Santander 2009

PROPUESTA DE PROYECTODE INVESTIGACIÓN

FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE

MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA

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Santander 2009

PROPUESTA DE PROYECTODE INVESTIGACIÓN

FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE

MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA

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ÍNDICE

A. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA: UNA VISIÓN GENERAL.

B. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA.

1. Resumen del proyecto 2. Estado de la técnica y problemática

3. Hipótesis y objetivos del proyecto 4. Metodología científica a seguir 5. Plan de trabajo 6. Experiencia del equipo y recursos técnicos

6.1. Investigadores principales: 6.2. Experiencia del equipo: 6.3. Recursos técnicos:

7. Relevancia y beneficios para el sistema Presupuesto

ANEXO I. Bibliografía más relevante del estado del arte.

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FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS

CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE MENINGOCOCO Y ALTA

INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA:

UNA VISIÓN GENERAL

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¿QUÉ?

Se propone la realización de un programa de investigación con dos líneas de trabajo diferenciadas que estudiará la incidencia de la meningitis en Cantabria desde el punto de vista epidemiológico y del microbiológico (biología molecular).

¿POR QUÉ?

La Comunidad de Cantabria presenta una tasa de incidencia de la enfermedad por cada cien mil habitantes claramente superior a la de una gran mayoría de las CCAA, prácticamente triplicando la media en el Estado de forma continua durante los últimos 30 años

¿QUIÉN? y ¿DÓNDE?

El proyecto se realizará en dos Instituciones: el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV), Instituto de Formación e Investigación Marqués de valdecilla (IFIMAV) y el Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) de Madrid, con la participación activa de 3 grupos:

· Grupo de Microbiología clínica y molecular del HUMV, Dr. Luis Martínez (Jefe de Servicio).

· Grupo de epidemiología y patogenia de las enfermedades infecciosas de HUMV. Dra. Carmen Fariñas (jefa de Área).

· Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII. Dr. Julio Vázquez (director del laboratorio).

¿CÓMO?

1a. Determinación del tamaño muestral.1b. Elección de la población de estudio.1c. Contacto con la población de estudio.1d. Recogida de Información.2a. Aislamiento e identificación de N. meningitidis en portadores.2b. Determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo.2c. Electroforesis en campo pulsado.2d. Multilocus Sequence Typing (MLST):2e. Antibiograma y caracterización de genes de resistencia a los antimicrobianos:

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¿CUÁNDO?

La duración del proyecto sería de tres años, comenzado preferiblemente en 2009.

¿CUÁNTO?

Se calcula un presupuesto total aproximado cercano a los 410.000 €.

CONTACTO:

Luzma García PiqueresDirectora adjunta Área de transferencia del conocimiento y desarrollo de proyectos europeosIFIMAV

Fundación Marqués de ValdecillaEscuela de Enfermería, 5º PlantaAvda. de Valdecilla s/n39008 Santander

Tel: +34 942 315 109 (directo) +34 942 331 077

Móvil: +34 676 953 386Fax: +34 942 344 000e-mail: ifimav.otri@fmdv.org

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FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES

CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS

DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE

ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA

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1. RESUMEN DEL PROYECTO

El Objetivo global es conocer algunos factores tanto del huésped como del patógeno, que pudieran asociarse a una elevada tasa de incidencia de enfermedad invasiva meningocócica en la Comunidad de Cantabria. Para ello se propone realizar una amplia encuesta de portadores asintomáticos en población de entre 4 y 19 años de edad, con objeto de poder definir mediante técnicas moleculares (PFGE y MLST) los clones que están circulando en población general y compararlos con los que se están aislando de casos clínicos. Esto nos permitirá conocer el grado de transmisibilidad de los clones virulentos, así como de otros clones que circulen en población general pero que se aíslen sólo ocasionalmente de casos clínicos. Una alta presencia de clones identificados como virulentos entre la población general sintomática indicaría una alta transmisibilidad de los mismos, unido bien a una alta virulencia o a un bajo nivel de inmunidad natural. Una vez definidos los clones mayoritarios, se propone analizar el nivel de inmunidad natural mediante una encuesta serológica para determinación de la Actividad Bactericida del Suero frente a los mencionados clones mayoritarios, tanto entre portadores asintomáticos como en aquellos aislados en casos de enfermedad invasiva.

2. ESTADO DE LA TÉCNICA1 Y PROBLEMÁTICA

La Enfermedad Meningocócica (EM) ha seguido un patrón cíclico en España, y desde los años 40 pueden observarse 5 picos de incidencia, que podrían definirse como picos epidémicos, con periodos inter-epidémicos de duración variable con niveles de endemia que fluctúan entre 1 y 2 casos por cien mil habitantes. Esta información epidemiológica, basada fundamentalmente en declaraciones de casos se complementa con información basada en datos de laboratorio desde el año 1978, momento en que se funda el Laboratorio de Referencia de Meningococos (LRM), entonces dependiente del Centro Nacional de Microbiología, Virología e Inmunología Sanitaria (CNMVIS), ahora parte del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). De acuerdo con la información existente, la Comunidad de Cantabria ha venido presentando tasas de incidencia de EM muy superiores a las encontradas a nivel global en el Estado. Así, durante la onda epidémica de fines de los años 70 a mediados de los 80, la tasa en Cantabria era de 38.37x105 mientras que la tasa en España era de 12.8; en 1987 la tasa fue de 16.03 y 5.47 respectivamente;

1 En el Anexo I se facilitan las referencias bibliográficas más relevantes en este campo.

Se propone la realización de un programa de investigación con dos líneas de trabajo diferenciadas que estudiará la incidencia de la meningitis en Cantabria desde el punto de vista epidemiológico y del microbiológico (biología molecular).

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finalmente, en el último informe de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica de España, correspondiente a la temporada 2005-2006, las tasas fueron de 3.24 y 1.38.

Así pues, la Comunidad de Cantabria presenta una tasa de incidencia de la enfermedad por cada cien mil habitantes claramente superior a la de una gran mayoría de las CCAA, prácticamente triplicando la media en el Estado de forma continua durante los últimos 30 años. Debe indicarse que si bien esta situación es característica de una gran parte de la cornisa cantábrica, incluyendo País Vasco y Galicia, las tasas de la CA de Cantabria son sistemáticamente las más elevadas.

Las razones de esta mayor tasa histórica de incidencia de EM son poco o nada conocidas, y podrían pasar por características propias de las cepas circulantes en el territorio o bien por características propias del huésped en la Comunidad, aunque probablemente una conjunción de ambas pueda estar relacionada con la elevada tasa de enfermedad.

El único reservorio conocido, y por lo tanto fuente de la infección de Neisseria meningitidis, agente causal de la EM, es el hombre. El microorganismo coloniza, la mayor parte de las veces de forma asintomática, la nasofaringe, y este proceso de infección local no desemboca en enfermedad invasiva en la inmensa mayoría de los casos. De hecho, a pesar de su reputación de patógeno altamente virulento, el meningococo es básicamente un comensal de la flora normal que se encuentra en la nasofaringe humana. El análisis de las características que condicionan el que una cepa de meningococo produzca o no enfermedad invasiva ha llevado a definir “líneas clonales” hipervirulentas (aquellas que son generalmente aisladas de casos clínicos y que han producido epidemias en diferentes países/regiones del mundo), junto con otras líneas que podrían definirse prácticamente como comensales, que nunca o raras veces se aíslan en procesos invasivos.

Desde el punto de vista de la inmunidad natural, y más específicamente, desde el punto de vista de la protección frente a meningococo, se acepta ampliamente que la actividad bactericida del suero (ABS), mediada por el complemento, es el indicador básico. Por lo tanto, anticuerpos específicos frente a algunos de los antígenos externos del microorganismo, con capacidad de activar la cascada del complemento, constituyen la principal defensa del huésped, tanto en términos de inmunidad inducida como natural.

Con los antecedentes expuestos, no están claras las razones que explican aumentos en la incidencia de la enfermedad en una zona geográfica concreta. Por un lado, parece evidente que la llegada de un tipo de cepa determinado, que exprese diversos antígenos nuevos para la zona, encuentra un territorio inmunológicamente virgen, en el que tiene una mayor facilidad para diseminarse y producir casos de enfermedad invasiva. Sin embargo esto sólo explicaría aumentos temporales de incidencia, ya que por regla general, la población ubicada en esa zona acabará desarrollando cierto grado de inmunidad natural frente a ese nuevos o nuevos antígenos, de forma que la curva epidémica revierta y muestre valores semejantes a los observados antes de la llegada de esa nueva variante. No obstante, para que esto suceda, la transmisión de este tipo

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de cepas debe ser suficientemente dinámica y no verse perjudicada por una excesiva producción de enfermedad, lo que sin duda constituye una evidente paradoja en el caso de la EM. Por lo tanto, un factor de gran importancia, que podría jugar un papel importante en determinar el grado de endemia en una zona concreta, o aumentos puntuales de la misma, es el nivel de inmunidad natural entre la población. Altos niveles de inmunidad natural en principio deberían llevar aparejada una baja tasa de incidencia de la enfermedad, con una baja circulación de la cepa. Sin embargo, unos niveles bajos en la circulación de una cepa concreta podrían traducirse igualmente en una escasa renovación de la inmunidad natural, lo que daría lugar a un círculo vicioso de poca transmisión y alta virulencia. Este modelo es uno más de los que podrían realmente estar produciéndose en la evolución natural de la EM, aunque otros factores como las infecciones del tracto respiratorio superior, condiciones climáticas etc. pueden igualmente tener un cierto grado de influencia en las fluctuaciones descritas.

3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DEL PROYECTO

La información cruzada entre las líneas clonales presentes en portadores asintomáticos en nasofarínge y las líneas clonales que se aíslan en casos de enfermedad invasiva meningocócica en Cantabria podría ofrecer algún grado de explicación de la elevada tasa de incidencia de esta patología en esta región geográfica.

Adicionalmente, el grado de inmunidad natural de la población frente, por un lado a los clones

La tasa de incidencia de la Meningitis en Cantabria es la más alta de todo el país. Urge entender las causas y conocer la naturaleza de la enfermedad en nuestra región.

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mayoritarios entre los portadores, y por otro lado frente a los más abundantes entre los aislados en casos clínicos, permitirá elaborar parámetros de comparación y establecer razones que expliquen las diferencias mencionadas en cuanto a las tasas de incidencia de la enfermedad. Unos niveles bajos de inmunidad natural frente a las líneas clonales que producen casos explicaría altas tasas de ataque y por el contrario, niveles altos de inmunidad natural frente a dichas líneas clonales podrían indicar alta circulación de esas líneas entre la población general, unido a alta virulencia de las cepas.

1. Líneas clonales circulantes vs. líneas clonales de casos clínicos: Como ya se ha mencionado, es de gran importancia evaluar el grado de transmisibilidad de las cepas que producen casos de enfermedad invasiva. Por lo tanto, se propone un estudio consistente en una muestra estratificada por edades y zona de residencia (rural o urbana). En todas las muestras se determinará la presencia de Neisseria meningitidis, y todas las cepas aisladas se caracterizarán por medio de serogrupo, serotipo y serosubtipo con anticuerpos monoclonales. Dicha información sería cruzada con la información de las cepas aisladas de casos clínicos, lo que permitirá la formación de “grupos teóricos de afinidad antigénica” (GTAA). Es decir, por ejemplo, se englobarían en el mismo grupo cepas B:4:P1.15 y también las que resultaran ser NG:4:P1.15, B:NT:P1.15 etc (todas las que teóricamente pudieran tener una expresión antigénica similar). Dichos GTAAs serían analizados más en profundidad mediante PFGE y Multilocus Sequence Typing (MLST) que permite la asignación de los aislados a líneas o complejos clonales definidos, lo que permitirá conocer el grado de correspondencia entre los aislados en nasofaringe de portadores sanos y los encontrados en enfermos.

2. Inmunidad natural: El grado de inmunidad natural viene determinado por el nivel de Actividad Bactericida del Suero (ABS) frente a aislados concretos, en la población sin antecedentes de enfermedad meningocócica. Para analizar este parámetro se recogerán entre 1 y 2 ml de sangre de todos los participantes en la encuesta de portadores, constituyendo una seroteca de la que posteriormente seleccionaremos aquellos sueros a utilizar. Se extraerá el suero de dichas muestras y se procederá a determinar la ABS frente a la cepa utilizada internacionalmente para esta metodología, así como frente a la cepa o cepas más prevalentes de entre las aisladas en casos de enfermedad y las más frecuentemente aisladas en portadores asintomáticos en la Comunidad Autónoma.

3. Sensibilidad a antimicrobianos: Se determinarán los patrones de sensibilidad de las cepas aisladas en la encuesta de portadores frente a los antimicrobianos de mayor interés clínico y epidemiológico, determinando la base genética de las resistencias que puedan aparecer a penicilina, fluoroquinolonas y rifampicina.

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4. Factores asociados al estado de portador asintomático: Se identificarán las características sociodemográficas así como posibles factores asociados al estado de portador asintomático de N. Meningitidis y se correlacionarán con las características de las cepas aisladas y al inmunidad natural de la población.

Podemos decir que en un proyecto como el planteado, vamos a tener dos poblaciones objeto de estudio:

1. Por un lado, la población de referencia la constituyen todos los niños y jóvenes de Cantabria. La población elegible la constituyen aquellos comprendidos entre 4 y 19 años y que tengan tarjeta sanitaria del sistema sanitario público (Servicio Cántabro de Salud –SCS-).

2. Por otro lado, la otra población de referencia está constituida por las cepas de meningococo aisladas de portadores asintomáticos y casos clínicos de enfermedad invasiva en Cantabria.

Objetivos de la aproximación microbiológica:

1. Aislar e identificar a nivel de especie cepas de N. meningitidis en portadores de la población de Cantabria.

2. Determinar los patrones de sensibilidad de las cepas aisladas a los antimicrobianos de mayor interés clínico y epidemiológico, y determinar la base genética de las resistencias que puedan aparecer a penicilina, fluoroquinolonas y rifampicina.

3. Establecer la relación clonal de los distintos aislados mediante electroforesis en campo pulsado.

Objetivos de la aproximación epidemiológica:

1. Estimar la prevalencia de portadores asintomáticos de N. meningitidis en la población infanto-juvenil de Cantabria.

2. Identificar las características sociodemográficas de los portadores asintomáticos de N. Meningitidis.

3. Determinar los factores asociados al estado de portador asintomático de N. Meningitidis, tales como factores sociales, característica sociodemográficas o de antecedentes clínicos y vacunales

4. Analizar la relación entre las características sociodemográficas y clínicas de población de estudio, las diferentes cepas clonales aisladas y los niveles de inmunidad detectados.

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4. METODOLOGÍA CIENTÍFICA A SEGUIR

1A. Determinación del tamaño muestral: Para detectar una prevalencia de portadores asintomáticos de N. Meningitidis del 10%, con una potencia estadística del 95% y una precisión de 0,02 se necesitaría incluir en el estudio al menos a 864 individuos. Asumiendo una tasa de respuesta del 50% (similar a la encontrada en otros estudios similares) se necesitarían 432 participantes más: en total 1296 niños/jóvenes. Sin embargo, con este tamaño muestral y una prevalencia del 10% sólo encontraríamos 86 portadores. Dada la baja prevalencia de algunas cepas de meningococo (< 1%), para poder alcanzar también los objetivos de identificación de cepas y evaluación de la transmisibilidad de las mismas será necesario un mayor número de muestras positivas. Por ello, se propone al menos incluir a 5000 sujetos en el estudio, de tal forma que se obtengan aproximadamente 500 muestras positivas, que permitan obtener datos significativos particularmente para aquellas cepas (B:2a y otras) cuya baja prevalencia en portadores obliga a tomar un alto número de muestras para obtener un número significativo.

1B. Elección de la población de estudio: Prácticamente el 95% de la población de Cantabria está adscrita al SCS: en el año 2004 527.024 personas tenían tarjeta sanitaria, mientras que los datos del INE de ese mismo año indicaban una población total de 554.784 habitantes en esta CC.AA. Por ello, se propone muestrear a la población de estudio a partir de los datos de identificación de la Tarjeta Sanitaria que se solicitarán al SCS. Se realizará un muestreo por conglomerados utilizando como unidad primaria la Zona Básica de Salud (ZBS). Dentro de cada Centro de Salud se estratificará por grupos de edad de forma proporcional a la población adscrita a cada ZBS. El rango de edades se ha seleccionado en base a encuestas similares en las que se ha descrito que por debajo de los 4 años de edad el porcentaje de meningococos en nasofaringe es extremadamente bajo, mientras que el mayor porcentaje se encuentra entre los 10 y los 19 años de edad.

1C. Contacto con la población de estudio: Se contactará con los sujetos incluidos en la muestra en sus propios hogares, mediante llamada telefónica explicando el proyecto y pidiendo la autorización de los padres o tutores legales en el caso de los menores de edad. A los que acepten se los citará para la entrevista, cumplimentación de documento de consentimiento informado, toma de muestras y extracción sanguínea en su Centro de Salud.

1D. Recogida de Información: La recogida de información y muestras se hará distribuida a lo largo de un año completo (la idea es incluir las 4 estaciones del año de forma que si el estudio comienza en primavera, termine en la primavera del año siguiente lo que no condiciona el momento de inicio). A cada uno de los participantes se les realizará una entrevista individual para la cumplimentación de un

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cuestionario en el que se recogerá información sobre variables de interés epidemiológico: datos sociodemográficos, antecedentes personales, enfermedades previas, historial de vacunaciones y factores sociales. La historia de vacunaciones previas se obtendrá de las historias clínicas de Atención Primaria.

2A. Aislamiento e identificación de N. Meningitidis en portadores: En los individuos anteriormente indicados, se tomarán muestras nasofaríngeas con torunda. Estas se inocularán en medio selectivo (medio NCY modificado) (35ªC, 5% CO2, 48 h) para inhibir el crecimiento de la flora saprofita y favorecer el crecimiento y el reconocimiento de N. meningitidis. De cada placa se seleccionarán al menos tres colonias con morfología compatible con la del género Neisseria, ralizándose un subcultivo en agar chocolate para la obtención de un cultivo puro. En los casos de cocos gramnegativos, oxidasa positiva y catalasa positiva que fermenten la maltosa en medio CTA, se realizará una identificación bioquímica de N. meningitidis empleando la galería comercial API 20NH. Se conservará un aislamiento por individuo.

Los microorganismos identificados como N. Meningitidis se caracterizarán adicionalmente mediante determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo, asignación a lineas clonales mediante analisis del ADN mediante electroforesis en campo pulsado y “multilocus sequence typing”, y determinación de niveles de susceptibilidad a antimicrobianos (penicilina G, ciprofloxacino, rifampicina y ceftriaxona).

2B. Determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo: El serogrupo de todas las cepas de meningococo aisladas de portadores asintomáticos será determinado mediante aglutinación con anticuerpos policlonales obtenidos en conejos en el Instituto de Salud Carlos III. Posteriormente se determinará el serotipo y el serosubtipo mediante enzimoinmunoensayo con células completas y anticuerpos monoclonales del National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC).

2C. Electroforesis en campo pulsado: Se analizará el ADN de los aislamientos tras su digestión con NheI, empleando geles de agarosa al 1% y un equipo CHEF-DR-II (6 V/cm). Una vez teñido el gel tras la electroforesis, los diferentes perfiles se definirán considerando <=3 bandas de diferencia y se analizarán mediante el coeficiente de Dice (Optimización 1.5%, tolerancia 1%). Se organizará una base de datos de perfiles electroforéticos o pulsotipos que permita la comparación entre los diferentes grupos de cepas mediante el programa informático Bionumeric.

2D. Multilocus Sequence Typing (MLST): Las cepas de N. meningitidis, tanto las aisladas de portadores como de casos clínicos, serán asignadas a líneas clonales establecidas, mediante la aplicación de MLST. Para ello en cada cepa se amplificará y secuenciará un fragmento de alrededor de 450 pares de bases de cada uno de los 7 genes definidos para la aplicación de esta metodología, siguiendo los protocolos de

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amplificación y secuenciación accesibles en http://pubmlst.org/neisseria/mlst-info/nmeningitidis/nmeningitidis-info.shtml. En cada cepa se definirá un perfil alélico y ese perfil alélico permitirá asignar cada aislado a líneas clonales definidas.

2E. Antibiograma y caracterización de genes de resistencia a los antimicrobianos: Se determinarán las CMIs de penicilina G, ceftriaxona, ciprofloxacino y rifampicina mediante microdilución en caldo, siguiendo las recomendaciones del CLSI. Como cepas de control se emplearán Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 y Escherichia coli ATCC 25922.

Los resultados se interpretarán mediante los puntos de corte para categorización clínica de este mismo comité. En todos los aislados se determinará la producción de ß-lactamasa empleando discos de nitrocefina.

En aquellas cepas para las que se obtengan CMIs para penicilina >= 0.5 mg/L, se secuenciará el gen penA tras amplificación del mismo mediante PCR empleando cebadores específicos. Se asignará el número de alelo penA de acuerdo con la base de datos http://neisseria.org/perl/agdbnet/agdbnet.pl?file=penA.xml, y en función de los diferentes alelos se construirá un árbol filogenético de los aislados.

En las cepas para las que la CMI de ciprofloxacino sea >=0.06 mg/l se secuenciarán las regiones que determinan resistencia a quinolonas de los genes gyrA y parC.

En las cepas resistentes a rifampicina se procederá a la caracterización de un fragmento del gen rpoB de acuerdo con protocolos recomendados por el European Monitoring Group on Meningococci (EMGM), asignando alelos en función de criterios establecidos por este grupo europeo de trabajo.

5. PLAN DE TRABAJO

El proyecto se realizará en dos Instituciones: el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV), Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla (IFIMAV) y el Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) de Madrid, con la participación activa de 3 grupos:

• Unidad de Enfermedades Infecciosas. Servicio de Medicina Interna del HUMV• Servicio de Microbiología del HUMV• Laboratorio de Referencia de Neisserias del ISCIII

Con arreglo al siguiente plan de trabajo:

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Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV: Los miembros del EI de esta unidad procederán a la recogida de información y muestras, distribuida esta última a lo largo de un año completo. Se procederá a realizar una entrevista individual a cada uno de los 5000 participantes en el estudio de portadores. Igualmente, esta persona procederá a realizar la toma de muestra nasofaríngea mediante toma con hisopo de faringe posterior a través de la boca, inoculación inmediata en medio selectivo y transporte al laboratorio en un tiempo inferior a las 5 horas, tal y como recomienda el EMGM. De igual forma, se procederá a realizar la toma de muestra de sangre para la posterior determinación de la ABS. Las muestras de sangre serán congeladas a -70ºC hasta su utilización. La preparación y planificación del estudio de portadores se llevará a cabo durante los primeros 3 meses del proyecto, mientras que la toma de muestras se llevará a cabo durante los siguientes 12 meses. Toda la información obtenida de los individuos participantes en el estudio de portadores asintomáticos será codificada e introducida en una base de datos. Posteriormente, la información será analizada mediante el paquete estadístico SPSS Statistics versión 17. Inicialmente se realizará un análisis descriptivo de los datos para conocer el tipo y distribución de las variables y seleccionar las pruebas estadísticas más apropiadas. Se calcularán medias y desviaciones estándar en variables continuas y distribución de frecuencias y porcentajes en variables categóricas. Las pruebas de significación estadística a utilizar serán la prueba t de Student y el análisis de correlación y regresión para variables continuas y la prueba de chi-cuadrado para variables cualitativas. Se calculará la prevalencia de meningococo con su intervalo de confianza y se realizará un análisis de la prevalencia, calculando la razón de prevalencia (RP) y su IC 95% para identificar posibles relaciones entre los valores de la prevalencia y las distintas variables epidemiológicas recogidas. Se realizará análisis multivariable mediante regresión logística para ajustar por posibles factores de confusión. El análisis tanto de las variantes sociodemográficas como de las diferentes variantes microbiológicas a incluir (líneas clonales en portadores vs enfermos, pulsotipos vs líneas genéticas definidas por MLST etc.) se realizará a lo largo de los 3 años de duración del estudio, ya que los datos de laboratorio irán obteniéndose de forma escalonada.

Servicio de Microbiología del HUMV: Se procederá a determinar la presencia de N. meningitidis en las muestras y posteriormente procederán a conservar dos muestras de cada una de los aislados, uno que permanecerá en el Servicio y otro que será enviado al ISCIII. Las muestras se analizarán en el Servicio de microbiología del HUMV mediante electroforesis en campo pulsado y también se procederá a determinar los niveles de susceptibilidad a antimicrobianos, así como a determinar posibles mecanismos genéticos de resistencia. Este trabajo comenzará a los 3 meses de iniciado el proyecto, continuándose hasta los dos años y medio de iniciado el estudio.

Laboratorio de Referencia de Neisserias del ISCIII: Se procederá a determinar el serogrupo, serotipo y serosubtipo en todas las muestras, así como procederá a asignar dichos aislados a líneas clonales definidas mediante MLST, realizándose el análisis de las líneas clonales resultantes así como la comparación con las obtenidas en casos clínicos de Cantabria en los últimos 5 años. Se procederá a determinar las ABS en las muestras de suero seleccionadas a

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tal efecto por el grupo de Enfermedades Infecciosas del HUMV. Este trabajo se iniciará a los 4 meses de iniciado el estudio y continuará hasta transcurridos los dos años y medio del estudio.

La totalidad del EI procederá a realizar un análisis global de resultados mediante el análisis de una base de datos que incluya tanto los datos demográficos como los microbiológicos. Cada uno de los grupos analizará la parte correspondiente a su aportación al proyecto y adicionalmente se realizará un análisis global incluyendo todas las variables estudiadas. Este trabajo se llevará a cabo durante los 6 últimos meses del proyecto.

6. EXPERIENCIA DEL EQUIPO Y RECURSOS TÉCNICOS

6.1. Investigadores Principales:

· Grupo de Microbiología clínica y molecular del HUMV, Dr. Luis Martínez (Jefe de Servicio).· Grupo de epidemiología y patogenia de las enfermedades infecciosas de HUMV. Dra.

Carmen Fariñas (jefa de Área).· Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII. Dr. Julio Vázquez (director del

laboratorio).

6.2. Experiencia del Equipo:

El Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII tiene abiertas diferentes líneas de investigación en Enfermedad Meningocócica y en el mismo se han producido 3 tesis doctorales en los últimos 5 años: “Desarrollo y aplicación de un nuevo marcador molecular para Listeria monocytogenes: Multilocus Séquense Typing. Análisis de la estructura poblacional de la especie” 2004, “Genética evolutiva y variabilidad de la proteína PorB de Neisseria meningitidis” 2007, y “Nueva estrategia de tipado en Neisseria meningitidis: Polimorfismo y fragmentos de restricción del gen porA”, 2008, todas ellas con la calificación de SOBRESALIENTE “CUM LAUDE”.

Desde el año 2001 a 2005 el grupo lideró el WP5 (Antibiotic resistance) del Proyecto “Impact of meningococcal epidemiology and population biology on public health in Europe”, subvencionado por una ayuda de la Unión Europea QLK2-CT-2001-01436, fruto del cual se realizaron las siguientes publicaciones:

J Antimicrob Chemother 2002; 49: 545-547. J Infect Dis, 2003; 187: 1010-1014. Antimicrob Agents Chemother, 2003; 47: 3430-3434. J Biol Chem 2003; 278: 31529-31535. Antimicrob Agents Chemother, 2004; 48: 348-349. FEMS Microbiol Rew, 2007; 31(1):97-100. FEMS Microbiol Rew, 2007; 31(1):64-70.

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Desde el año 2004 a 2007 parte del EI recibió una ayuda del ISCIII para el proyecto sobre “Tipabilidad de Neisseria Meningitidis basada en proteína de tipo 1 y su implicación en el desarrollo de vacunas: caracterización molecular”, dando lugar a las siguientes publicaciones:

J Med Microbiol, 2004; 53: 515-518. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13: 1087–1091. Emerg Infect Dis. 2008; 14:688-689.

En el año 2006 el EI consiguió una subvención del FIS para el desarrollo del proyecto sobre “Nuevos mecanismos de resistencia frente a antimicrobianos en Neisseria meningitidis”, proyecto que ha permitido realizar la siguientes publicaciones:

Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51:2784-2792. J Antimicrob Chemother. 2008; 61:286-290. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53:796-7

Finalmente, en relación al desarrollo y aplicación de vacunas en enfermedad meningocócica, el EI ha recibido fondos de la industria farmacéutica en diferentes Convenios de Colaboración, para seguimiento de epidemiología en situación post-vacunal, para análisis y caracterización de aislados responsables de cambios en epidemiología y para estudios de variabilidad y expresión de antígenos potencialmente incluidos en vacunas en desarrollo, así como para intervenciones en salud publica mediante encuestas de portadores asintomáticos. En relación con este tema, en los últimos años el grupo ha realizado las siguientes publicaciones más relevantes:

Emerg Infect Dis 2002; 8:1512-1514. J Med Microbiol, 2002; 51:1102-1106. J Med Microbiol 2003; 52:75-77. Infect, 2003; 31:51-4. J Med Microbiol. 2003; 52:75-7. Infection. 2003; 31:392-397. Euro Surveill. 2004; 9:11-15. Forensic Sci Int. 2005; 147:13-20. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2006; 24:608-612. J Exp Med 2008; 205:1423-1434. J Clin Microbiol 2009; 47:463-465.

La Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV aunque no está realizando en estos momentos ningún estudio relacionado directamente con la enfermedad meningocócica tiene amplia experiencia en la realización de estudios epidemiológicos en el campo de las Enfermedades Infecciosas tanto comunitarias como nosocomiales. Ejemplo de ello son las siguientes publicaciones: Hosp Infect. 2008;70(1):48-52; Clin Exp Rheumatol. 2008;26(5):854-9. Scand J Infect Dis. 2007;39(3):225-30; Ann Thorac Surg. 2006 ;81(4):1284-90; Infect Control Hosp Epidemiol. 2006;27(1):85-8; Chest. 2005;128(4):2647-52.

El Servicio de Microbiología del HUMV es uno de los más activos en investigación en su campo del sistema nacional de salud, perteneciendo, entre otros, a la Red Española de investigación en patologías infecciosas, dónde ya colaboran de forma activa con el Laboratorio de Referencia de Meningococos. Trabajan en las siguientes líneas de investigación:

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• Resistencias a beta-lactámicos, fluoroquinolonas, aminoglicósidos, glicopéptidos. Multirresistencia a los antimicrobianos. Bases bioquímicas y genéticas. Impacto clínicos de la resistencia a los antimicrobianos.

• Diseminación de la resistencia a antibióticos en bacterias Gram-negativas.• Diseminación de la resistencia a antibióticos en bacterias Gram-positivas.• Evaluación de métodos para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos.• Aplicaciones de la microbiología molecular en el diagnóstico y epidemiología de

las enfermedades infecciosas.

Como ejemplo de algunas de las publicaciones más relevantes del grupo se facilitan algunas referencias: Lancet 1998, 351:797-799; Antimicrob Agents Chemother 1999, 43: 1657-1661; Antimicrob Agents Chemother 2000, 44: 2534-2536; Antimicrob Agents Chemother 2001, 45: 2390-2392; Antimicrob Agents Chemother 2002, 46: 3926-3932; J Antimicrob Chemother 2003, 51:1037-1039; J Clin Microbiol 2004, 42:1089-1094; J Clin Microbiol 2004, 42:3734-3738; FEMS Microbiol Rev, 28:79-100, 2004; Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: 2122-2125; J Antimicrob. Chemother 2005. 56:251-252; Antimicrob Agents Chemother 2005 49:3311-3316; CLin Infect Dis 2005, 41: 227-232; Clin Microbiol Infect 2006. 12: 440-445; J Clin Microbiol 2006, 44 :2672; Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51:2236-9; J Antimicrob Chemother. 2007, 60:855-63; J. Bacteriol. 2007, 189:8546-55; Infect Immun. 2007 Feb;75(2):774-80; Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52:1503-5; Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52: 2297-2299; Pediatr Infect Dis J. 2008, 27: 602-604; BMC Microbiol. 2008, 8:148; Antimicrob Agents Chemother. 2009, 53:267-270; Antimicrob Agents Chemother. 2009, 53:1177-1184; J Clin Microbiol 2009, 47: 827-829.

6.3. Recursos Técnicos.

El Proyecto cuenta con toda la infraestructura de uso común del Hospital Marqués de Valdecilla de Santander, así como del Instituto de Salud Carlos III de Madrid, incluyendo Unidades de preparación de Medios y Material, Unidades de Secuenciación, etc. También se cuenta con los medios de cada uno de los grupos participantes que incluyen congeladores, aparatos de electroforesis en campo pulsado, lectores de enzimoinmunoensayo, termocicladores para PCR y secuenciación etc.

Tanto los recursos técnicos como los expertos necesarios para la buena realización del proyecto están involucrados y garantizados en el mismo.

Además, existe un compromiso institucional desde el IFIMAV para el apoyo y la buena consecución del proyecto.

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7. RELEVANCIA Y BENEFICIOS PARA EL SISTEMA

1. Por un lado, el poder entender alguna de las razones que expliquen altas tasas de incidencia de enfermedad invasiva meningocócica puede facilitar los procesos de intervenciones de Salud Publica en el control y prevencion. Conocer cuales son las cepas circulantes, su posible grado de virulencia en función de su presencia o no en casos clínicos, y el nivel de inmunidad natural en la población, son instrumentos fundamentales para toma de decisiones con las vacunas frente a serogrupo B que están en desarrollo.

2. El proyecto planteado, previsiblemente podría generar al menos 4 manuscritos para publicar en revistas con impacto entre 4 y 5. Los temas que podrían generar este tipo de publicaciones serían: el análisis de factores asociados al estado de portador asintomático, la descripcion de clones circulantes y su relación con los clones de casos clínicos, la descripción de los niveles de inmunidad natural frente a diferentes líneas clonales y su posible asociación con las tasas de incidencia de la enfermedad, y la descripción de los niveles de susceptibilidad frente a antimicrobianos en la población de meningococos procedente de portadores asintomáticos, como reservorio potencial de resistencia para los clones virulentos. Asimismo, el proyecto previsiblemente generará al menos 4 o 5 comunicaciones en Reuniones Científicas de ambito Internacional, tales como la Reunión de la Sociedad Europea de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, la Conferencia Internacional de Neisserias Patógenas y la Reunión del Grupo Europeo para Monitorización de Meningococos.

3. Aunque no analizado a priori, sería posible que los resultados del proyecto pudieran dar lugar a resultados, no sólo protocolizables sino también protegibles mediante derechos de propiedad industrial/intelectual.

Entender el porqué de la alta incidencia de la meningitis en nuestra región es la única vía para bajar dichos niveles y, con ello, mejorar la salud de nuestros ciudadanos y reducir costes en gasto sanitario.

Los resultados obtenidos, además, constituirán una buena base de trabajo para avanzar en la frontera del conocimiento de esta enfermedad y podrán tener una importante repercusión en su campo mediante la publicación y difusión activa de sus resultados.

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PRESUPUESTO

Un proyecto como el planteado requiere de la aportación de un alto número de personas, por el tamaño de la población a muestrear y por la cantidad de técnicas diferentes a aplicar. Por lo tanto, el Equipo Investigador ha valorado la necesidad de contratación de dos personas para la Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV para la toma de muestras, entrevista con los participantes en el estudio de portadores asintomáticos y análisis de las múltiples variables incluidas (un licenciado en medicina y una enfermera/o), una persona para el Servicio de Microbiología del HUMV (1 licenciada/o) y una persona para el laboratorio de Referencia de Neisserias del ISCIII (1 licenciada/o).

La adquisición de torundas para la toma de muestras y tubos para extracción de sangre constituyen la herramienta básica para poder obtener el material propio del estudio.

Por otra parte, la unica forma de definir con precisión las líneas clonales circulantes es el MLST, técnica que requiere de la secuenciación de fragmentos de 7 genes lo que supone un muy elevado número de reacciones de amplificación y secuencia, y lo mismo puede decirse en el caso del análisis de los mecanismos genéticos de las posibles resistencias que vayamos a ancontrar. Por otra parte, el Equipo Investigador ha considerado imprescindible el analizar los aislados mediante campo pulsado con objeto de poder definir con mayor precisión posibles variantes dentro de las lineas clonales. La solicitud de fondos para llevar a cabo esta metodología se ajusta al plan de trabajo contemplado.

Finalmente, la solicitud de viajes y dietas se ajusta a la existencia de 3 grupos de trabajo participando en el Equipo de Investigación, y responde al potencial expresado en cuanto al impacto bibliométrico del Proyecto solicitado.

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PARTIDA COSTE (EUR)

3 Licenciados

1 enfermera/o

1ª año 75.6002ª año 77.1123ª año 78.654

1ª año 22.3902ª año 22.8383ª año 23.295

SUBTOTAL 299.889

2. Gastos de ejecución

a) Adquisición de bienes y contratación de servicios (Inventariable, fungible y otros gastos)Torundas para toma de muestrasTubos para extracciones de sangreMedios de cultivo y reactivos para identificaciónMaterial para antibiogramasReactivos y material de plástico para PCR y PFGEReactivos y material de plástico para SecuenciaciónReactivos para determinación de ABS

1ª año 24.2002ª año 29.5003ª año 26.000

SUBTOTAL 79.700

SUBVENCION CONCEDIDA POR EL FIS (Fondo investigación Sanitaria del ISCIII, PLAN NACIONAL I+D) *

70.000

b) Viajes y dietasAsistencia a 3 Reuniones Científicas de Carácter Internacional para presentación de Resultados

1ª año 02ª año 3.5003ª año 3.500

SUBTOTAL 7.000

SUBVENCION CONCEDIDA POR EL FIS (Fondo investigación Sanitaria del ISCIII, PLAN NACIONAL I+D) *

1.500

SUBTOTAL GASTOS EJECUCIÓN CONSIDERADA LA SUBVENCIÓN DEL FIS 315.089GASTOS DE GESTIÓN 31.509TOTAL PROYECTO PENDIENTE FINANCIACIÓN 346.598

* El proyecto ha sido presentado a la convocatoria del Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) 2009 del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) del Plan Nacional de I+D evaluada por la Agencia Nacional de Evaluación y Prospectiva (ANEP) resultando elegido y concedida la subvención señalada en la tabla de presupuesto del proyecto.

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ANEXO I

BIBLIOGRAFÍA MÁS RELEVANTE DEL ESTADO DEL

ARTE

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1. Ala’Aldeen DA, Neal KR, Ait-Tahar K, Nguyen-Van-Tam JS, English A, Falla TJ, Hawkey PM & Slack RC (2000). Dynamics of meningococcal long-term carriage among university students and their implications for mass vaccination. J Clin Microbiol; 38: 2311–2316.

2. Broome CV (1986). The carrier state: Neisseria meningitidis. J Antimicrob Chemother; 18(Suppl. A): 25–34.

3. Cartwright K (1995). Meningococcal carriage and disease. Meningococcal Disease (Cartwright K, ed), pp. 115–146. John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK.

4. Cartwright K (2001). Epidemiology, surveillance, and population biology: carriage studies. Meningococcal Disease – Methods and Protocols (Pollard AJ & Maiden MCJ, eds), pp. 293–311. Humana Press Inc, Totowa, NJ.

5. Caugant DA, Kristiansen B-E, Fr_holm LO, B_vre K & Selander RK (1988). Clonal diversity of Neisseria meningitidis from a population of asymptomatic carriers. Infect Immun; 56: 2060–2068.

6. Caugant DA, H_iby EA, Rosenqvist E, Fr_holm LO & Selander RK (1992). Transmission of Neisseria meningitidis among asymptomatic military recruits and antibody analysis. Epidemiol Infect; 109: 241–253.

7. Caugant DA, Tzanakaki G, Kriz P (2007). Lessons from meningococcal carriage studies. FEMS Microbiol Rev; 31: 52–63.

8. Claus H, Maiden MC, Wilson DJ, McCarthy ND, Jolley KA, Urwin R, Hessler F, Frosch M & Vogel U (2005). Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis; 191: 1263–1271.

9. Jolley KA, Wilson DJ, Kriz P, McVean G & Maiden MC (2005). The influence of mutation, recombination, population history, and selection on patterns of genetic diversity in Neisseria meningitidis. Mol Biol Evol; 22: 562–569.

10. Jordens JZ, Williams JN, Jones GR, Christodoulides M & Heckels JE (2004). Development of immunity to serogroup B meningococci during carriage of Neisseria meningitidis in a cohort of university students. Infect Immun; 72: 6503–6510.

11. Maiden MCJ (2004). Dynamics of bacterial carriage and disease: lessons from the meningococcus. Hot Topics in Infection and Immunity in Children (Pollard AJ,McCracken GH Jr & Finn A, eds), pp. 23–29. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.

12. Yazdankhah S, Kriz P, Tzanakaki G, Kremastinou Kalmusova J, Musilek M, Alvestad T, Jolley K, Caugant DA & Maiden MC (2004). Distribution of serogroups and genotypes among disease-associated and carried isolates of Neisseria meningitidis from the Czech Republic, Greece and Norway. J Clin Microbiol; 42: 5146–5153.

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