REKOMBNANT DNA TEKNOLOJS RECOMBINANT DNA TECHNOLOGYDo.Dr.Mustafa ERAYMANMustafa Kemal niversitesi FEF BYOLOJ

TERMNOLOJ Rekombinant DNA: Doal olarak bir arada bulunmas mmkn olmayan DNA molekllerinin birletirilerek yeni bir kombinasyonun oluturulmasdr. Krosover ilemi ile de rekombinant DNA oluturulsa da rekombinant DNA ok farkl biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA molekllerinin birletirlimesi anlamnda kullanlr.

Genetik Deiimler nsanlar binlerce yldr dier canllarn genetiini deitirmilerdir. Bitki ve hayvanlarn yapay seleksiyonu

Doal proses Mutasyon, crossing over

Genetik Mhendislii Rekombinant DNA teknolojisi bakteri ve virslerle yaplan almalarda gelitirilen genetik teknikleri ve nkleik asit biyokimyas metotlarn birlikte kullanr. Rekombinant DNA teknolojisi bir genin snrsz miktarda izolasyonu iin gl bir aratr. Bu teknikteki temel ilemler:

1. Doku ya da hcrelerden DNA izole edilir. 2. DNA molekllerini zgl dizilerinden tanyp kesen Restriksiyon endonkleazlar ya da Restriksiyon Enzimleri (RE) ile kesilir. 3. RE ile kesilip oluturulan DNA paralar vektr ya da tayc molekl ile dier DNA molekl birletirilir. DNA paras yerletirilmi vektr bir Rekombinant DNA molekldr. 4. Oluturulan rekombinant DNA molekl bir konak hcreye aktarlr. Bu sayede binlerce kopya (klon) retilir. 5. Konak hcre kendisini elerken yabanc DNA molekln de oaltarak yavru hcrelere aktarr ve koloniler oluturulur. 6. Klonlanm DNA konak hcrelerden izole edilerek incelenebilir. 7. Potansiyel olarak klonlanm DNA transkripsiyona urayabilir, mRNAs translasyona ynlendirilebilir, gen rn izole edilebilir ve aratrma iin ya da ticari olarak satlabilir.

Genetik Mhendislii Genler izole edilir, modifiye edilir ve bir organizmaya yerletirilir. Rekombinant teknoloji ile mmkn olur. DNA kesilir ve paralar birletirilir Modifiye edilen paralar oaltlr

RESTRKSYON ENZMLER Hamilton Smith Haemophilus influenzaenn bakteriyofajlardan kendilerini nasl savunduklarn almlardr. Viral DNAy paralayan bir enzime sahip olan bakteriler kefedilmitir. Bugne kadar 200den fazla RE enzimi tanmlanmtr. RE enzimleri zgl DNA dizilerini tanyarak keser.

lk tanmlanan RE enzimi E.coliden elde edilen EcoRI (Eko-r-bir) olmutur.

RE enzimleri DNAy 4 - 12 sayda nkleotid dizisini spesifik olarak tanyp keser. Bu kesim ileminde baz enzimler kt ulu DNA paralar olutururken, bazlar da yapkan ulu DNA paralar olutururlar.

Kesilmi DNA Paralarnn Yaptrlmas Vektr ile DNA paras ayn enzimle kesilir. Rekombinant DNAy oluturacak ekilde bir tpe braklrlar. DNA ile vektr birbirine yaprlar. eker fosfat iskeleti birleme noktalarnda kaynama meydana gelmez. Bu ksmlarn birlemesi iin DNA ligaz enzimi kullanlr.

Rekombinant DNAlarn Klonlanmas ve oaltlmas

Rekombinant DNA transformasyon yoluyla konuku hcrelere aktarlr, Konuku iinde vektr kendi kopyasn oluturur, Yabanc DNAnn da kopyas oluturulmu olur, Ayn klondan binlerce koloni oluturularak byk miktarlarda rekombinant DNA oaltlm olur.

Vektrler Klonlanacak DNA Parasnn Taycsdrlar

Vektrler tayc DNA moleklleridirler, bu nedenle vektr olarak grev yapabilmesi iin baz zellikleri tamas gerekmektedir.

1. Kendini ve tad DNA molekln bamsz olarak replike edebilmelidir. 2. Vektr zerinde pek ok RE enzimin sadece bir krlma blgesi olmaldr. Bu blge RE ile kesilerek, ayn enzimle kesilen baka bir DNA parasnn bu blgeye sokulmas iin kullanlr. 3. zerinde seilebilir bir belirleyici tamaldr. Belirleyici, vektr tayan konak hcreleri vektr tamayan konak hcrelerden ayrmak iin kullanlr. 4. Konakdan kolayca izole edilebilir olmaldr.

Rekombinant DNA Klonlanmasnda Kullanlan Vektrler1. 2. 3. 4. 5. 6. Plazmid Klonlama Vektrleri Lambda ve M13 Bakteriyofaj vektrleri Kozmid vektrler Mekik vektrler YAC vektrleri BAC vektrleri

Plasmid Klonlama Vektrleri: Bakteriyel plazmidler, bakterilerde kromozomlara ilave olarak bulunan dairesel ekilli kk DNA moleklleridir. Kromozomlardan bamsz olarak kopyalanrlar. Bu zellikleri ile DNA oaltmada kullanlrlar.Antibiyotie diren geni tarlar, Rekombinant plazmitleri ayran seici bir sisteme sahiptir. (LacZ), 20 kbden byk DNAlar iin kullanl deildir, Klonlama blgesi ok sayda restriksiyon enzimi tanmaktadr. ok sayda enzimle kesilen DNAlarn klonlanmas mmkn olmaktadr. - galaksidase geni iinde bulunan klonlama blgesine DNA klonlandnda genin yaps bozulur ve klonlanm plazmid tayan hcreler X-gal maddesi ieren byme ortamnda koloniler renk deitirir.

pUC19 Polilinker: kesim alanlar lacZ+ gen

Amfisilin diren geni

Origin dizisi

Lambda () Faj ve M13 Vektrleri Bir E.coli virsdr, DNAs 48,5 kbdir, Dorusal kromozomunun merkezi blgesi RE ile kesilir ve yabanc DNA yerletirilir. Klonlanacak DNA ile Lambda DNAs birletirilir ve protein klf iinde paketlenir. Bu virs bakteri hcrelerine girerek kendini oaltr. 10-15 kblik klon DNA retilebilir.

Kozmit Vektrler1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Lambda ile plazmit kromozomlarnn birletirilmesiyle elde edilmitir. Doal yollarla meydana gelmezler. Daireseldir. Antibiyotik diren geni ierirler. (ampR) Orijin (ori) blgesi bulunur. Kesim enzimleri iin bir blge bulunur. Lambda fajnn, faj protein klfna paketlenmesi iin gerekli olan cos dizileri ierirler. Yabanc DNAy bulunduran kozmitler lambda protein ba iine paketlenir ve enfekte edici faj paracklar oluur. 50 kblik DNA tayabilirler.

Mekik Vektrler Birden fazla konak hcrede replike olabilirler. Kendiliinden replike olur veya konak replike olunca kendini oaltabilir. Bir organizmadan baka bir organizmaya genleri tamak iin yaygn olarak kullanlr.

rnein; Ate bceinin luciferase geni plazmide yerletirilir ve Agrobacteriuma aktarlr. Agrobacteriumda oaltlr ve ttn enfekte ederek gen aktarm ilemi tamamlanm olur.

http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/horton 3/medialib/media_portfolio/23.html

Bakteri Yapay Kromozomlar Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)

Byk DNA paralarnn klonlanmasnda kullanlan nispeten yeni bir vektr tipi bakteri yapay kromozomlardr. BAClar 100-500 kb DNA tayabilirler. allmalar daha kolaydr. Antibiyotik diren genleri, RE blgeleri ve F faktr genlerini iermektedirler. Kromozomal DNAnn byk miktarlarnn sekanslanmasnda ve genom sekanslama projelerinde kullanlmaktadr.

Maya Yapay Kromozomlar Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

Dorusal formdadr. Kendine ait sentromer ve her iki uta da telomerlerin bulunmas kromozom zellii katmaktadr. Kendini replike eden sekansa (ARS) sahip olduundan replikasyon olmaktadr. Her iki kolunda maya genleri iermektedir. RE kesim blgesi bulunmaktadr. 1 Mb (Megabaz) uzunluunda DNA tayabilirler. Maya hcrelerinde oalabilirler. nsan Genom Projesinde kullanlmaktadr.

Rekombinant DNA Ktphaneleri Tek bir bireyden tretilen klonlanm, DNA seti bir ktphane olarak adlandrlr. Klonlanm ktphaneler; Tm genomu, Tek bir kromozomu , Tek bir hcre tipinde transkripsiyona urayabilen aktif gen takmn temsil eder.

Rekombinant DNA ktphaneleri 2 tiptir.

Rekombinant DNA Ktphaneleri1. Genomik/kromozomal ktphane, tm dizilerden en az bir kopya ierir. Hcrelerden veya dokulardan DNA ayrtrlmas, DNAnn RE ile kesimi ve paralarn vektre taklmasyla oluturulur.

2. Tamamlayc (Complementary) DNA (cDNA) library, hcrelerden izole edilen mRNAdan yaplan DNA kopyalarnn klonlarnn koleksiyonudur. reverse transkriptaz (RNAya bal DNA polimeraz) RNA kalbndan DNA sentezi cDNA ktphaneleri hcrelerde ifade olan gen veya genleri yanstr.

Genomik Ktphanenin (plazmit veya Kozmid) Taranmas1. 2. Paralanm genomik DNA ieren Plazmid vektrler E. Coliye aktarlr ve petrilerdeki seici ortama alnrlar. (rnein, amfisilin). Petri zerine naylon veya nitroselloz yapsndaki bir kat filtre yavaa bastrlarak koloni oluturulan bakterilerin filtre zerine aktarlp kopyalarnn kmas salanr. (Filtre zerinde E.coli hcreleri bymeye devam ederler). Filtrede bakteriler paralanr ve DNA tek katl hale gelir. Membrana bal DNA tamamlayc DNA ile iaretlenir. (rnein DNA).32P

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

radyoaktif etiketli

Probdaki tamamlayc DNA aradnz DNA sekasndan oluur, homolog sekans tahminen ktphanede de bulunur. Balanmayan prob DNAs filtreden uzaklatrlr. Probla DNAnn hibridize olup olmad X-ray filmi veya kemiluminasansla anlalr. X-Ray filmi zerinde numuneler grlr. Pozitif olan klonlar seilir ve daha fazla analiz iin izole edilirler.

Genomik ktphaneyi Tarama

cDNA Ktphanesi1. 2. 3. cDNA olgun mRNAdan elde edilir, intronlar iermez. cDNA kodlanan blgeden daha az bilgi ierebilir. cDNA ktphanesi mRNAnn izole edildiin andaki bir hcrenin gen aktivitesini gstermektedir. (Zamanla ve dokudan dokuya gre eitlilik gsterir). mRNA hcreler ldkten sonra hzl bir ekilde paralnr, derhal izole edilir. cDNA ktphanesi oluturma:1. 2. 3. mRNA izole edilir. cDNA sentezlenir. cDNA klonlanr.

4.

5.

cDNA Ktphanesi Oluturma 1. Adm mRNA zolasyonu Olgun karyotik mRNA 3 ucunda poli-A kuyruuna sahiptir. mRNAlar oligo dTs (deoxythymidylic acid) ieren bir kolondan geirilir. Poli-A kuyruklar oligo dTs yapr ve dier tm molekller kolondan geerken mRNAlar kolonda kalr.

cDNA Ktphanesi Oluturma 2. Adm cDNA sentezi Ksa bir oligo dT primeri poli-A kuyruuna balanr. Primer reverse transkriptaz enzimi ile uzatlr. mRNA Rnase H ile paralanr. Fakat ksa RNA paralar kalr ve bunlar primer olarak kullanlr. DNA polimeraz I yeni DNA 5 - 3 sentezler ve RNA primerlerini uzaklatrr. DNA ligaz DNA paralarn birletirir. mRNAdan ift katl cDNA kopyas oluturulur.

cDNA sentezi

cDNA Ktphanesi Oluturma 2. Adm cDNAnn Klonlanmas1. cDNA kt ulara sahiptir, bu nedenle onlar yapkan ulara dntrecek restriksiyon blgesi linkerleri veya adaptrler eklenmelidir. 2. T4 DNA ligaz ve cDNAnn her bir ucuna restriksiyon alan linkerleri veya adaptrler ekleyecek kt u ligasyonu kullanlr. 3. Vektr ile cDNA ayn restriksiyon enzimi ile kesilir. 4. DNA ligazn varlnda vektr DNAs ile cDNA kartrlr. 5. Klonlama iin bir E. coli konaksna aktarlr.

BamHI linkerlerini kullanarak cDNA klonlama

Alternatif: adaptr kullanm

5-GATCCAGAC-3 GTCTG-5

cDNA Ktphanesini Tarama1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. cDNA ktphaneleri proteinler iin genleri dizileme veya belirlemede kullanlrlar. (cDNAlar transkribe edilen genler iin oluturulurlar). Bulmay istediiniz proteini kodlayan gen iin DNA sekansn biliyorsanz, homolog bir DNA probu kullanlabilir. Homolog DNA sekans mevcut deilse, cDNA proteini tanyan bir antikorla iaretlenebilir. Ekspresyon vektr: klonlanm cDNA aktarlmadan nce promotor ve transkripsiyon terminatr arasndaki bir vektre yerletirilir. mRNA cDNAdan transkrip edilir ve E. Coli ile translasyonu yaplr. Koloniler membrana transfer edilir. Membran proteini tanyan tanyan radyoaktif etiketli antikor probu ile inkbe edilir. (radyoaktif olmayan kemiluminesanslar da mevcuttur.) Antikorlarla balanan koloniler X-Ray film zerinde karanlk bir nokta brakr.

cDNA kaseti ieren transkrip olabilir vektr

Fig. 10.5 Screening a cDNA library with antibody probe.

PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Polymerase Chain Reaction (PCR)-Kary Mullis (1983) tarafndan kefedildi. -Primerleri kullanarak kk bir DNA parasnn oaltlmasn salar. -DNAnn istenilen blgesinde milyonlarca kopyann retilmesine izin verir.

41

Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) PCR(Polymerase Chain Reaction) PCR, genetik materyaller zerinde seilmi bir veya birden fazla blgenin in vitro koullar altnda oligonkleotid primer ve Taq polimeraz enzim kullanlarak bir otomatik termocycle sistem yardmyla oaltlma metodudur. PCR almas iin kullanlan genetik materyal kalp(template) DNA olarak adlandrlr.

PCR Teknolojisi; Test edilecek organizmalardan saf olarak izole edilmi kalp DNAdan az miktarda (2-50ng) alnr ve PCR iin zel hazrlanan bir karma ( master mix: steril deiyonize su, PCR tamponu, Taq polimeraz enzimi, MgCl, dNTPs ve primerler) ilave edilir. Hazrlanan bu karm mikrosantrifj tpleri ierisinde otomatik DNA termocycler cihazna yerletirilir ve kalp DNA zerindeki baz spesifik blgeler yaklak 30 PCR dngs sonucu en az milyon kez oaltlr.

PCR dngs; Kalp DNA zerindeki spesifik bir blgenin termocycler cihaz yardmyla tek bir defa sentezlenmesine bir PCR dngs denir. Herbir PCR dngs birbirini takip eden 3 farkl aamadan oluur: 1. DNA zincirlerinin ayrtrlmas(Denaturation) 2. Primerlerin balanmas(Annealing) 3. DNA sentezi(Extention)

100

Melting 94 oC

PCRExtension Annealing Primers 50 oC 72 oC

Melting 94 oC

30x

Temperature

50

0

T i m e3 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 5 5 3 3 5 5

3

5

5 5

5 3 5

5

3

Temperature

100

Melting 94 oC

PCR

50

0

T i m e

3 5

5 3

Temperature

100

Melting 94 oC

PCR

50

0

T i m e3 5

Heat5 3

Temperature

100

Melting 94 oC

PCR

50

0

T i m e3 5

Heat5 3

Temperature

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30x

0

T i m e3 5

Heat5 5

Heat5 5 3

Temperature

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30x

0

T i m e3 5 5 5 5

5 5

5 5 3

Temperature

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30x

03 5 5

T i m e5

5 5 3

Heat5 5

Heat5

Temperature

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30x

03 5 5

T i m e5 5 5 5

5 5 3

5 5

5 5

Temperature

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30x

03 5 5

T i m e5 5 5

5 5 3

Fragments of defined length

5

5

5

5 5

DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal CycleNumber 1 2 4 8 16 32 64

0 1 Cycles

2

3

4

5

6

Polymerase chain reaction (PCR)-DNAnn kk rneklerinin aratrlmasna olanak salad iin tp ve bilim dnyasnda devrim niteliinde olmutur. -Adli tp -Embriyodaki genetik bozukluklarn tansnda -lk insan ve hayvan trlerinden mitokondriyal DNAnn analizi -Zirai aratrmalarda kullanm alanlar bulmaktadr.

55

Restriksiyon Enzim Alanlarnn Analizi1. Restriksiyon alanlar, seilmi restriksiyon enzimleriyle DNAy keserek, agaroz gelde elektroforez yaparak haritalanabilir. Restriksiyon alanlarnn pozisyonunu haritalama pek ok uygulamaya sahip olabilen linkaj haritasn oluturur. DNA farkl enzimlerle kesilir ve her bir DNA-enzim karm jelde bir ayrma kuyusuna yklenir. Negatif ykle DNA elektrik alanda byklne gre ayrlr (daha kk olanlar daha hzl ilerler) Etidyum bromrle boyanan jelle retilen para numuneleri fotograflanr. DNA ladder ile karlatrldnda her bir bant farkl ekilde hareket eder. Farkl enzimlerle kesilen paralarn farkl say ve byklklerinin sonular yorumlandnda bir restriksiyon haritas yapmak iin kullanlr. 2. 3.

4.

5. 6. 7.

kesilmemi

EcoRI

BamHI

EcoRI + BamHI 2.5 kb 2.0 kb 0.5 kb

Byk bantlar daha yava yrr

5.0 kb

4.5 kb 3.0 kb 0.5 kb 2.0 kb

Kk banlar- daha hzl yrr

0.5

2.5

2.0

EcoRI

BamHI

USDA-ARS - RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis of PCR-amplified 16S rDNA sequences.

Restriksiyon Enzim Alan Analizlerinin Uygulamas1. Farkl restriksiyon enzimlerini kullanarak geni ve fine skalal haritalamal gen yaps analiz edilir. 2. Oluan DNA paralarnn numuneleri Kesilmi Para Uzunluu Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs)) olarak adlandrlr. 3. Sularn tespitinde ve filogenetik analizler iin kullanlabilir. 4. DNA sekanslama veya dier genotipleme metotlarna gre daha ucuzdur. 5. Kesik DNAlar Southern Blot kullanarak iaretlenebilir.

Southern Blot: Edward Southern tarafndan icat edildi

Bu tekniin basamaklar 1. Uygun restriksiyon enzimi ile DNA nn kesilmesi 2. Kesilen DNA nn agaroz jelde yrtlmesi 3. DNA nn denatre edilmesi 4. Denatre edilen DNA nn naylon veya nitroselloz membrana transfer edilmesi 5. Tek iplikikli DNA probu ile membrann muamelesi 6. Grntleme

Fig. 10.8, Southern Blot Components: (top to bottom) Weight Paper towels Membrane Gel Blotting paper Glass plate Tray with buffer

Northern Blot: Southern Blota benzerdir, fakat DNA deil RNAy iaretlemek iin kullanlr. mRNAnn bykln belirlemek iin kullanlabilir, rnein promotr ve terminatr vb. alanlarndaki farkllklar belirlemede kullanlabilir.

Example: Expression sybII gene at different life stages in the frog Xenopus laevishttp://www.xenbase.org/WWW/Marker_p ages/CNS/sybII.html

DNA Dizi Analizi Bir DNA parasnn nkleotid dizisini belirleme ilemidir. ki metod vardrMaxam and Gilbert / Sanger Zircir Sonlardrma Metodu modifiye nkleotid substratlarn kullanarak in vitro DNA sentez reaksiyonunun sekansa zel sonlandrmadr. Uzama ksa bir DNA primerini kullanarak kalp ssDNA zerinde zel bir alanda balatlr.

DNA Sequencing Cont. 4 deoksinkleotid baz (dNTPs) zincir sonlandrma nkleotidi dideoksinkleotid (ddNTPs)nin dk bir konsantrasyon la birliktedir. Eg. a mixture of a particular ddNTP (such as ddATP) with its normal dNTP (dATP in this case), and the other three dNTPs (dCTP, dGTP, and dTTP) are added. This reaction is performed four times using a different ddNTP (each labeled with a different fluorescent dye) for each reaction

DNA paralar ddNTPnin DNA polimerazla eklendii eklendii noktalarda sadece sonlanr.

DNA Sequencing Cont. DNA sekans biyolojik almalarda faydal olmaktadr. Genetik hastalklar iin tehis ve tan da nemlidir. Mutasyonlar belirlemede kullanlabilir.

DNA Sequencing Cont.

Gel with ladder of DNA

DNA sequencing gel. Sequence visualized by autoradiography

DNA Sekans (Dizi) Analizi

Carrot plant

Zebrafish

Rabbit

Teekkrler