Praktikum 2

Buněčný cyklus

Mitóza

Referát

Konfokální mikroskopie

Konfokální

mikroskop

Test

• 6 minut

• Uveďte své jméno, kruh a verzi

• Nepište nic do zadání!

• 1 i více správných odpovědí, v případě

nejasností lze doplnit krátký komentář.

• Poslední otázka je zaměřena na krátkou

odpověď.

Skripta – str.13 – 3.3Úkol 2: Změny koncentrace DNA během

buněčného cyklu• Graf dokumentuje početní

distribuci buněk kostní dřeně ve vztahu ke koncentraci jaderné DNA.

• Buňky byly obarveny fluorescenčním barvivem, které se váže na DNA, a s využitím průtokové cytometrie (FACS) rozděleny podle své koncentrace DNA.

Úkol 2: zadání• Vysvětlete, proč se ve

vzorku vyskytují buňky o různé koncentraci DNA.

• Objasněte, proč není početní rozdělení buněk rovnoměrné a proč má křivka dva vrcholy.

• Lze z grafu vyčíst relativní dobu trvání jednotlivých fází buněčného cyklu ?

Buněčný cyklus

interfáze

M

Buněčný cyklus

G1G2

S

M

Buněčný cyklus

syntéza DNA

S

G2

G1

M

G0 - fáze

Kontrolní body buněčného cyklu

Skripta – str.13 – 3.3 Úkol 2 – zadání

• Vysvětlete, proč se ve vzorku vyskytují buňky o různé koncentraci DNA.

• Objasněte, proč je početní rozdělení buněk nerovnoměrné a proč má křivka dva vrcholy.

• Lze z grafu vyčíst relativní dobu trvání jednotlivých fází buněčného cyklu ?

Úkol 2 – řešení

S

0

po

čet

bu

něk

G1

G2 + M

x xRelativní koncentrace DNA na buňku

1x 2x

Úkol 2 - závěr• Vycházíme z předpokladu, že

kostní dřeň obsahuje buňky, které se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu, nikoli však ve fázi G0.

• Vrchol A – buňky v G1 fázi – mají poloviční koncentraci oproti buňkám v G2 a M fázi – vrchol B.

• Oblast mezi dvěma vrcholy – buňky v S fázi (mají rozdílnou koncentraci DNA, proto nevytvářejí nápadný vrchol).

S

0

po

čet

bu

něk

G1

G2 + M

Relativní koncentrace DNA na buňku

1x 2x

Ukázky vyšetření „DNA-ploidie“

Aneuploidie u Barrettova jícnu

Barrettův jícen - prekanceróza

Aneuploidie v Barrettově jícnu

Aneuploidní buňky

Jiný výsledek – linie nádorových buněk

Zvýšený podíl buněk v S-fázi

svědčí o intenzivní proliferaci

Mitóza

• Jaderné dělení

– Profáze

– (Prometafáze)

– Metafáze

– Anafáze

– Telofáze

• Buněčné dělení

– cytokineze

Str. 14 – 3.5 Úkol 3: Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule

• Preparáty byly připraveny z vrcholů kořínků cibule kuchyňské (Allium cepa).

• Kořínky byly po fixaci ve směsi ethanol – kyselina octová (3 : 1) přeneseny na krátkou dobu do roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol.dm-3 (ohřátého na 60ºC) a pak na 30 – 90 minut do Schiffova reagens (roztok fuchsinu odbarvený oxidem siřičitým).

• Struktury obsahující DNA se vyloučeným fuchsinem zbarvily fialově.

Princip Feulgenovy nukleární reakce.

• Kyselou hydrolýzou

DNA dochází

k odštěpení bází

• Volné aldehydické

skupiny deoxyribózy

oxidují redukovaný

fuchsin na původní

fialovou formu.

Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule

• Prohlédněte pod mikroskopem roztlakový preparát kořínků cibule barvený Feulgenovou reakcí a najděte v něm dělící se buňky.

• K vyhledání buněk použijte objektiv o zvětšení 5-10x, k pozorování mitózy je nevhodnější objektiv 40x – 45x. Najděte a podle předložených fotografií určete jednotlivé fáze mitózy.

Mitóza v koříncích cibule

Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule

• Spočítejte cca 20-30 dělících se buněk a stanovte tzv. mitotický diferenciál, tj. zastoupení buněk v jednotlivých fázích mitózy (tj. v profázi, metafázi, anafázi a telofázi). Podíly buněk v jednotlivých fázích zapište do tabulky.

• Po vyplnění tabulky srovnejte údaje a zjistěte, zda jsou počty buněk v jednotlivých fázích přibližně stejné anebo buňky v určité fázi popř. fázích převažují. Vysvětlete své výsledky.

Mitotický diferenciál

Fáze mitózy Průběžný počet Celkový počet

ProfázeMetafáz

eAnafázeTelofáz

e

12

4

6

3

Str. 11 – 2.7 Úkol 4: Pozorování metafázních chromozomů z buněk

kostní dřeně myši• Pro získání preparátů byly čerstvě

usmrceným myším odpreparovány femury a z nich výplachem získána kostní dřeň. Ta byla přenesena do hypotonického roztoku a dále zpracována stejně jako buňky periferní krve (viz předchozí praktika).

• Skla s chromozomy byla obarvena roztokem Giemsa-Romanowski.

Pozorování chromozomů z buněk kostní dřeně myši

• Pozorujte chromozomy kostní dřeně myši na trvalém preparátu. K vyhledání buněk použijte objektiv o zvětšení 5-10x, k pozorování chromozomů nejlépe objektiv 40 – 45x.

• Obraz v mikroskopu srovnejte s přiloženou fotografií (zobrazuje chromozomy při zvětšení cca 1000x).

• Spočítejte, kolik chromozomů obsahuje somatická buňka myši. Použijte fotografii nebo spočtěte chromozomy přímo v zorném poli mikroskopu.

• Určete, který typ (popř. které typy) chromozomů je přítomen (popř. jsou přítomny) v buňkách myši

Myší chromozomy

Výsledky úkolů

Úkol 3 - mitóza

• Mitotický diferenciál

– Buňky v různých fázích mitózy mají rozdílné

zastoupení.

– Nejvíce buněk lze nalézt v profázi – tato fáze

trvá nejdéle.

Mitóza u nádorových buněkPorucha regulace buněčného cyklu vede ke vzniku

nádorových buněk. Ty se zpravidla vyznačují vysokou mitotickou aktivitou, která může mít za následek poruchy

rozchodu (nondisjunkce) chromozomů.

Chromozomy myši

telocentrické chromozomy

Myší chromozomy

10

10

11

9

celkem 40 chromozomů

Karyotyp myši - samice

Význam studia myších chromozomů

– testování mutagenity (genotoxicity)

Laboratorním myším byla aplikována látka s předpokládanými mutagenními účinky. Na každém obrázku jsou chromozomy z jedné myší somatické buňky. Zjistěte a popište chromozomové aberace,

které lze na nich pozorovat.

tetraploidie zlom

Příští praktika

• Praktická cvičení – kapitola 4: Meióza,

gametogeneze – str. 16 – 19

• Klinická cytogenetika I. – kapitola 6 – str. 38 – 43

• Referát: Etické otázky asistované reprodukce

• Test – mikroskopy, buněčný cyklus, mitóza,

základní poznatky o struktuře DNA a její replikaci

Na shledanou!

Fluorescence Activated Cell Sorter

• přístroj, jenž měří koncentraci DNA v každé buňce podle intenzity fluorescence – tzv. průtoková cytometrie

• Tento postup se mimo jiné používá také k měření koncentrace DNA v buňkách pacientů s hematologickými malignitami, popř. s nádory prsu, močového měchýře a střeva.

zpět k úkolu 1

Profáze

zpět

Metafáze

zpět

Anafáze

zpět

Telofáze

zpět

Cytokineze

zpět