Peran Enzim Protease dalam

Pembuatan Senyawa Flavoring

Disusun oleh :

Annisa Nurkhasanah 12/333161/TP/10422

Moch. Ainun Najib 12/333163/TP/10424

Rosydina Ghassani 12/333171/TP/10431

Levina Narkian Salim 12/333173/TP/10434

UNIVERSITAS GADJAH MADA

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN HASIL PERTANIAN

YOGYAKARTA

Peran Enzim Protease dalam

Pembuatan Senyawa Flavoring

I. Pendahuluan

Protease adalah enzim yang berfungsi untuk menghidrolisis ikatan peptida dari

senyawa-senyawa protein dan diurai menjadi senyawa lain yang lebih sederhana (asam

amino). Protease yang dipakai secara komersial seperti serine, protease, dan

metalloprotease biasanya berasal dari Bacillus subtilis yang mempunyai kemampuan

produksi dan sekresi enzim yang tinggi. Enzim ini secara komersial digunakan sebagai

suplemen makanan dan digunakan pada terapi enzim. (Utami dkk., 2012)

Senyawa flavor (aroma dan citarasa) sangat penting dan turut menentukan

perkembangan industri makanan dan minuman. Senyawa tersebut menentukan sifat

organoleptik yang merupakan salah satu atribut mutu makanan/minuman dan

menentukan pasar produk tersebut. Ada dua kelompok flavor, yaitu kelompok senyawa

indigenus (indigenous flavor) dan kelompok senyawa yang sengaja ditambahkan ke

dalam produk makanan/minuman. Senyawa flavor indigenus berasal dari bahan baku

makanan itu sendiri atau terbentuk di dalam makanan selama proses pengolahan.

 Kelompok senyawa flavor yang kedua adalah senyawa flavor yang sengaja

ditambahkan untuk memperbaiki mutu sensoris (flavor) makanan atau minuman

tersebut. Senyawa flavor ini termasuk ke dalam bahan tambahan makanan. Kelompok

senyawa ini ada yang ‘alami’ (natural) dan sintetis/artificial. Senyawa flavor ‘alami’,

sering juga disebut dengan bio-flavor, merupakan senyawa yang dihasilkan dari

ekstraksi tanaman/hewan atau diproduksi secara mikrobiologis. Jenis flavor ini sering

diperdagangkan dalam bentuk crude flavor maupun pure flavor. Flavor sintetis

merupakan senyawa yang dibentuk secara kimia. Senyawa flavor sintetis mempunyai

sifat sensoris yang sama dengan senyawa flavor ‘alami’.(Anonim A, 2012)

Flavoring yang banyak menggunakan enzim protease dalam pembuatannya

adalah meat flavor dan yeast extract. Kedua flavor tersebut menggunakan enzim

protease golongan sistein yakni enzim papain untuk mendapatkan asam amino sistein

dan glutamat yang menjadi prekursor utama pada pembuatan senyawa flavor tersebut.

Enzim protease terbagi menjadi empat kelompok utama, mekanismenya yaitu

serin, sistein, aspartat dan metal. Pada sisi aktif protease, sein dan sistein, gugus reaktif

menyerang secara nukleofilik pada ikatan peptida. Protease aspartat dan metal

mengaktifkan sebuah molekul air untuk menjadikannya sebagai nukleofil daripada

menggunakan gugus fungsi enzim itu sendiri. Meskipun demikian, pada dasarnya

keseluruhan proses pemecahan ikatan peptida adalah sama pada semua golongan

protease. (Anonim B, 2013)

Enzim sebagai biokatalisator berstruktur protein dalam mekanisme kerjanya

aktiitasnya dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu antara lain, pH, Suhu, konsentrasi

substrat, konsentrasi enzim, kehadiran aktiator atau inhibitor, adalah sebagai berikut:

a. PH atau derajat keasaman

pH merupakan salah satu faktor penting yang harus diperhatikan apabila kita

bekerja dengan enzim, hal ini dikarenakan enzim hanya mau dan mampu bekerja pada

kondisi pH tertentu saja. Suatu kondisi pH di mana enzim dapat bekerja dengan

aktivitas tertinggi yang dapat dilakukannya dinamakan dengan pH optimum.

Sebaliknya pada pH tertentu enzim sama sekali tidak lagi aktif atau bahkan rusak. Hal

ini dapat dijelaskan karna kita ketahui bahwa enzim merupakan molekul protein,

molekul protein kesetabilannya dapat dipengaruhi oleh tingkat keasaman

lingkungannya, pada kondisi keasaman yang ekstrim molekul-molekul protein dari

enzim akan rusak.

b. Suhu / Temperatur

Seperti halnya oleh pH, aktivitas kerja enzim juga dipengaruhi oleh temperatur

lingkungan dimana ia bekerja. Seperti reaksi kimia biasa suhu biasanya dapat

mempercepat proses reaksi, namun demikian pada titik suhu tertentu kecepatan reaksi

yang dikatalisis oleh enzim akan mulai menurun bahkan aktivitasnya tidak lagi

nampak. Kondisi suhu di mana enzim dapat menghasilkan aktivitas tertinggi dinamakan

suhu atau temperatur optimum. Oleh karena enzim berstruktur protein, sebagaimana

kita ketahui bahwa protein dapat dirusak oleh panas, sehingga pada suhu tinggi tertentu

aktivitas enzim mulai menurun dan bahkan aktiitasnya menghilang. Hal ini sangat

dimungkinkan karena terjadinya denaturasi atau kerusakan struktur protein oleh

pengaruh panas. Panas yang berlebihan akan menybabkan terjadinya kerusakan struktur

enzim yang dapat menybabkan kerusakan enzim baik secara keseluruhan maupun

sebagian terutama sisi aktifnya.

c. Konsentrasi Substrat

Reaksi-reaksi biokimia yang diktalisis oleh enzim diperngaruhi pula oleh

jumlah substrat. Jika kita melakukan pengujian konsentrasi substrat dari rendah ke tingi

terhadap kecepatan reaksi enzimatis, maka pada awalnya akan diperoleh hubungan

kesebandingan yang menyatakan kecepatan reaksi akan mkeningkat seiring dengan

meninkatnya konsentrasi substrat, namun kemudian akan diperoleh data yang

menyatakan pada konsentrasi substrat tinggi tertentu kecepatan reaksi tidak lagi

bertambah. Pada kondisi ini konsentrasi substrat menjadi jenuh dan kecepatan reaksi

menjadi maksimum yang sering juga disebut sebaai kecepatan maksimum (Vmax).

Hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi biasanya

dinyatakan dengan konstanta Michelis-Menten (KM). Nilai KM didefinisikan sebagai

konsentrasi substrat tertentu pada saat kecepatan reaksi enzimatis mencapai setengah

dari kecepatan maksimumnya.

d. Konsentrasi Enzim

Peningkatan konsentrasi enzim dalam suatu reaksi biokimia akan

meningkatkan kecepatan kecepatan reaksi yang dikatalisisnya.

e. Kehadiran aktivator/inhibitor

Aktivator adalah zat atau senyawa yang dapat menyebabkan meninkatnya

aktiitas enzim apabila ia berada pada saat terjadinya reaksi, dan sebaliknya inhibitor

adalah zat yang dapat menghambat aktivitas reaksi. (anonim c, 2009)

II. Peran Enzim Protease

1. Meat and Fish Flavor

Prekursor dari flavor daging dibagi menjadi dua kategori yaitu komponen larut

air (asam amino,peptida,karbohidrat,nukleotida,tiamin,dll) dan komponen tidak larut

air (lemak). Reaksi Maillard antara asam amino dan gula reduksi memicu

pembentukan aroma. Reaksi sistein dan gula reduksi membuat karakteristik flavor

daging terutama daging ayam dan babi. Flavor daging sapi didapatkan dari reaksi

oksidasi lemak,degradasi akibat panas dan interaksi antara protein,peptida,asam

amino dan karbohidrat.Prekursor dari flavor daging babi adalah 2-metil-3-firantiol

dan bis-(2-metil-3-furil)-disulfida. Reaksi Maillard antara gula reduksi dan asam

amino terutama sistein merupakan penentu utama aroma.Sedangkan prekursor pada

flavor daging ayam adalah 2-metil-3-furantiol,2-furfurythiol,metionol,nonanol,dan 2-

trans-nonenal. Senyawa 2-metil-3-furantiol adalah komponen utama dari flavor

daging ayam. Senyawa tersebut merupakan hasil reaksi antara ribosa dan asam amino

yang mengandung sulfur seperti sistein atau sistin. (Choe et al,2010) Berikut adalah

reaksi pembentukan senyawa 2-metil-3-furantiol :

(Melton,1999)

Pada pengembangan senyawa flavor pada daging,senyawa prekursor yang

paling penting adalah keberadaan asam amino mengandung sulfur yakni sistein. Oleh

karena itu pasti terjadi degradasi protein oleh enzim protease golongan sistein

protease yang menghasilkan asam amino sistein. Enzim yang biasanya digunakan

dalam pembentukan senyawa flavor daging adalah enzim papain.

Enzim Papain (EC 3.4.22.2) tergolong ke dalam kelompok protease yang

merupakan sistein endopeptidase. Pengelompokan tersebut adalah berdasarkan

nukleofil yang bertindak sebagai residu katalitiknya yaitu sistein (-SH).Enzim papain

termasuk protease sistein dengan struktur yang terdiri dari rantai tunggal polipeptida

dangan tiga jembatan disulfida dan pada sisi aktifnya terdapat residu sistein,histidin

dan asparagin. pH optimum enzim papain adalah 6-7 dengan suhu 60-70˚C.

Berikut adalah tabel mengenai senyawa flavor yang terdapat pada daging

ayam dan sapi :

Compounds Flavour dilution

factor

Odour

description

Chicken Beef

2-Methyl-3-furanthiol 1,024 512 Meat-like,

sweet

bis (2-Methyl-3-furyl)

disulphide

<16 2,048 Meat-like

2-furfurylthiol 512 512 Roasty

2,5-dimethyl-3-furanthiol 256 <16 Meaty

3-mercapto-2-pentanone 128 32 Sulphurous

Methionol 128 512 Cooked

potato

2,4,5-trimethylthiazole 128 <16 Earthy

2-formyl-5-

methylthiophene

64 64 Sulphurous

Phenylacetaldehyde 16 64 Honey-like

2-trans-4-trans-

decadienal

2,048 <16 Fatty

2-trans-4-cis-decadienal 128 <16 Fatty, tallowy

2-undecenal 256 <16 Tallowy,

sweet

γ-dodecalactone 512 <16 Tallowy,

fruity

γ-decalactone 64 <16 Peach-like

Nonanol 64 <16 Tallowy,

green

2-trans-nonenal 64 <16 Tallowy, fatty

2-trans-4-trans-

nonadienal

64 <16 Fatty

β-ionone 64 <16 Violet-like

(Gasser U., and Grosch W,1990)

Kecap ikan merupakan produk fermentasi ikan dengan garam. Kecap ikan

digunakan oleh masyarakat sebagai bumbu masakan, penyedap dan pencelupan

seafood. Kecap ikan memiliki cita rasa yang berbeda dengan kecap yang dibuat dari

kacang kedelai. Warnanya bening kekuningan sampai cokelat muda dengan rasa asin

yang relatif serta banyak mengandung senyawasenyawa nitrogen. Penggunaan enzim

proteolitik yang murni pada pembuatan kecap ikan memiliki kelemahan karena harga

enzim yang cukup mahal. Pemanfaatan sumber-sumber enzim yaang berasal dari alam

bisa menjadi alternatif pengganti enzim konvensional. Salah satu enzim yang bisa

dimanfaatkan adalah enzim bromelin yang berasal dari buah nanas dan enzim papain

dari daun pepaya.

Penambahan bromelin dan papain dapat memperpendek waktu fermentasi

kecap ikan (Choi et al,1999). Menurut (Baddows and Ardhesir,1979),enzim bromelin

dan papain dapat mencerna jaringan otot ikan dalam waktu pendek,kemudian

memproduksi hidrolisat dengan distriusi dan komponen konsentrasi nitrogenus

hampir sama dengan kecap ikan tradisional tetapi memiliki aroma yang berbeda.

Proteolisis yang terjadi selama proses fermentasi kecap ikan diasumsikan telah

menyebabkan peptida-peptida dan asam amino mengalami perubahan melalui

deaminasi,dekarboksilasi dan transaminasi menghasilkan amina,asam-asam keto

amonia. Hal penting pada tahap proses proteolisi dalam pembentukan aroma adalah

ketersediaan asam amino sebagai substrat untuk transformasi atau sintesis senyawa-

senyawa flavor oleh bakteri (Beddows et al,1976). Asam amino yang dominan

berperan dalam pembentukan flavor pada kecap ikan adalah asam glutamat,asam

aspartat,lisin,leusin dan sistein.

Senyawa volatil seperti sulfur dan nitrogen merupukan komponen utama senyawa

flavor pada kecap ikan. Senyawa sulfur bisa didapatkan dari bahan baku atau selama

proses fermentasi menghasilkan peptida dan asam amino sistein. (Giri et al,2010)

2. Savory Flavor

Pada tahun 1985, istilah umami atau savory flavor diakui sebagai istilah ilmiah

untuk menggambarkan rasa glutamat dan nukleotida . Umami merupakan rasa asam

amino L-glutamat dan 5'-ribonukleotida seperti guanosin monofosfat (GMP) dan

inosin monofosfat (IMP). Sensasi umami terjadi karena deteksi anion karboksilat dari

glutamat dalam sel reseptor khusus yang ada pada manusia. Umami meningkatkan

palatabilitas berbagai macam makanan. Enzim proteolitik akan menghancurkan

protein dan menghasilkan peptida dan asam amino. Begitu juga enzim nuklease yang

akan menghancurkan DNA dan RNA menghasilkan nukleotida ataupun nukleosida. 

Flavor savory merupakan salah satu jenis rasa yang banyak disukai yang

diidentikkan dengan rasa gurih antara lain seperti pada kaldu, keju dan MSG. Salah

satu bahan yang digunakan untuk menghasilkan flavor savory adalah ekstrak kamir,

dimana kelebihannya yaitu tidak ada laporan baik pada hewan percobaan maupun

manusia bahwa ekstrak kamir memberi reaksi seperti MSG. Lagipula oleh US

Agriculture Departement menggunakan nama umum ekstrak kamir (yeast extract) dan

ditetapkan oleh FDA sebagai flavor alami.

Ekstrak kamir banyak digunakan dalam formulasi flavor dalam produk produk

mie instan, ekstrusi (snack food), produk panggang (piza) dan berbagai jenis saus

pengganti flavor daging. Pembuatannya dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu

hidrolisis, plasmolisis dan autolisis. Autolisis adalah metode alternatif yang menarik,

dimana ekstrak kamir yang diolah secara autolisis akan menjadi ingridien penting

untuk flavor daging karena mengandung asam amino dan peptida yang tinggi sebagai

prekursor untuk reaksi Maillard, dan kemungkinan peptidanya dapat digunakan

sebagai bahan tambahan citarasa dan penegas rasa sebagai alternatif MSG.Namun

proses ini kurang optimal dalam mendegradasi komponen untuk membentuk flavor

savory yang diinginkan. Oleh karena itu, salah satu upaya untuk memaksimalkan

proses ini adalah dengan penambahan enzim protease. Indikator yang digunakan

untuk mengetahui tingkat keberhasilan penambahan enzim ini adalah total nitrogen,

formol nitrogen, protein terlarut, nila pH, kadar asam glutamat bebas, dan total

amonia. Parameter inilah yang akan menggambarkan perbedaan proses autolisis

dengan penambahan enzim protease dan tanpa penambahan enzim protease. Enzim

protease yang ditambahkan adalah enzim papain. Enzim papain mempunyai

spesifisitas atau akan memotong gugus asam amino pada sisi Arg, Lys, Glu, His, Gly,

Tyr. Asam amino hasil proteolisi oleh enzim papain salah satunya adalah asam

glutamat yang merupakan flavor dominan pada yeast extract.

3. Chocolate Flavor

Fermentasi dan pengeringan merupakan tahapan dalam pengolahan buah

kakao menjadi coklat yang menentukan karakteristik flavor coklat. Pada saat

fermentasi terjadi pembentukan precursor flavor utamanya asam amino dan reduksi

gula. Keduanya berperan dalam reaksi Maillard (pencoklatan) saat proses

penyangraian kakao. Reaksi ini membentuk karakteristik flavour coklat (warna dan

aroma khas)

Proteolisis sangat penting dalam pembentukan flavour coklat. Pada saat

fermentasi terjadi proses proteolisis yakni penguraian protein menjadi asam amino

dan peptide. Asam amino dan peptide ini terbentuk selama proses fermentasi akibat

kinerja enzim endoprotease dan exopeptidase.

Protein dalam buah kakao tidak berasa sebab berat molekul protein sangat

besar. Hal ini juga disebabkan molekul protein dalam buah kakao merupakan globular

yang tertutup dengan konfigurasi struktur yang kompleks, asam amino yang tergolong

hidrofobik terjebak didalamnya. Asam amino ini tidak dapat kontak dengan taste bud

yang ada di lidah sehingga tidak berasa (hambar). Apabila protein ini dihidrolisis oleh

protein maka struktur globular akan pecah dan grup asam amino hidrofobik dapat

terurai. Grup asam amino ini dapat kontak dengan taste bud dan memberikan rasa

pahit. (Yongsheng et al, 2014). Enzim Aminopeptidase menguraikan asam amino

hidrofobik yang menyebabkan taste pahit. Asam amino hidrofobik yang terkandung

pada buah kakao setelah fermentasi adalah alanin, isoleucine, leucine, prolin, valin,

methionin dan fenilalanin. (Sabahannur et al, 2015). Enzyme yang digunakan adalah

leucine aminopeptidase yang memotong peptide yang mengandung asam amino

leucine. Asam amino leucine ini tergolong asam amino hidrofobik yang apabila

terlepas maka akan menimbulkan cecap pahit pada lidah.

Karakteristik enzim yang digunakan untuk flavoring coklat adalah :

Flavourzyme mengandung Leucine Aminopeptidase yang diekstraksi dari

Aspergilus oryzae. Enzim ini optimal pada suhu 50-55o C dan PH antara 9,0. (Merz et

al, 2015). Leucine Aminopeptidase yang tergolong exopeptidase ini memecah L-

leucylglycine dan peptide lainnya yang memiliki N-terminal leucine. Leucine

Aminopeptidaseini tergolong metaloprotease yang memerlukan ion Mn2+ atau Mg2+

untuk aktifatornya. (Lin et al, 2010)

(Raisonnier, 2004)

Leucine aminopeptidase memecah asam amino leucine dan beberapa asam

amino lainnya kecuali arginin dan lisin.

(Anonim A, 2015). Asam amino yang terbentuk

seperti alanin, tirosin, valin, isoleusin, leusin

dan fenil alanin tergolong asam amino

hidrofobik yang merupakan precursor

pembentukan aroma dan cecap pada kakao. Selain menimbulkan cecap pahit, asam

amino hidrofobik ini precursor utama pembentukan methylpirazins. Senyawa

methylpirazin ini merupakan hasil reaksi asam amino dengan gula reduksi pada reaksi

Maillard.

Daftar Pustaka

Choe JH., Nam K., Jung S., Kim B., Yun HJ., & Jo C. 2010. Differences in the

quality characteristics between commercial Korean native chickens and broilers.

Korean J Food Sci Anim Resour. 30:13–19. 

Gasser U., & Grosch W. 1990. Primary odorants of chicken broth: A

comparative study with meat broths from cow and ox. Z Lebensm Unters Forsch.

190:3–8. 

Lin, Shie-Jea, Li-Lin Chen, Chiou-Yen Wen and Wen-Shen Chu. 2010.

Extracellular leucine aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae LL1 and LL2 .

African Journal of Microbiology Research. 4(3). 158-168.

Melton SL. 1999. Current status of meat flavour. Quality Attributes of Muscle

Foods. Xiong YL, Ho CT, Shahidi F, editorsKluwer Academic/Plenum

Publishers;New York: p. 115–130. 

Merz, Michael, Thomas Eisele, Pieter berends, Daniel Appel, Swen rabe, Imre

Blank, Timo stressler and Lutz Fischer. 2015. Flavourzyme, an Enzyme preparation

with Industrial Relevance : Automated Nine-step Purificatiom and Partial

Characterization of Eight Enzymes. Science.gov. Diakses pada tanggal 24 Oktober

2015

Raisonnier, Pr A. 2004. Digestion-Detixification. www.chups.jussie.fr.

Diakses pada tanggal 25 Oktober 2015

Sabahannur, St, Mursalim, Laode Asrul, Mariyati Bilang. 2015. Use of High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) for the Analysis of Amino Acid of

Sulawesi and Local Clone Cocoa Bean Fermentation. Jurnal of Food Research. 4(4).

120-126

Sousa de Brito, Edy, Nelson Horacio Pezoa Garcia, and Allan Cesar Amancio.

2004. Use of a Proteolytic Enzyme in Cocoa ( Therobroma cacao L.) Processing.

Braziian Archives of Biology and Technology. 4 (47). 553-558

Yongsheng Ma, Lintong Wang, XIanhui Sun, Jianqiang Zhang, Junfeng Wang

and Yue Li. 2014. Study on Hydrolisis Conditions of Flavourzyme in Soybean

Polypeptide Alcalase Hydrolysate and Soybean Polypeptide Refining Process.

Advance Journal of Food Science and Technology, 6(9) : 1027-1032

Anonim A, 2012. http://foodreview.co.id/baru/index1.php?id=56425 diakses

pada tanggal 23 Oktober 2015 pukul 19:25 WIB