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AGROBIOTECNOLOGÍA

Curso 2018

BACTERIAS FITOPATOGÉNICAS

Adrián Vojnov

Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. Cesar Milstein"-

CONICET

Fundación Pablo Cassará

Sumario

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Bacterias fitopatógenas Regulación de factores de virulencia

Estrategias para desarrollar resistencia a

bacterias mediante ingeniería genética

- Genes de resistencia

- Quorum quenching Referencias

Interacciones planta-bacteria

La planta y su sistema defensivo

Interacciones planta-bacteria

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.

Interacciones

planta-bacteria

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Eventos de señalización

que regulan la interacción planta-bacteria

- La planta atacada no puede proveer los requerimientos

. necesarios para la multiplicación del patógeno (resistencia

. de no-hospedante)

- La planta posee defensas estructurales o bioquímicas

. preformadas. Sólo los patógenos especializados

. completan una infección exitosa

- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la

. planta y el patógeno resulta restringido en la zona inicial

. de la infección (resistencia específica)

- Las condiciones externas cambian y el patógeno muere

. antes de llegar a una etapa en que la infección es

. irreversible

- Las condiciones externas son desfavorables

- Las defensas preformadas son inadecuadas

- La planta no detecta al patógeno y por ende no se producen

. respuestas defensivas inducidas (o se producen tardíamente)

• Se produce enfermedad cuando:

La interacción

planta-bacteria

no siempre

determina el

desarrollo de

una enfermedad

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

• No se produce enfermedad cuando:

La especificidad

del patógeno

bacteriano y de

los genes de

resistencia de

la planta

determinan

diferentes tipos

de interacción

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.

Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr

del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia

de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)

El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940) El modelo gen

por gen explica

los casos de

compatibilidad de

incompatibilidad

planta-patógeno

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.


Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

El sistema inmune en plantas

1) Inmunidad inducida por moléculas asociadas al patógeno (PTI):

Receptores de membrana (PRRs) que reconocen MAMPS o PAMPs. Ej.

Flagelina.

2) Inmunidad inducida por efectores del patógeno (ETI):

-Directo reconocimiento a través de NB-LRR proteínas (R)

ETI es una respuesta tipo PTI pero acelerada y amplificada que induce

resistencia y en general HR

Modelo de zigzag que cuantifica la respuesta de defensa

Jones and Dangl, 2006 nature. 444: 323

Localización

de proteínas

de resistencia

y esquema

de sus

dominios

funcionales

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:

hipótesis de la “proteína guardiana”

Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.

Interacción

Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)

en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1


Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.

Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos

comprendidos en una respuesta inducible

Respuesta

defensiva

- Engrosamiento de la pared celular

- Inducción de genes involucrados en la síntesis

de metabolitos secundarios

- Síntesis de tioninas

- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa

a patógenos

- Síntesis de ácido salicilico Inducción de Resistencia

Sistémica Adquirida (SAR)

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Las respuestas

defensivas

inducibles por

patógenos

comprenden

diversos

mecanismos

moleculares

Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.

Genes involucrados en resistencia local a patógenos

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

Genes involucrados en resistencia sistémica a patógenos

Las Bacterias y los PAMPs (pathogen-

associated molecular pattern) Inducen el cierre

estomático

Bacterias y PAMPs

Bacterias fitopatogenas

Bacterias fitopatógenas

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Las TOP 10

bacterias

Fitopatógena

s segun MPP

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.

Pseudomonas syringae pv.

tomato

Mansfield et al., Mol Plant Pathol.

2012 Aug;13(6):614-629.

Ralstonia solanacearum


Agrobacterium tumefaciens


Xanthomonas oryzae (oryzae)


Xanthomonas campestris pathovars


XANTHOMONAS AXONOPODIS

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis


Infección por Xanthomonas axonopodis (cancro de los cítricos)

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.

Síntomas de cancrosis en fruto, hoja y ramas de un Citrus.

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 ;13(:614-629.

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwini

a%20amylovora.pdf

Erwinia amylovora

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwinia amylovora.pdf

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwinia amylovora.pdf

Dickeya (dadantii and solani))


Candidatus Liberibacter-Huanglongbing

Diaphorina citri

Xylella fastidiosa


Principales componentes de la ultraestructura

de una bacteria fitopatógena típica

Esquema de

una bacteria

fitopatógena

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Microscopía electrónica de barrido de células

de Pseudomas syringae adheridas a la

superficie de un fruto de peral. Pueden

observarse las fimbrias que sirven como

elementos de unión.

500

nm

Microscopía

electrónica

de una

célula de

Pseudomonas

con flagelos

lofotricos

Microscopía

electrónica

de una

célula de

Xhantomonas

con un flagelo

polar

Bacterias fitopatógenas

Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Ciclo biológico

de una bacteria

fitopatógena

con fase epífita

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando

de los estomatas de hojas de cerezo infectadas

Microscopía de barrido de la superficie

del envés de una hoja de peral.

Se observan numerosas bacterias

colonizandola cavidad subestomática

Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales

Bacterias fitopatógenas observadas al microscopio de barrido

2 m

Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996. Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)

y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci

en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.

Microscopía electrónica de Xanthomonas

campestris colonizando una hoja

de Brassica. Las bacterias están

generalmente rodeadas de un polisacárido

extracelular (EPS) y proliferan en estrecho

contacto con las paredes celulares (CW)

La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula en el espacio extracelular o en el tejido vascular

A B A B

Micrografías de bacterias fitopatógenas

Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

SIDEROFOROS

EXOPOLISACARIDOS

EXOENZIMAS

BACTERIOCINAS

FITOHORMONAS

GENES

hrp

FITOTOXINAS

BACTERIA

Factores bacterianos requeridos

para la patogenicidad

Sistemas de secreción en bacterias gram negativas

Genes hrp

Büttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22B%C3%BCttner%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bonas%20U%22%5BAuthor%5D

Conocidos efectores de Xanthomonas y otros fitopatogenos

Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43

Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43

Código de unión al ADN de los efectores TAL

Heidi Scholze and Jens Boch. 2010. Virulence 1:5, 428-432

Las Bacterias y los PAMPs (pathogen-

associated molecular pattern) Inducen el cierre

estomático

Bender et al., MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS,1999, p. 266–292

Fitotoxinas producidas por Pseudomonas spp

-Las células guardianas pueden percibir a las bacterias y para ello el

receptor FLS2

-Para evitar la respuesta inmune que involucra a las células guardianas la

bacteria produce factores de virulencia específicos que le permiten reabrir

los estomas como una estrategia importante de patogenicidad.

-Los estomas, como parte de un sistema inmune integral, actúan como

barreras de infecciones bacterianas.

Los estomas entonces….

Regulación de factores de virulencia

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Quorum sensing

• Mecanismo de comunicación comunitario detectado

. para diversas especies de bacterias

• Capacidad de los microorganismos de percibir y

. responder a la densidad poblacional a través de la

. producción de moléculas difusibles de reducido peso

. molecular

Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)

Un gran número

de bacterias

Gram– se

comunican

sintetizando,

secretando y

respondiendo a

compuestos

difusibles

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Regulación génica dependiente de la densidad poblacional

El incremento de una población bacteriana determina una

elevada concentración de factores difusibles

Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.

Modelo simplificado de la transducción

de señales en quorum sensing

Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales

difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R

(rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa

entonces como regulador transcripcional, alterando su afinidad por secuencias

promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .

El mecanismo

de quorum

sensing es

mediado por

moleculas

difusibles

como las acil-

homoserin

lactonas

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Regulación de factores de virulencia

en Ralstonia solanacearum

Modificado de: Scel, Annu. Rev. Phytopathol.,2000.

Componentes

de la red

sensorial de

regulación

en Ralstonia

solanacearum

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Regulación en Xanthomonas campestris

Gentileza de J. Maxwell Dow

Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias

Autoinduccion de DSF sintesis

De

Factores de virulencia

Baja produccion de DSF

No sintesis de factores de virulencia

Alta densidad celular

DSF

HisK

HD-GYP

H-

D-

D- Rec

RpfC

RpfG

HisK

HPt

Rec

HD-GYP

H-

D-

H-

D- Rec

RpfC

RpfG

RpfF

Baja densidad celular

No/bajo DSF

DSF

HPt Rec

H

RpfF

Sínthesis de enzimas extracelulares ,

síntesis de EPS

Formación de biofilm

Motility

HD-GYP

D- Rec RpfG

di-GMP Cíclico

di-GMP Cíclico

Formación o dispersión

de Biofilm

Degradación enzimática

Reduce los niveles de di-GMP cíclico

Ryan et al 2006. PNAS 103: 1123-1134.

Exopolisacáridos

Xantano

Glucano cíclico b-1,2

Estructura del Xantano

Cepa silvestre Cepa mutada

Evaluación de síntomas

D

Days after inoculations

Ba

cte

ria

l g

row

th (

Lo

g c

fu/c

m2)

0 1 2 3 4 3

4

5

6

7

8

9

8004

8397

8396

Ba

cte

ria

l g

row

th

(L

og

cfu

/mg

fre

sh

we

igh

t)

2 3 4 0

4

1

2

3

8004

8397

8396


A

B

C D

El xantano son requeridos para la infectividad de Xanthomonas en N. benthamiana y

Arabidopsis

Xantano water

24 hours later Cepa mutada Cepa mutada


Bac

teri

al g

row

th (

Lo

g c

fu/c

m2)

3

4


4 0

Bac

teri

al g

row

th

(L

og

cfu

/mg

fre

sh

we

igh

t)


0

4

1

2

3

4 2

5

6

7

8

9 water+8004

xanthan+8004

water+8397

xanthan+8397

water+8396

xanthan+8396

water+8004

xanthan+8004

water+8397

xanthan+8397

water+8396

xanthan+8396

Xantano induce susceptibilidad a Xcc en

N. benthamiana yArabidopsis

Cepa silvestre EPS defective mutant

H2O

Xantano

El Xantano Suprime la deposicion Calosa

Yun et al., 2006. Plant Physiology 141:178-87

• El Xantano induce susceptibilidad en la planta

mediante la supresión de la deposición Calosa

• La respuesta asociada a la pared celular parece

ser una barrera la infección de Xanthomonas

Yun et al., 2006. Plant Physiology 141:178-87

ORDEN-DESORDEN

Estructura ordenada: Hélices rígidas

Estructura desordenada: Hélices flexibles

Grupos ACETILO

Favorecen la estructura ordenada

Interacciona con el backbone: uniones no covalentes

Estabilizan la molécula de xantano.

Grupos PIRUVATO

Cargas negativas

Repulsión con residuos GlcAc

Su remoción favorece una estructura ordenada y moléculas más compactas.

XANTANO

Estructura-Función

Glucano cíclico b-1,2 en

Xanthomonas

Glucano Agua

24 hours later Cepa silvestre Cepa silvestre


El Glucano cíclico b-(1,2) induce susceptibilidad en la planta

Wild type Mutant


ndvB+


Bacte

rial g

row

th (

Lo

g c

fu/c

m2)

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 0

8004 ndvB-

ndvB+

8004 ndvB- ndvB+

Hours

PR1

rRNA

Wild type ndvB-

6 12 24 48 6 12 24 48 6 12 24 48

La mutante ndvB posee reducida virulencia

Rigano et al., Plant Cell. 2007. (6):2077-89

Glucano Agua

ndvB ndvB ndvB ndvB

local local systemic systemic

Pre-treatmento con glucano : efecto local and sistémico

Water Glucan

Local Local Systemic Systemic

PR1

rRNA

Water-treated

plants

Glucan-treated

plants

Cyclic b-(1,2)-Glucan Acts in Systemic Suppression of Plant Immune

Responses

Rigano et al., Plant Cell. 2007. (6):2077-89

14C

(cp

m/c

m2)

200

300

400

500

600

700

800

Incubation times (hours)

0

20

40

60

80

100

120

0 0,5 6 12 24 48

Infiltrated leaves Distant leaves

La movilización del glucano en la planta induce susceptibilidad sistémica

14C-Glucano

Bacteria: organismo unicelular

Biofilm de bacterias: comunidad

•Biofilm

Ventajas de hacer un biofilm:

• Se protegen del medio ambiente (matriz)

• Disponen mas fácilmente de los nutrientes

• Cooperación entre especies (microconsorcio; sintrofismo)

• Adquisición de nuevas características genéticas

Estadios en el desarrollo de un biofilm bacteriano

Sauer 2003. Genome biology 4: 219

•Microscopio confocal •Lab-Tek® Chamber Slides

•Biofilm de Xanthomonas estudiado utilizando microscopia confocal

•Wt MM

•Day 5

Xanthomonas axonopodis pv. citri

gum prt Genes biosíntesis DSF

Slater et al., Mol Microbiol. 2000 38(5):986-1003.

Regulación de factores de virulencia en

Xanthomonas campestris

RpfG

H

RpfC

eng

gum prt Genes de virulencia rpfF rpfB

Genes de biosíntesis de DSF

- +

Estímulo ambiental?

DSF

¿DSF?

MI

ME

H

D

P D

RpfH

Día 2 Día 4

Xcc wt

rpfF

rpfC

Cepa silvestre

Cepa EPS-

Cepa silvestre Cepa defectiva en la

produccion

ee EPS

Xanthomonas citri

Flagella structure in Gran negative bacteria

(flgE)

(fliC)

Confocal microscopy analysis of biofilm

Malamud et al, 2011

Xac

(XY)

Mgum

B

(XY)

Proyección ZX

Proyección ZY

Proyección ZY

Proyección ZX

WT

0

2

4

6

8

0 1 2 3 4 7

WT

MgumB

Days after inoculation

0 1 2 3 4 7

0

0

C

8

Po

pu

lati

on

siz

e

(lo

g c

fu/c

m2)

2

4

6

Xac

Supervivencia epifítica

Biofilm en superficie de la

hoja

Rigano et al, Mol Plant Microbe Interact.

2007

Biofilm en el cancro

Rigano et al Molecular Plant-Microbe Interaccion, 2007

In vitro In vivo

Florencia Malamud

Rafael Homem

Alexandre Morais do Amaral

CNPq-CONICET

collaborative grant

Analisis de adesión de las mutantes por el

método de cristal violeta

Malamud et al, Microbiology 2013 Sep;159(Pt 9):1911-9

La mayoría de las mutantes están reducidas

en virulencia

Malamud et al, Microbiology. 2013 Sep;159(Pt 9):1911-9

La Motilidad es necesaria en el desarrollo

de un biofilm maduro

Swimming Swarming/

Sliding

Malamud, et al, Microbiology. 2013 Sep;159(Pt 9):1911-9

Caracterización de la mutante hrpM

Wt 306 hrpM c-hrpM

Malamud et al Mol Plant Pathol. 2012 Dec;13(9):1010-8

El gen hrpM codifica la glucano

sintetasa

ß-1,2 glucano

ß-1,2 glucano


La mutante hrpM esta reducida en la formacion de biofilm y patogenicidad


Caracterización de la mutante

ntrC

ntrC posee reducida capacidad

en desarrollar biofilm y

quimiotaxis

ntrC esta reducida en virulencia

dependiendo del modo de inoculación

La formacion de un biofilm maduro requiere:

•Expresión de genes regulados por rpf/DSF y producción de

xantano

•Xantano es importante en la formación de biofilm, en el

crecimiento epifitico y dentro de los cancros.

•La movilidad dependiente del flagelo es requerida en la formación

del biofilm maduro.

•El glucano cíclico ß-1,2 es importante en la formacion biofilm

•NtrC regula la sintesis de flagelo, quimiotaxis y motilidad

Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Cre

cim

ien

to b

acte

ria

no

[lo

g u

fc/c

m2)]

Días después de la inoculación

Control Transgénico BS2

Xcv (+ avrBS2) Xcv (+ avrBS2)

La expresión del gen BS2 en tomate confiere

resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria

Tomado de: Tai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.

Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.

C

control

transgénicas

control

transgénicas

Resistencia a la

infección de

Xanthomonas oryzae pv.

oryzae en plantas

transformadas con el

gen Xa21

A: cultivar Minghui 63-12

B: cultivar IR72-82

La interferencia

de la

comunicación

entre bacterias

es una posible

estrategia

de resistencia

antimicrobiana

Posibles blancos y estrategias para interferir en la

comunicación entre bacterias (quorum quenching)

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Mecanismos que afectan la regulación

mediada por homoserin lactonas

Reconocen las A - HSLs

producidas por otros org.

Homólogos de proteína Lux - R

No producen A - HSLs

Salmonella enterica

( patógeno humano )

Organismos A - HSLs oportunistas

Afectan sistema de quorum

sensing

Diferentes compuestos Plantas superiores

( arroz , arveja, etc)

Se unen a receptores de A - HSLs

Inhiben quorum sensing

Furanonas halogenadas Delisea pulchra

Moléculas imitadoras de las A - HSLs

Degrada A - HSLs A - HSLs lactonasa

Gen aiiA

Bacillus sp. 240B1

Degrada A - HSLs Actividad aminoacilasa Variovax paradoxus

Función Molécula Organismo

Enzimas degradadoras de A- - HSLs

Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.

Transformación de plantas de papa con el gen

de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.

Cortes transversales de tubérculos de papa

inoculados con Erwinia carotovora.

A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.

A la derecha: tubérculo de planta transformada con el

gen aiiA.

Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.

Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA

Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas

Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.

Las plantas

que expresan

N-acil-homo

serin lactona

exhiben

mayor

resistencia

a Erwinia

carotovora

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

A BA B

A: detalle de una hoja

de una planta

transgénica infectada

con Erwinia carotovora

B: hoja de una planta

luego de la infección

Porcentajes de

infección observados

para dos líneas

transgénicas (barras

verde y anaranjada) y

de una planta control,

no transgénica (barra

violeta).

1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and

García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco

confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal,

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of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.

Referencias

Resistencia

a bacterias

fitopatógenas

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