3.3 Bacterias Fitopatógenas

Yonis Hemández

Las bacterias son organismos microscópicos sumamente pequeños. Se conocen alrededor de 1600especies de ellas. La inmensa mayoría son organismos estrictamente saprófitos y como tales beneficianal hombre ya que ayudan a descomponer las cantidades enormes de materia orgánica que produceanualmente el hombre y sus fábricas en forma de productos de desecho o que son el resultado de lamuerte de las plantas y los animales. Varias especies producen enfermedades en el hombre, entre ellasla Tuberculosis, la Neumonía y la Fiebre Tifoidea, y otras producen enfermedades en los animales,como es el caso de la Brucelosis y del Antrax.

En relación con las bacteriosis, el reconocimiento de las mismas como agentes causantes deenfermedades en plantas, comenzó recién desde hace alrededor de 100 años. En una década (1877-1887) T.J.Burril y J.C.Arthur en Estados Unidos, trabajando con tizón violento o fogón de laspomaceas; J.H.Walker en Holanda, trabajando con la amarillez del jacinto y L.Savastano en Italia,trabajando con el mal negro de la vid, demostraron que dichas enfermedades tenían una bacteria comoagente causal. A pesar de estos trabajos, muchos patólogos vegetales, no reconocieron la existencia delas bacteriosis y solamente a comienzos del siglo XX las evidencias existentes, permitieron convencer yaceptar universalmente la existencia de enfermedades causadas por bacterias y esto se debe a lasnumerosas y excelentes aportaciones de E.F.Smith desde 1895.

Características de las Bacterias Fitopatógenas

Morfología: La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de bastón, la únicas excepcionesson un par de especies de Stheptomyces las cuales son filamentosas. Los bastones son más o menoscortos y cilíndricos y en los cultivos jóvenes tienen una longitud que va de 0.6 a 3.5 mm y un diámetrode 0.5 a 1.0 mm. En los cultivos viejos o en altas temperaturas los bastones de muchas especies sonmucho más largos e incluso pueden tener forma filamentosa. En ocasiones se dan variaciones de laforma de bastón en la forma de una masa, una Y o una V y otras formas ramificadas.

Las paredes celulares de la mayoría de las especies de bacterias están cubiertas por un material viscosoy gomoso que puede ser delgado (caso en el cual se le denomina capa mucilaginoso) o denso,formando una masa relativamente amplia en torno a la célula (en cuyo caso se le denomina cápsula). Lamayoría de las bacterias fitopatógenas poseen delicados flagelos en forma de filamentos que a menudoson considerablemente más largos que las células que formaron. En algunas especies bacterianas, cadabacteria presenta un solo flagelo, mientras que otras poseen un ramillete de flagelos en uno de susextremos, algunas tienen un flagelo simple o un ramillete de ellos en cada extremo y todavía otrasposeen flagelos peritrícos, es decir, distribuidos sobre toda la superficie. En las especies filamentosasde Stheptomyces, las células constan de filamentos ramificados cenocíticos (no septados), los cuales amenudo tienen forma espiral y producen conodios en cadena sobre hifas aéreas.

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Las células bacterianas presentan paredes celulares delgadas, relativamente firmes y un poco rígidasque al parecer son bastante distintas a la membrana citoplasmática interna pero que en ocasionesparece integrarse y fusionarse en la capa mucilaginoso externa o la cápsula. La pared celular incluye elcontenido de la célula y permite la entrada al flujo de nutrientes y la salida de desechos, enzimasdigestivas y otros productos emitidos por la célula bacteriana.

Todas las sustancias contenidas en el interior de la pared celular constituyen el protoplasto. Este estáformado por una membrana citoplásmica o membrana del protoplasto, la cual determina el grado depermeabilidad selectiva de las distintas sustancias que fluyen hacia el interior y desde el exterior de lacélula; por el citoplasma que es una mezcla compleja de proteínas, lípidos, carbohidratos, muchos otroscompuestos orgánicos, minerales y agua, y por el material nuclear, que aparece como corpúsculosesféricos, elipsoidales o en forma de pesas que se encuentran dentro del citoplasma.

Reproducción: Las bacterias fitopatógenas en forma de bastón se reproducen mediante el procesoasexual conocido como ‘fisión binaria’ o ‘fisión’ . Esta se produce por la invaginación de la membranacitoplasmática hacia la parte central de la célula, formando un tabique membranoso transversal, quedivide al citoplasma en dos partes aproximadamente iguales. Durante el proceso, se secretan osintetizan dos capas del material de la pared celular (continuando con la pared celular externa) entre lasdos capas de la membrana. Cuando concluye la formación de dichas paredes celulares, las dos capasse separan dando como resultado un par de células.

Mientras que la pared celular y el citoplasma están sufriendo fisión, el material nuclear se organiza enuna estructura circular en forma de cromosoma la cual se autoduplica y se distribuye por partes igualesentre las dos células formadas a partir de la célula en división.

Ecología y Diseminación: La mayoría de las bacterias fitopatógenas se desarrollan principalmentecomo organismos parásitos en las plantas hospedantes y parcialmente en el suelo como saprófitos. Sinembargo hay grandes diferencias entre especies en cuanto al grado de desarrollo en uno u otroambiente.

Algunas bacterias patógenas, tales como Erwinla amylovora que produce el tizón del fuego, producensus poblaciones en la planta hospedantes, mientras que en el suelo su número disminuye con rapidez y amenudo no participa en el avance de la enfermedad de una estación a otra. Estos patógenos handesarrollado ciclos de infección sostenidos de planta en planta, con frecuencia a través de insectosvectores y, ya sea debido a la naturaleza perenne del hospedero o a la asociación que se establezcaentre las bacterias y sus órganos de propagación vegetativa o semilla, han perdido los requerimientosnecesarios para sobrevivir en el suelo.

Algunas otras bacterias patógenas, tales como Agrobacterium tumefaciens , la cual produce de laagalla de corona, forman sus poblaciones en el interior de las plantas hospedantes, pero estaspoblaciones sólo disminuyen gradualmente cuando se liberan en el suelo. En caso de que hospedantessusceptibles se desarrollen en ese suelo durante varios años, podría liberarse una cantidadsuficientemente alta de bacterias para causar un incremento neto en su número poblacional en el suelo

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de una estación a otra. Por último otras bacterias patógenas, tales como Erwinias y Pseudomonascausantes de pudriciones blandas producen parte de sus poblaciones en el suelo.

Cuando habitan en el suelo, las bacterias viven principalmente sobre los órganos vegetales y con menosfrecuencia libre o saprofíticamente o en su mucílago bacteriano natural el cual las protege de variosfactores adversos. Las bacterias pueden sobrevivir en o sobre las semillas, otros órganos de lasplantas, insectos, etc., que se encuentran en el suelo. Sobre las plantas, las bacterias pueden sobrevivirepifíticamente en yemas, en heridas, en sus exudados o en el interior de varios tejidos u órganos queinfectan.

La diseminación de las bacterias fitopatógenas de una planta a otra o a otra parte de la misma planta, selleva a cabo principalmente a través del agua, los insectos, diversos animales y el hombre. Aúnbacterias que poseen flagelos se desplazan sólo a distancias muy cortas. La lluvia por su efecto delavado o salpicado, lleva y distribuye bacterias de una planta a otra, de uno de sus órganos a otro y delsuelo a las partes inferiores.

Género de Bacterias Causantes de Enfermedades

Los principales géneros de bacterias fitopatógenas son los siguientes: Pseudomonas, Xanthomonas,Erwinia, Agrobacterium y el anteriormente llamado Corynebacterium que se dividió en 4 génerosRhodococcus, Arthrobacter, Clavibacter y Cuitobacterium. Existen otros géneros que tambiéncausan enfermedades, entre ellos Xilella, Clostridium y Bacillus.

Síntomas Producidos por Bacterias Fitopatógenas

Manchas y tizones: Las cuales pueden aparecer sobre hojas, tallos, inflorescencias y frutos comomanchas de varios tamaños o como necrosis continuas de rápido avance (tizones). La mayoría de lasmanchas bacterianas son causadas por bacterias de los géneros Xantomonas y Pseudomonasmientras que los tizones verdaderos son causados por especies de Erwinia y Pseudomonas.

Marchitamientos vasculares: Afectan plantas herbáceas como hortalizas, cultivos mayores y aplantas tropicales y ornamentales. Entre los géneros de bacterias que producen este tipo deenfermedad se encuentran especies de los géneros Clavibacter, Curtobacterium (antesCorynebactorium), Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas.

Pudriciones blandas: Generalmente desprenden un olor desagradable por la producción de sustanciasvolátiles en el tejido, cuando éste es degradado por la bacteria. Los géneros bacterianos involucradosen este tipo de síntomas son Erwinia, Pseudomonas y Ciostridium.

Agallas y proliferación de raicillas: Las agallas se forman en los tallos y raíces de plantas infectadas,principalmente por bacterias pertenecientes al género Agrobacterium. Además está involucrado enesta sintomatología una bacteria del género Pseudomonas. La proliferación de raicillas puede serocasionada por bacterias también del género Agrobacterium y Rhodococcus .

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Cánceres: Son producidos por bacterias del género Clavibacter, Xanthomonas y Pseudomonas.

Sarnas: Estos son síntomas ocasionados por bacterias del género Streptomices principalmente.

Diagnóstico de Bacterias Fitopatógenas

La discusión del diagnóstico de bacterias fitopatógenas (Toma de muestras, aislamiento e identificación)es tomada del libro Manual de Laboratorio. Diagnóstico de hongos, bacterias y nemátodosfitopatógenos.

Toma de muestras: ¿Cuándo deben analizarse las muestras vegetales en busca de posibles bacteriasfitopatógenas? . La respuesta, evidentemente compleja, no puede ser resumida en una proposiciónconcisa y su ambigüedad es tal que resultaría obvio aconsejar: "Cuando se sospeche la existencia deestos microorganismos".

En efecto, la aparición sobre diversas partes vegetales de marchitamientos, oscurecimientos vasculares,podredumbres, enanismos, agallas o distorsiones, corresponde a un conjunto de síntomas que puedentener su orígen en causas diversas: Fisiopatías, ataques de hongos fitófagos, reacciones ante lesionesproducidas por nemátodos, por insectos y, desde luego, también por bacterias.

No obstante, hay una sintomatología clásica provocada por determinadas infecciones bacterianas en losvegetales que supone: alteraciones de los tejidos con presencia de zonas acuosas o de aspectoaceitoso, exudados y manchas o necrosis angulares.

Por otra parte, existen creencias bastante difundidas, basadas en fenómenos organolépticos, queatribuyen a las bacterias fitopatógenas un protagonismo, por lo general, inexistente. De forma másprecisa se está aludiendo al “mal olor”, desprendido por algunos vegetales enfermos, y sobre todo poraquellos que presentan una podredumbre blanda. Sin embargo, en gran número de ocasiones, la fetidezse debe a bacterias no fitopatógenas, saprófitas o parásitos secundarios, que crecen sobre tejidos yamuertos o tan viejos y débiles que estando próximos a su fin fisiológico, son incapaces de resistir elataque de otro organismo; el olor desagradable es producido generalmente por sustancias volátilesoriginadas durante la desintegración de los tejidos de las plantas cuando son atacadas por saprófitos.Por tanto, el mal olor no implica necesariamente la actuación de una bacteria fitopatógena, aunque enalgunos casos pueda ser debido a ella.

La toma de muestras constituye un pilar fundamental no sólo para la emisión de dignósticos correctos,sino también para la elaboración de cartografías que permiten un conocimiento general de los patógenosexistentes en cualquier país, de sus áreas de dispersión, de los cultivos afectados o de la intensidad desus daños. Por ello se recomienda la elaboración de fichas de campo lo más completas posible. lalocalización cartográfica de los lugares muestreados y una selección cuidadosa del material a estudiar.

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Consejos Prácticos para Recolección y Transporte de Muestras

Si bien la experiencia dictará la forma más adecuada de efectuar la toma de muestras en cada casoparticular, se van a indicar unos consejos que pueden resultar muy prácticos para la ejecución de estaactividad.

Equipo básico: La recogida de muestras de campo, sea cual sea la metodología de muestreo elegida,precisa un equipo mínimo sencillo compuesto, en la mayor parte de los casos, por los siguienteselementos: tijeras de podar, navaja, pinzas, recipiente isotérmico, guantes y protectores del calzado deun sólo uso, bolsas de papel y de plástico, papel o aluminio, etiquetas, lápices, rotuladores, fichas ocuaderno de campo, algodón y un recipiente irrompible con alcohol de 96°.

Cómo realizar el muestreo: Cuando nos encontremos en el lugar indicado para iniciar el muestreo esconveniente observar la rutina siguiente:

1. Comprobar la localización cartográfica realizando las anotaciones pertinentes en las fichas ocuaderno de campo. Deberán quedar bien reflejados todos los antecedentes planta/anomalía y en estesentido los agricultores de la zona, al conocer la historia del campo y del inicio de la enfermedad, seránuna fuente de información muy valiosa. Podría significar gran ayuda para realizar el muestreo en elterreno y orientar los análisis de laboratorio, el saber, por ejemplo, si se ha aplicado algún tratamientocuyos residuos resulten nocivos en el cultivo actual, si las siembras se han efectuado en el momentooportuno, si han existido condiciones ambientales; lluvias, tormentas- relacionabas con la aparición oexpansión de la enfermedad o si las primeras plantas afectadas presentaban características comunes(determinada variedad, lote de semillas, procedencia).

Las fichas de campo son aconsejables que se adapten a un modelo único, hecho que no impediráampliar determinadas informaciones de acuerdo con problemas específicos.

2. Realizar una toma de muestras representativa de todos los síntomas de la enfermedad que incluya, deforma preferente, los estados iniciales de infección.

Esta recomendación resulta válida incluso en muestreos prefijados estadísticamente en los que, sinprejuicio de ser efectuados según el protocolo, se adjuntará como anexo la muestra recogida en lascondiciones señaladas.

El proceso de toma de muestra deberá realizarse con toda meticulosidad pues una selección incorrectapodría llevar a diagnósticos equivocados.

Con el fin de evitar problemas que suelen presentarse al realizar las observaciones y análisis delaboratorio, indicamos que las anomalías sintomatológicas se apreciarán mejor si se comparan conmaterial sano recogido en el mismo estado de crecimiento y los aislamientos se obtendrán con másfacilidad si las muestras no presentan estados avanzados de descomposición. Por ello, en el campo, silos síntomas observados son manchas y necrosis en hojas o frutos, deberán seleccionarse hojas y

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frutos, incluso de plantas vecinas a una fuertemente atacada, que tenga zonas acuosas o puntostranslúcidos, ya que estas áreas necróticas son lugares con baja densidad de inóculo para intentar losaislamientos y, además están normalmente colonizadas por saprófitos: cuando se aprecienmarchitamientos de hojas y/o tallos, o un oscurecimiento del sistema vascular, se recogerá, si es posible,la planta entera puesto que puede haberse producido un bloqueo de los vasos del xilema y noencontrarse el patógeno en la parte de la planta con síntomas (así un aislamiento del agente productordel chancro bateriano del tomate, Clavibacter mchiganense subsp, michiganensis no va a lograrsefácilmente a partir de vasos muy atacado debido a las migraciones del patógeno); en los casos dechancros y desecamientos la muestra tendrá que incluir el borde de la lesión y varios centímetros detejido sano, pues lo más probable es que el patógeno ya no exista en los tejidos viejos o cancerosos (sise intenta analizar un brote quemado de peral para averiguar un posible ataque de Erwinia amylovora,agente productor del fuego bacteriano, se detectará con más facilidad a varios cm de distancia delfrente desecado); cuando se trate de podredumbres blandas, ya sean plantas o tubérculos, sólo seconseguirá un aislamiento relativamente fácil a partir de muestras casi sanas; indicamos también que enlos tumores o agallas bien desarrolladas no existen patógenos y sólo cuando son muy jóvenes puedeencontrarse en su interior la causa de su formación.

Empacar de forma adecuada cada muestra con su etiqueta de identificación correspondiente

Las muestras para análisis bacteriológicos suelen introducirse en bolsas de plástico y, dado que estematerial crea condiciones ambientales favorecedoras de la multiplicación de saprófitos indeseados, esimportante que antes de su empaquetado estén libres de humedad superficial. Se aconseja, siempreque sea factible, sustituir el plástico por papel aluminio. Además no deberá utilizarse plástico (las bolsasde papel son más aconsejables) cuando se envuelvan tejidos con síntomas de podredumbre blanda ocon alta probabilidad de sufrir alteraciones de ese tipo, como ocurre con la papa y las cebollas.

Para una mejor conservación de las muestras, recomendamos guardarlas en neveras portátiles o, por lomenos, mantenerlas protegidas de calores excesivos y desecaciones que se originan, por ejemplo,cuando se dejan expuestas a pleno sol.

Evitar cualquier peligro de contaminación. Así cuando las raíces formen parte de una muestra deberáimpedirse que la tierra manche al resto de la misma, para ello conviene colocar una bolsa de plásticocerrada alrededor de las raíces y de la parte inferior del tallo e introducir todo a continuación en unasegunda bolsa. Si una muestra incluye agallas radiculares debe procurarse no dañarlas, puesto que secontaminarían probablemente con saprófitos del suelo.

Al terminar de recoger cada muestra es preciso desinfectarse con alcohol las manos y todos aquellosinstrumentos que pudieran haber estado en contacto con agentes nocivos. Esto se hace tanto paraevitar la contaminación de nuevas plantas y la diseminación de las enfermedades como paraprotegernos ante un posible patógeno humano. Si se ha actuado con guantes de plástico y protectoresdel calzado habrá que recogerlos en una bolsa para su posterior eliminación.

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Tratamientos previos

Cuando las muestras lleguen al laboratorio deberán colocarse entre 2°- 5° C, hasta el momento derealizar los correspondientes análisis. En caso de muestras con podredumbre blanda se efectuará loantes posible para evitar la proliferación de organismos secundarios. Si se trata de manchas foliarespuede procederse a herborizar parte de la muestra, sirviendo así como fuente de referencia al sobrevivirmuchas bacterias meses o años en material desecado guardado a temperatura ambiente.

Si las muestras van a ser enviadas a otro laboratorio es fundamental empaquetarlas adecuadamentepara que sufran el menor deterioro posible. Como hemos dicho envolviéndolas en papel de aluminio,normalmente, llegan en unas condiciones óptimas. Si el envío incluye casos de patógenos invasoresradiculares, conviene lavar algunas de las muestras dejándola libre de tierra y eliminando el exceso dehumedad mediante un secado con papel de filtro; otra parte irá con tierra adherida por si fuese precisorealizar el aislamiento del suelo, pero procurando siempre que la tierra no manche el resto de la planta.

Bases del Diagnóstico

Antes de proceder a un análisis bacteriológico, en especial cuando no se tiene experiencia con lamuestra problema, es importante recabar la máxima información bibliográfica sobre las fitobacterias quepueden atacarla. Se cataloga así una serie restringida de microorganismos. A continuación deberárealizarse una segunda selección en concordancia con la sintomatología observada.

Estos pasos previos no se hacen con el fin de emitir un diagnóstico sintomatológico, sino para sacar elmáximo partido de las experiencias que legan los investigadores y obtener resultados certeros con unmínimo esfuerzo. Por esta razón se aconseja que una vez efectuadas ambas selecciones, con la ideapreconcebida de la posible causa de la enfermedad (uno o dos patógenos normalmente), se procedasegún se especifica en capítulos sucesivos.

Si los métodos que se utilizan en un proceso de identificación fueran similares o muy parecidos seríamás correcto hacer un análisis general y, de acuerdo con el mismo, emitir un diagnóstico. Pero losmétodos, lo mismo que los patógenos, son diferentes. Como por ejemplo podremos citar análisis detubérculos de la patata: en nada se parecen los protocolos que deben seguirse para detectar eidentificar las bacterias causantes de podredumbres blandas con los de Clavibacter michiganensesubsp. sepedonicum productor de la podredumbre anular de la patata.

En éste capítulo se indican de forma general, los pasos previos y los procedimientos que con mayorfrecuencia se emplean para un diagnóstico. Su lectura y comprensión constituyen una baseimprescindible en cualquier tipo de análisis.

Información Inicial: Al encontrarnos en una época en la que el empleo de nuevas técnicas de análisispermite modificar la actual clasificación bacteriana y el aislamiento de nuevos patógenos, se haceindispensable recabar la máxima información actualizada sobre las posibles bacterias que pueden atacara la muestra problema.

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Para facilitar los diagnósticos más usuales se han recopilado en la tabla siguiente, las bacterias que conmayor frecuencia afectan a diversas especies vegetales.La nomenclatura que normalmente se emplea es aquella que figura en la “Approved list of bacterialnames” (SKERMAN et.al.; 1980). Debemos señalar que en la tabla no están todos los que son, sinosólo los patógenos más frecuentes, y aún así se ha omitido, en algunos casos, bacterias que tienen unagama muy grande de hospedantes, como pueden ser causantes de tumores o de podredumbresblandas. Tampoco se citan bacterias que se encuentran en todas partes y normalmente no producendaños, pero que, en determinadas ocasiones, especialmente cuando las plantas crecen o se almacenanen condiciones inadecuadas, pueden convertirse en “patógenos oportunistas”, así ocurre con agentespectinolíticos que se localizan normalmente en el suelo, en las raíces, o en la superficie de lashojas.(Pseudomonas marginalis, P. virídiflava, P. fluorescens, Erwinia spp.)

Se mencionan, sin embargo, algunos patógenos clasificados recientemente, como el agente causante dela “Enfermedad de Pierce” de la viña, o el productor del “Corkeyroof” de la lechuga, aunque la gamade sus hospedantes, al igual que otros aspectos de su ciclo biológico, no está todavía determinada.

Una vez enumerados los posibles patógenos se deberá procederse a su selección, de acuerdo con lasintomatología inducida en las plantas, sin olvidar que en lugares o microclimas determinados puedenaparecer síntomas no citados en la literatura y que un mismo síntoma puede tener orígenes muydiversos. A modo de ejemplo, y limitándonos exclusivamente a bacteriología, citamos los casos dePseudomonas syringae pv. syringae, P. s. pv. phaseolicola y Xanthomonas campestris pv.phaseolí Productores todos ellos de manchas grasas en hojas de frijol.

Selección del material y de los puntos de análisis: Si se quiere efectuar con rapidez un diagnósticose deberá seleccionar correctamente la parte o partes de la muestra que vayan a analizarse, siendo lasideales aquellas que presenten un único tipo de población: la patógena.

Para ello se precisa disponer en el laboratorio de material fresco con síntomas de ataque incipiente. Sila muestra contiene material descompuesto, es vieja, procede de suelo, o se ha empaquetado húmeda,pueden encontrarse muchos saprófitos que dificulten o impidan el aislamiento del patógeno, no sólo porsu desarrollo más rápido, sino también por su capacidad competitiva que origina luchas biológicas nodeseadas en placas de cultivos. El simple lavado de la muestra con agua del grifo, su introducción enhipoclorito sódico al 0,5% durante dos o tres minutos seguido de un lavado con agua, o el paso de unalgodón embebido en alcohol y un ligero flameado, ayudará a eliminar los saprófitos superficiales. Conuna desinfección excesiva se corre el riesgo de destruir a la vez saprófitos y patógenos. Se comprendeque cuando se busca un patógeno en una mancha foliar deberán tan solo realizarse ligerasdesinfecciones (incluso un simple lavado con agua), mientras que si la localización es en el interior devasos podrá llegarse a la introducción directa de pequeños trozos de muestra en alcohol y su paso porla llama. Contrariamente la desinfección no podrá realizarse cuando se busquen patógenos sobre lassuperficies (por ejemplo, cubierta de las semillas). A veces resulta práctico efectuar los análisis con ysin desinfección.

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Como lugar o lugares de análisis se elegirán aquellos en los que se sospeche una multiplicación inicialdel patógeno. Si se observan, por ejemplo, manchas sobre las hojas, se buscará en primer lugar laexistencia de pequeños puntos, de tipo acuoso preferentemente y tal vez sólo observables al trasluz,que se seleccionarán, aunque se realicen otros análisis sobre manchas más desarrolladas. En caso denecrosis en tallos, puede resultar práctico analizar independientemente tanto los límites superior einferior de la necrosis visible, como diversas zonas colindantes de apariencia totalmente sana, debido aque el frente de avance de la bacteria puede encontrarse a varios centímetros del lugar donde seobservan los daños, tal ocurre, como ya se ha dicho, en los casos de Erwinia amylovora en su ataquea brotes de rosáceas.

Estas dificultades para la localización del patógeno pueden solventarse mediante un examenmicroscópico de los diversos tejidos. Así, en los casos de manchas, basta coger un pequeño fragmentode las misma, colocarlo en un porta objetos con una gota de agua y después de taparlo con uncubreobjetos, observarlos a 400 u 800 aumentos; se podrá apreciar como una masa bacteriana fluye yse difunde en el agua a partir de la sección del tejido. Cuando se trata de análisis vasculares, convieneseparar y presionar cuidadosamente los vasos para permitir que las bacterias salgan de su interior,observándose de forma similar. Si bien este examen microscópico es importante, la simple detección'de células bacterianas no es suficiente para un diagnóstico. Por una parte, las bacterias puedenconfundirse con restos de células de la planta o con gránulos de almidón o clorofila y, por otra parte, laobservación microscópica no permite diferenciar saprófitos de patógenos.

Extracción bacteriana: Una vez seleccionados los lugares de análisis, para conseguir que las bacteriasabandonen las células de la muestra, se procede a disgregar los tejidos de la planta en un medio líquido.Este proceso deberá realizarse de la forma más aséptica posible, si bien la técnica de extraccióndependerá del tipo de tejido y el lugar en que se encuentre ubicado el patógeno.

Con frecuencia, especialmente en casos de manchas foliares la disgregación se realiza colocando lostejidos en cajas de Petri (a ser posible de vidrio) y partiéndolos finamente con la ayuda de bisturíes.Otras veces, por ejemplo para extraer patógenos del interior de semillas, se procede a la molienda delas muestras. Como medio líquido a menudo se utiliza agua estéril pero en algunas ocasiones es precisorecurrir a determinados tampones o caldos nutritivos que facilitan la extracción y multiplicación delmicroorganismo.

El paso de las bacterias al medio líquido se favorece al agitar los recipientes, placas, matraces, o vasos,que contienen las mezclas; el tiempo óptimo de maceración es variable según el proceso que se realice.Así, por ejemplo, en análisis de semillas cuando se buscan bacterias en su interior, es frecuenteproceder a triturar las muestras en molinos y mezclar la harina resultante con un medio líquido. En estecaso, no es necesario, ni conveniente, que la muestra permanezca tiempo en remojo, pues la finura de latrituración permite el paso casi instantáneo de las bacterias al líquido, por lo que la permanencia de laharina en remojo va a favorecer sobre todo la multiplicación de saprófitos. Contrariamente, cuando lassemillas no se trituran y las bacterias deban salir por sí mismas del interior de las cubiertas el tiempo queprecisan es mucho mayor e incluso puede ser necesario emplear un medio líquido tamponado que evite

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las alteraciones del pH además de efectuar siembras progresivas del mismo para determinar el tiempoóptimo de remojo.

Siembra, interpretación de cajas y aislamientos: Antes de sembrar debe comprobarse que en lascajas con medio de cultivo no existan contaminaciones. Es fundamental que la superficie del medio notenga agua libre, ya que la mayor parte de las bacterias puede desplazarse nadando, forma un tapiz deorganismos entremezclados en lugar de colonias separadas. Normalmente, si el medio no se ha vertidomuy caliente y las cajas se han dejado secar a temperatura del laboratorio, en 24 o 48 horas están encondiciones de uso. Ante una necesidad urgente se forzará el secado, para lo cual se colocan abiertasboca abajo durante 20 o 30 minutos en estufa a 400C o bien se dejan el mismo tiempo abiertas enposición normal, dentro de una cámara de flujo laminar.

Para efectuar la siembra se deposita sobre la capa de agar, con ayuda de pipeta Pasteur, asa deinoculación u otro instrumento adecuado, una gota de líquido procedente de la maceración de lostejidos, y se extiende sobre la superficie del medio formando estrías en 4 direcciones perpendiculares.Esta operación puede efectuarse con el asa deslizándola suavemente en posición vertical sobre lasuperficie del medio; el asa se quemará y enfriará (tocando por ejemplo la superficie del agar entre lasestrías) antes de efectuar las extensiones en una nueva dirección, con el fin de favorecer la aparición decolonias separadas. Todo el proceso debe realizarse en máximas condiciones asépticas evitandocualquier corriente de aire incluidas las que origina el operario con sus movimientos.

Una vez sembradas las cajas se ponen a incubar en posición invertida, para evitar condensacionesindeseables de agua en la tapa a una temperatura normalmente comprendida entre 25 y 27°C, aunqueen ocasiones, por ejemplo, con determinadas bacterias corineformes, resultan más apropiadastemperaturas inferiores de 21 a 23 °C. Si se sospecha que el organismo que se va buscando puedetardar en aparecer (tal como Clavibacter michiganensis subsp. sepedonkum, Xanthomonasampelina, Xanthomonas fragariae) es aconsejable sellar las placas con papel poroso y elástico. Seconsigue así una menor desecación del medio, al mismo tiempo que se protegen de la entrada de ácarosu otras posibles contaminaciones.

Las placas de Petri ya sembradas deberán examinarse diariamente, observando y anotando la aparicióny las características de las colonias. Estos detalles van a proporcionar una clave para emitir u orientar eldiagnóstico. Así las colonias macroscópicas visibles a 24- 36 horas suelen corresponder a sapráfitosmientras que la mayor parte de las Pseudomonas fitopatógenas y los distintos patovares deXanthomonas campestris producen colonias visibles a simple vista a las 48-72 horas. Cuando seespera la aparición de organismos de crecimiento lento es aconsejable utilizar una lupa para ayudar a sudetección y recorrer visualmente tanto el lugar donde se ha depositado la gota, como las diversasestrías. Así pues, el primer dato que hay que anotar es el tiempo de aparición de las colonias y, ensucesivas lecturas, otros detalles como su diámetro variable desde fracción de milímetros a varioscentímetros, forma (reticulares, ovaladas, irregulares, con bordes enteros, ondulados, estrellados, llanassobre el agar, levantadas, acuminadas, lisas o rugosas), color (opacas, translúcidas u opalescentes).Estas anotaciones morfológicas se refieren a colonias que se encuentran bien separadas e idealmentecreciendo en cultivo puro. Sin embargo, el hecho real es que muy pocas veces se consigue éste y la

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interferencia de la flora acompañante es un obstáculo. El patógeno deberá ser el organismopredominante en la placa de aislamiento. Si esto no ocurre, y sobre las placas aparece todo unmosaico bacteriano, el intentar localizar el tipo de colonias correspondientes al patógeno es comobuscar una aguja en un pajar. Nuestro mejor consejo es que se efectúen nuevas siembras. Cuando enlas placas se observe la presencia de colonias sospechosas de pertenecer al patógeno, entremezcladascon sapráfitos, de tal forma que no se localicen colonias solitarias, conviene tomar unas cuantascolonias, diluirlas en agua estéril y efectuar una resiembra con objeto de garantizar la pureza de losaislamientos y comprobar la fidelidad de las anotaciones.

Entre la flora acompañante que aparece con mayor frecuencia figura Erwinia herbicola. El aspectoinicial de sus colonias puede recordar al de algunos Pseudomonas, pero al crecer produce un exudadode aspecto mucoide con un pigmento amarillo o naranja no difusible que la asemeja a un Xanthomonasu otro patógeno. También se presentan a menudo saprófitos con colocaciones amarillas o rojizas(pigmentos carotenoideos) o con pigmentaciones verdes fluorescentes en medios deficientes en hierroque pueden corresponder a Pseudomonas patógenos o no patógenos.

Como se ha dicho, el examen de las cajas orienta el diagnóstico pero además, algunas veces, essuficiente como tal. Supongamos, por ejemplo, que se han analizado unas plantas de tomate, laslecturas de los 3 primeros días han llevado a describir diferentes tipos de colonias, y al revisarlasnuevamente se observa la presencia de abundantes colonias amarillas puntiformes que surgen entre lasestrías. Casi con toda certeza se puede diagnosticar Clavíbacter michiganensis subspmichiganensis., más si los síntomas observados sobre las muestras coinciden con los originados poreste patógeno. Otro resultado que al observar las plantas puede obtenerse es que las anomalíasobservadas no se deben a un agente bacteriano. Para afirmar esto debe tenerse mucha seguridad enlos análisis, siendo tal vez más prudente afirmar que no se han logrado aislar bacterias fitopatógenas.En ocasiones al estudiar las características de algunos aislamientos pueden indicarnos que se trata deuna fitopatógena, por ejemplo, Pseudomonas syringae. Sobre esta bacteria, u otras que tienen unafase de vida epífita, se quiere llamar la atención por el hecho de que no es suficiente la simplelocalización de colonias aisladas para atribuirle la causa de una enfermedad. Insistimos en que elpatógeno debe figurar entre los organismos predominantes en las placas de aislamiento. Es por tantonecesario, después de todo lo dicho, considerar en la lectura de las placas de análisis la concentraciónde colonias bacterianas de un supuesto patógeno para continuar con la identificación y centrar eldiagnóstico.

El aislamiento de la colonia deberá realizarse tocándola ligeramente con la punta de una agujaenmangada y sembrando una estría en un tubo con agar inclinado o en otra caja de Petri. La ventaja deutilizar placa es que ahorra manipulación de tubos, pudiendo una misma caja servir para variosaislamientos. Llamamos la atención sobre esta forma de actuar que, aunque no es realmente ortodoxa,puede resultar práctica, pero existe el peligro tanto de mezcla de aislamientos como de competencia delos mismos por el medio nutritivo. La forma más correcta de realizarlos y al mismo tiempo estudiar lascaracterísticas de las colonias, es coger las que se localizan solitarias, suspenderlas en agua estéril yresembrar. Ello va a permitir comprobar la pureza del cultivo, hecho imprescindible cuando se hanusado medios selectivos, puesto que aunque en la placa se observen colonias perfectamente aisladas

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pueden contener entremezcladas células de otras bacterias cuyo desarrollo se ha inhibido, pero semantienen viables. Por otra parte conviene señalar que la morfología de las colonias puede sufrirvariaciones estables o inestables, y que los pigmentos se ponen de manifiesto en medios concretossegún la edad de los cultivos y el estado nutricional, lo cual puede dificultar el encaje de esas coloniasen un "patrón taxonómico" concreto.

Selección de cultivos bacterianos: Dado que hoy en día la identificación bacteriana implica realizaruna serie de test, más o menos fiables, pero largos y laboriosos en todo momento, resulta más prácticonormalmente, iniciar los ensayos comprobando en primer lugar la patogenicidad de los aislamientospara saber si el organismo aislado es el causante de la enfermedad y, en caso afirmativo, proceder a suposterior identificación.

Desde un punto de vista "teórico-real" los bioensayos deben efectuarse sobre la misma especiehospedante (e incluso cultivar) de la que se ha aislado el patógeno. Ello implica tener invernaderos, ocámaras climatizadas que permitan disponer de una amplia gama de plantas cuyo estado fenológicopuede ser importante para algunas inoculaciones. Estas exigencias constituyen un factor limitante y, engeneral, sin solución, máxime si se tiene en cuenta la necesidad tan frecuente de emitir un diagnóstico deforma rápida. En la práctica sólo en casos muy específicos y concretos, un laboratorio de diagnósticotiene planificadas y “listas para uso” las plantas hospedantes.

El problema de la provisión de plantas se soluciona parcialmente efectuando cierto tipo de ensayos, quesi bien no constituyen auténticos exámenes de patogenia, si proporcionan una ayuda inicial de gran valoren la selección previa de aislamientos. Entre los más difundidos figura el test de hipersensibilidadrealizado frecuentemente sobre hojas de tabaco; la amplia utilización de esta prueba, rutinaria en loslaboratorios, se debe a que la mayor parte de las bacterias fitopatógenas tiene la propiedad de inducirla reacción de hipersensibilidad mientras que los saprófitas no la tienen. El ensayo, tal como se realizaactualmente, es muy práctico con patógenos cuya gama de hospedantes es restringida, mientras quecarece de valor significativo ante bacterias muy polífagas, por ejemplo Agrobacterium induce tumoreso algunas Erwinias ssp. causantes de podredumbres blandas.

Otro tipo de pruebas, también de amplio uso, consiste en hacer las inoculaciones sobre fragmentos deplantas. Se aplican no sólo para comprobar el poder patógeno de cultivos puros, sino también comomedio de crecimiento más propicio o selectivo para el desarrollo de fitopatógenos que de sapráfitos;ésta última característica posibilita su empleo como fuente de aislamientos indirectos de los patógenos.

Diagnóstico e Identificación: El objetivo fundamental de todo laboratorio de diagnóstico es si unamuestra está o no enferma y cuál es la causa o causas de la enfermedad. Factores limitantes, comopueden ser el tiempo o los medios disponibles, hacen que la mayor parte de las veces los problemashaya que resolverlos emitiendo un diagnóstico presumible, por ejemplo, cuando dentro de una zonadeterminada se están presentando daños similares a otros estudiados previamente, basta con efectuaralgunas pruebas para emitir con bastantes garantías un diagnóstico que permitirá la acción contra elagente causante. La confirmación del diagnóstico, para el cual se requiere el aislamiento, lacomprobación del poder patógeno y la identificación bacteriana, se efectuará siempre que sea posible

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pero necesariamente cuando aparezca un problema ya sea en una nueva área o sobre una especiediferente. Un grado más avanzado de dificultad, que sobrepasa las posibilidades de un laboratorionormal, es la clasificación de nuevos patógenos.

Estos capítulos de bacteriología están orientados exclusivamente hacia el diagnóstico e identificación defitopatógenos que pueden aislarse en medios normales de cultivo, dejando a un lado, a pesar de suenorme importancia, otros que necesitan requisitos muy especiales para su aislamiento y cultivo, talcomo es, y por mencionar alguno, el agente productor sobre las viñas de la enfermedad de PIERCE.Xylella fastidiosa, perteneciente a un nuevo género de bacterias de reciente descripción.

Así pues, nuestras orientaciones van dirigidas al diagnóstico e identificación de las fitobacteriastradicionalmente enclavadas dentro de los géneros Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia,Pseudomonas y Xanthomonas, cuya identificación suele ser muy sencilla aunque, por supuesto, hayalgunas excepciones.

Las normas previas que se dan a continuación provienen en parte del "Bergey's Manual ofDeterminativo Bacteriology" y se basan en el estudio de ciertos caracteres fenotípicos fáciles decomprobar.

Las bacterias presentan una serie de características que por su constancia, se consideran de valortaxonómico. Entre ellas figuran el Gram, el tipo de respiración aeróbica, anaeróbica, anaeróbica-facultativa, existencia de citocromo c-oxidasa, arginina dihidrolasa o catalasa. Existen otraspropiedades, tales como la utilización o producción de ácidos a partir de azúcares, ácidos orgánicos oaminoácidos, a veces empleadas en la identificación, que pueden variar de un aislado a otro y estar enclara dependencia con las condiciones de trabajo.

Cuando se establece una clasificación es fundamental que los caracteres elegidos no sólo seanconstantes sino también que al estudiarlos se obtengan resultados claros. Sin embargo, a veces lasdudas son inevitables. Como ejemplo, se admite la existencia de un primer criterio de divisiónbacteriana en Gram (+) y Gram (-), pero ¿Qué hacer cuando el Gram es variable, o cuando aparecenaislamientos con la oxidasa incierta o débilmente positiva?. En primer lugar, hay que asegurarse que setrabaja con un cultivo puro y tener en cuenta que los resultados pueden depender, entre otros factores,de la cantidad de inóculo, de la temperatura y período de incubación, de la composición del medio o dela versatilidad de interpretación de resultados. Todo lo anterior pone de relieve la necesidad tanto dedisponer de cepas de referencia como de métodos de diagnósticos tipificados que puedan aplicarse porigual en los laboratorios. Muchos métodos para el diagnóstico de enfermedades bacterianas se basanen técnicas de detección que no requieren el aislamiento del patógeno.

Las siguientes son las normas básicas a seguir en una correcta identificación bacteriana:

• Estar seguros de la pureza del cultivo.• Trabajar de mayor a menor categoría (género, especie).• Usar toda la información disponible para limitar el rango de los patógenos.

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• Aplicar el sentido común a cada etapa.• Usar el número mínimo de tests para hacer la identificación.• Comparar los aislamientos con cepas de referencia.

Métodos Serológicos

Otra manera de realizar el diagnóstico de bacterias fitopatógenas en una determinada muestra, es através del uso de la Serología. Las técnicas serológicas permiten la detección e identificación de estospatógenos en menor tiempo que el usado por el método tradicional de aislamiento e identificación, através de pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas (ya discutido) y en forma precisa, lo quehace que estas técnicas sean de uso frecuente en los laboratorios de diagnóstico. (La discusión de estastécnicas son tomadas del libro "Manual de laboratorio. Diagnóstico de hongos, bacterias y nematodosfitopatógenos. 1991).

Características antigénicas de las bacterias: Las células bacterianas no son antígenos homogéneossino que están compuestas por numerosos antígenos, a modo de mosaico, distribuidos en la paredcelular, y en los flagelos. Por otro lado, los constituyentes de la pared celular varían según que labacteria sea Gram(+) o Gram(-). Así, las bacterias Gram(+) pueden poseer dos tipos deconstituyentes antigénicos: los debidos a la pared, de gran poder antigénico entre los que figuran algunasproteínas, polisacáridos y ácidos teicoicos. Los capsulares sólo se encuentran en aquellas bacteriasprovistas de ella, estando formados por polímeros de azúcares.

En las bacterias Gram(-), los antígenos de la pared tienen como constituyente principal, un complejopolisacarídico cuya especificidad antigénica viene en función de la naturaleza y variabilidad de lascadenas de azúcares que lo componen, no de la pared lipídica. Estos antígenos somáticos de labacterias Gram(-) se denominan antígenos-O, debido al tipo de enlace y la posición en las cadenas delos azúcares, siendo específicos de cada grupo de bacterias. Los antígenos flagelares son moléculas deproteínas fibrosas que constituyen los cilios de las bacterias flageladas y se les denomina antígenos-H,aunque los determinantes antigénicos responsables de su especificidad son desconocidos. En algunoscasos existen antígenos capsulares, aunque a veces se tratan de estructuras externas de la pared,formadas por polisacáridos altamente polimerizados. Estas sutancias son inmunógenas y en generalespecíficas de tipo.

Test de aglutinación: Al poner un antígeno en presencia de sus anticuerpos específicos se produce lacombinación entre ellos, dando lugar a la formación de un agregado, que a lo largo del proceso vahaciéndose más voluminoso y se observa más claramente al flocular en la suspensión que lo contiene.

En las soluciones acuosas, las bacterias se mantienen dispersas gracias a los grupos hidrófilos queposeen en su pared. La aglutinación se va a producir por medio de los anticuerpos específicos y susdeterminantes antígenos. Al agregar un antisuero, los determinantes antigénicos de la pared bacterianase bloquean por la fijación de los anticuerpos. Como éstos tienen dos sitios de combinación, puedenreaccionar con dos unidades bacterianas diferentes formando redes tridimencionales que dan lugar aagregados, los cuales reuniéndose por aproximación entre sí forman aglutinados más o menos

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voluminosos. Su tamaño y velocidad de formación están en función de la concentración sérica, del pH,de la temperatura, de la agitación y de la relación entre las cantidades de antígenos y anticuerpospuestos en contacto.

Este test, por su sencillez, se utiliza frecuentemente para la diagnosis y detección rápida de muchasbacterias fitopatógenas. Para su ejecución no se necesita ni gran experiencia ni aparatos complicados,sino todo lo contrario. Puede efectuarse en portaobjetos o en tubo de ensayo.

a. Aglutinación en portaobjetos: Podemos afirmar que este ensayo serológico es la prueba mássencilla de realizar de todas cuantas van a exponerse. Aunque el método fue puesto a punto porTIPOGRAF (1941) en la URSS para el diagnóstico directo de Conybacterium sepedonicum sobreplantas, no obstante no suele aplicarse actualmente a detecciones directas sobre material vegetal debidoa la elevada concentración bacteriana necesaria para poder visualizar la reacción, por lo que tan solo seutiliza con cultivos de bacterias previamente aisladas.

Una de sus múltiples aplicaciones en laboratorio la constituye su inestimable utilidad en la identificaciónde Erwinia amylovora cuyos aislados (al menos por el momento) son por un lado antigénicamentehomogéneos y por el otro muy diferentes de los de las bacterias asociadas normalmente en infeccionesmixtas con ella.

El proceso de ejecución del test es el siguiente:

• Extraer con un asa una parte de un cultivo y suspenderla uniformemente en agua fisiológica (0.85%CINA), o en tampón fosfato salino 0.05M pH 7,2, o en casos de necesidad simplemente aguadestilada estéril.

• Colocar en un porta objetos una gota de la suspensión anterior, procurando que sea densa. Enocasiones esta suspensión se prepara directamente en el porta objetos, depositando en él una gotade tampón y emulsionando el contenido de una asa con la que se ha extraído parte de un cultivo.

• Depositar próxima a la gota anterior, otra de volumen similar, de antisuero a la disolución adecuada(normalmente comprendida entre 1110 y 1150) en agua fisiológica.

• Poner cuidadosamente en contacto ambas gotas para que vayan mezclándose. Para ello se toma elporta objetos con los dedos, balanceándolo muy suavemente hasta producir el contacto entreambas (por tanto, de antígeno y anticuerpo) y dar lugar al comienzo de la reacción. Ésta se hacevisible al cabo de un cierto período de tiempo mínimo de unos 3-5 minutos. Los casos difíciles odudosos pueden resolverse con ayuda de una lupa, aunque siempre es conveniente hacerlo de estemodo.

El test debe plantearse con los siguientes ensayos:

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a. La cepa problema con el antisuero.b. La cepa problema y el suero fisiológico.c. Un testigo positivo homólogo del antisuero.

El establecimiento de este sistema tiene por objeto la comprobación de si la bacteria en estudiopresenta por sí misma capacidad de aglutinación directa con el suero fisiológico al tiempo de detectaruna posible contaminación por descuido o error del operario.

La prueba c debe efectuarse previamente para tratar de conocer la dilusión óptima del antisuero quedebe emplearse, efectuando ensayos de dilución de agua fisiológica, a escalas de 112, 114, 118, 1116,1132, 1164, etc., para una concentración del antígeno de 100 bactlml, observando el límite de dilusiónque es visible la reacción. Entonces para trabajar se elige el número de dilusión anterior al límiteencontrado antes (si por ejemplo se observa aglutinación hasta 1164, se adopta para trabajar 1132).

b. Aglutinación en tubo: Este método es más sensible que el anterior, siendo su ejecución de la formasiguiente:

• Colocar en la gradilla de 10 a 12 tubos de aglutinación o Waserman.• Depositar 1,8 ml en el primer tubo y 1 ml en los restantes, de agua fisiológica tamponada (solución

salina 0,85%), diluida 10 veces en el momento de su empleo.• Preparar la dilución adecuada del antisuero con agua fisiológica, tomando como referencia la

dilución óptima, que deberá haberse efectuado previamente.• Depositar con una pipeta 0,2 ml de la dilución del antisuero anterior, en el primer tubo, mezclando

ambas mediante succión y descargas sucesivas del líquido con la pipeta, hasta producir una mezclahomogénea.

• Pipetear 1 ml de la mezcla anterior y depositarla en el segundo tubo, repitiendo la operaciónanterior hasta su homogeneización.

• Repetir la serie de pipetos y mezclas hasta el penúltimo tubo, tirando la parte correspondiente a éstey quedando el último como control (sin antisuero).

• Depositar en cada tubo 1 ml de suspensión bacteriana de 9° bact/ml en suero fisiológico.• Mezclar bien los contenidos de los tubos para lograr una perfecta homogeneización.• Incubar los tubos a temperatura ambiente durante media hora.• Observar la aparición de la aglutinación semitransparente o blanquecina a modo de humo blanco,

siendo la última aquella en que se percibe en el interior de la mezcla depositada en el tubo.

La suspensión bacteriana anteriormente citada puede prepararse con células bacterianas, tanto vivascomo muertas. Se ha demostrado que en algunos casos, tales como las bacterias de los génerosPseudomonas y Xanthomonas, los antígenos termostables son más específicos que los termolábiles.

Por ello muchas veces resulta aconsejable coagular los antígenos termolábiles, lo cual puede llevarse acabo mediante ebullición en un baño de María de la suspensión bacteriana durante dos horas.

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Test de doble difusión de agar: Es un método de precipitación, entendiendo como tal el proceso dereacción entre antígenos y anticuerpos específicos, en que primeramente se produce una combinaciónentre ambos, formando agregados de alto peso molecular que mediante procesos físico-químicos(distribución de cargas eléctricas, etc.) dan lugar a macro-moléculas insolubles que precipitan. Estemétodo es más sensible que los de aglutinación, teniendo la ventaja de que pueden estudiarse ycompararse simultánea e independientemente varios antígenos y antisueros.

Para ello se emplazan ambos separadamente en pocillos efectuados en una capa de gel de agarosa y aldifundirse a través de sus poros y entrar en contacto entre sí dan lugar a una reacción de precipitaciónen forma de líneas visibles. La cantidad de cualquiera de los reactivos en un punto dado del precipitado,es función de dos factores principales:

a. Su concentración inicial. Una vez emplazado el reactivo en el pocillo correspondiente, comienza sudifusión en el gel en sentido radial, formándose a partir del centro un gradiente continuo pero deconcentración decreciente.

b. La velocidad de difusión en el medio. El más utilizado es el gel de agar. Siendo éste unpolisacárido extraído de algas marinas.

Es soluble en el agua a 95 °C y forma un gel cuando se enfría a 37 °C. Al gelificar, las moléculasforman poros cuyo tamaño varía inversamente a la concentración del agar. Una vez que los reactivosse difunden en el medio gelosado, se produce la reacción serológica de precipitación en aquellos puntosen que las concentraciones de antígeno y anticuerpo están en equilibrio. La banda de precipitación serátanto más marcada cuanto mayor sea la cantidad de antígenos y anticuerpos reaccionantes, siendo másnítida y precisa, sin alargarse exageradamente, cuando los reactantes estén en equilibrio.

Teniendo en cuenta que la velocidad de difusión de los diferentes antígenos y anticuerpos en el mediogelificado es variable según su tamaño, si se investiga organismos compuestos por diversos antígenos,como en el caso de las bacterias, se formarán bandas de precipitación sucesivas de manera ordenada.Por lo tanto cada banda formada determinará una estructura antigénica específica, por lo que elserotipo de la bacteria en estudio estará representado por el número total de bandas que componen lareacción, o sea la suma de estructuras antigénicas que componen la bacteria.

El test de doble difusión en agar fue descrito en 1946 y desarrollado por OUCHTER LONY (1958).La sencillez del método, al no requerir manipulaciones ni aparatos complicados, ha hecho que seaaltamente utilizado para diagnosis de numerosos agentes patógenos. Su único inconveniente es que lacantidad de antisuero utilizada es mayor que en otros métodos.

Para la correcta aplicación del método, debe tipificarse la concentración de antígeno en 109 células/mlcon objeto que las comparaciones con antígenos frente a una concentración dada de antisuero seauniforme. Algunos autores destruyen los componentes antigénicos no específicos, pasando lassuspensiones bacterianas por autoclave a 121 °C durante dos horas.

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La realización del test se lleva acabo de la manera siguiente:

• Se prepara una suspensión de agar purificado al 0,8 por 100 contenido de 0,85 por cien de CINAy 0,02 por cien de azida de sodio como conservante, en agua destilada, hasta total disolución delagar para lo cual debe hervir la solución.

• Si se utilizan cajas de Petri de 100 x 15 mm, se depositan en ellas con ayuda de una pipeta 15 mlde la solución aún caliente, dejando enfriar hasta la solidificación y cerrando a continuación la placa.

• Si se utilizan portaobjetos, éstos deben emplazarse sobre bastidores de plástico «exprofeso», bienequilibrados hasta conseguir una perfecta horizontalidad. A continuación con la ayuda de unapipeta Pasteur o similar se depositan gotas o pequeñas cantidades de solución caliente entre losbordes de los portas y el del bastidor, con el objeto de que al enfriarse gelifique y deje selladosambos entre sí. Una vez solidificado el gel de unión se deposita encima de los portas de nuevosolución caliente, con ayuda de una pipeta hasta conseguir llenar el bastidor entero, con lo que seobtendrá tras solidificación del gel por enfriamiento una capa de 1 mm de espesor. Los bastidorespueden conservarse hasta su utilización en cajas de plástico húmedas a 4 °C.

• La formación de pocillos en el gel, puede efectuarse con una plantilla agujereada según un esquemaprevisto (número de pocillos) y con ayuda de una sacabocados del diámetro a utilizar deseado.Este esquema se utiliza generalmente para caja de Petri empleando las siguientes medidas: diámetrodel pocillo 5 mm, distancia entre pocillos 10 mm.

• Si por el contrario se utilizan bastidores con portaobjetos, existe un aparato manual que efectúa elagujereado del gel de los portas asimismo según el esquema elegido. En este caso el diámetro delpocillo es de 2 mm y la distancia entre pocillos es de 6 mm.

• Una vez efectuados los cortes en el gel para conformar los pocillos, mediante una pipeta Pasteuracoplada a través de una goma a una bomba de vacío, se succionan las porciones circularescortadas, quedando así listos para poder ser llenados con los reactantes. Esta operación deextracción conviene hacerla inmediatamente antes de proceder a su rellenado.

• El esquema normalmente utilizado es el del de seis agujeros periféricos equidistantes entre sí(situados en los vértices de un hexágono) y de otro central. No obstante pueden emplearsemodelos de cuatro y ocho agujeros, según la complejidad y número de muestras a estudiar.

• En el pocillo central se deposita el antisuero que normalmente es de un volumen de 50 ul, a ladistribución conveniente.

• En los periféricos se depositan los antígenos involucrados en el estudio: la suspensión problema ysus dilusiones, los testigos, etcétera, en el mismo volumen que el anterior.

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• Cerrar las placas de Petri o bien colocar los bastidores en un chasis de tres alturas y depositarlo enuna caja de plástico con un poco de agua en el fondo para obtener una atmósfera húmeda.

• Dejar reposar a temperatura ambiente unas horas.

• Observar las bandas de precipitación formadas.

Test de Aglutinación pasiva al Látex: La realización del test se lleva a cabo en placas de perplexgrueso, recuperables, o bien en láminas finas de plástico, desechables, pero en ambos casos provistasde pocillos semiesféricos en los que se depositan los reactivos y se lleva a cabo la reacción. Diversosfactores afectan al buen funcionamiento de la técnica. En primer lugar, la concentración del antisueroinfluye en la fijación de los anticuerpos o de las inmunoglobulinas, o las partículas del látex por lo quedeberá determinarse su óptimo ya que éste es un factor considerado crítico.

En la aplicación del método se obtienen mejores resultados mediante la utilización de inmunoglobulinaspurificadas que con antisueros brutos, o simplemente purificados. No obstante hay que tener presenteque no todas las preparaciones de IgG obtenidas por precipitación con sulfato de amonio, sonigualmente efectivas para "sensibilización" de partículas de látex, debido principalmente al grado variablede contaminación con albúminas y globulinas, etc. Algunos autores observan que estos hechos notienen lugar cuando la preparación de inmunoglobulinas se lleva a cabo mediante electroforesis o porfraccionamiento por el método de Cohn, encontrado que el test resulta más específico y sensitivo.Nuestra experiencia nos muestra que una suspensión de suero-látex bien hecha permite efectuar un grannúmero de pruebas serológicas con una sensibilidad adecuada, evitando reacciones no específicas. Esteproducto es, normalmente, bastante estable si se conserva a 4 °C, al menos durante unos meses.

Laboratorios

Sintomatología: Familiarizarse con la sintomatología producida por las bacterias fitopatógenas,compara diferentes métodos de aislamiento de bacterias fitopatógenas.

1. Seleccione al menos 2 muestras sospechosas de estar afectadas por bacterias fitopatógenas,describa la sintomatología, tratando de diferenciar síntomas jóvenes, de viejos.

2. Observación del flujo bacteriano: En el caso de manchas, marchitamientos o quemazonesselecciones un pedazo de tejido foliar, córtelo asépticamente con su escalpelo, (mm.), y colóqueloen un portaobjetos, con una gotita de agua destilada y déjela por espacio de 1-3 minutos. Cubra lagota con el cubreobjetos y observe el lente de inmersión, (es necesario el uso de aceite), laaparición del flujo bacteriano.

3. Estarán a disposición del estudiante cajas de cultivos con los siguientes medios:

YCA: 10 gr. de levadura, 5 gr. de CaCO3 en 1 000cc de agua destilada, con 16 gr. de agarbacteriológico. Colóquelo en la autoclave por 15 minutos.YDCA: El mismo medio anterior agregando 10 gr. de dextrosa.

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AN: Agar nutritivo. Extracto de carne 3 gr., peptona de carne 5 gr. y 15 gr. de agarbacteriológico en 1 000cc de agua destilada.

Estas cajas serán utilizadas para realizar los aislamientos del material a su disposición, las metodologíasa usar serán discutidas en el momento del laboratorio.

Cultivo puro, preservación y mantenimiento: Para la obtención de cultivos puros, tres (3) diferentesle serán discutidos (Na = agar nutritivo, YCA = agar levadura, CaCO3 y YCDA = agar levaduradextrosa y CaCO3) la composición exacta de los mismos le fue dada en el laboratorio anterior.

1. De sus placas donde se realizó sus aislamientos iniciales, seleccione una colonia aislada sospechosade ser patogénica (creció después de 24 horas en el medio, es la más frecuente) con su asa deplatino, previamente flameada y enfriada, repita el procedimiento de estriado para nuevamenteobtener colonias aisladas, realicélo en los tres diferentes medios, dos placas de cada medio,previamente anote color de la colonia, brillo, elevación y forma, luego de dos o tres días tomenuevamente una colonia para dar inicio a su cultivo puro.

2. De las segundas placas se da inicio al cultivo puro, se le suministra tubos con agar inclinado ydiferentes medios (YCDA - YCA). Tubos con sólo agua destilada, tubos con glicerol.

3. Siembre su cultivo puro tomando las precauciones en sus diferentes tubos de agar inclinado, dostubos por cada medio por aislamiento, déjelo crecer hasta que sea visible el crecimiento de labacteria, dos o tres días, luego cúbralo con: a.- Aceite mineral, b.- glicerina; un tubo cubierto decada una de éstas maneras.

Los tubos con agua destilada serán tratados en dos formas; una dilución de la bacteria bastante túrbida(3 ml) se agrega a 4 ml de agua destilada estéril, se mezclará y se guardará.

Un último procedimiento será con la bacteria disuelta en agua destilada. Cultivo de 48 horas (túrbido).Tome tres ml y colóquelos en un tubo, luego añada la misma cantidad de glicerol y guárdelo. Todospueden ser guardados a 4 °C con excepción del tubo con glicerol que se colocará a temperaturas decongelación. El objetivo es comparar éstos 4 medios de guardar o preservar bacterias, la penúltimasemana de clases, el material será tomado y sembrado para realizar las comparaciones respectivas.

Tinción de Gram: Este tipo de tinción nos diferencia las bacterias en dos amplios grupos: Grampositiva y Gram negativa.

Gram positiva: retiene la tinción primaria dando una apariencia púrpura a negro azulosa.Gram negativa: pierde la tinción primaria y toman un color rosado suave.

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Procedimiento:

• En una lámina porta objetos limpia, coloca una gota de suspensión bacteriana (48 horas decrecimiento) y realice un frotis con su asa de platino, séquelo al aire (sin calentarlo), suavementepase por la llama la parte opuesta del porta objetos, para fijar la bacteria al porta objetos.

• Llene el frotis preparado y fijado con la solución cristal violeta por un minuto.• Lave en agua corriente el exceso (pocos segundos), drene el exceso de agua, y suavemente seque

mediante toalla de papel.• Llene el frotis (o cúbralo), con una solución de lodine por un minuto.• Lave en agua corriente por pocos segundos, séquelo.• Decolore con solvente (alcohol - etílico), por 30 segundos, seque (si el descolorizador es utilizado

por mayor tiempo, la bacteria Gram (+) puede perder color).• Lave con agua corriente por 2 segundos.• Coloque la solución de safranina por 10 segundos.• y- Lave rápidamente en agua corriente, seque y observe.

Tinción con rojo congo: Coloque una gota de rojo congo en una lámina portaobjetos, con su asa deplatino, coloque la suspensión bacteriana (48 horas de crecimiento), y mézclela con rojo congo, haga unfrotis y deje secar al aire, una vez seco el frotis agregue unas gotas de alcohol ácido (3 gotas) de talmanera que cubra bien el frotis, deje secar al aire.

Agregue una gota de aceite de inmersión y observe al microscopio con aumento de 1 00 x (lente deinmersión). KOH al 3%: coloque en el portaobjetos una gota de KOH al 3%, tome de su preparadobacteriano (caja de cultivo, 48 horas de crecimiento) con su ansa de platino, una pequeña porción debacteria y mézclela bien, tome un palillo o una aguja de disección, introdúzcala en la preparación y tratede suspenderla, si se forma una suspensión mucoide, que se suspende 0,95 cm del portaobjeto, se estáen presencia de una bacteria Gram (-), si no se forma esto, se está en presencia de una bacteria Gram(+)

Pruebas de Patogenicidad: Antes de realizar las pruebas bioquímicas o paralelamente a las mismas,debemos tener la seguridad de que estamos trabajando con un patógeno de plantas, para lo cual laspruebas de patogenicidad y el reaislamiento nuevamente de las colonias bacterianas es una necesidad.Antes de entrar en materia debemos recordar que las bacterias a diferencia de numerosos hongos nosecretan sustancias que disuelven la cutícula de la planta, no emiten haustorios u otros. Las bacteriassólo pueden penetrar en forma pasiva, algunas lo hacen a través de aperturas naturales como estomas,hidátodos y lenticelas, otras a través de heridas o daños sufridos por la planta. Las bacterias nopenetran la pared celular o crecen dentro de las células de la planta hospedante, ellas crecen en losespacios intercelulares o en los sistemas vasculares.

Tipos de Inoculación: Para conocer si nuestra bacteria es patogénica, pueden realizarse diferentestipos de inoculación, aspersión de la bacteria sospechosa es un método muy usado y efectivo, conaquellas enfermedades bacterianas que producen manchas, ya que por lo general éstas son bacteriasque penetran por las aperturas naturales, como lo es el caso de la Xanthomonas y muchas

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Pseudomonas, pero es una metodología poco eficaz en el caso de bacterias que penetran por heridasy provocan pudriciones, aquí deberá emplearse cualquier metodología que involucro heridas, pinchadocon la bacteria, inyección, heridas cortantes con material embebido en la bacteria, macerado concarborudum y la bacteria en suspensión y luego frotamiento de las hojas, en fin existen muchasposibilidades. En nuestro laboratorio combinaremos: aspersión y heridas a las hojas con alfileres,cubriendo de este modo todos los patógenos posibles.

La planta a usar: Deben estar en estado de crecimiento, jóvenes, con buen follaje y deben eliminarsecualquiera que presente anomalías, síntomas de deficiencia, etc., deben ser regadas y abonadasregularmente.

Preparación del inoculo: El inóculo debe provenir de cultivos puros con 24 - 48 horas decrecimiento, con una concentración 103 - 105 cél/ml para aspersión y de cerca de 106 cél/ml cuando esinyección, se disuelve en agua destilada, o en solución buffer fosfato con pH 7.0, debemos tener encuenta que concentraciones muy elevadas de inóculo causan síntomas atípicos, por lo general necrosisseca alrededor del sitio de inyección, los síntomas típicos bacterianos son por lo general en su etapainicial acuosos (water soaking), esos síntomas atípicos se presentan como una respuesta de defensa dela planta, y pueden confundir al investigador, Al principio nuestro interés es de que las plantas seenfermen, para conocer si nuestra bacteria es patogénica, pero luego nos interesa repetir exactamentelos síntomas producidos en condiciones de campo.

Post - Tratamiento: Mantendremos las plantas por un período de 24 - 48 horas en cámara húmeda(100%) después de la inoculación, para asegurar las mejores condiciones a la penetración de lasbacterias.

Aspersión: Existen numerosos aparatos que pueden ser utilizados, desde una bombita de barbero,hasta un atomizador de alta presión, en pruebas de campo asperjadoras cumplen un buen trabajo y esrecomendable la inoculación en la tarde (6 pm) para darle a las plantas al menos 12 horas de mayorhumedad, una inoculación en el campo en la mañana (8 am) seguida de unas 10 horas de sol continúaestá condenada al fracaso.

Observación de las plantas: Las plantas deben ser observadas diariamente por un tiempo de 14 días,en los cuales se comparan con los controles, plantas inoculadas solo con agua, o con un contaminantebacteriano.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

AGRIOS, G. 1978. Plant Pathology. 2 ed. Academic Press. New York. 703 p.

JAUCH, C. 1985. Patología Vegetal. 3 de. El Ateneo. Buenos Aires. 320 p.

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Manual para Patólogos Vegetales. 1985. Common Wealth Mycological Institute. Kew SurreyEngland. 438 p.