rekombinant dna teknolojisi ve genomik - kisi.deu.edu.trkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/genetik muh...

C H A P T E R

PowerPoint® Lecture by:

Melissa Rowland-Goldsmith

Chapman University

3

Rekombinant DNA

teknolojisi ve

genomik

Çeviri: Aslı Sade Memişoğlu

© 2013 Pearson Education, Inc.

Başlıklar

• 3.1 Rekombinant DNA teknolojisi ve

klonlamaya giriş

• 3.2 İyi bir vektörün özellikleri

• 3.3 İstenilen gen nasıl tespit edilir ve

klonlanır?

• 3.4 Rekombinant DNA teknolojisinde

laboratuvar teknikleri ve uygulamalar


3.1 Rekombinant DNA teknolojisi ve

klonlamaya giriş

• 1970’ler: gen klonlama gerçek oldu

– Klon – bir molekül, hücre veya organizmanın

aynısının üretimi

• Tüm bunlar

– Restriksiyon enzimleri – DNA kesen

enzimler (moleküler makaslar)

– Plazmid DNA vektörleri – kendi kendini

eşleyebilen halkasal DNA

Keşfi ile mümkün oldu

• Bu moleküller farklı DNA parçalarını klonlamak için

kullanılabilir



klonlamaya giriş

• Restriksiyon enzimleri

– Genellikle bakterilerde bulunur

– Bir DNA zincirinde yanyana nükleotitler arasındaki

fosfodiester bağını kopararak DNA’yı keser.

– DNA’da, restriksiyon bölgesi, denilen belirli dizileri

tanır, bağlanır ve keser

• Her restriksiyon bölgesi palindromdur – karşılıklı

zincirlerde her yönde aynı şekilde okunur

– 4 veya 6 baz çifti kesen farklı restriksiyon enzimleri

vardır


• Restriksiyon enzimleri bakterinin kendi DNA’sını

neden kesmez?


klonlamaya giriş

Restriksiyon

enzimi

EcoRI

EcoRI

metilaz

Restriksiyon

enzimi

EcoRI

EcoRI metillenmiş

DNA’yı kesmez

Metillenmemiş

DNA

Metillenmiş

DNA

Metillenmemiş

DNA

EcoRI

restriksiyon

bölgesi

Yapışkan uçlar

Kesme



klonlamaya giriş

• Restriksiyon enzimleri

a. Bazılarının DNA’yı kestiği uçlarda tek zincirli uzantılar

kalır – yapışkan uçlar

b. Bazılarının kestiği noktalar çift zincirlidir – küt uçlar

Yapışkan uçlar

Yapışkan uçlar

Küt uçlar

kesim

kesim

kesim

• EcoRI aşağıdaki diziyi keser mi?

• 5'CTCGAGTTCGAG3'

• 3'GAGCTCAAGCTC5'© 2013 Pearson Education, Inc.


klonlamaya giriş



klonlamaya giriş

• Yapışkan uçlar oluşturan enzimlerin avantajı– Klonlamada tercih edilir çünkü yapışkan uçlara sahip

DNA parçaları kolay birleşir – tek zincirli uçlar birbirleriyle hidrojen bağı yapar

Yapışkan uçlar

Küt uçlar kendiliğinden

hidrojen bağı yapmaz

Yapışkan uçlar ve küt uçlar

Yapışkan uçlar, kendiliğinden H-bağ yapar

Bir sonraki birleşme adımını kolaylaştırır



klonlamaya giriş

• Plazmid DNA – genellikle bakterilerde bulunan

küçük halkasal DNA

• Kromozom dışı DNA olarak adlandırılırlar çünkü

bakteri kromozomu daışında ayrıca

sitoplazmada bulunurlar

• 1 – 4 kb (kilo baz) arasında küçük moleküllerdir

• Kromozomdan bağımsız olarak kendilerini

eşleyebilirler

• Vektör olarak kullanılabilirler – yabancı DNA’yı

kabul eden, taşıyan ve çoğaltan DNA parçaları.

Rekombinant

DNA oluşturmak


1) Restriksiyon enzimi DNA’yı kendi

tanıma bölgelerinden keser

2) Yapışkan uçlu DNA parçaları

oluşur

3) Aynı restriksiyon enzimiyle

kesilmiş iki farklı DNA parçası bir

araya geldiğinde baz eşleşmesi

yapar

4) Birleşen parçalar çizgisel veya halkasal

)plazmid gibi) moleküller oluşturabilir.

5) DNA ligaz enzimi, iki DNA parçasını

birleştirir. Sonuçta İnsan DNA’sı ve plazmid

DNA içeren bir rekombinant DNA oluşur

İnsan

DNA’sı

EcoRI restriksiyon

bölgeleri

Yapışkan uç

Yapışkan uç

Yapışkan uçlar H-

bağ yapar

Başka bir kaynaktan

DNA – bakteri

plazmidi

Ligaz enzimi

ile DNA

belkemiklerin

in kovalent

birleşimi

Bakteri

plazmid

DNA’sı

İnsan

DNA’sı



klonlamaya giriş

• Bakteri hücrelerinin transformasyonu

– Yabancı DNA’yı bakteri içine sokmak için yöntemler

– Kimyasal

• Bakteri hücreleri kalsiyum klorürle muamele edilir (hücre

duvarında delik açar)

• Buz üzerindeki bakteri hücreleri ile DNA karıştırılır

• Karışım ısıtılır

• Rekombinant DNA bakteri içine girer, kopyalanır ve

proteinleri üretir.

– elektroporasyon

• Yüksek voltajlı elektrik kısa sürelerle bakteri hücrelerine

uygulanır (hücre duvarında delik açılır)



klonlamaya giriş

Transformasyon sonrası rekombinant bakteri

seçilimi

– Seçilim: Rekombinant plazmid DNA’yı içine almamış

bakterileri transforme olmuş bakterilerden ayırma işlemi.

Antibiyotik seçilimi – Plazmid DNA üzerinde bulunan

antibiyotik direnç geni hangisi ise, bakterileri o antibiyotik

ile büyütmek.

Böylece plazmidi içine almamış bakteriler antibiyotik

direncine sahip olmadıkları için ölürler. Yaşayanlar sadece

Plazmidi içeren bakteriler olur

https://www.youtube.com/watch?v=MIfDx417SDs

https://www.youtube.com/watch?v=MIfDx417SDs


Plazmid içine DNA klonlama

Antibiyot

ik direnç

geni

Yabancı DNA

İlgilenilen bölge

Yapışkan

uçlar

Hibridizasyon

+DNA ligaz

Transformasyon

Bakteri

hücresi

Bakteri

kromozomuBakteriler antibiyotik içeren

besiyerine ekilir

Sadece rekombinant DNA’yı

içeren bakteriler büyür

Klonlar

Kültür

DNA

ayrıştırılır



klonlamaya giriş

İnsan genlerinin klonlanması

• Rekombinant yöntemler kullanılarak üretilen ilk protein insülin, ikincisi ise büyüme hormonudur.

• İnsan insülin geni bir plazmide klonlandı ve bu plazmid bakteriye transforme edilerek proteinin yüksek miktarlarda üretilmesi sağlandı.


3.2 İyi bir vektörün özellikleri

• DNA klonlama vektörlerinin genel özellikleri– Büyüklük – Konak hücre kromozom DNA’sından

ayıracak kadar küçük olmalı. Fakat yabancı DNA’yı kolay klonlayacak kadar büyük olmalı

– Replikasyon başlangıç noktası (ori) – DNA eşlenmesini başlatmak için gereken özel DNA dizisi – böylece konank hücre kromozomundan bağımsız olarak kendini eşleyebilir

– Çoklu klonlama bölgesi (MCS) – farklı rest. enzimleri için tanıma bölgeleri – seçenekleri çoğaltır

– Seçilim genleri – antibiyotik gibi

– RNA polimeraz promotor dizileri – Transkripsiyonun gerçekleşmesi için gerekli



• Vektör tipleri

– Bakteri plazmid vektörleri – 7 kb’den küçük parçalar

klonlanabilir

– Bakteriyofaj vektörleri – 25 kb’ye kadar

– Kozmid vektörleri – 20 -40 kb

– İfade vektörleri – protein üretimi

– Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) – 100-300 kb – büyük

DNA parçalarının dizilemesi için kullanışlı

– Maya Yapay Kromozomları (YAC) – 200kb-2mb – küçük

ökaryot kromozomu

– Ti vektörleri – bitki hücrelerine aktarım için



• İnsan insülin proteinini bakteri ifade

vektörü ile bakteride üretmek istiyoruz,

• Bunun için insan genomik DNA’sını

doğrudan kesip vektöre klonlandığında

bakteri insülini üretmedi. Neden??? – Genomik DNA intron içerir ama bakterilerin intron –

ekzon kes yapıştırma enzimleri yoktur

• Ne yapmak gerekir?– Daha önce ekzonları birleştirilmiş halde bir DNA vermek

gerekir.

– mRNA alınır, ters transkripsiyonla DNA’ya çevrilir,

çoğaltılır – PCR tekniği


3.3 İstenilen gen nasıl tanımlanır ve

klonlanır?

• Polimeraz zincir tepkimesi

– 1980’lerde geliştirildi – hücre dışı DNA sentez yöntemi

– Belirli bir DNA dizisinin kısa sürede pek çok kopyasını

üretmek için bir teknik

– Yöntem

• Çoğaltılacak DNA, nükleotitler (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),

tampon ve DNA polimeraz bir tüpe eklenir.

• İleri ve geri primerler eklenir – çoğaltılması istenilen bölgeye

özgü tamamlayıcı küçük DNA parçaları (20–30baz

uzunluğunda)

• Tüp, termal döngü cihazı (PCR cihazı) olarak adlandırılan

cihaza yerleştirilir ve tepkime gerçekleşir.


Kalıp DNA



klonlanır?

• PCR (devam)

– PCR cihazı DNA’yı bir dizi tepkimeden geçirir – PCR

döngüleri

– Her döngü 3 basamaktan oluşur

1. Denatürasyon (ayrılma) – 94 °C - 96 °C ısıtma

2. Birleşme (hibridizasyon) – Primerler 55 °C - 65 °C’de

hedef DNA dizisindeki tamamlayıcı bazlarla H-bağı

yapar

3. Uzama – DNA Pol hedef DNA’yı 70 - 75 °C’de kopyalar

– Her döngü sonunda DNA miktarı 2’ye katlanır

– Aynı döngü 20–30 defa tekrarlanır


PCR bileşenleri PCR tepkimesi (1 döngü)

DNA örneği Primerler Nükleotitler

DNA polimeraz Tampon PCR tüpü

Termal döngü cihazı

1 PCR döngüsü

1. Denatürasyon

2. Yapışma

3. Uzama

Zincirler ayrılır

Primerler kalıba bağlanır

Yeni zincir sentezlenir

• https://www.youtube.com/watch?v=V2JYy

6-DE9c


https://www.youtube.com/watch?v=V2JYy6-DE9c



klonlanır?

PCR avantajları:

• Kısa bir zaman içinde çok az bir başlangıç

örneğinden milyonlarca kopya DNA üretir

• 1 molekül DNA ile başlanan bir PCR

tepkimesinin sonunda kaç kopya olduğunun

hesaplanması: 2N N: döngü sayısı



klonlanır?

• Uygulamalar

– Gen ifadesi çalışmaları

– Bakteri ve virüs enfeksiyonlarının tespiti

– Genetik hastalık tanısı

– Olay yerinde bulunan az miktarda dokudan elde edilen DNA’nın tespiti

– Fosillerden elde edilen DNA tespiti

– Tarımda tohum saflığının belirlenmesi

– Sistematik ve evrim çalışmalarında (doğadaki çeşitli canlı

türlerinin tanısı, türler arasındaki farklılıkların

belirlenmesinde)


3.4 Rekombinant DNA teknolojisinde laboratuvar

teknikleri ve uygulamalar

Protein üret ve yapı ve

işlevini araştırSaflaştırılmış proteini

antikor veya aşı üretimi

İçin kullan

Klonlanmış genin

kromozom üzerindeki yerini

belirle, gen kopya sayısı ve

yapısını araştır

Gende mutasyon

oluştur ve değişen

işlevi araştırGen yapısı, dizisi, organ, doku ve

hücrelerde ifadesini araştır

Gen işlevini çalışmak için

transgenik hayvanlar üret

İnsanlara verilmek üzere proteini

yüksek miktarlarda üret

Gen tedavisi

Genetik veya bulaşıcı

hastalık teşhisi

Adli tıpta

kullanım

GDO üretimi

Toksik atıkları

temizlemek için

bakteri

İlaca

dirençli

tarım

ürünleri


3.4.1 Agaroz jel elektroforezi

• Agaroz Jel Elektroforezi: DNA parçalarını büyüklüklerine göre ayırıp

görüntülenmesini sağlayan teknik

• Agaroz bir tür algden elde edilir

• Toz halindeki agaroz bir tampon çözeltisinde eritilir ve yatay tanka

dökülür.

• Donduğunda, küçük deliklere sahip olan yarı katı jel halini alır.

• Bu delikler arasından DNA geçer.


– Jelde DNA’nın ilerleyebilmesi için jel, elektriği ileten

bir tampon çözelti içine batırılır

– DNA örneği, kuyucuk denilen jel üzerindeki çukurlara

yüklenir

– Elektrik uygulanır

• DNA eksi yüklüdür – Neden?

• Dolayısıyla + kutupa doğru hareket eder

• Büyük parçalar deliklerden zor geçtiği için yavaş ilerler.

Küçük parçalar daha hızlı ilerler.

– DNA arasına yerleşen boyalar sayesinde UV ışık

altında görüntüleme yapılır ve fotoğraf çekilir.



2000

1500

1000

500

basepairs

A

B

C

M Digest

• Şekilde görülen DNA bantlarının büyüklüğü nedir?

https://www.youtube.com/watch?v=KKmiKKMDDhY

https://www.youtube.com/watch?v=59aIHlUoNQs

https://www.youtube.com/watch?v=KKmiKKMDDhY

https://www.youtube.com/watch?v=59aIHlUoNQs



Farklı

boylarda DNA

parçaları

Katot

Anot

Güç

kaynağı

DNAya bağlanan bir

boya ile boya

(etidyum bromür)

Bantları UV ışın

altında ışıma ile

görüntüle

Büyük

parçalar

Küçük

parçalar

Bitmiş jel

jel

Kuyucuklar

Be

lirte

ç D

NA

Ke

silm

em

iş D

NA

Ke

silm

em

iş D

NA

Be

lirte

ç D

NA


– Klonlanmış geni bir veya daha fazla restriksiyon

enzimi ile keserek, kesme bölgelerinin yerlerinin

belirlenmesi

– Restriksiyon haritasını bilmek daha küçük DNA

parçalarını klonlamada faydalı olur.

– Sonrasında bu küçük parçaların dizilemesi yapılır.

– Protokol:

a.DNA tek veya çift restriksiyon enzimiyle kesilir

b.Agaroz jel elektroforezi ile DNA ayrılır

c. Parçalar harita çıkarmak üzere sıralanır.

3.4.2 Genin restriksiyon haritası


*** Not: Artık biyoinformatik yöntemler kullanılmaktadır

3.4.2 Genin restriksiyon haritası

Restriksiyon haritası

Parça büyüklüğü (kb)

Kesilmemiş DNA

Bam HI ile

kesilmiş DNA

PST I ile

kesilmiş DNA

Bam HI + Pst I

ile kesilmiş DNA


3.4.3 DNA dizileme

– Klonlanmış bir genin nükleotit dizisinin kontrol edilmesi

önemlidir. Neden?

• Amino asit dizisi, gen yapısı, düzenleyici diziler, mutasyonlar

bilinir

– Zincir sonlanma yöntemi (Sanger yöntemi)

• Dizisi belirlenecek DNA parçası PCR tepkimesine alınır fakat

zincirin sonlanmasına neden olan floresan boyalı ddNTP

nükleotitleri kullanılır

– Yeni nesil DNA dizileme yöntemleri daha uzun

parçaları daha kısa sürede dizilemeye olanak

sağlamıştır

– https://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWjDwes

https://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWjDwes


FISH

• İlgilenilen genin kromozomdaki yerini ve kopya sayısını belirleme yöntemi– Yöntem:

• Kromozomlar hücrelerden ayrıştırılır ve lam üzerine yayılır.

• İlgilenilen gene tamamlayıcı bazlar içeren kısa DNA/RNA parçalarına (prob) floresan moleküller bağlanır ve bu lamların üzerine eklenir

• Prob kromozom üzerindeki tamamlayıcı nükleotitler ile birleşir (hibridizasyon)

• Floresan ışık altında bu bölgeler görüntülenir.

3.4.4 Floresan in situ hibridizasyonu


• Karyotip analizi yapılır

• Floresan ışımanın birden fazla kromozom üzerinde görülmesi ne demektir?

• FISH genetik hastalıkların belirlenmesinde kullanılır

• FISH, belirli bir mRNA’yı hangi hücrelerin ürettiğini anlamak için de kullanılır

3.4.4 Floresan in situ hibridizasyonu

Prob DNA

floresan boyanır

Denatürasyon ve hibridizasyon

Denatüre olmuş

kromozom DNA

Boyanmış prob

• Belirli bir lösemi tipindeki mutasyonun

belirlenmesi

• BCR ve ABL genleri kanser durumunda

birleşir (kırmızı ve yeşilin birlikte görülmesi


• Hücrelerde belirli bir mRNA’nın

görüntülenmesi


3.4.5 Gen ifadesini çalışmak

• Belirli bir doku veya hücreler tarafından üretilen mRNA’nın

analiz edilmesi gerekir

• Ters transkriptaz PCR

• Yöntem:

– mRNA hücrelerden ayrıştırılır ve bundan cDNA (komplementer

DNA) üretmek için ters transkriptaz enzimi kullanılır

– Ters transkriptaz RNA’dan DNA kopyalayabilen bir enzimdir.

– Daha sonra bu DNA PCR tepkimesi için kullanılır.

– İlgilenilen mRNA için primerler kullanılır

– Ürünler agaroz jelde görüntülenir

– Bir doku veya hücredeki ifade düzeyleri anlaşılır


Su örneklerinde toksoplazma tespiti


• Son yıllarda PCR tepkimelerinde cihazların hassas

ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, gerçek zamanlı (real-

time) PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin

gelişmesine neden olmuştur.

• “Real-time” PCR’da ürünlerin analizi tepkime sırasında

yapılmaktadır.

• Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının

mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin

uygulanmasına gerek kalmamaktadır.

• “Real-time” PCR ürünlerinin niteliksel ve sayısal

analizlerinde, floresan boyalardan yararlanılmaktadır.



– Gen mikroçipleri bir doku veya hücre tarafından

belirli bir anda ifade edilen tüm genleri analiz

etme olanağı sağlar

– Küçük bir cam mikroskop lamı kullanılır– Küçük DNA probları bu lam üzerine bilgisiyar kontrolündeki bir

robot tarafından mikro noktalar halinde sabitlenmiştir.

– mRNA’dan cDNA üretilir ve floresan ile boyanır

– Lam üzerine konulan örnek, eğer tamamlayıcı problar varsa,

onlarla hibridize olur

– 10,000 DNA noktası bulunabilir

– Lazer ile analiz yapılır

– Floresan ışıma genin ifade edildiğini, ışıma miktarı ise azalma

artışları belirtir



Kontrol örnek Deney örnek

mRNA ayrıştırma

Ters transkripsiyon,

floresan işaretleme

Eşit miktarda karıştır

ve hibridizasyon

Erken

tümör

Geç

tümör


– Normal ve hastalıklı dokular karşılaştırılarak

hangi genlerin hastalığın ilerlemesinde etkili

olduğu anlaşılabilir

– Bu sayede yeni ilaçlar ve hedef genler

belirlenebilir



3.4.6 Gen mutasyonu çalışmaları

– Bir gen tarafından kodlanan proteinin işlev ve yapısını

anlamak için kullanılır.

– Klonlanan bir genin tek bir nükleotitinde istenilen

değişiklik yapılabilir

– Daha sonra bu gen hücrelerde ifade edilir ve bu

mutasyonun etkisine bakılır.

– Böylece proteinin işlevi için hangi nükleotitlerin önemli

olduğu anlaşılır.

– Bu sayede hastalıklarda yer alan proteinlerde neyin

yanlış olabileceği bilgisi edinilir.


3.4.7 RNA müdahalesi

– Gen ifadesini engelleyen küçük RNA molekülleri –normalde zaten hücreler tarafından üretilirler

– Bu RNA parçaları günümüzde istenilen genin susturulması için kullanılmaktadır

rekombinant dna teknolojisi ve genomik - kisi.deu.edu.trkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/genetik muh...

Documents