UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGDEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICADISCIPLINA DE LABORATRIO BSICO II

RELATRIO DE AULA PRTICA

Cintica Enzimtica da Enzima Invertase

Acadmicos: Alex Toshio KassadaRA: 60772

Guilherme Chaves Souto BrancoRA: 60521

Letcia Maria SgobiRA: 85462

Paulo Otvio FiorotoRA: 60903

Professora:Lucinia Aparecida Cestaria Tonon

Maring, 12 de novembro de 20131. RESUMODe acordo com a proposta inicial do experimento, que a determinao da inibio da enzima invertase por efeito de concentrao de substrato, por efeito do sulfato de cobre e frutose, o experimento foi realizado atravs do mtodo do DNS, com leitura da absorbncia a 600 nm no espectrofotmetro, para dez diferentes valores de concentrao de inibidor e reagentes mantidos em temperatura ambiente, a fim de comparar os dez resultados obtidos para cada inibio, e determinar qual a velocidade mxima de reao (Vmx) e a constante Michaelis Menten (Km) durante a atividade dos inibidores. A partir do experimento realizado possvel concluir que como o mesmo foi feito em uma temperatura diferente da considerada ideal para a melhor atividade da enzima. A partir disto, pode-se afirmar que os perfis inibidores das substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo necessria a repetio do experimento, desta vez na temperatura favorvel, de 55C. Os erros podem ser resultado de manipulao inadequada e de equipamentos descalibrados.2. INTRODUOA invertase uma enzima utilizada na hidrlise de sacarose e xarope de glicose e frutose, o qual muito utilizado na indstria alimentcia. Por consumir menos energia do que os mtodos tradicionais de hidrlise cida com cido sulfrico e gerar um produto de melhor qualidade so considerados extremamente vantajoso.Este relatrio tem como base o estudo da cintica enzimtica da enzima invertase e os efeitos causados por inibidores sobre a reao da mesma.3. FUNDAMENTAO TERICACintica EnzimticaSegundo Pinto (2009), cintica enzimtica o estudo das reaes qumicas que so catalisadas por enzimas, e implica na determinao das velocidades de transformao dos reagentes em produtos, assim como no entendimento da influncia do meio reacional, envolvendo concentrao de reagentes e produtos, alm de fatores termodinmicos como temperatura e presso sobre as velocidades dessas transformaes. O conhecimento dessas propriedades de extrema importncia para a compreenso das transformaes que ocorrem no interior das clulas que esto envolvidas nos processos fermentativos e nos reatores enzimticos.Influncia do SubstratoUm dos fatores que afetam a velocidade de uma reao catalisada por enzimas a concentrao do substrato presente. A concentrao varia durante a ocorrncia da reao, visto que ele convertido em produto durante o processo. Sendo assim, a velocidade da reao varia em funo da quantidade de substrato ainda no convertido. Quanto maior a quantidade de substrato, maior a velocidade da enzima e a velocidade da reao atinge seu mximo quando a soluo est saturada de substrato (CSAR).Equao de Michaelis-MentenDe acordo com Moyes e Schulte (2010), a relao entre a concentrao de substrato e a velocidade foi descrita matematicamente pela primeira vez pelos bioqumicos Leonar Michaelis e Maud Menten como uma hiprbole retangular, sendo que ela leva em contra o valor da constante de Michaelis-Menten, chamada de Km, que a concentrao necessria de substrato para que se obtenha uma velocidade inicial que metade da velocidade mxima possvel. A constante Km indica a afinidade da enzima por um substrato. Um Km baixo indica alta afinidade, e o contrrio tambm vlido.A equao de Michaelis-Menten leva em conta, alm da constante Km, a concentrao de substrato ([S]) e a velocidade mxima de reao (Vmax), sendo ela descrita desta maneira:

Inibio EnzimticaExistem substncias que se associam a enzimas e alteram sua atividade enzimtica de uma forma que influencia a ligao do substrato. Esse o caso dos inibidores, que so substncias que reduzem a atividade de uma enzima. Segundo Voet (2001), inibio pode ser de forma competitiva, na qual uma substncia compete com o substrato pela ligao ao stio ativo da enzima, incompetitiva, na qual o inibidor liga-se ao complexo enzima-substrato, mista, em que o inibidor se liga enzima e ao complexo enzima-substrato, por produto, em que o produto que se acumula durante o curso da reao compete com o substrato pela ligao ao stio-ativo, e por contato, em que a as clulas encostam umas nas outras e impedem a proliferao.4. MATERIAIS E MTODOSAgitador Vortex;Espectrofotmetro;Soluo de invertase [0,1 g/L];

gua destilada;Estante para tubo de ensaio;Soluo de sacarose 5% p/v a pH 4,5;

Balo volumtrico;Pipeta;

Banho-maria;Ponteiras;Soluo DNS;

Becker;Reatores batelada;Sulfato de cobre [0,63mM];

Cronmetro;Rolhas;Termmetro de mercrio;

Dispensete;Soluo de frutose [22mM];Tubos de ensaio.

4.1. Metodologia da inibio enzimtica pelo efeito da concentrao de substrato Primeiramente preparou-se vrias concentraes de sacarose de acordo com o quadro 01.Quadro 01. Reagentes e quantidades para o estudo do efeito da concentrao de substrato.Tubos12345678910

Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72

gua destilada (mL)98,88,68,48,287,77,57,37

Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e completou o volume com gua destilada. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura ambiente por dez minutos (anotando a temperatura). Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por 10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas, pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio, agitando-os rapidamente em agitador Vortex, com posterior leitura no espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o branco.

4.2. Metodologia da inibio enzimtica pelo sulfato de cobre e frutosePrimeiramente numeraram-se os 10 tubos de ensaio para cada tipo de inibidor e em seguida adicionou-se os reagentes segundo o quadro 02 e 03.Quadro 02. Efeito da inibio por sulfato de cobre na atividade da enzima.Tubos12345678910

Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72

Sulfato de cobre (0,63 Mm) (mL)2222222222

gua destilada (mL)76,86,66,46,265,75,55,35

Quadro 03. Efeito da inibio da frutose na atividade da enzima.Tubos12345678910

Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72

Frutose (22mM) (mL)1111111111

gua destilada (mL)87,87,67,47,276,76,56,36

Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e complete com gua destilada. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura ambiente por dez minutos (anotando a temperatura). Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por 10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas, pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio, agitando-os rapidamente em agitador Vortex, com posterior leitura no espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o branco.5. RESULTADOS5.1. Efeito da Concentrao de SubstratoOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio de acordo com a concentrao inicial de sacarose nos tubos esto dispostos na tabela 1.Tabela 1 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia

Branco00

111,11-0,012

222,220,007

333,330,008

444,440,009

555,550,026

672,220,027

783,330,037

894,440,072

9111,110,081

Utilizando-se a curva padro da glicose + frutose, pelo mtodo do DNS, onde a curva dada pela equao y = 0,5345x 0,0261, sendo do tipo y = a b.x. Ento, so obtidos os valores do coeficiente linear da reta obtida (a) e coeficiente angular da reta ajustada (b), que so, -0,0261 e 0,5345, respectivamente. A partir dos valores destes coeficientes e das absorbncias contidas na tabela 1, podemos calcular a quantidade de glicose + frutose presente (mg/mL), atravs da seguinte equao.

Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)d = diluio da amostra (1/6)Para cada valor de absorbncia de cada amostra, ou seja, de y, obtm-se um valor de MG, como pode ser visto na tabela 2. A partir dos dados de quantidades em mg/mL de glicose + frutose, constantes na tabela 2, calculou-se, atravs da equao abaixo, o nmero de moles de glicose + frutose presentes na amostra.

Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)MM = massa molar da glicose + frutose (0,360 mg/mol)Vr = volume de reao (10 mL).Os nmeros de moles de glicose + frutose calculados esto dispostos na tabela 2.A partir do nmero de micromoles de glicose + frutose gerado durante 10 minutos de reao, calculou-se a velocidade da mesma, dividindo-se essa quantidade de micromoles por 10, para se obter a velocidade em micromoles de glicose + frutose por minuto. Os dados esto dispostos, tambm, na tabela 2.Tabela 2 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)

Branco0000

111,110,1584,3970,440

222,220,37210,3211,032

333,330,38310,6331,063

444,440,39410,9451,094

555,550,58516,2461,625

672,220,59616,5581,656

783,330,70819,6761,968

894,440,07230,5893,059

9111,110,08133,3963,340

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 3.Tabela 3 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)

Branco--

10,0902,274

20,0450,969

30,0300,940

40,0230,914

50,0180,616

60,0140,604

70,0120,508

80,0110,327

90,0090,299

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 2, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 1. A partir dos dados constantes na tabela 3, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 2.

Figura 1 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da concentrao de substrato, obtidos neste experimento.

Figura 2 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da concentrao de substrato, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 2, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 4,957 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 111,358.5.2. Inibio da invertase por sulfato de cobre e frutose5.2.1 Inibio da invertase por sulfato de cobreOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio, contendo soluo de sacarose e sulfato de cobre esto dispostos na tabela 4.Tabela 4 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia

Branco00

111,11-0,005

222,220,009

333,330

444,440,007

555,550,011

672,220,008

783,330,008

894,440,015

9111,110,009

Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente (mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao (moles/min), esto dispostos na tabela 5.Tabela 5 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)

Branco0000

111,110,2376,5790,658

222,220,39410,9451,094

333,330,2938,1380,814

444,440,37210,3211,032

555,550,41611,5681,157

672,220,38310,6331,063

783,330,38310,6331,063

894,440,46112,8161,282

9111,110,39410,9451,094

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 6.Tabela 6 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)

Branco--

10,0901,520

20,0450,914

30,0301,229

40,0230,969

50,0180,864

60,0140,940

70,0120,940

80,0110,780

90,0090,914

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 5, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 3. A partir dos dados constantes na tabela 6, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 4.

Figura 3 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.

Figura 4 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 1,249 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 9,276.5.2.2 Inibio da invertase por frutoseOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio, contendo soluo de sacarose e frutose, esto dispostos na tabela 7.Tabela 7 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia

Branco00

111,110,025

222,220,041

333,330,028

444,440,059

555,550,095

672,220,11

783,330,14

894,440,139

9111,110,111

Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente (mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao (moles/min), esto dispostos na tabela 8.Tabela 8 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)

Branco0000

111,110,57415,9341,593

222,220,75320,9232,092

333,330,60716,8691,687

444,440,95526,5362,654

555,551,35937,7613,776

672,221,52842,4384,244

783,331,86551,7935,179

894,441,85351,4815,148

9111,111,53942,7504,275

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 9.Tabela 9 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)

Branco

10,0900,628

20,0450,478

30,0300,593

40,0230,377

50,0180,265

60,0140,236

70,0120,193

80,0110,194

90,0090,234

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 8, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 5. A partir dos dados constantes na tabela 9, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 6.

Figura 5 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por frutose, obtidos neste experimento.

Figura 6 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por frutose, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 4,953 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 27,233.6. DISCUSSOCom base no prvio conhecimento de que um maior valor de Km indica uma menor afinidade da enzima com o substrato, e quanto maior o valor de Vmx, mais rpido ocorrer a reao desejada, tem-se a discusso dos resultados obtidos nas diferentes etapas do experimento e metodologia utilizada a seguir.A afirmao do perfil inibidor dos compostos utilizados no experimento (sulfato de cobre e frutose) pode ser equivocada, pois o mesmo foi alvo de fontes de erro que interferiram no resultado, principalmente nos dados de velocidade mxima de reao, pois como a mesma foi realizada a temperatura ambiente (25C), tem-se que a velocidade foi diretamente prejudicada, pois a temperatura tima para a enzima seria na faixa de 55C, como visto em experimentos anteriores. Alm dos demais erros experimentais, como por exemplo, no momento da pipetagem, erro na leitura de absorbncia, falta de preciso na cronometragem, entre outros.Com isso, e com os resultados de Km e Vmx encontrados, tem-se que para este experimento, nas condies descritas anteriormente, a concentrao de substrato provoca uma menor afinidade entre enzima e substrato, pois obteve o maior valor da constante de Michaelis Menten quando comparado aos demais. De acordo com o estudo de Dias et al (2009), os valores para a enzima invertase de Km e Vmx so respectivamente 16,5 mM e 1181 M/min. E a partir destes dados tem-se que o sulfato de cobre se mostrou um inibidor incompetitivo, pois diminuiu o valor de Km e Vmx, o que indica que ele se ligava somente quando se tinha a formao do complexo enzima-substrato, impedindo a reao de catlise.J no caso da frutose, a mesma demonstrou um perfil de inibidor competitivo, pois teve um aumento no valor de Km (27,233 mM), o que significa dizer que a frutose ir competir com as molculas do substrato.7. CONCLUSESA partir do experimento realizado possvel concluir que como o mesmo foi feito em uma temperatura diferente da considerada ideal para a melhor atividade da enzima. Portanto, concluses sobre o perfil inibidor das substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo necessria a repetio do experimento, desta vez na temperatura favorvel, de 55C. 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS[1]. Apostila de Laboratrio Bsico II 2013. Universidade Estadual de Maring. Departamento de Engenharia Qumica. Engenharia de Alimentos. Maring Paran.

[2]. CSAR, Paulo. Introduo Cintica Qumica. In: Portal de Estudos em Qumica. Disponvel em: . Acesso em: 04 de novembro de 2013.[3]. DIAS, A.; SANTOS, M.; BRANCO, M. Caracterizao cintica da enzima invertase. Brasil, 2009. 16p.[4]. MOYES, C. D. & SCHULTE, P. M. Princpios de Fisiologia Animal. Disponvel em: < http://books.google.com.br/books?id=hRAE0y0yLKQC&pg=PA38&dq=artigos+michaelis-menten&hl=pt-BR&sa=X&ei=LKJ6UqvDMZPwkQewkIDQCw&ved=0CE4Q6AEwBQ#v=onepage&q=artigos%20michaelis-menten&f=false>. Acesso em: 06 de novembro de 2013.[5]. PINTO, G. F. Cintica Enzimtica, Brasil, 2009. Disponvel em: < http://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=qLq2XI5ap6AC&oi=fnd&pg=PA7&dq=artigos+cin%C3%A9tica+enzim%C3%A1tica&ots=WsckSNzymZ&sig=NMiykBJAXS77YcjA5u0xxsaxvME#v=onepage&q=artigos%20cin%C3%A9tica%20enzim%C3%A1tica&f=false>. Acesso em 04 de novembro de 2013.[6]. VOET, D.; VOET, J. G. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica A Vida em Nvel Molecular, pg. 1176. Disponvel em: Acesso em: 06 de novembro de 2013.