praktikum 5 07
TRANSCRIPT
Praktikum 4 - dokončení
karyotyp
Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu
fúze buněk
myší myelomová buňka
lidská buňka
Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu
• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.
– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.
Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.
Gen pro enzym B leží na chromozomu X.
Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.
Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených
chromozomů.
Praktická cvičení
str. 22 – 5.8 Úkol 5
Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace
buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi
nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek, které jsou
nezbytné při diagnostice mnoha onemocnění. • testování účinků léčiv a jiných chemických látek,
které by mohly ohrozit zdraví člověka, stanovení genotoxicity
• klinická genetika – prenatální a postnatální vyšetření
• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů
Praktikum 5
Chromozomová analýza
Karyotyp
Vyšetření geneticky podmíněných onemocnění
rodinagenealogické
vyšetření
chromozomy
cytogenetické vyšetření
DNAmolekulárně-
biologické vyšetření
pacient
Test
• 10 otázek (po 1 bodu)
• 15 minut
• Nezapomeňte uvést své jméno, kruh a
verzi, kterou píšete.
• Nepsat „romány“.
Cytogenetické vyšetření• Vyšetření karyotypu
• Stanovení chromozomových aberací– Numerických
• Změny počtu chromozomů
– Strukturních • Změny struktury chromozomů
• Význam – Diagnostika poruch způsobených chromozomovými
aberacemi
– Stanovení rizika pro potomstvo
Cytogenetická vyšetření
• Prenatální
– Vyšetření plodu
• Postnatální
– Vyšetření již narozeného jedince
plo
d
chorion
amnion
pupečník
Biopsie choriových klků
(CVS)
Amniocentéza
Kordocentéza
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.Závěr prenatálních
vyšetření
Týdny těhotenstvíPrenatální vyšetření
Choriové klky
Biopsie choriových klků
od 11. týdne těhotenství
Transabdominální odběr Transvaginální (transcervikální) odběr
Biopsie choriových klků
tkáň choriových klků
prohlídka pod stereomikroskopem
Prenatální vyšetření
Biopsie choriových klků
Amniocentéza
Kordocentéza
11. 16. 20. Těhotenství (týdny)
12.-20. týdenUltrazvuk
Biochemický test v 16.týdnuAFP, hCG, E3, PAPP
24.
ZÁVĚR PRENATÁLNÍCH
VYŠETŘENÍ
Ultrazvukové vyšetření
Provádíme plošně všem těhotným ženám.
Ultrazvukový záznam
Nuchální translucence
normální zvýšená
Možnost postižení plodu Downovým syndromem
Biochemický test
• Vyšetření tzv. biochemických „markerů“
• AFP – alfa-fetoprotein
• hCG – choriogonadotropin
• uE3 – nekonjugovaný estriol
• PAPP – pregnancy associated plasmatic protein
• V současnosti se používají různé kombinace markerů.
• Odchylky koncentrace upozorňují na možné (ne však
jisté) postižení plodu.
Amniocentéza
zpravidla od 15 - 16. týdne těhotenství
Amniocentéza
Odebíráme cca 20 ml plodové vody – po centrifugaci buňky kultivujeme a plodovou vodu použijeme k
biochemické analýze.
Kordocentéza
• Percutaneous umbilical blood sampling.
• Odběr fetální krve z placentálního úponu vena umbilicalis
provádíme od 20. týdne těhotenství
Kordocentéza
Ke všem prenatálním odběrům
musí těhotná žena podepsat
informovaný souhlas (pozitivní
revers), resp. negativní revers.
plo
d
chorion
amnion
pupečník
Biopsie choriových klků
(CVS)
Amniocentéza
Kordocentéza
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.Závěr prenatálních
vyšetření
Týdny těhotenstvíPrenatální vyšetření
Cytogenetická vyšetření
• Prenatální
– Vyšetření plodu
• Postnatální
– Vyšetření již narozeného jedince
Indikace pro postnatální chromozomová vyšetření
• Viz Klinická cytogenetika I.
• str. 54 – 57 subkapitola 9.2
– str. 56 – 9.2.3
Vzorky tkání pro postnatální vyšetření
• Periferní krev
• Fibroblasty z kožní
biopsie
• Kostní dřeň
(hemoblastózy)
• Nádor
• Sekční materiál (v
případě úmrtí pacienta)
Jak odebrat periferní krev pro chromozomové vyšetření?
• Desinfikovat místo
vpichu alkoholem
• Krev do zkumavky s
heparinem, resp.
Lithium-heparinem
• (Do EDTA odebíráme
krev pouze pro izolaci
DNA.)
Kultivace periferní krve
• Viz skripta klinická cytogenetika I., str.57 – 9.2.4
• Fytohemaglutinin – vysoce imunogenní látka – působí proliferaci lymfocytů
Klasické barvení chromozomů
Používáme pouze roztok Giemsa-Romanowski
6 – 12
13 – 15
19 – 20 21 – 22
4 – 5
G-pruhování (GTG)Trypsin + Giemsa
Viz Praktická cvičení – str. 25/obr. 6.1, str. 27/obr.6.3
Každý G-pruh má své číslo
Xq27.3
Chromozom X s očíslovanými G-pruhy
Syndrom fragilního X
Další metody barvení chromozomů
• R-pruhování
• Q-pruhování
• C-pruhování
• Ag-NOR
Viz skripta Klinická cytogenetika I., kapitola 9 (str. 58 – 59)
Metoda HRT
• Speciální kultivační technika
• Umožňuje získání prometafázních chromozomů
• Vhodná pro zjištění strukturních přestaveb malého rozsahu
Úkoly• viz Praktická cvičení• Str. 25
– 6.3 Úkol 1 Pozorování lidských chromozomů (preparát – postup při pozorování stejný jako v předchozích praktikách)
• Str. 26– 6.4 Úkol 2 Určení konstituce pohlavních chromozomů
(fotografie – počítáme akrocentry)
• Str. 27– 6.5 Úkol 3 Sestavení karyotypu (krabička s obrázky
chromozomů – sestavte karyotyp podle předlohy)
Výsledky zkontroluje vedoucí praktika nebo paní Tůmová.
Úkol 2: Určení konstituce pohlavních chromozomů
• Na předložené fotografii lidských chromozomů obarvených metodou G-pruhování zjistěte, zda se jedná o buňku muže nebo ženy.
• Chromozomy lze určit srovnáním s přiloženou předlohou.
• Jednodušší je však spočítat všechny malé akrocentrické chromozomy
Úkol 2
21 22 Y
muž
žena
Úkol 3
• Viz krabička a předloha
Výsledky
Zápis karyotypu podle ISCN 2005
• Normální nález– Muž … 46,XY– Žena … 46,XX
V zápisu uvádíme:
Celkový počet všech chromozomů, konstituci gonozomů
46,XY
Prosíme, vraťte preparáty do krabiček.
Příští praktikum
• Téma: Numerické chromozomové aberace
• Skripta
– Praktická cvičení – str. 28 – 33
– Klinická cytogenetika I. – kapitoly 10, 11
• Test nebude!
Na shledanou!
Obrázek převzat z publikace J. Šmardy: Člověk v proudu dědičnosti, ilustrace Dr. P. Ondrovčíka