pierre-yves turpin

Spectroscopies optiquesSpectroscopies optiques

Pierre-Yves TURPINPierre-Yves TURPINProfesseur à lProfesseur à l’’Université Pierre et Marie CurieUniversité Pierre et Marie Curie

Absorption électronique & Dichroïsme circulaire

Fluorescence & Développements : FRET, FRAP et FLIM

Spectroscopies vibrationnelles : absorption InfraRouge,

diffusions Raman et Raman résonnant

Plan

Rayonnement électromagnétique

2 trains d’onde perpendiculaires, électrique (E) etmagnétique (M), se déplaçant à la vitesse de la lumière

dans le milieu considéré

Lumière ?

Lumière

Longueur d’onde de l’onde EM : ! (en m, cm, !m, nm...)Fréquence de l’onde : " = c/! (en Hz), avec c = 3.108 m.s-1

Energie du photon associé : E = h ", avec h = 6,63.10-34 J.sNombre d’onde : "’ = 1/ ! = "/c (en cm-1)

Etotal = Eorientation spin électronique

+ Eorientation spin nucléaire

+ Etranslation + Erotation

+ Evibration + Eélectronique

EkT

-!nhaut

nbas= exp ( )

Boltzmann : rapport des populationsdes niveaux d’énergie

avec k = 1,38 10-23 J.K-1

Matière

Etotal = Eorientation spin électronique

+ Eorientation spin nucléaire

+ Etranslation

+ Erotation

+ Evibration

+ Eélectronique

continu

10-3 J/mole radio

10 J/mole microondes

1-40 kJ/mole IR

105-106kJ/mole UV-Vis

Interaction Lumière-Matière

Principalement trois types:

Diffusion : changement de direction de la lumière sanschangement d’énergie (sauf exceptionvibrationnelle des noyaux)


Absorption électronique : énergie EM transférée auxélectrons de la molécule (transition d’un état de”basse

énergie” à un état de “haute énergie”)

E0

En

h!


Emission : énergie EM perdue par la molécule sous la forme d’unphoton (transition «"radiative"» d’un état de “haute énergie” à un

état de “basse énergie”)

E0

En

h!

Dans les molécules, les orbitales électroniques décrivant les niveaux d’énergie sont descombinaisons d’orbitales électroniques atomiques.

exemple:

# et # “bonding”

#* et #* “antibonding”

électronsélectrons moléculesmolécules$$

Absorption électronique

Transitions entre différents niveaux d’énergie électroniques pourcertaines molécules : des «"chromophores"».

Soumis à une énergie lumineuse donnée (photon), un électron peut êtretransféré d’une orbitale moléculaire à une autre... si le résultatcorrespond à un mouvement asymétrique des charges.

HOMO

LUMO

Loi de Beer-Lambert

Sur une épaisseur traversée dx, l’intensité suit une loi de décroissance du 1er ordre : dI / dx = - I c "(!)

soit - dI / I = "(!) c dx

intégration sur l : ln (I0 / It) = "(!) l c

ou It = I0 exp (- "(!) l c)

I0 Itransmis It

l

échantillon homogène, concentration c

une fraction constante de lumière est absorbée pour chaque intervalle dx $$

Loi de Beer-Lambert

It = I0 exp (- "(!) l c)

A(!) est la «"densité optique"» ou DO : elle varie avec !

%(!) est le «"coefficient d’extinction molaire"» = "(!) / 2.303

* variation de I en fonction de la distance l traversée, à c donnée

* variation de la concentration c sur une distance donnée

A(!) = log10 I0/It = %(!) c l

Absorption

On peut aussi définir la transmission : T = It / I0

ou le % de transmission : %T = 100 T liés à A : A = - log10 T

Absorption

absorbée observée


S0

S1

S2

!0 !4 !'0 !'4

Absorption

A! = "! l c

"! est une mesure du “pouvoir d’absorption” , et il est lié à la

probabilité de transition électronique à une ! donnée.

Molécule !max (nm) " à !max (M-1. cm-1)

Trytophane 280 5600

219 47000

A

!

spectre d’absorption du Trp

Absorption

Molécule !max (nm) " à !max (M-1. cm-1)

Trytophane 280 5600

219 47000

Adénine 260,5 13400

NAD+ 260 18000

ADN 258 6600

Applications de l’absorption

caractérisationspectrale des

espèces


conjugaisonschimiques

shiftbathochromiques


effet de solvant :

[1,2,4]Triazine


effet de solvant: pH

pH ! moins d’électrons “non-bonding”

coefficient " moins élevé

délocalisation diminuée hypsochromique

!, " = 280, 1430 254, 169

NH2

NH3+

Aniline Anilinium ion

H2O OH-+ +


effet de solvant: pH

Tyrosine

utilisation: détermination de l’environnement, ou interne/externe

Polarisation

Polarisation circulaire droite

ComposanteComposante : verticale: verticale horizontalehorizontale

Polarisation

combinaison d’ondes circulaires droite + gauche avec

amplitudes égales=

lumière polarisée linéaire

Dichroïsme circulaire

Des molécules chirales ou asymétriques, peuvent absorber différemment la lumièrepolarisée à droite et à gauche:


Quelques molécules chirales ou asymétriques…

agarose ADN protéine


Mesure:

source

polariseurlinéaire

modulateur

échantillon traitement

&A = AG-AD = &% c l avec &% = %G-%D

A ! donnée, on a:

&%! est le dichroïsme circulaire molaire

Applications du DC

antiparallel antiparallel ''--sheetsheet

''-turn-turn

((-helix-helix

otherother

Protéines

Applications du DC

Protéines

chymotrypsinchymotrypsin

lysozymelysozyme

triosephosphate isomerasetriosephosphate isomerase

myoglobinmyoglobin

Applications du DC

Protéines

21ºC :21ºC :

((-helical signal-helical signal

81ºC : a coil-like81ºC : a coil-likesignalsignal

Applications du DC

Autres

Applications du DC

Autres


S0

S1

S2

!0 !4 !'0 !'4

E

relaxation (ou «"conversion interne"») non-radiative : pas par émission de photon,

mais par dissipation de chaleur

Fluorescence

S0

S1

S2

!0 !4 !'0 !'4

E

!0< !''0>relaxation radiative : par émissionde photon à partir de S1

Relaxation non radiative rapideRelaxation non radiative rapidevers Svers S11 (chaleur) (chaleur)

Diagramme de Jablonski

EN

ER

GY

S0

S1

S2

T2

T1

ABS FLUO I.C.

ABS - Absorbance S 0.1.2 - Singlet Electronic Energy Levels

FL - Fluorescence T 1,2 - Corresponding Triplet States

I.C.- Nonradiative Internal Conversion IsC - Intersystem Crossing PH - Phosphorescence

IsC

IsC

PHOSPHO

[Vibrational sublevels]

Vibrational energy levels

Rotational energy levels

Electronic energy levels

Singlet States Triplet States

Triplet state

FLUO : transition FLUO : transition singulet-singulet singulet-singulet PHOSPHO : transition «PHOSPHO : transition «""interditeinterdite"»"» triplet-singulettriplet-singulet

Mesure

Spectres:

mesure de la lumière émise uniquement

solutions diluées, pour éviter l’auto-absorption de la lumière émise

L’intensité est liée à la probabilité de transition (constante kf en s-1)

- d'excitation de fluorescence = I (!émission fixe)

- d'émission de fluorescence = I (!excitation fixe)

Fluorescence

495 nm 520 nm

Stokes Shift is 25 nmFluorescein

molecule

Flu

ore

scen

ce I

nte

nsi

ty

Wavelength

«"Déplacement de Stokes"» : la fluorescence et toujours déplacée vers le rougede l’absorption électronqiue

Spectres

Ethidium

PE

cis-Parinaric acid

Texas Red

PE-TR Conj.

PI

FITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm

Spectres

Spectre d'émission : la forme est indépendante de !exc

mais l'intensité est proportionnelle à %(!exc)$ Spectre d’excitation

Spectres

Mélange de 2 fluorophores

Spectres


Spectres


Spectres

Nuclease

Folded protein

Unfolded protein

Spectres

290 330 370 410 450

wavelength, nm

A

B

C

D

E

abc

abc

d

a

bc

d

ab

c

abc

Ca-parvalbumin: Trp est enfoui, 305 nm

Ca-free parvalbumin: tryptophan est exposé au solvant

Trp dans différents solvants: hexane, trehalose glass,

glycerol, water

Paramètres de la fluorescence

)f:

Durée de vie defluorescence

Intensité

t (ns)

kf = 1 / )f

Si fluo. uniquement : cinétique du premier ordre

I = IO e -kf t

Paramètres

*f :kf = 1 / )f

en fait : k = kf + +ki

) = 1 / k = 1 / (kf + +ki) < )ftemps de relaxation

*f = kf / (kf + +ki) rendement quantique

*f = ) / )f < 1

*f = nbre h" fluo / nbre de h" abs

mesure par comparaison

Transfert intermoléculaire de Fluorescence,

par résonance (non-radiatif)

Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET

Inte

nsi

té

!

DONNEUR D ACCEPTEUR A

1ère condition : recouvrement spectral Fluo D - Abs A

Transfert intermoléculaire de Fluorescence,

par résonance (non-radiatif)

Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET

S0

S1

S0

S1

donneur D accepteur A

résonance

2ème condition : R pas trop grand (R est la distance intermoléculaire D - A)

Constante de transfert : kD-A = kDseul (R0/R)6

R0 «"distance critique"» D-A pour laquelle la proba. detransfert est de 50%

non-radiatif

Transfert de Fluorescence

FRET

10-100 Å

Transfert de Fluorescence

Exemples:

Donneur

accepteur

Donneur-accepteur

BenzèneBenzène CC66HH66

Toluène C6H5-CH3Toluène C6H5-CH3

Stratégie «Stratégie «""antisensantisens""» : blocage de l» : blocage de l’’ARN par une séquence complémentaireARN par une séquence complémentaire résistante aux nucléases cellulairesrésistante aux nucléases cellulaires

pierre-yves turpin

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