Praktikum 3

dokončení

Spermatogeneze- viz ukázka v mikroskopu

1 – leptotene/zygoten

2 – pachyten

3 – mladší spermatidy

4 – starší spermatidy

5 – Sertoliho buňky

6 - spermatogonie

Preimplantační diagnostika• Genetická, popř. jiná vyšetření vajíčka či embrya

prováděná před implantací do těla matky.• Využíváme

– Pólové tělísko– 1 – 2 buňky z 8-buněčného embrya– Větší počet buněk z blastocysty

Etické problémy asistované reprodukce

• Náhradní (surogátní) matky

– Kdo je matka?

• Dárcovství spermie

– Anonymita?

– Legalizovaná nevěra?

• IVF

– osud nadbytečných embryí – pokusy na lidech?

– vícečetná těhotenství – fetocida

Test

• 5 otázek

• 10 minut

• Nezapomeňte uvést své jméno, kruh a verzi, kterou

píšete.

• U otázek zaměřených na výběr z více alternativ je

možná 1 i více správných odpovědí. Možný je i krátký

doprovodný komentář.

• U otázek zaměřených na konkrétní odpověď nepsat

„romány“.

Praktikum 4

Kultivace buněk in vitro

Kultury

• Orgánové

• Tkáňové

• Buněčné

– Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se

samostatně dělí – tak vzniká buněčná

kultura .

Oba termíny se často zaměňují.

Alexis Carrel (1873 – 1944)

Složení média• základní anorganické živiny• stopové prvky

• stabilizátory pH (CO32-/HCO3

-, HPO42-/H2PO4

-)– pH = 7,2 – 7,4

• glukóza• aminokyseliny• vitaminy a jiné složky různých enzymů• mastné kyseliny a lipidy• specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení • sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)• antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)

Kultivační podmínky

• Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami.

• Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit.

• V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý.

Práce ve sterilním boxu

Pasážování buněk

• Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru.

• Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky

Buněčné kultury

• živočišných buněk

– savčích buněk (včetně

lidských)

• rostlinných buněk

– explantátové kultury

– význam ve šlechtitelství a

genetickém inženýrství –

produkce transgenních

plodin

kultura makrofágů

explantátová kultura – tzv. kalus

Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme:

• kultury epiteliálních buněk

• k. fibroblastoidních buněk

• k. lymfoblastoidních buněk

• k. neuroblastoidních buněk

Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin:

• Primokultury (též primární kultury)– obsahují buňky čerstvě izolované z organismu– existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se

rozmnožily, převést do nového média.

• Buněčné kmeny– vycházejí z primárních kultur– kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň

jednou pasážovány – zhruba po 40-50 děleních zanikají.

• Buněčné linie (též permanentní buněčné linie)– mají charakter nádorových buněk– neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho– vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky

původně izolované z nádorů

log N

čas

lag

log

stacionární fáze

úbytek

Růstová křivka buněčné kultury

Referát

Nahradí experimenty s buněčnými kulturami pokusy na zvířatech?

Praktické úkoly

viz Praktická cvičení

str. 21 – 24 – Kapitola 5

Str. 21 – 5.4 Úkol 1: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem

• Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu.

• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobky s živou buněčnou kulturou a s fixovanou a obarvenou buněčnou kulturou.

Str. 21 – 5.5 Úkol 2: Počítání buněk

v suspenzi

ukázka – viz mikroskop u katedry

Str. 22 – 5.6 Úkol 3: Pozorování buněk HeLa

• Buňky v předložené Petriho misce byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří.

• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x.

• Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar.

Str. 22 – 5.7 Úkol 4: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO

• Spočtěte jednotlivé chromozomy na fotografii a povšimněte si jejich utváření.

• Zkuste vysvětlit své výsledky.

karyotyp

Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu

fúze buněk

myší myelomová buňka

lidská buňka

Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu

• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.

– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.

– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.

– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom

z hodnocených klonů.

Průřez semenotvorným kanálkem

1 – leptotene/zygoten

2 – pachyten

3 – mladší spermatidy

4 – starší spermatidy

5 – Sertoliho buňky

6 - spermatogonie

Výsledky úkolů

Úkol 3: Pozorování buněk HeLa

Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.

Úkol 4: Chromozomy CHO buněk

21 chromozomů

7

6

4

4

5

6

3

7

Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře.

Karyotyp buněk CHO

21 chromozomů

Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.

Karyotyp normální a nádorové buňky

normální buňka muže

nádorová buňka

Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.

Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu

• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.

– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.

Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.

Gen pro enzym B leží na chromozomu X.

Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.

Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených

chromozomů.

Praktická cvičení

str. 22 – 5.8 Úkol 5

Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace

buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi

nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek. • testování toxicity, resp. genotoxicity• klinická genetika – prenatální a postnatální

vyšetření• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů

Příští praktikum

• téma – Chromozomové vyšetření

– Praktická cvičení – kapitola 6

– Klinická cytogenetika I. – kapitola 9

• test – dosavadní učivo z praktik

Na shledanou!

Hezké jarní dny přeje E.K.