reações de aglutinação agregação ag-ac observado visualmente teste rápido tipos de...
TRANSCRIPT
Reações de Aglutinação
• Agregação AG-AC •Observado visualmente• Teste rápido
Tipos de Aglutinação
• Direta• Indireta ou Passiva• Reversa (Inibição da Aglutinação)
Exemplos de Aplicação da Técnica• Teste de gravidez (gonadotrofina coriônica = HCG): urina• Rotavírus: fezes• Diagnóstico de trombose• Crises de anemia hemolítica (ex. falciforme)• Eritroblastose fetal (doença hemolítica do recém nascido)• Diagnóstico de hepatite B: soro• Diagnóstico de Toxoplasmose: hemaglutinação (soro)• Teste de tipagem sanguínea (ABO e Rh): banco de sangue
Aglutinação Direta
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
• Detecção AG ou AC específicos• Quantificação
Aglutinação bacterianaPresença de infecçãoDiferenciação de espécies
Aglutinação passivaAg solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
+
+
Reversa (Inibição da Aglutinação)
Aglutinante
DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISADIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA
TIREÓIDETSHAnti-receptor TSHT3 e T4 livresTBGCalcitonina TSH neonatal
FERTILIDADE Estradiol UltrasensívelProgesterona HCG Estradiol
MARCADORES TUMORAIS
PSA total
PSA livre
ENDOCRINOLOGIA ACTHAldosteronaRenina
DIABETESInsulinaPeptídio C
TOXICOLOGIA
FARMACOLOGIAALÉRGENOS
AC DE ALERGIAS
DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS
Radioimunoensaio (RIA)
Vantagens • Sensível, rápido e preciso• Análise quantitativa de reação Ag-AC• Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g)
Limitações• Alto Custo• Vida média dos reagentes (radioisótopos)• Risco operacional
Radioisótopos mais usados• 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias
Etapas do teste• Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas (padrões/calibradores)• Ensaio • Contagem da radiação: ou (contador de cintilação) ou γ (contador de radiação gama)
• Hormônio• proteínas séricas• drogas• vitaminas• Ac
Moléculas marcadas com isótopos
Radioimunoensaio
Radioimunoensaio
Princípio: • Ac que reconhece especificamente o analisado
Soro com quantidadedesconhecida de analisado
eSoro com analisado
marcado I125
ACACACACAC
+ =
Precipitado com baixas contagensSoro tem muito analisado circulante
Precipitado comaltas contagensSoro tem pouco analisado circulante
interesse
Imunofluorescência
Direto e indireto:• Usado para pesquisa de AC em células (imunocitoquímica) e tecidos (imunohistoquímica)• Ex da aplicabilidade: biópsia de doenças imunológicas (pele, rins, sífilis, herpes simples, varicela-zoster) Sistema Avidina-Biotina:• Técnica de amplificação• Avidina+Biotina = complexo• Avidina pode ser saturada com fluoresceína (verde),ficoeritina (vermelha), peroxidase (M. óptica), ferritina (M.eletrônica).• Várias biotinas podem se ligar ao AC = amplificação dafluorescência
Enzimaimunoensaio
• Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática
Vantagens:• Alta sensibilidade• Reagentes estáveis e seguros• Rapidez
Exigências para a enzima ser usada no teste:• Alta atividade específica• Produto formado estável• Fácil quantificação• Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção• Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica,acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase,ribonuclease
Métodos:ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima)Imunoblotting
ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima
1. Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc)2. Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina,gelatina, caseína, etc).3. Diluição da amostra4. Lavagens entre os períodos de incubação5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática(ex. H2O2, ortotoluidina).
ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima
Objetivo:• Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima• Quantificar um AC pelo uso de um AG específico ligado à enzima
BloqueioLeite desnatado
ou Tween 20+
LavagemAmostra
+Lavagem
membrananitrocelulose
+ Ag ( )
Adição deAnti-Ig** = Enzima(peroxidase,fosfatase ou
glicose oxidase)+
Lavagem
Adição dosubstratoda enzima
COROu
conjugados marcados com radioisótopos
(bandas e radiografia)
ELISA: dot-ELISA (Immuno-dot ou dot-blot ELISA)
• Simples, rápida e sensível• proteínas, ácidos nucléicos, membranas, fungos, vírus, bactérias
ELFA: Enzyme Linked Fluorescent AssayEnsaio Fluorescente Ligado à Enzima –Enzima catalisa reação fluorescente e nãocolorimétrica