REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİII

DR. ONUR YILMAZ

2017

RESTRİKSİYON ENZİMLERİ

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN TARİHÇE VE GENEL ÖZELLİKLERİ

1965’de Arber; DNA metilasyonunun bakteriyi restriksiyon ajanlarından koruduğunugöstermiştir.

Bakteri kendi DNA’sını metilleyerek RE enzimlerinden korur

Bakteride bulanan spesifik metilaz enzimleri metil grupları eklerler.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİ

Saflaştırılmış ilk RE

E. coli’den EcoRI ve EcoRII

H. influenzae’dan HindII ve HindIII

Laboratuvarda tekrar birleştirilebilen gen parçalarına ayırabilmektedir.

Araştırmacılar RE’lerin;

Gen organizasyonu, Gen fonksiyonu ve Gen ekspresyonu ile ilgili araştırmalarda kullanılabileceğini tanımlamışlar ve böylece

1970’lerin sonlarında moleküler biyologlarca yaygın kullanılmaya başlamıştır.

Günümüzde 300’e yakın farklı DNA dizilimini tanıyan 3000’den fazla RE vardır.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNDE PALİNDROMİK SEKANS DİZİSİ

Genetik palindromlar sözcüklerdeki palindromlara benzer. DNA içerisindeki birpalindromik sekansta her iki 5’ - 3’ yönündeki baz sekansları aynıdır.

5’

5’

3’

3’

Restriksiyon enzimleri, DNA içerisinde restriksiyonbölgeleri olarak bilinen spesifik palindromiksekanslardan keserler. Bunlar genellikle 4 veya 6bazlık sekanslardır.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİ NASIL ÇALIŞIR?

1) DNA iplikçiği ve EcoRI tanıma bölgesi.

2) EcoRI restriksiyon enzimi eklendiğinde

3) Kesilmiş fragmanların ayrılması ile yapışkan uçlu kısımların oluşması.

Yapışkan Uçlar

EĞER ORTAMA DNA LİGAZ EKLENİRSE?

Yapışkan uçlar

DNA ligaz benzer restriksiyon enzimi ile kesilmiş yapışkan uçları birbirine bağlar.

Farklı restriksiyon enzimleri ile kesilmiş yapışkan uçlar birbirleri ile bağlanmaz.

Neden?

Çünkü oluşan yapışkan uçlardaki baz sekansları birbiriyle uyumlu olmayacaktır.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİ

Restriksiyon enzimleri DNA sekansını tarar.

Spesifik bir nükleotid setinin olduğu bölgeyi bulur.

Bu dizilimlere yakın bölgelerden ya da bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerdenDNA’yı keserler.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN KULLANIM ALANLARI

RE ile

Seçilen genin çoğaltılabilmesi

Kodladığı proteinin üretilmesi

Gen dizilerinin belirlenebilmesi yapılabilir olmuştur

RE;

Rekombinant DNA’nın eldesi

DNA haritasının çıkarılması

Polimorfizmlerin belirlenmesi

Probların hazırlanması

DNA modifikasyonlarının belirlenmesinde kullanılır

RESTRİKSİYON ENZİM TİPLERİ ???

Restriksiyon Enzimleri;

Metilaz aktivitelerine

Alt ünite kompozisyonlarına

Kırılma pozisyonlarına

Sekans özgüllüklerine

Kofaktör gereksinimlerine göre geleneksel olarak 4 tip içerisinde sınıflandırılır.

TİP I ENZİMLER

Hem restriksiyon hem de modifikasyon yapabilen iki fonksiyonlu enzimler

Çok yaygın olarak bulunmaktadırlar

Tanıma dizilerine bağlanmalarına rağmen kesimleri dizi dışında tesadüfi olarak gerçekleşir

Aktiviteleri için;

ATP,

S-adenozilmetionin ve

Mg+2 gereklidir

TİP II ENZİMLER

DNA’yı tanımlanmış pozisyona yakın yerden ya da dizi içinden keser

Tam hedef nükleotitten veya çok yakınından kesim yapma özelliğine sahipler

DNA analizi ve gen klonlanmasında laboratuvarlarda kullanılırlar

Aktivite için Mg+2 gerekli iken ATP gereksinimi yok

Tip II enzimler kesim sonucu DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre iki altgruba ayrılır;

DNA’nın 5’ ucunda yapışkan uç (sticky end) oluşturulması

Bu uçların ligasyon etkinlikleri yüksektir

Klonlama çalışmalarında tercih edilir

TİP II ENZİMLER

Yapışkan uçlar

Küt uç oluşturulması

Ligasyon etkinlikleri düşüktür

Klonlama çalışmalarında daha az tercih edilirler

5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’

3’ ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5’

Küt uçlar

TİP II ENZİMLER

Restriksiyon ve modifikasyon enzimlerinin büyük bir kombinasyonu

Tip I enzimleri gibi metilasyon modifikasyon fonksiyonuna sahiptirler

Mg+2 ve ATP’ye bağımlı kesim yaparlar

Tam bir kesim yapma özellikleri zayıftır

DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanmalarına rağmen kesimi farklı bir yerden yaparlar

TİP III ENZİMLER

Genel olarak metile DNA’yı tanırlar

E. coli ’nin McrBC sisteminde olduğu gibi

McrBC, tek veya her iki sarmalda methylcytosine içeren DNA’yı kesen bir

endonükleazdır. McrBC, metillenmemiş DNA da işlevsel değildir.

TİP IV ENZİMLER

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN İSİMLENDİRİLMESİ İsimlendirme;

Enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi

Bakteri türünün ilk iki harfi

Soya ait bir harf

İlk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası

EcoRI;

E= genus Escherichia

co= türünün ilk iki harfi coli

R= suş RY13

I= bu türden izole edilen ilk enzim

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI

RE;

DNA tanıma bölgeleri ve Katalitik bölge olmak üzere iki alt birimden oluşur

Tanıma bölgesi DNA üzerindeki spesifik bölgeyi tanır ve katalitik bölgenin buraya yerleşmesini sağlar

Katalitik bölge yerleştikten sonra heliksin fosfodiester bağını kırar

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI

RE;

Çift sarmal DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanabildikleri gibi tanıma bölgelerinin dışından da bağlanabilmektedirler.

Bu durumda çizgisel DNA boyunca kayarlar ve

Bu işlem sırasında DNA ile enzim arasını su molekülleri doldurur

Enzim tanıma bölgeleri bulunduğunda su molekülleri uzaklaştırılır.

Enzim-DNA kompleksi oluşunca hem enzim hem de DNA dizilerinde konformasyonel değişiklikler oluşur

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI

RE;

Sadece bazlar arasındaki yatay konumda bulunan fosfodiester bağını keserler

Karşılıklı iki baz arasındaki hidrojen bağlarını kesmezler

Hidrojen bağları;

Fosfodiester bağlarının kırılmasıyla ve

Çözelti içindeki termal hareket sonucu oluşan enerjinin etkisiyle kendiliğinden kırılır

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN BAĞLANMA VE KESME MEKANİZMASI

Aynı diziyi tanıyan ve farklı organizmalardan elde edilmiş RE’lerine izoşizomer denir

(SacI ve SstI)

İzoşizomerler, genellikle farklı optimum reaksiyon şartlarına ve stabiliteye

sahiptir

İzoşizomerler aynı diziyi tanımalarına rağmen kesimi dizinin farklı bölgelerinden

de yapabilirler bunlara da neoşizomerler denir (SmaI ve XmaI)

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN TEPKİME ŞARTLARI

RE için;

Hem saklanmaları hem de aktivitelerini gösterirken uygun şartların sağlanması gerekir

Kullanılacakları zaman üretici firmalardan gerekli bilgiler alınmalıdır.

ƛ DNA cut with PstI

RE’lerin;

Star aktivitesi

DNA ve enzim konsantrasyonunun uygunsuzluğu

pH ve iyonik dengenin uygun olmaması

Enzimin başka enzimlerle kontaminasyonu uygun olmayan kesimlere neden olur.

-20°C’de saklanırken saklama tamponunda %50 gliserol bulunur

Gliserol enzimin donmasını engeller

RESTRİKSİYON ENZİMLERİ

STAR AKTİVİTE

RE’lerin en önemli özellikleri;

Optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden kesebilirken, optimal olmayan şartlarda bu kesim oldukça değişkendir.

Buna “star aktivite” ya da “relaxed specificity” denir

Bu olay çok önemli olduğundan kullanılacak enzimin star aktivitesinin olup olmadığı bilinmelidir.

STAR AKTİVİTE

Star aktiviteye neden olan durumlar;

Yüksek gliserol konsantrasyonu

Çok yüksek enzim konsantrasyonu

Yüksek pH (>8.0)

Organik maddelerin varlığı (DMSO ve etanol gibi)

Kofaktör olarak Mg+2 yerine diğer divalent katyonların bulunması (Mn+2, Cu+2 vb).

STAR AKTİVİTE

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN KULLANIMI İLE REKOMBİNANT

DNA ELDESİ

Şekil: Varaldo ve arkadaşları tarafından gen bankasına gönderilen FM162351 noluermTR sekansı.

ermTR-F: AACTGCAGATAACCGGCAAGGAGAAGGTTATA (PstI)

ermTR-R: AATCTAGACGTTCTCTTAAAGTTAGAGAACGC (XbaI)

Plazmid

insert

pUC19

PstI

XbaI

Ligasyon

PstI

XbaI

PstI

XbaI

ÖZEL BİR RESTRİKSİYON ENZİMİ İÇİN RESTRİKSİYON KESİM BÖLGELERİ, LİNEAR DNA VE BU ENZİM İÇİN TEK BİR KESİM BÖLGESİ İÇEREN PLAZMİD

Plazmid

Linear DNA

RESTRİKSİYON REAKSİYONUNUN UYGULANMASI

DNA LİGAZIN EKLENMESİ

DNA LİGAZIN EKLENMESİ REKOMBİNANT PLAZMİD DNA’SI

Birden fazla olası rekombinant plazmid eldeedilebilir fakat burda bizim çalışmamız içinistenilen bölgeyi içeren plazmidgösterilmektedir.

DİĞER OLASI REKOMBİNANTLAR

…ve daha pek çoğu!

REKOMBİNANT PLAZMİD DNA’SININ BAKTERİ HÜCRESİNE AKTARILMASI

REKOMBİNANT BAKTERİLERİN ÇOĞALTILMASI

İSTENİLEN GENİ İÇEREN REKOMBİNANT PLAZMİDİ NASIL AYIRABİLİRİZ?

Restriksiyon fragmentleri

rastgele olasılıklarla

plazmidimize ligasyonu yapıldı.

Buna bağlı olarak birçok

rekombinant plazmid formu

oluştu.

Elektroporasyon

yoluyla plazmidlerin

bakteri hücrelerine

aktarılması.

Bakteri hücreleri seçici bir besiyerinde

diğer istenilmeyen DNA parçalarını

almış plazmidleri içeren bakterilerden

ayrılır.

Rekombinant

plazmidler