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Anlisis de grupos terminales

Secuenciacin del pptido

N-terminal C-terminal

Degradacin de Edman.

Mtodo de Sanger Carboxipeptidasa

Mtodo de Sanger

3. Identificar las N-terminales.

El reactivo clave utilizado en el mtodo de Sanger para identificar le N-terminal es el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno.

1-Fluoro-2,4-dinitrobenceno es muy reactivo ante la sustitucin nucleoflica aromtica.

N+

O

-ON+

O

O-

F El nuclefilo ataca aqu desplazando al F.

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Mtodo de Sanger

3. Identificar las N-terminales. El 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno reacciona con el nitrgeno del grupo amino del aminocido de la N-

terminal.

La hidrlisis cida rompe todos los enlaces peptdicos dejando una mezcla

de aminocidos, solo uno de ellos (el N-

terminal) porta un grupo 2,4-DNP.

Degradacin de Edman

3. Identificar las N-terminales.

1. Mtodo para determinar la N-terminal.

2. Puede ser realizado secuencialmente un residuo a la vez en la

misma muestra. Usualmente se puede determinar los

primeros 20 aminocidos a partir de la N-terminal por este

mtodo.

3. 10-10 g de muestra es suficiente.

4. Ha sido automatizado.

5. El reactivo clave es el fenilisotiocianato.

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Degradacin de Edman

3. Identificar las N-terminales.

fenilisotiocianato

pptido

pptido

pptido pptido

calor

Una feniltiourea

Calor

H+

Una tiazolona Feniltiohidantoina

Carboxipeptidasa

protena H3NCHC

O

R

+ NHCHCO

O

R

C

O

La Carboxipeptidasa es selectiva para la ruptura del enlace peptdico del aminocido

C-terminal.

3. Identificar las C-terminales.

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4. Organizar la informacin de las secuencias

de los fragmentos menores que pueden

revelar la secuencia entera.

Sntesis de pptidos

Sntesis en fase slida Sntesis en solucin

La formacin de una amida no es tan sencilla con los aminocidos ya que el grupo carboxlico puede reaccionar con su

propio grupo amino.

La conectividad de los AA deben realizarse en la secuencia correcta. La formacin aleatoria del enlace peptdico con una

mezcla de fenilalanina y glicina puede dar por ej. 4 dipptidos:

PhePhe GlyGly PheGly GlyPhe.

Algunos AA tiene cadenas que podran interferir con la formacin del dipptido. Como resultado, la sntesis de pptidos siempre

implica la activacin de ambos reactivos para formar los enlaces

peptdicos correctas y proteger grupos para bloquear la formacin

de enlaces incorrectos

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1. Limitar el nmero de posibilidades protegiendo el nitrogeno de un AA y el grupo carboxilico del otro.

N-Protegido

fenilalanina

C-Protegido

glicina

NHCHCOH

CH2C6H5

O

X H2NCH2C

O

Y

Estrategia general Sntesis de pptidos

2. Enlazar los dos AA protegidos.

NHCH2C

O

Y NHCHC

CH2C6H5

O

X

NHCHCOH

CH2C6H5

O

X H2NCH2C

O

Y

Estrategia general Sntesis de pptidos

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3. Desproteger el grupo amino de la N-terminal y el grupo

carboxlico de C-terminal

NHCH2CO

O

H3NCHC

CH2C6H5

O +

Phe-Gly

NHCH2C

O

Y NHCHC

CH2C6H5

O

X

Estrategia general Sntesis de pptidos

Sntesis de pptido en solucin Paso preliminar: Proteccin de la N-terminal con Z

Paso 1: Activar al grupo carboxlico con cloroformiato de etilo

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Paso 2: Formacin del enlace peptdico para acoplarse al prximo AA.

Paso 3: Activar al grupo carboxlico del dipptido con cloroformiato de etilo

Sntesis de pptido en solucin

Paso 4: Formar el tripptido

Paso 5: desproteccin del extremo N-terminal del pptido completo.

Sntesis de pptido en solucin

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Sntesis de pptido en fase slida

Resina de Merrifield

Sntesis de pptido en fase slida por el mtodo

Merrifield

Dipptido

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Estructura de las protenas

Estructura primaria

Esta definida por la secuencia de aminocidos junto con los

puentes disulfuro. Todas las propiedades de la protena se

determinan, directa o indirectamente, por la estructura primaria.

Estructura secundaria

Es el plegamiento regular local entre residuos de AA cercanos

de la cadena polipeptdica. Este tipo de estructura se adopta

gracias a la formacin de puentes de hidrgenos entre los

grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos

involucrados en las uniones peptdicas de AA cercanos en la

cadena.

Estructura terciaria

La estructura terciaria de una protena es su completa

conformacin tridimensional. La estructura terciaria

incluye toda la estructura secundaria y todos los dobleces y

pliegues en el medio.

Estructura cuaternaria

se refiere a la asociacin de dos o ms cadenas de pptidos

para completar la protena

Estructura secundaria de las protenas

N

N

O

C b

H

H

H

O

Y N

N

O

C b

H

H

H

O

f

N

N

O

C b

H

H

H

O

C b

C b O

w

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a-hlice

f = -58 y = -47

ngulos tpicos de a-hlice

w = 180

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puentes H en la a-hlice

Hoja plegada b

antiparalelo

paralelo

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Disposicin espacial de una hoja b

f = 180

y = 180

Estructura terciaria Estructura cuaternaria

Estructura secundaria

Estructura primaria

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Estructura terciaria Estructura cuaternaria

Estructura secundaria

Estructura primaria

Pequeos cambios en la medio ambiente puede causar un cambio qumico o conformacional de la

protena que resulta en la desnaturalizacin

Desnaturalizacin: Alteracin de la estructura normal y la prdida de la actividad biolgica de una

protena. Muchos factores que pueden favorecer a la desnaturalizacin, pero los ms comunes son el

calor y pH.

Desnaturalizacin de las protenas

Al cambiar el pH, las cargas de los aminocidos cambian haciendo que partes que se atraian no lo hagan ms o que grupos que no interaccionaban se repelan

Un aumento de temperatura puede aumentar la movilidad rompiendo puentes H y otras interacciones dbiles

Los enlaces covalentes no se afectan

al desnaturalizarse:

Las enzimas pierden su actividad cataltica

La solubilidad disminuye drsticamente

En algunos casos puede revertirse