema de sus dominios funcionales

Agrobiotecnología


BS2: gen de resistencia de pimiento que confiere resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de resistencia a las razas 2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; FLS2: gen de resistencia a bacterias de Arabidopsis thaliana; L6: gen

de resistencia a la roya del lino 6; PBS1: gen de A. thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae; Pto: gen de resistencia a P. syringae pv. tomato; RPG1: gen de resistancia a Puccinia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a P.

syringae pv. maculicola; RPP5: gen de resistencia a Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de A. thaliana que confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1: gen de resistencia a Ralstonia

solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a X. oryzae pv. Oryzae; Va1 y Va2: genes de resistencia de tomate que confieren resistencia a Verticillium alboatrum. ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de localización nuclear; PEST: secuencia Pro-

Glu-Ser-Thr-like; CC: dominio coiled-coil; NB: dominio de unión a nucleótidos; TIR: domino similar a Toll/receptor de interleuquina; LRR: leucine rich repeat; WRKY: dominio de “dedos de zinc” . Dominios 1-4: sin homología conocida.

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia: hipótesis de la “proteína guardiana”

Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.

Interacción

R2

proteína “guardiana”

Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémico scomprendidos en una respuesta inducible

Respuesta defensiva

- Engrosamiento de la pared celular- Inducción de genes involucrados en la síntesisde metabolitos secundarios. Síntesis de fitoalexinas

- Síntesis de tioninas- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa (PRs)a patógenos

- Síntesis de ácido salicílico Inducción de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)

Agrobiotecnología


Las respuestas defensivas inducibles por patógenos comprenden diversos mecanismos moleculares

Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.

Cl -

BA

Genes involucrados en resistencia local a patógenos


CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethylene-insensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de

transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5. TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG

COL1

EIN2


Genes involucrados en resistencia local a patógenos

Independiente de SAR

SIR ISRSAR

Dth9: detachment 9; ISR1: induced systemicresistance 1; JAR1: JA resistance 1; NPR1-1 inducible; SNI1: suppressor of SAR SON1: suppressor of nim1-1; SAG: salicylic acid glucoside.

Dir1?

Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética

Agrobiotecnología


TotalPseudomonas syringae pv. phaseolicola

HabaPseudomonassyringae pv. phaseolicola

OCTasainsensible a faseolotoxina

TotalPseudomonas syringaeTabacoPseudomonassyringae pv. tabaci

Proteína de resistencia a tabtoxina

Inhibición de la patogenicidad o de factores de viru lencia bacterianos

Erwinia carotovora

Ralstonia solanacearum

Pseudomonas syringae pv. tabaci

Erwinia carotovora

Erwinia amylovora


Ralstonia solanacearum

Resistencia a

ParcialTabacoGusano de sedaMB39

ParcialTabacoGusano de sedaShiva-1

ParcialManzanoGusano de sedaAtacina E

ParcialTabacoHumanoLisozima

ParcialPapaBacteriofago T4Lisozima

ParcialTabacoHumanoLactoferrina

ParcialPapaCangrejo herraduraTaquiplesina

Producción de compuestos antibacterianos no vegetal es

Nivel de resistencia

Especie transgénica

OrigenProteína

Estrategias para desarrollar resistencia a bacteriaspor medio de ingeniería genética

Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.

ParcialErwinia carotovoraTabacoErwinia carotovoraExpR

ParcialErwinia carotovoraTabacoBacillus spp.aiiA

Interferencia con el mecanismo de quorum sensing

Total Pseudomonas syringae pv. tabaci

TabacoHalobacteriumhalobium

Bacterio-opsina

Muerte celular inducida artificialmente en el sitio de infección


Erwinia carotovora

Xanthomonas oryzae

Erwinia carotovora

Resistencia a

TotalArrozCultivares resistentesProteína Xa21

ParcialPapaErwinia carotovoraPectato liasa

ParcialPapaAspergillus nigerGlucosa oxidasa

ParcialTabacoCebadaTionina

Incremento de los sistemas de defensa naturales

Nivel de resistencia

Especie transgénica

OrigenProteína

Estrategias para desarrollar resistencia a bacteriaspor medio de ingeniería genética

Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.

Péptidosantimicrobianos

Estructuras de algunos péptidos antimicrobianos

En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente) En verde: aminoácidos hidrofobitos

Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.

Agrobiotecnología


Mecanismos de acció n postulados para péptidos antimicrobianos

La estructura anfipática de los péptidos antimicrobianos determina su especificidad y mecanismo de acción

Agrobiotecnología



Mecanismos de acción postulados para péptidos antimicrobianos


Modelo de Shai-Matzusaki-Huang para el mecanismo de acción de péptidos líticos

A: reconocimiento de la membrana bacteriana.

B: inserción a la membrana mediada por la atracción electrostática

C: formación de poros en la membrana.

D: transporte de péptidos y lípidos a la capa interna de la membrana.

E: acción de los péptidos sobre “blancos” intracelulares

F: colapso de la membrana bacteriana y ruptura de la célula.

Llípidos en amarillo: carga negativa. Lípidos en negro: sin carga neta

Transformación de cloroplastos de tabaco con el gen del análogo de magainina MSI-99

Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 µl de 8x105, 8x104, 8x103

y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.

Expresión en plantas de un péptido líticoantimicrobianoanálogo demagainina

Agrobiotecnología


Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.

Transgénica

Transgénica

Wild type

Wild type

8.105 8.105

8.105 8.1058.104

8.102 8.103

8.103

8.102

Resistencia a bacterias mediada por sarcotoxina, un péptido aislado de Sarcophagaperegrina

Hojas de plantas de naranja inoculadas con Xanthomonas axonopodispv. Citri (104 ufc/mL), bacteria causante de la cancrosis en cítricos.

Izquierda: planta control no transgénica; derecha: planta transgénica que expresa el gen de sarcotoxina. Fotos obtenidas a los 26 d post-infección.

Expresión de sarcotoxina en plantas transgénicas de cítricos

Agrobiotecnología


Tomado de: Ohshima et al. J. Biochem., 1999.

La lisozima esuna enzima de reconocida acción bacteriolítica

Estructura del vector pSR-2 conteniendo el gen quimérico de la lisozima del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido señal de

α-amilasa de cebada. El gen es dirigido por el promotor de 35S del CaMV

Resistencia antibacteriana en plantas de papa transformadas con el gen de lisozima del fago T4

Agrobiotecnología


Tomado de : Düring et al. The Plant Journal, 1993.

Ensayos de maceración con distintas densidades de inóculo

La resistencia fue clasificada determinando la superficie macerada sobre el total de la superficie de cada disco. En a) se muestra el promedio de 5 experimentos; en b) se muestra el promedio de 4 experimentos. La edad de los tubérculos fue de 2-3 meses

Ensayos de maceración con Erwinia carotevora pv atroséptica a lo largo de 1-12 días. Se presentan los resultados correspondientes a los controles, el mejor transformante

y el valor promedio de todos los transformantes

Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4

Cuantificación de los resultados de un bioensayo de brotacion de tuberculos en invernadero luego de la infección con Erwinia carotovora pv. atroséptica

Comparación de la brotación en plantas de papa control y transformadas con la lisozima del fago T4 en condiciones de invernadero. Se plantaron trozos de tubérculo infectados con Erwinia carotovora pv atroséptica. Izquierda: plantas transgénicas T424; derecha: plantas control Z2

Ensayos de brotación de tubé rculos en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4

Plantas transgénicasde papa que expresan elgen de la lisozima

Agrobiotecnología

Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.

Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina

Plantas control Plantas transgénicas

Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina

controles transgénicas controles transgénicas

Ensayos de infección con Erwinia carotovorade plantas transgénicas (derecha) y controles (izquierda) de Solanumtuberosumque expresan combinaciones de uno, dos y tres genes antimicrobianos

Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas

Ensayos de maceración en tubérculos de Solanumtuberosuminoculados con Erwinia carotovora

Las tioninas son proteínas ricas en cisteína tóxicas para las bacterias

Desarrollo de plantas de tabaco que expresan tioninas de trigo y de cebada

Agrobiotecnología

Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.

Lesiones causadas por las bacterias 6 días después de la inoculación en plantas transformadas con la tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)

Datos de infección. El porcentaje de infección fue medido 90 h después de la inoculación y representa la proporción de puntos de inoculación que formaron lesiones necróticos.

Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas con Pseudomonas syringae pv tabaci

Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal. 1993.

SNN: N. tabacum Sansum NN no transformada SNN+CS: plantas de N. tabacum Samsun NN transformadas con un vector vacío UP1 hz y UP2 hz: plantas homocigotas transformadas con la tionina de cebada UP6 pg y UP7 pg: progenies heterocigotas de UP1 y UP2 UP3 hz y UP4 hz: plantas homocigotas transformadas con la tionina de trigo.

WTUP1

El desarrollo de la infección se midió titulando el número de bacterias. Los títulos en las plantas UP1 a las 34 y 48 h fueron significativamente diferentes de los de las plantas UP3 y controles. Los títulos en UP3 no son significativamente diferentes de los de los controles


(trigo)

(cebada)

A: lesiones causadas por el patógeno en plantas transgénicas (UP1) y control (WT)

a los 4 días de la infección

B: Datos de infección. Se midió el área necrótica a los 4 días de la infección en el

Experimento 1 y a los 3 días de la infecció n en el Experimento 2.


La OCTasa de Pseudomonas es

insensible a su propia toxina.

Se la expresó la secuencia de la la OCTasa en plantas para proteger de la acción

de la faseolotoxina.

A la secuencia de la OCTasa se le agregó una

señal de transporte al cloroplasto (en plantas, ruta de síntesis cloroplastídica).

Modo de acción de la faseolotoxina

faseolotoxina

19,80 ± 0,4019,90 ± 0,1522,90 ± 0,66SSO-T16

10,30 ± 0,3010,70 ± 0,1414,20 ± 0,26SSO-T13

2,10 ± 0,302,10 ± 0,155,50 ± 0,10SSO-T1

N.D.59,80 ± 2,4068,00 ± 6,10SSO-T3 (cloroplastos)

N.D.0,90 ± 0,036,0 ± 0,05Control (cloroplastos)

N.D.0,10 ± 0,022,50 ± 0,02Control

Toxina (375 ng/ml)Toxina (37 ng/ml)Sin toxina

Actividad OCTasaPlanta

Efecto de faseolotoxina en la actividad de ornitil ca rbamoil transferasa (OCTasa) de plantas transgénicas SSU-OCTasa y planta s control.

La actividad de OCTasa está expresada como mmoles de citrulina formados por min/mg de proteína, con la excepción de extractos de cloroplastos, que fueron

reportados por mg de clorofila. Las actividades mostradas representan un promedio de tres experimentos independientes. N.D. = no determinado.

Ensayos con faseolotoxinaen plantas transgénicas SSU-OCTasa

Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Ensayos con faseolotoxinacon plantas transgénicas SSU-OCTasa

A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina. C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los

tratamientos en las hojas fueron con 2 µl de una solucion de 3 µg/ml de toxina.Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina

Agrobiotecnología


Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pvphaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa

A y C: Plantas control no transformadas a los 7 días de la inoculación con PseudomonasB y D: Plantas transgénicas SSU-OCTasa a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas

A B

C D

Ensayos con Pseudomonassyringae en plantas transgénicas SSU-OCTasa

Agrobiotecnología

Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Transformación de arrozcon el gende resistenciaXa21

Agrobiotecnología


Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.

CC

Plantas controlPlantas transgénicas




Resistencia a la infección con Xanthomonas oryzaepv. oryzae en cultivares susceptibles transformados con el gen Xa21

A: cultivar Minghui 63-12

B: cultivar IR7 2-82

C: Síntomas en plantas transgénicas (izquierda) y control (derecha) en ensayos de campo.

Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21

Segregación de la expresión de Xa21 en la generación R1 de las líneas transgénicas IR72-82, Minghui 63-12, Minghui 63-22 y BG90-2-27

Transformación de arrozcon el gende resistenciaXa26

Resistencia a la infección de Xanthomonas oryzae pv. oryzaeen plantas transformadas con el gen Xa26, aislado del cultivar MH63

MH63: Minghui 63 (con moderada resistencia)MDJ8: Mudanjiang 8 (susceptible)RB22: MDJ8 transformado con Xa26

Agrobiotecnología


Lesiones producidas por Xanthomonas orizae pv. orizaesobre hojas de plantas de arroz.

IR24: planta susceptiblesRb17-18: Líneas transgenicas que expresan el gen Xa26.

Controles de la PCR para Xa26:Positivos: MH63 y IRBB3, líneas moderadamente resistentes y resistentes, respectivamente.Negativo: MDJ8, línea susceptible.

Tomado de: Sun et al., Plant Journal, 2004.

Crecimiento de Pseudomonas syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas con el gen de resistencia Pto (líneas sólidas) y en plantas control no transformadas

(líneas discontínuas). Las plantas fueron inoculadas con bacterias que expresan el gen avr/Pto (cuadrados) o que no poseen el gen (triángulos). Los tipos de interacciones que se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr; [2]: compatibilidad (ausencia del gen R y presencia del gen avr; [3]: compatibilidad (presencia del gen R

y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y del gen avr)

Transformación de tabaco con el gen de resistencia Pto de tomate

Agrobiotecnología


Tomado de: Thilmony et al. The Plant Cell. 1995.

Planta transgénica

Planta controlCre

cim

ient

o ba

cter

iano

[lo

g(c

fu/c

m2 )

]

Detección de H2O2 en plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger

A: raíces de planta de papa no transgénica (izquierda) y transgénica

(derecha)

B: discos de hoja de papa no transgénica (arriba) y transgénica (abajo) puestos en

medio KI/almidón por 30 minutos

C: Idem que B, pero durante 5 horas

D: discos de tubérculos de papa de plantas no transgénicas (arriba) y

transgénicas (abajo) puestos en medio KI/almidón por 30 minutos

E: Idem que D, pero por 5 horas

ββββ-D-glucosa + O 2. ácido glucónico + H 2O2

glucosa oxidasa

Incremento del nivel de H 2O2 en hojas de papa transgénicas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger . Controles: Russet Burbak no transformada y planta transformada con el vector vacío (17227-1). Líneas transgénicas: 22587-3, 22587-12 y 22587-33

Detección de H2O2 en plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger

Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovorade plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa

Inhibición del crecimiento Erwinia carotovora en discos de tubérculos de plantas transgénicas

Se midió el número de bacterias entre 1 y 5 días luego de la inoculación. Los símbolos vacíos corresponden a los controles de plantas no transformadas o transformadas con el vector vacío. Los símbolos llenos corresponden a dos líneas transgénicas que expresan el gen de glucosa oxidasa

A: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24 oC bajo condiciones aeró bicas B: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24 oC bajo condiciones anaeróbicas

Los minituberculos de papa de plantas no transgénic as (RB) o de las líneas transformadas con glucosa oxidasa 22587-3 (3) y 22587-34 (34) se inoc ularon con 2x10 5 cfu de Erwinia carotovora

por disco de tubérculo. Los síntomas se evaluaron a los tres días de la inoculación

Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovorade plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa

Inhibición de la regulación de factores de virulencia

Agrobiotecnología


Quorum sensing

• Mecanismo de comunicación comunitario presente en . diversas especies de bacterias. Fue detectado por . primera vez en Vibrio fischeri

• Capacidad de los microorganismos de percibir y . responder a la densidad poblacional a través de la . producción de moléculas difusibles de reducido peso . molecular

Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)

Un gran número de bacterias Gram – se comunican sintetizando, secretando y respondiendo a compuestos difusibles

Agrobiotecnología


Regulación génica dependiente de la densidad poblac ional

El incremento de una población bacteriana determina una elevada concentración de factores difusibles

Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.

Modelo simplificado de la transducción de señales en quorum sensing

Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R (rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa entonces

como regulador transcripcional, aumentando su afinidad por secuencias promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .

El mecanismo de quorumsensing es mediado por moléculas difusibles como las acil-homoserinlactonas

Agrobiotecnología


Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Proteína R activada

El sistema rpf en Xanthomonas campestris

Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias

Gentileza de J. Maxwell Dow

endoglucanasas ,proteasas y polisacáridos

rpf : Regulation of Pathogenicity Factors

Estructura de moleculas señalizadoras de quorum sensing

La interferencia de la comunicaciónentre bacterias es una posible estrategiade resistenciaantimicrobiana

Posibles blancos y estrategias para interferir en l a comunicación entre bacterias ( quorum quenching )

Agrobiotecnología


Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

HSL

sintetasa

R

Mecanismos que afectan la regulación mediada por homoserin lactonas

Reconocen las A-HSLsproducidas por otros organismos

Homólogos de proteínaLux-RNo producen A-HSLs

Salmonella enterica(patógenohumano)

Organismos A-HSLs oportunistas

Afectan sistema de quorumsensing

Diferentes compuestosPlantas superiores( arroz, arveja, etc)

Se unen a receptores de A-HSLsInhiben quorum sensing

Furanonas halogenadasDelisea pulchra

Moléculas imitadoras de las A-HSLs

Degrada A-HSLsA-HSLs lactonasaGen aiiA

Bacillus sp. 240B1

Degrada A-HSLsActividad aminoacilasaVariovax paradoxus

FunciónMoléculaOrganismo

Enzimas degradadoras de A-- HSLs

Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol., 2002.

Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.

Transformación de plantas de papa con el gen de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.

Cortes transversales de tubérculos de papa inoculados con Erwinia carotovora.

A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.A la derecha: tubérculo de planta transformada con el

gen aiiA.

Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1. Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiAAbajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas

Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.

Las plantas que expresan genes deN-acil-homoserinlactona sintasasexhiben mayor resistencia a Erwinia carotovora

Agrobiotecnología


A BA B

A: detalle de una hoja de una planta transgénica infectada con Erwinia carotovoraB: hoja de una planta control luego de la infección

Porcentajes de infección observados para dos líneas transgénicas (barras verde y anaranjada) y de una planta control, no transgénica (barra violeta).

Transformación de plantas de tabaco con el gen de la N-acil-homoserinlactona sintasade E. carotovora(gen expI )

transgénica control

1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal, 3:457-462, 1993.

2. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H. Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome tocontrol phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-862, 2001.

3. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acylhomoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.

4. Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248, 2002.

5. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A. Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant Biology, 5:1369-1375, 2002.

6. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plantsproducing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibitenhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora. Molecular Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.

7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen, M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.

Referencias

Agrobiotecnología


resistencia a bacterias fitopatogenas

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