optimierung der osteogenen differenzierung mesenchymaler ... · technische universitÄt mÜnchen...

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie

Experimentelle Unfallchirurgie

Klinikum rechts der Isar

Optimierung der osteogenen Differenzierung

mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe

Isabel F. Kerler

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen

Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Medizin

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny

Prüfer der Dissertation:

1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler

Eberhard-Karls-Universität Tübingen

2. Univ.-Prof. Dr. P. Biberthaler

Die Dissertation wurde am 06.06.2014 bei der Technischen Universität

München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 17.12.2014

angenommen.

Meinen lieben Eltern

Inhaltsverzeichnis

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Inhalt

1 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................... 5

2 Einleitung .............................................................................................. 9

2.1 Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel..............................................................9

2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene Differenzierung von Ad-

MSCs ......................................................................................................................15

2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung ......................................................18

2.3.1 Phosphat- und Calciumlieferanten ..................................................................18

2.3.2 Vitamin D3 .......................................................................................................19

2.3.3 Dexamethason ................................................................................................20

2.3.4 BMP 2 und BMP 7............................................................................................21

3 Zielsetzung........................................................................................... 24

4 Materialien und Methoden ................................................................. 25

4.1 Verbrauchsmaterialien ..........................................................................................25

4.2 Geräte und Software .............................................................................................26

4.3 Steriles Arbeiten ....................................................................................................27

4.4 Zellisolation ...........................................................................................................27

4.4.1 Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe .......27

4.4.2 Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen ...............................29

4.5 Zellzahlbestimmung ...............................................................................................31

4.5.1 Sulforhodamin B (SRB) Färbung .......................................................................31

4.5.2 Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten

Zellzahl pro cm2 ...............................................................................................33

4.6 Kultur und Differenzierung ....................................................................................36

4.6.1 Passagieren .....................................................................................................36

4.6.2 Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter

Medien ............................................................................................................37

4.6.3 Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung ............37

4.6.4 Medienübersicht .............................................................................................39

Inhaltsverzeichnis

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4.6.5 BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay ......................................................................40

4.6.6 Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung ...........42

4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mRNA-Ebene ...............45

4.7.1 Isolation von mRNA aus Zellen ........................................................................45

4.7.2 Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA ...............................................47

4.7.3 Überprüfung der Integrität der RNA ................................................................48

4.7.4 Synthese von komplementärer DNA (cDNA) ....................................................49

4.7.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ....................................................................49

4.7.6 Gelelektrophorese ...........................................................................................54

4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarBlue® Assay .........................55

4.9 Funktionelle Charakterisierung..............................................................................56

4.9.1 Nachweis osteogener Eigenschaften ...............................................................56

4.9.1.1 Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP)..........................56

4.9.1.2 Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung ......................................................60

4.9.1.3 Van Kossa Färbung ...................................................................................62

4.9.1.4 Alizarin Rot Färbung .................................................................................64

4.9.2 Nachweis chondrogener Eigenschaft: Alcianblau Kernechtrot Färbung ...........67

4.9.3 Nachweis adipogener Eigenschaft: Ölrot O Färbung ........................................68

4.10 Densitometrische Auswertung ..............................................................................70

4.11 Statistische Auswertung ........................................................................................70

5 Ergebnisse ........................................................................................... 71

5.1 Zellzahltest.............................................................................................................71

5.2 Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien..73

5.3 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren ...................74

5.4 Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium ..................................75

5.5 2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge ...................77

5.6 Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungseigenschaften des

Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason hingegen nicht............................79

5.6.1 Bestimmung nicht toxischer Vitamin D3 Konzentrationen ................................80

Inhaltsverzeichnis

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5.6.2 Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen .........................81

5.6.3 Vitamin D3 induziert die AP-Aktivität ...............................................................82

5.6.4 Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von

Vitamin D3 und Dexamethason ........................................................................84

5.7 BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 ................................87

5.7.1 Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht .............87

5.7.2 Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung

nicht ................................................................................................................88

5.7.3 BRE Reporterassay ..........................................................................................89

5.8 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener

Differenzierung ......................................................................................................91

6 Diskussion............................................................................................ 95

7 Zusammenfassung und Ausblick ....................................................... 107

8 Abbildungsverzeichnis ....................................................................... 109

9 Tabellenverzeichnis ........................................................................... 111

10 Informationen zu den Primern .......................................................... 112

10.1 Alk 1 ..................................................................................................................... 112

10.2 Alk 2 ..................................................................................................................... 112

10.3 Alk 3 ..................................................................................................................... 112

10.4 Alk 5 ..................................................................................................................... 112

10.5 Alk 6 ..................................................................................................................... 113

10.6 TGF-ß-RII .............................................................................................................. 114

10.7 BMPRII ................................................................................................................. 114

10.8 IGF1R ................................................................................................................... 114

10.9 IGF2R ................................................................................................................... 115

10.10 RetinoidXR ß ........................................................................................................ 115

10.11 GAPDH ................................................................................................................. 115

10.12 BMP 4 .................................................................................................................. 115

10.13 BSP 2 .................................................................................................................... 116

10.14 MGP ..................................................................................................................... 116

Inhaltsverzeichnis

Seite | 4

10.15 OSF 2 .................................................................................................................... 117

10.16 Alkalische Phosphatase ....................................................................................... 117

10.17 Osteoprotegerin .................................................................................................. 117

10.18 BMP 2 .................................................................................................................. 118

10.19 Osteopontin ......................................................................................................... 118

10.20 Osteocalcin .......................................................................................................... 119

10.21 Vitamin D ............................................................................................................. 119

10.22 Osteoprotegerin .................................................................................................. 120

10.23 RANKL .................................................................................................................. 120

11 Literaturverzeichnis ........................................................................... 121

12 Danksagung ....................................................................................... 129

Abkürzungsverzeichnis

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1 Abkürzungsverzeichnis

ActR-II ..................................................Aktivin Rezeptor Typ II

ActR-IIB ................................................Aktivin Rezeptor Typ II B

Ad-MSCs ...............................................Adipose derived Mesenchymal Stem Cells

(Fettgewebstammzellen)

ALCAM .................................................activated leukocyte cell adhesion molecule

Alk ........................................................Activine-receptor like kinase

AMHR-II ................................................Anti Müller Hormon Rezeptor Typ II

AP .........................................................Alkalische Phosphatase

ATP .......................................................Adenosintriphosphat

BMP .....................................................Bone Morphogenetic Protein

BMPRII .................................................Bone Morphogenetic Protein Receptor Typ II

B-MSCs .................................................Bone marrow derived mesenchymal stem cells

(Knochenmarkstammzellen)

bp .........................................................Basenpaare

BRE .......................................................BMP Response Element

BSA .......................................................Bovines Serum Albumin

BSP 2 ....................................................Bone Sialoprotein 2

C2C12...................................................murine Myoblasten Zelllinie

Ca .........................................................Calcium

ca. ........................................................circa

CD ........................................................Cluster of Differentiation

cDNA ....................................................komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cm ........................................................Zentimeter

cm2 .......................................................Quadratzentimeter

CO2 .......................................................Kohlenstoffdioxid

ddH2O ..................................................zweifach destilliertes, nicht steriles Wasser

DEPC.....................................................Diethylpyrocarbonat

Dex. ......................................................Dexamethason


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dH2O .....................................................destilliertes Wasser

DMEM ..................................................Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO ...................................................Dimethylsulfoxid

DNA ......................................................Desoxyribonukleinsäure

D-PBS ...................................................Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline

EDTA ....................................................Ethylendiamintetraacetat

EZM ......................................................extrazelluläre Matrix

FACS .....................................................Fluorescence Activated Cell Sorting

FCS .......................................................Fetales Kälberserum

g ...........................................................Gramm

g ...........................................................Vielfaches der Erdbeschleunigung

GAPDH .................................................Glycerinaldehyd-3-phosphat

GMP-Richtlinien ...................................Good Manufacturing Practice guidelines

h ..........................................................Stunde

H2O .......................................................Wasser

HEPES ...................................................4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure

HTM-Zellen ...........................................humane Trabekelwerkszellen

IGF .......................................................insuline like growth factor

kD ........................................................kilo Dalton

M .........................................................Molar

M-CSF ...................................................Macrophage Colony-Stimulating-Factor,

dt.: Monozytenkolonien-stimuliernder Faktor

MEM ....................................................Minimum Essential Medium Eagle

Mg ........................................................Magnesium

mg ........................................................Milligramm

MGP .....................................................Matrix gla Protein

min .......................................................Minute

ml .........................................................Milliliter

mM ......................................................Millimolar

Mr .........................................................relative molekulare Masse

mRNA ...................................................messenger Ribonukleinsäure


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MSC ......................................................Mesenchymale Stammzelle

N ..........................................................biologische Replikate (Spenderanzahl)

n ...........................................................technische Replikate pro Spender

NF-κB ....................................................nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer’ of

activated B-cells

ng .........................................................Nanogramm

nm ........................................................Nanometer

nM........................................................Nanomolar

nmol .....................................................Nanomol

OC ........................................................Osteocalcin

OD ........................................................optische Dichte

OP ........................................................Osteopontin

OP-1 .....................................................Osteogenic Protein-1 = BMP 7

OPG ......................................................Osteoprotegerin

OSF 2 ....................................................Osteoblast Specific Factor 2

OSS .......................................................Osteoblasten aus Spongiosa

OSÜ ......................................................Osteoblastenkultur aus dem Kollagenaseüberstand

PBS .......................................................Phosphate-Buffered Saline

PCR .......................................................Polymerase Kettenreaktion

pH ........................................................negativ dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionen-Aktivität

pNP ......................................................4 Nitrophenol

pNPP ....................................................4-Nitrophenylphosphat

PDIA3 ...................................................Protein Disulfidisomerase A3

R² .........................................................Bestimmtheitsmaß

RANK ....................................................Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B

RANKL ..................................................Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B Ligand

RLU .......................................................Relative Light Unit

RNA ......................................................Ribonukleinsäure

RT .........................................................Raumtemperatur

RT-PCR ..................................................Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion


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runx2 ....................................................Runt-related transcription factor 2

s ...........................................................Sekunde

S ...........................................................Svedberg

SDS .......................................................Sodiumdodecylsulfat

Smad ....................................................Sma- and Mad-related protein

sRANKL .................................................löslicher Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor

κ B Ligand

SRB .......................................................Sulforhodamin B

TBE .......................................................Tris-Borat-EDTA-Puffer

TGF-β....................................................Transforming Growth Factor β

TGF-βRI.................................................Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ I

TGF-βRII................................................Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ II

TRIS ......................................................Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

V ..........................................................Volt

λ ...........................................................Einheit für die Wellenlänge des Lichts

°C .........................................................Grad Celsius

µg.........................................................Mikrogramm

µl ..........................................................Mikroliter

µm ........................................................Mikrometer

µM .......................................................Mikromolar

µmol .....................................................Mikromol

# ...........................................................Probennummer

Einleitung

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2 Einleitung

2.1 Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel

Das menschliche Skelett besteht durchschnittlich aus 208 Knochen. Es bildet zusammen mit

knorpeligen Skelettelementen den passiven Stütz- und Bewegungsapparat des Körpers und

erfüllt eine Schutzfunktion für die inneren Organe. Daneben stellen die Knochen den

Bildungsort der Blutzellen dar, beteiligen sich an verschiedenen Stoffwechselprozessen und

sind das größte körpereigene Phosphat- und Calciumreservoir (Felsenberg 2001, S. 488;

Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).

Zur exemplarischen Darstellung des Knochenaufbaus wird ein langer Röhrenknochen, wie

das Femur, näher betrachtet. An einem Röhrenknochen kann anatomisch ein Schaftbereich

(Diaphyse) von einer proximalen und distalen Epiphyse unterschieden werden. Die beiden

knorpeligen Epiphysenfugen grenzen während der Wachstumsphase den Schaft von den

Epiphysen ab, verknöchern jedoch im Erwachsenenalter. Weitere makroskopisch erkennbare

Merkmale sind die äußere, homogen erscheinende Rindenschicht (Substantia compacta) und

die nach innen anschließende Substantia spongiosa. Die Spongiosa ist ein Gitterwerk aus

dünnen, traktoriell ausgerichteten Platten und Bälkchen (Trabekel) dessen Zwischenräume

von Knochenmark und Fett ausgefüllt werden. (Lüllmann-Rauch 2003, S. 122-130; Aumüller

2010, S. 184-186)

Der Knochen besteht mikroskopisch betrachtet aus Knochenzellen und extrazellulärer

Matrix, davon entfallen 70 % auf einen anorganischen und 30 % auf einen organischen

Anteil. Der anorganische Teil besteht vor allem aus Hydroxylapatit-Kristallen sowie Chloride

und Fluoride. Die organische Knochensubstanz wird zu 95 % aus Typ-I-Kollagenfibrillen

(bestehend aus drei Ketten, die sich zu einer Tripelhelix vereinen) und zu 5 % aus

nichtkollagenen Proteinen (siehe unten) gebildet (Felsenberg 2001, S. 488). Dieser Verbund

aus druckfesten Mineralkristallen und zugfesten Kollagenfibrillen verleiht dem Knochen

seine biegefeste Eigenschaft. Die wichtigsten nichtkollagenen Proteine des Knochens sind:

- Osteoprotegerin (OPG) wird von Osteoblasten sezerniert, um den Knochen vor

Abbau zu schützen. OPG ist der Schlüsselfaktor für die Inhibition der

Osteoklastendifferenzierung, -fusion und -aktivität. Es bindet sRANKL und

antagonisiert dieses dadurch (Haima 2013, S. 4). Glukokortikoide wirken umgekehrt:

Einleitung

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sie hemmen die Bildung von OPG und stimulieren diejenige von RANKL, dadurch

fördern sie den Knochenabbau (Brabnikova Maresova, Pavelka et al. 2012, S. 354;

Clarke 2012, S. 167).

- sRANKL wird von Osteoblasten sezerniert und ist der lösliche Rezeptor-Aktivator des

nuclear factor (NF)-κB Liganden. Es stimuliert die Bildung reifer Osteoklasten und

fördert somit den Knochenabbau. Die Zellaktivierung wird durch die Bindung von

sRANKL an den osteoklastischen Membranrezeptor RANK (NF-κB) induziert (Haima

2013, S. 4).

- Knochenspezifische Alkalische Phosphatase (AP) ist außen an der Plasmamembran

von Osteoblasten lokalisiert. Dieses membrangebundene Enzym spielt bei der

Mineralisation der extrazellulären Knochenmatrix eine wichtige Rolle; der

Mechanismus ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. Außerdem kann AP als

biochemischer Knochenmarker in der Beurteilung des Knochenumsatzes und zum

Therapiemonitoring verwendet werden (hohe AP-Konzentrationen können ein

Hinweis auf vermehrte Knochenneubildung sein)(Haima 2013, S. 4).

- Bone Sialoprotein (BSP) ist ein wichtiges Strukturprotein der Knochenmatrix und

wird normalerweise nur in mineralisiertem Bindegewebe von Knochen und Zähnen

exprimiert (Fisher, Whitson et al. 1983, S. 12723). BSP 2 ist die im Menschen

vorkommende Variante und ist auch bekannt unter „cell-binding sialoprotein“ oder

„integrin-binding sialoprotein“. BSP 2 unterstützt die Bindung von Osteoblasten an

die EZM und stimuliert dadurch die Bildung von Hydroxylapatit-Kristallen (Mansson,

Carey et al. 1995, S. 1071; Haima 2013, S. 4).

- Osteocalcin wird von Osteoblasten in der Phase der Mineralisation sezerniert, ist

Vitamin K-abhängig und kann durch Vitamin D3 stimuliert werden. Es ist ein calcium-

bindendes Protein und zieht Osteoklasten an (Siddiqi, Burrin et al. 1997, S. 753;

Haima 2013, S. 4).

- Osteopontin ist ein Adhäsionsprotein, das Osteoklasten in der mineralisierten Matrix

verankert. Osteopontin ist wie auch Osteonectin nicht knochenspezifisch, sondern

findet sich noch in weiteren Geweben (Butler 1989, S. 123; Haima 2013, S. 4).

- Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-

Familie gehört (Wozney 1989, S. 267). Sie fungieren als Zytokine und besitzen die

Fähigkeit die Knochen- und Knorpelbildung zu induzieren und zu regulieren.

Einleitung

Seite | 11

Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Nervengewebe

und in der Genese fast aller Organe, wie beispielsweise Lunge, Niere, Haut oder

Gonaden (Hogan 1996, S. 1580). Zum Beispiel tritt bei der genetisch vererbten

Fibrodysplasia ossificans progressiva eine erhöhte BMP 4 Expression in Lymphozyten

auf, die zur Verknöcherung von Muskelgewebe führt (Van den Wijngaard, Pijpers et

al. 1999, S. 1432).

- Proteoglykane sind sehr große Moleküle und bestehen zu 95 % aus Kohlenhydraten

und 5 % aus Protein. Aufgrund der starken negativen Ladung können Proteoglykane

besonders viel Wasser binden und erlangen dadurch raumfüllende Eigenschaften

(Pschyrembel 2004, S. 1492).

Die dreidimensionale Anordnung der EZM legt fest, ob es sich um einen Geflecht- oder

Lamellenknochen handelt.

Der Geflechtknochen, auch Faserknochen genannt, ist die unreife Vorstufe des

Lamellenknochens und ist vor allem während der Knochenentwicklung oder Frakturheilung

zu finden. Die Kollagenfibrillen sind in Bündeln miteinander verflochten, so dass man sich die

Knochenstruktur wie verknöchertes Bindegewebe vorstellen kann.

Im Verlauf des natürlichen Knochenumbaus wird der Geflechtknochen durch den

biomechanisch hochwertigeren Lamellenknochen ersetzt. Die lamellare Anordnung der

Matrixbestandteile sowie die enge räumliche Beziehung zwischen Gefäßen und

Knochenlamellen werden besonders in der Kompakta deutlich. Beide Strukturen zusammen

bilden eine Baueinheit, das sogenannte Osteon (Durchmesser 250-350 µm, Länge bis zu 1

cm). Im Zentrum eines Osteons befindet sich der sogenannte Havers’sche Kanal

(Durchmesser mind. 20 µm), in dem neben Vene und Nerv ein Gefäßast der Arteria nutricia

verläuft. Diese dringt von außen durch die Kortikalis in den Markraum ein und versorgt die

Gefäße des Knochenmarks. Die Havers-Gefäße sind durch Gefäße in den querverlaufenden

sogenannten Volkmann-Kanälen miteinander verbunden. Um das Havers-Gefäß sind 5-20

Speziallamellen konzentrisch angeordnet. Die Kollagenfibrillen laufen dabei spiralig um den

Havers’schen Kanal, während die Osteozyten zwischen den Lamellen eingemauert sind.

Weiter unterscheidet man äußere und innere Generallamellen, sie sind nicht um ein Gefäß

angeordnet und umgeben die Kompakta parallel zur äußeren und inneren Oberfläche.

Schaltlamellen (interstitielle Lamellen) sind Reste unvollständig abgebauter Spezial- oder

Einleitung

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Generallamellen und sind der Beweis für die stetigen Umbauvorgänge im Knochen.

(Benninghoff 1985, S. 135-137; Lüllmann-Rauch 2003, S. 129-131; Schünke 2005, S. 35).

In der gefäßlosen Spongiosa sind die flächigen Lamellen parallel zur Trabekeloberfläche

angeordnet. Ein Trabekel ist höchsten 300 µm dick, somit können die Osteozyten per

diffusionem von den Gefäßen aus dem Markraum versorgt werden (Lüllmann-Rauch 2003, S.

130).

Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens Die Abbildung zeigt die Baueinheit eines Röhrenknochens, das Osteon; die versorgenden Blutgefäße verlaufen in der Kompakta in den präformierten längsverlaufenden Havers’schen Kanälen und in quer angeordneten Volkmann-Kanälen; nach außen (links) schließt das Periost die Kompakta ab, nach innen (rechts) beginnt die Spongiosa. Modifizierte Abbildung nach www.servier.com/Powerpoint-image-bank.

Folgende drei Zelltypen werden unterschieden:

1. Osteoblasten entstehen über ihre Vorstufe, den Osteoprogenitorzellen, aus

mesenchymalen Stammzellen. Ihre Hauptaufgaben sind die Bildung, Organisation und

Mineralisierung der EZM sowie die Synthese von Kollagen und weiteren

Knochenproteinen. Diese Aufgaben erfüllen sie in mehreren Arbeitsschritten:

Zellproliferation: Bildung der EZM

Osteon

äußereGenerallamellen

Schaltlamellen

Volkmann-Kanal mit Gefäßen

Periost

Havers‘scher Kanal mit Gefäßen

Spongiosa

Kompakta

Osteozyt

Einleitung

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Reifung der EZM: Synthese von Proteinen (z.B. knochenspezifische Alkalische

Phosphatase)

Mineralisation der EZM: die AP-Expression wird herrunterreguliert, dafür

nimmt die Genexpression für Sialoprotein, Osteopontin und Osteocalcin zu

nach der Fertigstellung der Knochenmatrix gibt es drei Optionen für die

Osteoblasten: etliche werden von einer neu gebildeten Lamelle

„eingemauert“ und werden dadurch zu Osteozyten, über 50% sind überflüssig

und gehen durch Apoptose zugrunde und die restlichen wenigen reihen sich

in einem inaktiven Zustand in das Endost ein (Benninghoff 1985, S. 138-139;

Lüllmann-Rauch 2003, S. 126-127).

2. Osteozyten werden bis auf eine schmale Zone, die mit Kollagen und interstitieller

Flüssigkeit gefüllt ist, komplett von mineralisierter Matrix umgeben. Von jeder

einzelnen Zelle gehen viele Knochenkanälchen (Canaliculi) ab, die mit den

Nachbarzellen durch Gap junctions in Verbindung stehen. Dieses Hohlraumsystem

gewährleistet per diffusionem die Aufrechterhaltung des Zellmetabolismus und die

Kommunikation untereinander. Ihre Funktion ist noch nicht ausreichend geklärt, aber

es konnte beobachtet werden, dass Areale, in denen die Osteozyten abgestorben

sind, von Osteoklasten abgeräumt werden. (Benninghoff 1985, S. 139; Lüllmann-

Rauch 2003, S. 125-126; Schünke 2005, S. 15)

3. Osteoklasten sind eine Spezialform der Makrophagen. Sie entstehen durch Fusion von

bis zu 100 einkernigen Vorläuferzellen, die denen der Monozyten entsprechen und

sind für die Knochenresorption verantwortlich. Die Arbeitsweise der Osteoklasten

umfasst folgende Schritte:

Mineralienauflösung: Osteoklasten bilden in dem Bereich, welcher der

Knochenoberfläche aufliegt, einen Faltensaum zur Oberflächenvergrößerung.

In dieser geriffelten Oberfläche befindet sich eine H+-ATPase mit der ein

saures Mikromilieu (pH ca. 4,5) zur Auflösung der Calciumverbindungen

erzeugt wird. Die komplette Lysezone ist nach außen durch eine

Versiegelungszone abgegrenzt.

Gleichzeitig sezernieren die Osteoklasten lysosomale Enzyme (z.B. Cathepsin

K, Tartrat-resistentes Isoenzym der sauren Phosphatase = TRAP 5b) zur

Zerlegung der organischen Matrix.

Einleitung

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Osteoklasten nehmen die Matrix-Fragmente mittels Rezeptor-vermittelter

Endozytose auf, transportieren sie durch den Zellleib und schleusen sie auf

der gegenüberliegenden, nicht osteoklastisch tätigen Seite wieder aus.

Zur Proliferation von Osteoklastenvorläuferzellen sezernieren Osteoblasten

Wachstumsfaktoren (TGF-, RANKL) und Zytokine (z.B. M-CSF) (Fuller, Lean et al. 2000,

S. 2445). Zusätzlich interagieren die Blasten und Klasten über RANK direkt miteinander,

was die Fusion und Reifung der Osteoklasten anregt. Osteoprotegerin aus den

Osteoblasten unterbindet diese Interaktion. Nach Calcitoninbindung löst sich der

Osteoklast von der Knochenmatrix und der Faltensaum verschwindet. (Benninghoff

1985, S. 140-141; Lüllmann-Rauch 2003, S. 127-129; Pschyrembel 2004, S. 1331)

Das Endost überzieht die innere Knochenoberfläche. Es besteht aus einer dünnen Schicht

von nicht-mineralisierten Kollagenfibrillen und einer Schicht lining cells. Diese umfassen

mesenchymale Stammzellen, Osteoprogenitorzellen, ruhende Osteoklasten und –blasten

werden bei Umbau- oder Reparaturmaßnahmen aktiviert (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129).

Das Periost überzieht die äußere Knochenoberfläche, ist gut vaskularisiert und innerviert. Es

weist die gleichen Zellen wie das Endost auf.

Jährlich werden etwa 10% der gesamten Knochenmasse umgebaut (remodelling), um das

Skelett vor Materialermüdung zu schützen, Mikroschäden zu reparieren und es an die

funktionelle Beanspruchung anzupassen.

Neben den mechanischen Aspekten haben auch Hormone einen großen Einfluss auf den

Knochenstoffwechsel (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129):

Östrogen hemmt die Osteoblasten-induzierte Rekrutierung der Osteoklasten, somit

ist der Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen eine der maßgeblichen

Ursachen für Osteoporose (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).

Parathormon aus der Nebenschilddrüse erhöht Osteoblasten-vermittelt die

Rekrutierung und Aktivität der Osteoklasten, die durch eine gesteigerte

Knochenresorption den Serumcalciumspiegel erhöhen (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133;

Haima 2013, S. 6).

Calcitonin, das in den C-Zellen der Schilddrüse gebildet wird, ist der Gegenspieler des

Parathormons. Durch direkte Osteoklastenhemmung bewirkt es eine schnelle jedoch

Einleitung

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nur kurz dauernde Senkung der Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Serum

(Benninghoff 1985, S. 147; Lüllmann-Rauch 2003, S. 133; Haima 2013, S. 6).

Vitamin D3 (siehe Kapitel 2.3.2)

2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene

Differenzierung von Ad-MSCs

Adäquate Therapiemöglichkeiten für Patienten mit größeren Knochendefekten, z.B. bedingt

durch ein Trauma oder nach Tumorextraktion, die nicht durch körpereigene

Reparaturmaßnahmen geheilt werden können, stellen ein großes Problem in der

orthopädischen und unfallchirurgischen Versorgung dar. Der derzeitige klinische Standard ist

die auto- und allogene Knochentransplantation (Kao and Scott 2007, S. 513). Für den

Patienten ist die autogene Behandlungsmethode jedoch mit einem erhöhten Risiko für

Infektion und Morbidität durch den zusätzlichen operativen Eingriff verbunden (Brawley and

Simpson 2006, S. 342; Chen, Chen et al. 2006, S. 496; Silva, Cortez et al. 2006, S. 420; Chou,

Mann et al. 2007, S. 199). Der Einsatz allogener Transplantate bringt die Gefahr einer Graft-

versus-Host Reaktion mit sich (Wheeler, Haynie et al. 2001, S. 251; Wheeler 2005, S. 36;

Kode, Mukherjee et al. 2009, S. 377). Alternativ werden auch alloplastische Ersatzverfahren

angewendet, die jedoch lediglich als Defektfüller dienen und bei einem ausbleibenden

osteoinduktiven Einbauprozess sich lockern können. Im Tiermodel konnten große

Knochendefekte durch Beschichtung der Implantate mit osteogenen Wachstumsfaktoren

erfolgreich überbrückt werden (Pelled, Ben-Arav et al. 2010, S. 13-14; Vertenten, Gasthuys

et al. 2010, S. 153-157). Übertragungsversuche in den klinischen Alltag sind bis jetzt

allerdings gescheitert.

Das Tissue Engineering eröffnet für diese Patientengruppe eine neue, risikoarme und

vielversprechende Behandlungsmöglichkeit. Ziel ist nicht nur die Wiederherstellung der

Funktionalität der betroffenen Extremität sondern eine vollständige Genesung durch den

Einsatz körpereigener histogener Zellen auf biokompatiblen Trägermaterialien (Egana, Fierro

et al. 2009, S. 1191; Schmidt-Rohlfing, Tzioupis et al. 2009, S. 786). Anfänglich kamen vor

allem autogene primäre Osteoblasten zum Einsatz, die jedoch nicht in ausreichender Menge

gewonnen werden konnten. Somit hat sich in den letzten Jahren die Verwendung

mesenchymaler Stammzellen etabliert. Studien belegen das ubiquitäre Vorkommen

mesenchymaler (adulter) Stammzellen in verschiedenen Geweben und Organen wie

Einleitung

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Knochenmark, Muskel, Gehirn, Haut und subkutanem Fettgewebe (Kakudo, Shimotsuma et

al. 2008, S. 191). Per definitionem charakterisiert man Stammzellen durch ihre Fähigkeit zur

Selbstreplikation und somit spielen sie eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der

Homöostase im Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Band-, Fett- und Stromagewebe (Bruder, Fink

et al. 1994, S. 283). Ein weiteres Merkmal mesenchymaler Stammzellen ist deren Plastizität,

d.h. sie sind in der Lage in verschiedene Gewebetypen zu differenzieren (Pittenger, Mackay

et al. 1999, S. 143; Mizuno 2009, S. 56).

Bezüglich der osteogenen Differenzierungslinie können sich mesenchymale Stammzellen in

sogenannte Osteoprogenitorzellen, Vorläuferzellen einiger Knochenzellen, weiter

differenzieren. Osteoprogenitorzellen stellen die Ausgangsform für die

Weiterdifferenzierung in Osteoblasten, Osteozyten und „lining cells“ dar (Clarke 2008, S.

134).

Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle (modifiziert nach Takada, Kouzmenko et al. 2009, S. 444) Die mesenchymale Stammzelle kann durch ihre Plastizität in unterschiedlich spezialisierte Gewebe differenzieren.

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Gimble et al. haben vorgeschlagen, dass Stammzellen für den Einsatz in der regenerativen

Medizin folgende Kriterien erfüllen sollten (Gimble 2003, S. 1249-1250; Gimble, Katz et al.

2007, S. 1249-1250):

zur Reduktion des perioperativen Risikos für den Spender müssen die Stammzellen

durch minimal invasive Extraktionsmethoden gewonnen werden können

aus dem zur Verfügung stehende Gewebe sollen mit standardisierten Methoden eine

große Zahl von Zellen (im Millionenbereich) isoliert werden können

eine Differenzierung in verschiedene Gewebe soll durch regulierbare und

reproduzierbare Methoden gewährleistet werden

Gewährleistung sicherer und effektiver auto- und allogener Transplantations-

möglichkeiten

die Zellen müssen gemäß aktueller GMP-Richtlinien (Good Manufacturing Practice

guidelines; EU-Richtlinie 2003/94/EC) verarbeitet werden können

Traditionell werden MSCs aus dem Aspirat einer Knochenmarkbiopsie gewonnen. Diese ist

jedoch sehr schmerzhaft, geht mit einem nicht zu unterschätzenden periinterventionellen

Risiko für den Patienten einher und liefert nur eine geringe Menge an Material, wenn

Folgeerscheinungen wie Anämien vermieden werden sollen (Bain 2003, S. 949).

Subkutanes Fettgewebe hingegen kann leicht in Lokalanästhesie in ausreichenden Mengen

entnommen werden. Es ist möglich aus einem Gramm Fettgewebe ca. 5 x 103 Zellen zu

isolieren, etwa 500 mal so viel wie aus Knochenmark (Coleman 2006, S. 117). Zudem

verringert der Gebrauch von adulten Stammzellen Akzeptanzprobleme der Methoden bei

den Patienten oder Konflikte mit den aktuell geltenden Gesetzen in Deutschland.

Allen geforderten Punkten kann mit Fettgewebsstammzellen nachgekommen werden und

somit stellen sie eine gute Alternative zu den Knochenmarkstammzellen dar. Zur

Überprüfung ob Ad-MSCs auch für das Tissue Engineering von Knochen verwendbar sind,

werden sie auf ihre Oberflächenrezeptoreigenschaften untersucht und mit verschiedenen

Substanzen stimuliert, um die osteogene Differenzierung zu induzieren.

Für diese Arbeit wird abdominelles bzw. Hüftfett verwendet, das nach vorheriger Aufklärung

und schriftlicher Zustimmung der Patienten während der Operation entnommen wird.

Einleitung

Seite | 18

2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung

Damit den Zellen auch die benötigten Nähr- und Signalstoffe zur osteogenen Differenzierung

zur Verfügung stehen, werden verschiedene Supplemente für die nachfolgenden

Experimente verwendet. Dies erfolgt einerseits in Anlehnung an bereits publizierte

Protokolle zur osteogenen Differenzierung und andererseits durch den Einsatz von

Substraten, die Osteoblastenkulturmedien zugesetzt werden (Hattori, Sato et al. 2004, S. 4;

Kroeze, Knippenberg et al. 2011, S. 233).

2.3.1 Phosphat- und Calciumlieferanten

Hydroxylapatit-Kristalle bilden die Hauptkomponente des mineralisierten Matrixanteils und

bestehen aus Calcium und Phosphat.

Als Phosphatlieferanten werden -Glycerolphosphat (siehe Abbildung 3) und

L-Ascorbinsäure-2-phosphat (siehe Abbildung 4) eingesetzt, wobei letzteres die Zugabe von

HEPES (siehe Abbildung 5) erfordert, um einer pH-Wert-Entgleisung entgegenzuwirken.

Das zweiwertige Calcium wird als Calciumchloridsalz (siehe Abbildung 6) zugegeben.

Abbildung 3: β-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (von Sigma Aldrich)

Abbildung 4: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (von Sigma-Aldrich)

Einleitung

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Abbildung 5: HEPES (von Sigma-Aldrich)

Abbildung 6: Calciumchloriddihydrat (von Sigma Aldrich)

2.3.2 Vitamin D3

Vitamin D3 (Cholecalciferol) (siehe Abbildung 7) ist ein Hormon, das im menschlichen

Organismus die intestinale Ca2+-Aufnahme und dessen Einbau in den Knochen reguliert.

Somit erhöht es die Effizienz des Calciums (Haima 2013, S. 6). Biochemisch handelt es sich

dabei um ein Steroid, das durch UV-Licht oder enzymatisch in seine aktive Form, das 1,25-

Dihydroxycholecalciferol umgewandelt wird.

Die elementare Bedeutung von Cholecalciferol im Knochenstoffwechsel wird am

Krankheitskomplex der Vitamin-D-Mangelerscheinungen deutlich. Eine Hypovitaminose

führt zu Mineralisierungsstörungen des Skeletts und kann sich je nach Lebensalter in

unterschiedlichen Krankheitsbildern äußern: Säuglinge und Kinder erkranken an der

sogenannten Rachitis, bei der eine Störung der enchondralen Ossifikation vorliegt, die von

schweren Knochendeformationen bis hin zu Tetanien und Krampfanfällen führen kann.

Im Erwachsenenalter äußert sich dieser Vitaminmangel als Osteoporose (verminderte

Knochensubstanz und mikroarchitektonischer Stabilitätsverlust) oder Osteomalazie (erhöhte

Weichheit des Knochens und Verbiegungstendenz). Erstere kann Spontanfrakturen mit sich

bringen, bei letzterer kommen als weitere Komplikation noch Deformationen hinzu

(Pschyrembel 2004, S. 1933-1934; Rassow 2012, S. 278).

Einleitung

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Abbildung 7: Cholecalciferol (von Sigma-Aldrich)

2.3.3 Dexamethason

Zusammen mit anderen Hormonen verzögern Glukokortikoide wie das Dexamethason (siehe

Abbildung 8) in physiologischen Dosen das Längenwachstum von Röhrenknochen durch

Proliferationshemmung von Osteoblasten und der Differenzierung von Knorpelzellen in den

Epiphysenfugen (Rassow 2012, S. 595). Im medizinischen Alltag weisen sie ein weites

Behandlungsspektrum für die verschiedensten Indikationen auf. Jedoch wird bei einer

Langzeittherapie ihr immunsuppressives Potential von einer großen Anzahl unerwünschter

Nebenwirkungen begleitet, die in ihrer vollen Ausprägung als Morbus Cushing bekannt sind.

Im Bereich der Knochen können sehr hohe Dosen, auch wenn sie nur kurzfristig zum Einsatz

kommen, zu Osteoporose oder aseptischen Knochennekrosen im Kopfbereich von Humerus

und Femur führen (Kaiser 2002, S. 137-138).

In vielen Publikationen konnte Dexamethason dennoch die osteogene Differenzierung

mesenchymaler Stammzellen nicht nur induzieren sondern auch signifikant verbessern

(Koehler, Alge et al. 2013, S. 4150; Ma, Zhang et al. 2013, S. 1403).

Abbildung 8: Dexamethason–Cyclodextrin-Komplex (von Sigma-Aldrich)

Einleitung

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2.3.4 BMP 2 und BMP 7

Diese beiden Vertreter aus der Familie der BMPs werden seit einigen Jahren in Form von

rekombinanten humanen Proteinen klinisch zur Anwendung gebracht. Zum Einsatz kommt

dabei das rekombinante humane BMP-2 (rh-BMP-2) InductOs® der Firma Wyeth und das rh-

BMP-7 Osigraft® der Firma Olympus vormals Stryker. Ersteres ist zugelassen bei akuten

Tibiafrakturen sowie zur monosegmentalen anterioren lumbalen Spondylodese bei

Erwachsenen mit degenerativem Bandscheibenvorfall und einem erfolglosen 6 monatigen

konservativen Therapieversuch. Letzteres wird bei seit mindestens 9 Monaten bestehenden

Pseudarthrosen nach Tibiafrakturen eingesetzt.

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-Familie

gehört (Wozney 1989, S. 267). Im klinischen Alltag finden BMP 2 und BMP 7 Einsatz bei der

Behandlung von großen Knochendefekten oder Frakturheilungsstörungen (Wildemann,

Burkhardt et al. 2007, S. 1; Schmidmaier, Capanna et al. 2009, S. 41).

BMP 2 ist ein potentes osteoinduktives Zytokin, das die Bildung von Knochen und Knorpel in

Verbindung mit osteokonduktiven Trägern wie Kollagen und synthetischem Hydroxylapatit

induziert. Zusätzlich zur osteogenen Aktivität spielt BMP 2 eine wichtige Rolle bei der

kardialen Morphogenese (Hill 2013, S. 41).

BMP 7 auch bekannt als Osteogenic Protein-1 oder OP-1 ist eine wirksame osteogene

Substanz, die in Anwesenheit geeigneter Trägerstoffe (z.B. eines Kollagenschwammes oder

synthetischem Hydroxylapatit) zur Behandlung von Knochendefekten eingesetzt wird. BMP 7

induziert die Knorpel- und Knochenbildung, ist an der Regulation des Calciumhaushaltes

sowie der Knochenhomöostase beteiligt (Hill 2013, S. 41).

Für die Signaltransduktion der Mitglieder der TGF-β Superfamilie werden jeweils ein TGF-β

Rezeptor Typ I (Alk 1-7) und Typ II Rezeptor (TGF-β, ActR-II, ActR-IIB, BMPRII und AMHR-II)

(Massague 1998, S. 753; Inman, Nicolas et al. 2002, S. 65-66) benötigt (siehe Abbildung 9).

Die BMPs vermitteln ihre Signale lediglich über Alk 1, Alk 2, Alk 3 und Alk 6 der Typ I

Rezeptoren sowie BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB der Typ II Rezeptoren. Nach Bindung des

BMP-Liganden an einen der Typ I Rezeptoren verbindet sich dieser Komplex intrazellulär mit

dem entsprechenden Typ II Rezeptor. Der konstitutiv aktivierte (phosphorylierte) Typ II

Rezeptor aktiviert nun den Typ I Rezeptor durch die Übertragung des Phosphatrests (Piek,

Heldin et al. 1999, S. 2109; Chen, Deng et al. 2012, S. 273-274). Der aktivierte Typ I Rezeptor

erkennt die fünf zytoplasmatisch rezeptorregulierten Smad-Proteine (R-Smads 1, 2, 3, 5, 8).

Einleitung

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Die Bindung eines BMP-Liganden aktiviert R-Smad 1, 5 und 8 (Piek, Heldin et al. 1999, S.

2109) wohingegen TGF-β, Nodal oder Activin über R-Smad 2 und 3 die Signaltransduktion

vermitteln (Ross and Hill 2008, S. 384-385). Smad 4 wird nicht von Liganden kontrolliert und

kann mit allen aktivierten R-Smads Komplexe bilden. Somit unterstützt es als common-

mediator Smad-Protein (co-Smad, Smad 4) bei der Signaltransduktion in den Zellkern. (Ross

and Hill 2008, S. 385-386)

Die I-Smads (Inhibitory Smads) bestehend aus Smad 6 und 7 wirken auf die

Signalübertragung inhibierend. Diese binden zum einen an den Typ-I-Rezeptor und hindern

somit die Aktivierung der R-Smads oder erkennen zum anderen direkt aktivierte R-Smads

und beeinflussen dadurch die Komplexbindung mit co-Smad. Smad 6 inhibiert die BMP-

Signaltransduktion wohingegen Smad 7 zusätzlich den TGF-β- und Activin-Signalweg hemmt.

(Ross and Hill 2008, S. 386, 393)

Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings Die Ligandenbindung aktiviert im Zellinneren die R-Smad Phosphorylierung, dabei übermitteln die BMPs ihre Aktivierung über Smad 1/5/8 und TGF-β über Smad 2/3, zusammen mit dem co-Smad wird die Information in den Zellkern weitergeleitet. I-Smad 6 wirkt inhibitorisch auf das Smad 1/5/8 Signalling wohingegen Smad 7 beide Signalwege beeinflussen kann. (modifiziert nach Horbelt, Denkis et al. 2012, S. 470)

TGF-βRII:- BMPRII- ActR-II- ActR-IIB

BMP

Smad 4

TGF-βRI:- Alk 1- Alk 2- Alk 3- Alk 6

TGF-βRI TGF-βRII

TGF-β

Smad 1/5/8 Smad 1/5/8 Smad 2/3Smad 2/3P P

Smad 4

R-SmadP

Smad 4

Smad 6

Smad 7

Einleitung

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Die Arbeitsgruppe um Kang schleuste in C2C12-Zellen einen rekombinanten Adenovirus, der

alle 14 BMPs exprimiert. Anschließend injizierten sie diese in den Quadrizeps von

Nacktmäusen. In den Gruppen von BMP 2, 6, 7 und 9 (siehe Abbildung 10) konnten sie

sowohl radiologisch als auch histologisch die Ossifikation des Muskels an dieser Stelle

nachweisen (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314).

Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 C2C12 Zellen mit rekombinantem Adenovirus, der alle 14 BMPs exprimiert, wurden in den Quadrizeps der Nacktmäuse injiziert. Nach 3 Wochen konnte röntgenologisch bei den mit BMP 2, 6, 7 und 9 stimulierten Gruppen Knochengewebe nachgewiesen werden (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314). Kontrollgruppe: GFP = Grün Fluoreszierendes Protein, das Dreieck zeigt die Injektionsstelle

Lange Zeit waren nur BMP 2 und BMP 7 rekombinant herstellbar und für die klinische

Anwendung zugelassen, deshalb beschränken wir uns auf diese beiden Faktoren.

Zielsetzung

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3 Zielsetzung

Knochenmarkstammzellen waren lange die vielversprechendste Quelle von mesenchymalen

Stammzellen. Sie sind jedoch nur in geringen Mengen verfügbar, wenn das hämatopoetische

Gleichgewicht nicht zerstört werden soll. Zusätzlich ist deren Extraktion mit einem nicht zu

vernachlässigenden interventionellen Risiko verbunden.

Ziel dieser Arbeit war es deshalb mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe zu isolieren

und diese osteogen zu differenzieren. Ad-MSCs sind in großen Mengen verfügbar und

können risikoarm und einfach von jedem Patienten gewonnen werden.

Zur Überprüfung welche Substanzen von den Zellen aufgenommen werden können, müssen

diese zunächst mittels Bestimmung von Oberflächenrezeptoren charakterisiert werden.

Anschließend sollen die Zellen mit verschieden zusammengesetzten Medienkonstellationen

stimuliert werden, um ein osteogenes Differenzierungsprotokoll zu erstellen. Ein weiteres

Ziel ist es möglichst preisgünstige Supplemente zu verwenden, was vor allem für den

späteren klinischen Einsatz eine entscheidende Rolle spielt. Abschließend werden die

differenzierten Stammzellen bezüglich ihrer exprimierten osteoblastentypischen Gene noch

mit primären Osteoblasten verglichen.

Im Überblick sollen also folgende Ziele verfolgt werden:

1. Grundcharakterisierung der Ad-MSCs:

a. Expression von Oberflächenrezeptoren

b. chondrogene Differenzierung

c. adipogene Differenzierung

2. Erstellung eines optimierten osteogenen Differenzierungsprotokolls durch Testung

verschiedener osteogener Mediensupplemente auf:

a. AP-Aktivität

b. Matrixmineralisierung

c. Expression osteoblastentypischer Gene

Bei der Charakterisierung der osteogenen Eigenschaften dienen primäre humane

Osteoblasten als Goldstandard.

Materialien und Methoden

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4 Materialien und Methoden

4.1 Verbrauchsmaterialien

Material Hersteller/Bezugsadresse

Aqua Spüllösung (ddH2O) DeltaSelect, Dreieich

Cell Culture Flask 175 cm² with filter cap SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Cell scraper 13 mm blade, 20 mm blade PAA, München

Cellstrainer PAA, München

Cryo-Tubes 2 ml PAA, München

Cuvetten: Uvette 220-1600 nm, 50-2000 µl Eppendorf, Hamburg

DMSO Sigma, München

Einmalspritzen, 2-teilig, steril, 10 ml, 20 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Ethanol 70 % zur Desinfektion Apotheke, MRI

Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI

Formaldehyd Apotheke, MRI

Glaspipette, serologisch, steril 5 ml, 10 ml,

25 ml, 50 ml

SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe

HCl zum Einstellen des pH Wertes Merck, Darmstadt

Konische Röhrchen, Polypropylen, steril,

15 ml, 50 ml

BD Falcon™, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

NaOH zum Einstellen des pH Wertes Merck, Darmstadt

Pasteurpipetten Glas groß 230 mm, 150 mm NeoLab, München

PCR 8er-Strips mit separatem Deckelstreifen, PP, autoklavierbar, DNase-, DNA- und RNase-frei

Brand GmbH & Co KG, Wertheim

Pipettenspitzen epT.I.P.S. Standard 0.1-10 μl, 2-200 μl, 50-1000 μl

Eppendorf AG, Hamburg

Safe-Lock Reaktionsgefäße 0.5 ml, 1.5 ml,

2.0 ml Eppendorf AG, Hamburg

Skalpell B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Steriles Wasser B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Sterilfilter PAA, München

Wasserstabil Carl Roth, Karlsruhe

Zellkulturplatte, 48 Vertiefungen, Flachboden

mit Deckel

BD Falcon™, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Flachboden mit Deckel

SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Zellkulturschalen Falcon, 353003

Zellkulturschalen 10 cm Corning Omnilab, München

Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Materialien


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4.2 Geräte und Software

Gerät Hersteller

8-Kanal Pipette Research® (variabel) 300 μl Eppendorf AG, Hamburg

Absaugpumpe: Vacusafe comfort IBS Integra Biosciences, Fernwald

Autoclav: 2540 SL Systec, Wettenberg

Bench BDK (Luft- und Raumtechnik GmbH), Sonnenbühl-Genkingen

BioPhotometer Eppendorf, Hamburg

Einkanal Pipette Research® (variabel)

2,5 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl Eppendorf AG, Hamburg

ELISA-Reader: FluoStar OMEGA BMG LabTec,

Gel Kammer: Wide Mini Sub Cell 6R Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Graph Pad Prism www.graphpad.com

Image J NIH, USA-Bethesda

Inkubator: Hera Cell 150 Haereus, Thermo Fisher Scientific

Intas Gel Jet Imager Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen

Kühl- und Gefrierschränke

- 80 °C - 20 °C No Frost Premium + 4 °C profi line

Sanyo, Bad Nenndorf Liebherr, CH – Bulle Liebherr, CH – Bulle

Laborabzug-7561 DIN 12924 Klasse 2 Köttermann Systemlabor, D-Uetze/Hänigsen

Luer-Zange Materialwirtschaft Klinikum MRI

Magnet Mixer: MR Hei-Mix L Heidolph, Schwabach

Mastercycler ep gradient S Eppendorf AG, Hamburg

Microsoft Excel Microsoft Office 2010

Mikroskope: Axiovert 40 CFL Eclipse TS 100

Zeiss, Berlin Zeiss, Berlin

Mikrowelle TechnoStar, Bremen

NanoDrop 1000, Spectrophotometer Thermo Scientific, USA – Wilmington

Neubauer Zählkammer Carl Roth, Karlsruhe

Ph-Meter: PB-11 Sartorius, Göttingen

Photo-Dokumentation für PCR-Gel Intas, München

pipetus® Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt

PowerPac™ HC Power Supply Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Primer Blast www.pubmed.com

Vortex-Genie 2 Scientific Industries, US-New York

Vortex-Genie 2 Carl Roth, Karlsruhe

Waage: EG 220-3 NM Kern & Sohn, Balingen-Frommern

Wasserbad Memmert Gmbh Co Kg, Schwabach

Zentrifugen :

Centrifuge 5804R Centrifuge 5417R

Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg

Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Geräte

http://www.graphpad.com/

http://www.pubmed.com/


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4.3 Steriles Arbeiten

Zur Vermeidung von Kontaminationen aber auch zum Eigenschutz werden die Zellen

ausschließlich unter sterilen Bedingungen isoliert und kultiviert. Dafür werden alle Versuche

in einer sterilen Werkbank durchgeführt. Ein vertikaler, laminarer Luftstrom mit eingebauten

HEPA (high efficiency particulate air) Filter und UV-Lampe, die am Ende eines jeden

Arbeitstages für 30 min eingeschaltet wird, ermöglichen nahezu keimfreies Arbeiten.

Zusätzlich ist gründliches Händewaschen vor Arbeitsbeginn, das Tragen von Handschuhen

und die Händedesinfektion mit Ethanol 70 % essentiell. Zu Beginn der Tätigkeit werden die

Flächen der Werkbank sowie alle verwendeten Materialien mit Ethanol 70 % abgesprüht.

Nicht sterile Lösungen, die mit den Zellen in Kontakt kommen, werden entweder steril

filtriert oder bei 120 °C für 20 min autoklaviert. (Schantz and Ng 2004, S. 4-7)

4.4 Zellisolation

4.4.1 Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe

Benötigte Materialien:

DMEM High Glucose (4,5 g/L) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mM stabilem Glutamin

FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) (für alle nachfolgenden Versuche gilt: FCS muss vor der Verwendung für 30 min auf 56 °C erhitzt werden, um das Komplement zu inaktivieren)

Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)

Durchführung der Methode:

Herstellung des Ad-MSC Kulturmediums mindestens 24 h vor Beginn der Isolation, um eine

mögliche Kontamination ausschließen zu können:

Endkonzentration

500 ml DMEM 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L


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Das Fettgewebe wird gewogen und in einer Zellkulturschale mit steriler Pinzette und Skalpell

zerkleinert. Anschließend gibt man das Fett in ein 50 ml Reaktionsgefäß, füllt mit D-PBS auf,

vermischt beides gut durch vorsichtiges Schütteln und zentrifugiert alles für 10 min bei

430 x g, 22 °C, ohne Beschleunigung oder Bremse. Das Fettgewebe schwimmt nach der

Zentrifugation oben und die auszuwaschenden Blutbestandteile haben sich als Pellet am

Boden gesammelt. Nun wird D-PBS und Pellet mit einer autoklavierten Glaspipetten

abgesaugt und der Waschschritt zwei- bis dreimal wiederholt, um eine Verunreinigung der

Kultur durch andere Zellarten zu minimieren.

Zwischenzeitlich kann die Kollagenase-Lösung hergestellt werden, man benötigt 1 ml Lösung

pro 1 g Fett:

Endkonzentration

0,6 mg Kollagenase CLS II 0,06 % 1 ml D-PBS

miteinander vermischen und die Lösung durch einen Sterilfilter zum Fettgewebe geben. Um

optimale Voraussetzungen für die Kollagenase zu schaffen inkubiert man das Gefäß im

Wasserbad (37 °C) für 30-60 min unter wiederholtem Schütteln bis eine Fettemulsion

entstanden ist. Zum Stoppen der Enzymwirkung in diesem Ansatz gibt man nun 10 ml

Kulturmedium zu, mischt es durch vorsichtiges Schwenken unter und zentrifugiert alles für

10 min bei 600 x g, 22 °C mit einer mittleren Beschleunigungs- und Bremsstärke. Das oben

aufschwimmende Fett kann mit der Pinzette abgenommen und der flüssige Überstand

abgesaugt werden. Das Pellet wird mit 12 ml warmem D-PBS resuspendiert und, um

verbleibendes Bindegewebe zu entfernen, durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von

200 µm in ein neues 50 ml Gefäß gefiltert. Nach Zugabe von 15 ml Kulturmedium kann die

Zellsuspension in eine Kulturflasche mit 175 cm2 gegeben werden. Inkubation der Zellen bei

37 °C und 5 % CO2 mit anschließendem Mediumwechsel nach 12-24 h, um nicht adhärente

Zellen (z.B. Erythrozyten) zu entfernen, danach im Intervall von 5 Tagen wechseln. Sind am

Folgetag im Lichtmikroskop viele frei schwimmende Zellen zu erkennen ist ein Waschschritt

mit D-PBS vor der erneuten Mediumzugabe empfehlenswert.


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4.4.2 Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen


MEM-EARLE PAA, Pasching, Austria (E15-024) HAM’S F-12 PAA (E15-016) FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Glutamin PAA (M11-006) L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium

Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960) ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat

(MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)


Herstellung des MEM-EARLE/HAM’s F12 Kulturmediums vor Beginn der Isolation:

1. L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung

Endkonzentration

128 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat (MW: 289,54 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration

20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren

2. β-Glycerolphosphat Stocklösung

Endkonzentration

108 mg ß-Glycerolphosphat (MW: 216,04 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration

20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren

3. MEME/HAM’s F12 Kulturmedium

Endkonzentration

500 ml einer 1:1 Mischung aus MEME und HAM’s F12 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L 0,5 ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung 0,005 mM 0,5 ml ß-Glycerolphosphat Stocklösung 0,005 mM


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Das Knochenfragment (in dieser Arbeit werden ausschließlich Femurköpfe verwendet) gibt

man in eine Zellkulturschale. In ein 50 ml Reaktionsgefäße (A) werden 40 ml D-PBS

vorgelegt. Da man zum Bearbeiten des Knochens diesen in die Hand nehmen muss, ist die

Verwendung von sterilen Handschuhen erforderlich. Nun mit einer Knochenzange nach Luer

kleine Fragmente aus dem Spongiosa- und Markbereich gewinnen und sofort in das

vorbereitete Gefäß (A) geben (der restliche Knochen muss als Sondermüll entsorgt werden).

Zum Waschen der Knochenstücke füllt man das Gefäß (A) bis 50 ml mit D-PBS auf,

verschließt und schwenkt es vorsichtig und saugt mit einer sterilen Glaspipette

Fetttröpfchen und D-PBS ab. Diesen Waschvorgang wiederholt man solange bis der Knochen

weitestgehend fett- und blutfrei ist. Als nächstes bereitet man die Kollagenase-Lösung zu,

man benötigt 1 ml Lösung pro 1 ml Knochen:

Endkonzentration

0,7 mg Kollagenase CLS II 0,07 % 1 ml D-PBS

miteinander vermischen und steril filtriert in Gefäß (A) geben. Anschließende Inkubation im

Wasserbad bei 37 °C für eine Stunde unter mehrmaligem Schwenken.

Den Überstand aus Gefäß (A) abnehmen und in ein neues Gefäß (B) geben, die

Knochenfragmente in (A) werden dann noch weitere zweimal mit D-PBS gewaschen und die

Waschlösung wieder in (B) überführt. Gefäß (B) zentrifugiert man für 10 min bei 600 x g,

20 °C ohne Beschleunigung oder Bremse, saugt den Überstand ab und resuspendiert das

Pellet in 25 ml MEME/HAM’s F12 Medium. Abschließend gibt man die Zellsuspension in eine

Kulturflasche mit 175 cm2, diese aus dem Kollagenaseüberstand stammenden Osteoblasten

tragen die Bezeichnung OSÜ. Die Knochenfragmente aus Gefäß (A) füllt man ebenso in ein

Zellkulturflasche (175 cm2) und gibt 25 ml Medium hinzu, die Zellen, die aus der Spongiosa

heraus wachsen werden als Osteoblasten aus der Spongiosa (OSS) bezeichnet. Beide

Flaschen werden nun bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Mediumwechsel am nächsten Tag und

dann alle 5 Tage.


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4.5 Zellzahlbestimmung

4.5.1 Sulforhodamin B (SRB) Färbung

SRB bindet unter sauren Bedingungen an Oberflächenproteine und findet Verwendung bei

der Erstellung von Wachstumskurven, Toxizitätstests und der Normalisierung von

Enzymaktivitäten ohne die Zellen dabei zu lysieren.


Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Essigsäure 99,8 % Sigma, München (695084) Sulforhodamin B Natriumsalz Sigma (S9012) TRIS (hydroxymethyl)-aminomethan Sigma (T87602)


Herstellung der benötigten Lösungen:

1. 1 % Essigsäurelösung

Endkonzentration

10 ml Essigsäure 1 % 990 ml ddH2O

2. Sulforhodamin B (SRB-) Lösung

Endkonzentration

1 g Sulforhodamin B (MW: 580,65 g/mol) 0,4 % 250 ml 1 % Essigsäurelösung Lösung ist wiederverwendbar in brauner Flasche lagern

3. 10 mM ungepufferte TRIS-Lösung (pH = 10 – 10,5)

Endkonzentration

1,2 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 10 mM 1 L dH2O

Zu Beginn saugt man das Medium von den Zellen ab und fixiert diese für 1 h bei -20 °C mit

Ethanol. Das Ethanol wird wieder abgesaugt und die Zellen mit SRB-Lösung bedeckt:

50 µl pro Well einer 96-Well-Platte 300 µl pro Well einer 48-Well-Platte 600 µl pro Well einer 24-Well-Platte


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Zur Inkubation der Färbelösung die Platte lichtdicht abdecken und für 30 min auf den

Schwenkinkubator stellen. Anschließend wird die wiederverwendbare SRB-Lösung zurück in

die Flasche gegeben und der überschüssige, nicht gebundene Farbstoff viermal mit

1 % Essigsäurelösung abgewaschen. Im Lichtmikroskop ist nun eine pinke Färbung der Zellen

zu erkennen (siehe Abbildung 11).

Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen nach Färbung mit SRB-Lösung (Vergrößerung: 10 X).

Zur Quantifizierung das SRB vollständig auf dem Schwenkinkubator mit 10 mM

ungepufferter TRIS-Lösung lösen


und die optische Dichte (OD) bei = 565 nm (OD des SRB) (siehe Abbildung 12) und

= 690 nm (Störeinflüsse, z.B. durch eventuelle Beschädigungen an der verwendeten Platte)

messen. Zur Berichtigung der Messwerte bildet man die Differenz aus beidem:

OD565 nm – OD690 nm. Das Ergebnis stellt eine relative Bestimmung der Oberflächenproteine

der fixierten Zellen dar und dient somit als relative Zellzahlbestimmung (Skehan, Storeng et

al. 1990, S. 1107).


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Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der SRB-Lösung bei 565 nm.

Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur

Fixierung Ethanol 1 h / -20 °C

Färbung SRB-Lösung 30 min, lichtdicht, Shaker / RT

Waschen 1 % Essigsäure 4 x

Farbstoff lösen / Quantifizierung

10 mM ungepufferte TRIS-Lösung

bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT

Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der SRB-Färbung.

4.5.2 Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten

Zellzahl pro cm2


Neubauer Zählkammer Laboroptik GmbH, Bad Homburg Trypan blau 0,5 % Biochrom AG, Berlin (L6323) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Ethanol 70 % Apotheke MRI

Wellenlänge [nm]

Ab

sorp

tio

n


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Zum Aussäen einer bestimmten Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit, muss erst die

Gesamtzellzahl der Zelllösung nach dem Resuspendieren des Pellets ermittelt werden. Dazu

entnimmt man der Zellsuspension 30 µl und vermischt diese gut mit 30 µl Trypan blau

Stocklösung:

Endkonzentration

1 ml Trypan blau 0,5 % 0,125 % 3 ml D-PBS

Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer Die schematische Darstellung zeigt die Interferenzlinien, die zwischen Zählkammer und Deckglas entstehen, wenn man dies nach Befeuchten mit der Atemluft mit sanftem Druck von vorne aufschiebt (modifiziert anhand der Herstellerangaben). Vergrößerte Darstellung der Zählnetze siehe nächste Abbildung.

Die speziell für Zellzählungen entwickelte Neubauer Zählkammer (siehe Abbildung 13) wird

wie folgt vorbereitet: zuerst Zählkammer und Deckglas mit Ethanol säubern. Anschließend

beides mit Atemluft befeuchten und das Deckglas mit sanftem Druck von vorne auf die

Zählkammer schieben (Vorsicht: Bruchgefahr des Deckglases). Die Ausbildung von

Interferenzlinien („Regenbogenlinien“) auf beiden Außenstegen zeigt, dass das Deckglas

richtig aufsitzt und somit der Abstand zwischen Mittelsteg und Deckglas 0,1 mm beträgt.

Nun gibt man die Trypan blau-Zelllösung mit einer Pipette an die Grenze zwischen Deckglas

und Zählkammer, welche durch die Kapillarwirkung in den Spalt zwischen Deckglas und

Kammerboden gesogen wird. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen

Kammer und Deckglas verbleiben. Die so beschickte Zählkammer kann nun unter dem

Mikroskop ausgezählt werden, wobei blau gefärbte Zellen tot sind und nicht mitgezählt

werden.

GrundplatteBeschriftungsfeld

Außensteg

Zählnetze

Deckglas Interferenzlinien


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Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer Zählkammer (modifiziert anhand der Herstellerangaben)

(a) schwarze Punkte: Zellen, die mitgezählt werden, graue Punkte: Zellen, die nicht mitgezählt werden (b) empfohlene Zählrichtung (c) großes Quadrat (insgesamt 9 pro Zählnetz) (d) kleines Quadrat (insgesamt 16 in jedem großen Quadrat eines Zählnetzes)

Alle Zellen, die innerhalb der 16 kleinen Quadrate plus diejenigen, welche auf bzw. an zwei

der vier Begrenzungslinien liegen werden in Pfeilrichtung zusammengezählt. Auf diese Weise

werden die je neun großen Quadrate der zwei Zählnetze ausgezählt, anschließend addiert

und die Zellzahl wie folgt berechnet:

Gesamtzellzahl G:

Anzahl der lebenden Zellen L:

Vitalität VI [%]:

n: Mittelwert aller gezählten Zellen

m: Mittelwert aller lebenden Zellen

VF: Verdünnungsfaktor (hier: 2) V: Volumen der Zellsuspension 104: Faktor der Zählkammer


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Um eine definierte Anzahl von Zellen pro cm² auszusäen, wird als nächstes die insgesamt

benötigte Zellzahl B berechnet:

Mit dem letzten Rechenschritt

ermittelt man die Menge an Zellsuspension, die in das Behältnis zuzugeben ist.

4.6 Kultur und Differenzierung

4.6.1 Passagieren


Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Trypsin-EDTA (1 X) PAA (L11-004) Kulturmedium für die jeweilige Zellart


Als Erstes das Kulturmedium mit einer sterilen Glaspipette absaugen und 20 ml warmes

D-PBS für 5 min in die Flasche geben, um Mediumreste, die das Trypsin inaktivieren würden,

auszuwaschen. Bei sehr hoher Konfluenz (80-100 %) sollte dieser Waschschritt ein zweites

Mal wiederholt werden. Nach erneutem Absaugen der Waschlösung Trypsin (2 ml auf eine

175 cm² Flasche) hinzugeben, durch Schwenken verteilen bis der Boden vollständig bedeckt

ist und die Flasche für 5 min bei 37 °C inkubieren lassen. Zum Lösen von noch am Plastik

adhärenten Zellen vorsichtig mit der Handinnenfläche gegen die Seitenwände klopfen.

Mikroskopisch kontrolliert man ob alle Zellen eine kugelige Form angenommen haben und

frei in der Flüssigkeit schwimmen, dies sind sichere Zeichen, dass sie sich vom Boden gelöst

haben. Ist das nicht der Fall muss die Inkubationszeit um 5 min verlängert werden. Um nun

das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen gesammelt in ein Reaktionsgefäß überführen zu

können, die Zellen mit warmem Kulturmedium vom Flaschenboden spülen. Dazu 15 ml


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Medium in eine serologische Pipette aufnehmen, dabei die Flasche so halten, dass der

Flaschenhals schräg nach oben zeigt und mehrmals mit diesen 15 ml Medium die Zellen vom

Flaschenboden abspülen. Anschließend die Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß geben und

für 7 min bei 600 x g, RT mit mittlerer Beschleunigungs- und Bremsstärke zentrifugieren.

Nach dem Absaugen des Überstands und Resuspension des Zellpellets in warmem

Zellkulturmedium werden die Zellen gezählt (siehe Kapitel 4.5.2) und auf neue Flaschen oder

Schalen verteilt.

4.6.2 Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter

Medien


Preadipocate Growth Medium (PGM)-2 Bulletkit (PT-9502 & PT-8202) Lonza, Walkersville (PT-8002) Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (Ready-to-use) PromoCell, Heidelberg (C-28012)


Der Versuch wird mit Ad-MSCs zweier Spender durchgeführt. Zuerst wird pro Spender eine

48-Well Platte mit Ad-MSCs bestückt. Nach 12 h wird jede Platte zur Hälfte mit dem

adipogenen und chondrogenen Medium (200 µl pro Well) beimpft und für 22 Tage bei 37 °C

und 5 % CO2 kultiviert, wobei alle 4 Tage die Differenzierungsmedien erneuert werden. Die

im Anschluss durchgeführten Färbungen sind in den Kapiteln 4.9.2 und 4.9.3 beschrieben.

4.6.3 Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung


L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960)

ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891)

HEPES (MW: 238,31 g/mol) Sigma (H4034) Calciumchloriddiyhdrat (MW: 147,02 g/mol) Sigma (C3881) Dexamethason (MW: 392,47 g/mol) Sigma (D2915) Cholecalciferol (MW: 384,65 g/mol) Sigma (95230)


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DMEM High Glucose (4,5 g/L) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mM stabilem Glutamin

FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) 100 U/L Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma (41639) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002)


Zu Beginn werden die Stocklösungen für die einzelnen Substanzen angesetzt, dabei sollte

deren Konzentration so gewählt werden, dass sich einerseits der Stoff vollständig löst

andererseits aber nur eine kleine Menge zum Ad-MSC Kulturmedium (Herstellung siehe

Kapitel 4.4.1) zugeben werden muss. Am besten eignen sich daher Lösungen die 100- bis

2000fach so hoch konzentriert sind wie die gewünschte Endkonzentration.

Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die verwendeten Konzentrationen in den jeweiligen

Stocklösungen und Differenzierungsmedien.

Substrat [c]

Stocklösung [c] im Differenzierungs-

medium Lösungsbasis

L-Ascorbinsäure-2-phosphat 100 mM 200 µM Ad-MSC Kulturmedium

HEPES 2,5 M 25 mM Ad-MSC Kulturmedium

ß-Glycerolphosphat 1 M 10 mM Ad-MSC Kulturmedium

CaCl2 1,5 M 1,5 mM Ad-MSC Kulturmedium

Dexamethason 100 µM 100 nM D-PBS

Cholecalciferol 10 mM 5 µM DMSO

Tabelle 4: Mediensupplemente Konzentrationen der Stocklösungen und Differenzierungsmedien sowie Lösungsbasen für das jeweilige Mediensupplement.

Der Mediumwechsel von Ad-MSC Kulturmedium erfolgt in einem 5 tägigen und der von

Differenzierungsmedium in einem 4 tägigen Intervall.


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4.6.4 Medienübersicht

Ad-MSC Kulturmedium: DMEM High Glucose (4,5 g/L) mit 2 mM stabilem Glutamin

+ 100 U/L Penicillin/Streptomycin + 10 % FCS Funktion: Kultur der Ad-MSCs

Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS: DMEM High Glucose (4,5 g/L) mit 2 mM stabilem Glutamin

+ 100 U/L Penicillin/Streptomycin + 2,5 % FCS Funktion: Basis zur Herstellung der verschiedenen Medien zur osteogenen Differenzierung und als Kontrolle

Basisdifferenzierungsmedium: Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS + 200 µM L-Ascorbinsäure-2-phosphat + 25 mM HEPES + 10 mM β-Glycerolphosphat + 1,5 mM CaCl2

Funktion: Induziert die osteogene Differenzierung und wird zur

Optimierung mit weiteren Supplementen (Dexamethason, Vitamin D3, BMP 2 und BMP 7) kombiniert

Optimiertes osteogenes Basisdifferenzierungsmedium Differenzierungsmedium: + 5 µM Vitamin D3

Funktion: Medium, das die besten Ergebnisse bei der osteogenen Differenzierung von Ad-MSCs erzielt


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4.6.5 BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay

Zur Analyse des TGF-β Signallings werden die Zellen mit Adenovirus Typ 5 infiziert. Das BMP

Response Element (BRE) dient als Promotor, an den phosphoryliertes Smad1/4 als

Transkriptionsfaktor bindet (Hata, Seoane et al. 2000, S. 230). Mit Ad5-BRE-Luc infizierte Ad-

MSCs bilden Luciferase, wenn Smad1/4 phosphoryliert, also der Smad1/5/8-Signalweg vom

BMP-Liganden aktiviert wird (siehe Abbildung 15).

Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay Nach Rezeptoraktivierung wird der Smad 1/5/8-Komplex phosphoryliert und induziert zusammen mit Smad 4 die Luciferase Expression. Das anschließend zugesetzte Luciferase Substrat wird von der gebildeten Luciferase gespalten wobei ein Lichtsignal entsteht (in Anlehnung an: Massague 2000, S. 170).


Ad5-BRE-Luc Virus bereitgestellt von Prof. S. Dooley Rekombinantes Humanes BMP 2 PeproTech, Hamburg (120-02) Rekombinantes Humanes BMP 7 PeproTech, Hamburg (120-03) Cell Culture Lysis reagent 5 x und Promega, USA (E153A) Luciferase Substrate

TGF-βRII

BMP

Alk 1

Smad 1Smad 5

Smad 8Smad Phosphorylierung

Smad 4

BRE Reporter Sequenz

Luciferase Expression

Rezeptoraktivierung durch Ligandenbindung

Lichtsignal

Luciferase Substrat

https://www.peprotech.com/de-DE/Seiten/Product.aspx?productid=120-02


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50.000 Ad-MSCs werden in jedem Well von zwei 12 Well Platten ausplattiert und für 24 h

inkubiert. Auf 7,5 ml Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS gibt man 600 µl Virussuspension und

beimpft jedes Well mit 300 µl dieses Ansatzes. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt

und entsprechend der S2-Richlinien autoklaviert entsorgt. Nach Entfernung des

Virusüberstandes gelten S1-Richtlinien. Je zwei Wells werden mit 500 µl verschiedener

Konzentrationen von BMP 2 und/oder BMP 7 (siehe Tabelle 5) stimuliert. Als Grundmedium

für die verschiedenen BMP-Konzentrationen und für die Kontrollgruppe wird das

Basisdifferenzierungsmedium verwendet.

Nach 48 stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 werden die Zellen lysiert. Der

Zelllysepuffer muss vor Gebrauch im Verhältnis 1:4 mit ddH2O verdünnt werden. Das

Medium wird abgesaugt und je 30 µl Lyselösung werden in ein Well gegeben, durch

Schwenken auf dem Wellboden gut verteilt und anschließend friert man die Platten bei

-80 °C für mindestens 12 h ein.

Nun können die Zellen entweder mit einer Pipettenspitze oder einem zugeschnittenem

Zellschaber vom Wellboden abgekratzt werden und in je ein Eppendorf-Reaktionsgefäß

pipettiert werden. Anschließend werden die Proben bei 4 °C und 14.000 g für 10 min

zentrifugiert.

Für die Luciferasemessung werden 10 µl vom Überstand in eine 96 Well Platte gegeben, für

die Lowry Proteinmessung (siehe Kapitel 4.6.6) benötigt man 2 µl pro Well.

BMP 2 BMP 7 BMP 2 + 7

5, 10, 50, 100 ng/ml 5, 10, 50, 100 ng/ml 5, 10 ng/ml

Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen Eingesetzte BMP-Konzentrationen bei der Überprüfung der Aktivierung des TGF-β Signallings mittels BRE Reporterassay.

Vor Zugabe des Luciferasesubstrates sollten die Einstellungen am Elisa reader vorgenommen

werden: Lumineszenz Messung des durch die Luciferase gebildeten Lichtes mit einem

maximalen gain (4000); da die Enzymaktivität ihren Peak zeitabhängig erreicht, wird die

Messung mindestens sechs Mal wiederholt, um einen aussagekräftigen Mittelwert zu

erhalten. Die Messwerte werden in Relative Light Units angegeben (RLU).

Zur Berechnung der RLU pro µg Protein benötigt man die Proteinmenge der gemessenen

Proben (siehe Kapitel 4.6.6). Die gemessene RLU jedes einzelnen Wells wird durch die


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dazugehörige Proteinmenge geteilt, abschließend wird noch der Mittelwert aus allen einzeln

gemessenen RLU/µg Protein für jede BMP-Konzentration und -Konstellation ermittelt.

4.6.6 Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung

Die Proteinmenge wird mittels der von Lowry veröffentlichten Folin Phenol Methode

bestimmt (Lowry, Rosebrough et al. 1951, S. 265-268).


Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, München (A4503) Na-K-Tartrat Sigma (228729) CuSO4*6H2O Sigma (31293) Na2CO3 Sigma (S2127) 1 M NaOH Merck, Darmstadt (109137) Folin Reagenz Sigma (47641)



1. 10 µg/µl BSA Stocklösung:

Endkonzentration:

50 mg BSA 10 μg/μl 5 ml ddH2O

Zur Berechnung der Standardkurve benötigt man verschiedene BSA-Konzentrationen, die

wie in Tabelle 6 dargestellt, zubereitet werden:

BSA Stocklösung 8 μg/μl 6 μg/μl 4 μg/μl 2 μg/μl 1 μg/μl 0 μg/μl

10 μg/μl BSA Stock 800 μl 600 μl 400 μl 200 μl 100 μl 0 μl

ddH2O 200 μl 400 μl 600 μl 800 μl 900 μl 1000 μl

Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve Übersicht über die verschiedenen Konzentrationen von BSA Stock und ddH2O zur Erstellung einer Standardkurve.

Aliquots der BSA Stocklösung können bei -20 °C gelagert werden.

2. Na-K-Tartrate Stocklösung:

Endkonzentration:

2 g Na-K-Tartrate 2 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern


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3. CuSO4 Stocklösung:

Endkonzentration:

1 g CuSO4 * 6 H2O 1 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern

4. Na2CO3 Stocklösung:

Endkonzentration:

20 g Na2CO3 2 % 900 ml ddH2O 100 ml 1 M NaOH 100 mM

5. Lösung A:

Endkonzentration:

20 µl Na-K-Tartrate Stocklösung 1 % 20 µl CuSO4 1 % 1,96 ml Na2CO3 98 % immer frisch vor Gebrauch herstellen!

6. Lösung B:

Endkonzentration:

100 µl Folin Reagenz 1 mg/dl 2,9 ml ddH2O immer frisch vor Gebrauch herstellen!

Es werden je 2 µl der Probe in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Zur gleichzeitigen

Erstellung der Standardkurve werden als Triplikate je 2 µl jeder BSA Konzentration

(Tabelle 6) in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Dann gibt man 150 µl Lösung A in jedes

Well (Probe und Standardkurve) und lässt alles für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.

Anschließend werden 30 µl von Lösung B zugegeben, gut gemischt, um eine

Präzipitatbildung zu vermeiden, und es folgt ein weiterer Inkubationsschritt von 1 – 2 h bei

Raumtemperatur. Anschließend ist zu beobachten, wie sich die gelbe Lösung allmählich blau

verfärbt. Je intensiver die Blaufärbung umso mehr Protein ist in der Probe. Die Absorption

wird mit dem Elisa Reader bei = 750 nm gemessen.


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Zur Berechnung der Proteinmenge muss zuerst die Geradengleichung anhand der

Standardkurve (siehe Abbildung 16) ermittelt werden. Nun wird die Geradengleichung nach

x aufgelöst, die gemessenen Werte für y eingesetzt. Als Ergebnis erhält man die

Proteinmenge der Probe in µg/µl.

Zum Beispiel:

Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung Das Diagramm zeigt ein Beispiel für eine Standardkurve der BSA-Lösung, dabei ist auf der Abszisse die BSA-Konzentration in µg/µl und auf der Ordinate die Absorption bei λ = 750 nm dargestellt.

Standardkurve BSA

0 2 4 6 80.0

0.2

0.4

0.6

y = 0,05905x + 0,04360

R2 = 0,9893

BSA [µg/µl]

OD

[

= 7

50

nm

]


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4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mRNA-

Ebene

4.7.1 Isolation von mRNA aus Zellen


peqGOLD TriFast Peqlab, Erlangen (30-2020) Chloroform Roth, Karlsruhe (6340.1) Isopropanol Apotheke, MRI 70 % und 99,8 % Ethanol Apotheke, MRI Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma, München (D5758) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Borsäure Sigma (B7901) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) SIGMA (E51343 Glycerol Sigma (G5516) Isopropanol Apotheke, MRI Bromphenol Blue Sigma (114391) ddH2O Apotheke, MRI


Folgende Lösungen müssen vor Beginn der Isolation hergestellt werden:

1. DEPC H2O

Endkonzentration

1 ml DEPC 0,1 % 1 l ddH2O für 1 h bei 37 °C inkubieren, anschließend autoklavieren und abkühlen lassen.

2. 10 X Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE)

Endkonzentration

540 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 0,89 M 275 g Borsäure (MW: 61,83 g/mol) 0,89 M 37,3 g EDTA (MW: 372,24 g/mol) 20 mM 5 L H2O auf pH 8,3 einstellen


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3. PCR Ladepuffer (5 X)

Endkonzentration

1 mg Zyanoblau 25 ml 10 X TBE 5 X 5 ml Glycerol 10 % 20 ml H2O

Während der gesamten Isolation ist unter dem Abzug zu arbeiten, da einige der

verwendeten Substanzen gesundheitsschädlich sind. Die Zellen wurden bis zu einer nahezu

100 %igen Konfluenz kultiviert. Zu Beginn wird das Medium vorsichtig von den Zellen

gesaugt, TriFast zugegeben und gleichmäßig über den Boden verteilt:

500 µl TriFast / 25 cm² Zellkulturflasche 1000 µl TriFast / 75 cm² Zellkulturflasche 1500 µl TriFast / 175 cm² Zellkulturflasche

Die Zellen werden gründlich mit einem Zellschaber vom Plastikboden abgeschabt und die

Suspension in ein steriles Eppendorf-Gefäß überführt. Soll die Isolation zu einem anderen

Zeitpunkt fortsetzen werden, können die Zellen bei -80 °C eingefroren werden, andernfalls

wird die Zelllösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen nachfolgenden

Bearbeitungsschritten werden die Proben stets auf Eis gelagert. Nach Zugabe von 100 µl

Chloroform je 500 µl TriFast wird alles für 15 s vermischt und eine weitere Inkubationspause

von 5-10 min eingelegt. Während der anschließenden Zentrifugation bei 14.000 x g, 4 °C für

10 min wird in einem weiteren Eppendorf-Reaktionsgefäß 250 µl Isopropanol je 500 µl

TriFast vorbereitet. Nach der Zentrifugation den RNA-haltigen Überstand (obere, klare

Schicht) (Abbildung 17 a) vorsichtig in das bereitgestellte Eppendorf-Gefäß pipettieren.

Beides wird vermischt, für 10 min auf Eis inkubiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die

RNA setzt sich unten als gelartiges meist nicht sichtbares Pellet ab (Abbildung 17 b).


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Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt (b) gelartiges Pellet enthält RNA Das linke Reaktionsgefäß ist eine schematische Darstellung der Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt, wobei der wässrige Überstand die RNA enthält. Rechts ist ein Gelpellet am Gefäßboden zu erkennen, das sich nach Zentrifugation des RNA-Überstands mit Isopropanol vermischt, absetzt.

Die flüssige Phase über der RNA wird abgeschüttet, 1 ml Ethanol 70 % zugegeben, im

Anschluss wieder wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Diesen

Waschschritt ein weiteres Mal wiederholen, danach das Pellet in 30 µl DEPC H2O

resuspendieren und den verbleibenden Alkohol bei offenem Deckel verdampfen lassen

(10-15 min). Die RNA wird bei -20 °C gelagert bis sie genutzt wird.

4.7.2 Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA

Diese beiden Kriterien werden mit dem NanoDrop Spectrophotometer bestimmt. Zu Beginn

muss das Gerät geeicht werden, dazu ermittelt man den Blindwert von DEPC-H2O.

Anschließend je 1 µl der zu messenden Probe auftragen und gleichzeitig die optische Dichte

bei 230, 260 und 280 nm messen. Anschließend berechnet das Programm folgende

Quotienten:

260/280: diesen Quotienten nennt man auch primären Reinheitsparameter. Der

Richtwert für reine DNA liegt bei 1,8 und für reine RNA bei 2,0. Liegen diese

Werte niedriger, spricht dies für eine Verunreinigung durch Proteine, Phenol oder

andere Stoffe, die bei 280 nm absorbieren.

RNA

Proteine RNA

a b

DNA


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260/230: dieser Quotient repräsentiert den sekundären Reinheitsparameter. Der

Sollwert liegt zwischen 1,8 bis 2,2. Niedrigere Werte können z.B. durch eine

Verunreinigung mit Kohlenhydraten und / oder Phenol verursacht sein.

Zusätzlich berechnet das Programm über eine modifizierte Beer-Lambert Gleichung die RNA-

Menge in ng/µl. Für weitere Informationen zum Gerät siehe Benutzerhandbuch.

4.7.3 Überprüfung der Integrität der RNA

Mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) wird die Intaktheit der mRNA überprüft.

Zunächst wird anhand der in Kapitel 4.7.2 bestimmten RNA-Menge berechnet, welches

Volumen der RNA-Probe 0,5 µg RNA enthält. Das ermittelte Volumen der Probe wird mit

DEPC-H2O bis auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 3 µl PCR-

Ladepuffer werden 10 µl von jeder Probe und 2 µl des pUC19-Markers auf ein 1,5 %iges

Agarosegel geladen und für 40 min bei 60 V an den Power Supply angeschlossen. In der

anschließenden Fotodokumentation zeigt die intakte mRNA zwei klare Banden (28S und 18S

ribosomale RNA), ist sie jedoch degradiert sind nur weiße Schlieren zu erkennen. Ein Beispiel

für intakte RNA zeigt Abbildung 18.

Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) Rechts ist der pUC19-Marker zu erkennen. Die aufgetragenen RNA-Proben weisen je 2 Banden, 28S und 18S ribosomale RNA auf, was für die Intaktheit der RNA spricht.

28S

18S

Proben Marker


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4.7.4 Synthese von komplementärer DNA (cDNA)

Zur Charakterisierung der Zellen mittels PCR muss nun die zuvor gewonnene mRNA in cDNA

umgeschrieben werden.


Transcriptor High Fidelity cDNA synthesis Kit Roche, Basel (5081955) DEPC-H2O (Herstellung siehe Kapitel 4.7.1)


Siehe bitte mitgelieferte Gebrauchsanweisung. Ziel ist es 1 µg RNA in einem Arbeitsgang

umzuschreiben. Die so hergestellte cDNA wird mit DEPC-H2O auf eine Endkonzentration von

5 ng/µl verdünnt und bei -20 °C gelagert.

Eine anschließende PCR (siehe Kapitel 4.7.5) mit dem Primer für Glycerinaldehyd-3-

phosphat-dehydrogenase (GAPDH), dem house keeping gene, das in jeder Zelle vorhanden

ist, gibt Aufschluss über die Intaktheit und relative Quantität der cDNA.

4.7.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase Kettenreaktion ermöglicht die selektive in vitro Amplifikation bestimmter

DNA-Abschnitte durch Nachahmung der in vivo DNA-Replikation.


Primer forward und reverse MWG Operon 10 X Reaktionspuffer BD Axon,Kaiserslautern (22466) (Mg2+-frei, Detergenz-frei) Magnesiumchlorid 25 mM Axon,Kaiserslautern (22466) Taq Polymerase 1000 U Axon,Kaiserslautern (22466) dNTP-Mix 10mM je Nukleotid Axon,Kaiserslautern (24478)


Die Primer wurden mit dem auf www.pubmed.com verfügbaren Primer Blasts erstellt und

von MWG Operon hergestellt (weitere Informationen zu den verwendeten Primern siehe

Kapitel 10).

Die in Pulverform gelieferten Primer müssen vor dem Gebrauch in DEPC-H2O gelöst werden.

Das vom Hersteller empfohlene Mischungsverhältnis findet man auf einer mitgelieferten

Liste (in unserem Fall 50 pmol/µl). Die Stocklösung sollte bei -80 °C gelagert werden und

http://www.pubmed.com/


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wird für die PCR im Verhältnis 1:10 mit DEPC-H2O verdünnt. Die Verdünnung kann wie alle

anderen PCR Reagenzien bei -20 °C aufbewahrt werden.

Die nachfolgende Tabelle beinhaltet die benötigten Reagenzien und Volumina pro

Reaktionsgefäß zur Durchführung der PCR.

Reagenz Menge/Reaktionsgefäß

Template 5 µl (bei schwachem Signal kann die Menge erhöht werden, DEPC-H2O Volumen anpassen)

DEPC- H2O 8,4 µl (bei Erhöhung des Templatevolumens anpassen: Template + DEPC-H2O müssen 13,4 µl ergeben)

10 X Reaktionspuffer BD 2 µl

Magnesiumchlorid 2 µl

Primer forward 1 µl

Primer reverse 1 µl

dNTP-Mix 0,5 µl

Taq Polymerase 0,1 µl

Gesamtvolumen 20 µl

Tabelle 7: PCR-Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß Liste der PCR-Reagenzien mit den entsprechenden Mengenangaben pro Reaktionsgefäß.

Nun werden alle PCR-Zusätze in der aufgelisteten Reihenfolge in spezielle RNase-freie

Reaktionsgefäße pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass sowohl die verwendeten

Substanzen als auch der hergestellte Ansatz stets auf Eis zu lagern sind. Als Probentemplate

wird cDNA von Ad-MSCs, als positive Kontrolle primäre humane osteoblastäre cDNA und als

negative Kontrolle DEPC H2O verwendet. Die Zeit- und Temperatureinstellungen am

Mastercycler (siehe Tabelle 8) sowie eine Zykluszahl von 35 wurden nach einigen

Probedurchläufen für alle getesteten Primer einheitlich beibehalten.

Phase Temperatur Dauer

1. Erste Denaturierung 95 o C 4 min

2. Denaturierung 95 o C 30 s

3. Primerhybridisierung variabel 30 s

4. Elongation 72 o C 30 s

5. Letzte Elongation 72 o C 10 min

Tabelle 8: Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler Einzelne PCR-Phasen mit den benötigten Temperatur- und Zeiteinstellungen am Mastercycler.

35 X


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Im Denaturierungsschritt werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen der

DNA aufgebrochen. Die erste Denaturierung, auch Initialisierung genannt, dauert jedoch

länger als alle darauf folgenden, um zu gewährleisten, dass nur noch DNA-Einzelstränge

vorliegen und die Primer vollständig voneinander getrennt sind.

Als nächstes folgt die Primerhybridisierung, bei der sich die Primer („Startpunkte der

Replikation“) an die DNA anlagern. Die dabei benötigte Temperatur ist für die einzelnen

Primer unterschiedlich. Sie hängt maßgeblich von der Primerlänge sowie von der Anzahl der

durch drei Wasserstoffbrücken verbundenen Guanin-Cytosin Basenpaare ab, je mehr G-C

Paare umso höher ist die Hybridisierungstemperatur.

In der letzten Phase, der Elongation, amplifiziert die thermostabile DNA-Polymerase die

Einzelstränge zu Doppelsträngen. Die Temperatur hängt von der verwendeten Polymerase

ab. Man geht davon aus, dass die DNA-Polymerase etwa 1000 bp/min anlagern kann,

dementsprechend ist die Dauer des Elongationsschritts anzupassen. Die Dauer des letzten

Elongationsschritts sollte wieder länger gewählt werden, um noch nicht vollständige

Amplifikationen abzuschließen.

Durch das exponentielle Wachstum der DNA-Stränge sind nur etwa 35 Wiederholungen der

Schritte 2-4 nötig, um ausreichend Kopien für weitere Versuche zu erhalten.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und

Amplicongröße für jeden Primer aufgelistet:


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Gen Akzessions-nummer

Sequenz 5' -> 3' Hybridisierungs-temperatur [°C]

Amplicon-größe [bp] Forward Primer Reverse Primer

BMP / TGF-β Signalweg

Alk 1 / TGF-β-RI (Smad1/5/8) NM_001077401.1 GCT CAG ACA CGA CAA CAT CC ATT GCG GCT CTT GAA GTC G 60 256

Alk 2 / activin A type II receptor precursor

NM_001616.3 CTT GCA TTG CTG ACT TTG G CCA ATT TCC TCC TCA AAT GG 60 253

Alk 3 / BMPR-IA NM_004329.2 CAC TGC CCC CTG TTG TCA TAG ATC CTG TTC CAA ATC ACG ATT GT 57 179

Alk 5 / TGF-β-RI (Smad2/3) NM_004612.1 TGT TGG TAC CCA AGG AAA GC AAC ATC GTC GAG CAA TTT CC 60 287

Alk 6 / BMPR-IB NM_ 001203 CTT TTG CGA AGT GCA GGA AAA T TGT TGA CTG AGT CTT CTG GAC AA 52 130

TGF-β-RII NM_003242.5 ATG CTG CTT CTC CAA AGT GC AGG TTG AAC TCA CGT TCT GC 54 258

Bone morphogenetic protein receptor, type II (BMPRII)

NM_001204.6 CCA CCT CCT GAC ACA ACA CC GAC CTT GTT TAC GGT CTC CTG 56 154

Insulin-like growth factor-Rezeptoren

Insulin-like growth factor 1 receptor precursor (IGF-I R)

NM_00875.3 TCG ACA TCC GCA ACG ACT ATC AGG GCG TAG TTG TAG AAG AGT TT 57 241

Insulin-like growth factor 2 receptor (IGF-II R)

NM_000876.2 GTG GAA GTG TGG ATA TTG TCC AG

ACA GCT CAC TGT TGT GTT GAA 57 146

Vitamin D Rezeptoren

Retinoid X Rezeptor NM_021976.3 TGG GCT CTC CCT TTC CAG T GAT TGC ACA TAG CCG TTT GCC 57 236

Vitamin D Rezeptor NM_000376 GAC ATC GGC ATG ATG AAG GAG GCG TCC AGC AGT ATG GCA A 54 158

House keeping Gene

Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

NM_002046.3 GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG 54 419

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=116734713



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Gen Akzessions-nummer

Sequenz 5' -> 3' Hybridisierungs-temperatur [°C]

Amplicon- größe [bp] Forward Primer Reverse Primer

Osteoblastäre Marker

Alkalische Phosphatase (AP) NM_000478.4 ACG TGG CTA AGA ATG TCA TC CTG GTA GGC GAT GTC CTT A 53 475

Bone morphogenetic protein 2 precursor (BMP 2)

NM_001200 CCC CCT ACA TGC TAG ACC TGT CAC TCG TTT CTG GTA GTT CTT CC 60 150

Bone morphogenetic protein 4 preprotein (BMP 4)

NM_130851 TGG TCT TGA GTA TCC TGA GCG GCT GAG GTT AAA GAG GAA ACG A 60 130

Bone Sialoprotein 2 (BSP 2) NM_004967 TGA CTC ATC CGA AGA AAA TGG AG CTG GAT TGC AGC TAA CCC TGT 60 202

Matrix gla protein (MGP) NM_000900 AGA TGG AGA GCT AAA GTC CAA GA GTA GCG TTC GCA AAG TCT GTA 60 102

Osteocalcin (OC) NM_000711 CAC TCC TCG CCC TAT TGG C GCC TGG GTC TCT TCA CTA CCT 62 138

Osteopontin / BSP1 NM_000582 CTC CAT TGA CTC GAA CGA CTC CGT CTG TAG CAT CAG GGT ACT G 60 257

Osteoprotegerin (OPG) NM_002546.3 CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AGG TTA GCA TGT CCA ATG TG 60 313 Osteoblast Specific factor 2 (OSF 2)

NM_006475 TAA GTT TGT TCG TGG TAG CAC C GTG TGG GTC CTT CAG TTT TGA TA 60 140

RANKL NM_033012.3 TCC CAA GTT CTC ATA CCC TGA CAT CCA GGA AAT ACA TAA CAC TCC

56 245

Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer Tabellarische Auflistung von Akzessionsnummer, Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und Amplicongröße für das jeweilige Gen.

Nach Ablauf des PCR-Programms werden die Proben mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) ausgewertet.




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4.7.6 Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden mittels eines Agarosegels, das in einer ionischen

Pufferlösung liegt und an ein elektrisches Feld angeschlossen ist, die DNA- bzw. RNA-Stränge

ihrer Größe nach getrennt. Zusätzlich wird ein Marker aufgetragen, dessen DNA-Fragmente

validiert sind und somit als Referenz eine Größeneinschätzung der untersuchten Proben

erlaubt.


peqGOLD Universal Agarose Peqlab, Erlangen (35-1020) Borsäure Sigma, München (B7901) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma (E51343) Ethidiumbromid Lösung 500 µg/ml Sigma (E1385) pUC19-Marker ready-to-use Roth, Karlsruhe (T149.1)


Herstellung des 1 X TBE: 1:10 Verdünnung des 10 X TBE (siehe Kapitel 4.7.1) mit dH2O.

Hauptbestandteil des Gels ist das Polysaccharid Agarose, dessen Moleküle ein engmaschiges

Netz bilden, das die Wanderung der geladenen Teilchen erschwert. Die Porengröße dieses

Netzes lässt sich durch Konzentrationsänderungen der Agarose variieren. Üblich sind

Agarosekonzentrationen zwischen 1,5 bis 2 %, wobei für kleine geladene Teilchen ein hoher

Agaroseanteil im Gel gewählt werden sollte und umgekehrt. Für die nachfolgenden Versuche

wurde ausschließlich 1,9%iges Agarosegel verwendet (nur am speziell eingerichtetem

Ethidiumbromidplatz arbeiten, Nitrilhandschuhe verwenden und Verbrauchsmaterialien

sowie Gel im Sondermüll entsorgen):

Endkonzentration

1,9 g Agarose 1,9 % 100 ml 1 X TBE

aufkochen lassen, bis die Agarose vollständig gelöst und eine klare Flüssigkeit entstanden ist.

Nach der Zugabe von 7 µl Ethidiumbromid das Gel auf den vorbereiteten Gelschlitten gießen

und abkühlen lassen (ca. 30 min). Nun den Kamm, der kleine Taschen im Gel ausspart,

vorsichtig herausziehen und den Schlitten in die mit 1 X TBE gefüllte Kammer einsetzen. Die

Kammer muss mindestens bis 0,5 cm über dem Niveau der Geloberfläche mit Puffer

aufgefüllt werden.


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Zum Befüllen der einzelnen Taschen wird die Probe (20 µl) mit 5 µl Ladepuffer (pUC19-

Marker ready-to-use) vermischt und 8 µl dieser Mischung in die Tasche pipettiert. Sind alle

Proben in die Taschen eingebracht, die Kathode probennah und die Anode probenfern

anschließen und die Einstellungen am Power Supply vornehmen. Als Standardeinstellung

wurde in dieser Arbeit eine Spannung von 90 V für 30 min gewählt.

Zur Auswertung und Fotodokumentation wird der Intas Gel Jet Imager verwendet.

Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) Links ist eine inverse Darstellung eines Gelelektrophoresebildes mit deutlich sichtbaren Primerdimeren zu sehen, rechts ist eine Referenzabbildung des pUC19-Markers vergrößert abgebildet.

4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarBlue® Assay

alamarBlue® ist ein wasserlöslicher, gering toxischer Indikator zur quantitativen Bestimmung

von Zellproliferationsraten und hilft bei der Viabilitätsbeurteilung nach toxischen Einflüssen

auf die Zellen. Wachsen die Zellen so geben sie Wasserstoffionen an ihre Umgebung ab und

reduzieren diese dadurch. Findet jedoch kein Wachstum statt so bleibt das

Umgebungsmilieu oxygeniert. Der alamarBlue®-Mechanismus beruht auf einer Redox-

Reaktion, bei aktivem Zellmetabolismus (viele H+-Ionen vorhanden) wechselt der

wasserlösliche Indikatorfarbstoff Resazurin vom oxygenierten Zustand (blau, nicht

fluoreszierend) in die reduzierte Form Resorufin (rot, fluoreszierend) (vgl.

Herstellerangaben).

bp

501489404331

24219014711111067

34 (2x)

Primerdimer


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alamarBlue® Reagenz Biozol, Eching (BZL727) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002)


Dem Medium wird 1/10 seines Volumens an alamarBlue® Reagenz zugegeben und die Zellen

bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Bei hohem Zellmetabolismus kann der Farbumschlag bereits

nach 30 min sichtbar sein. Abschließend wird die Resorufinfluoreszenz bei = 544 nm und

= 590 nm gemessen. Die Viabilität wird immer als prozentuale Angabe im Vergleich zur

Kontrollgruppe aufgeführt.

4.9 Funktionelle Charakterisierung

4.9.1 Nachweis osteogener Eigenschaften

Zum Vergleich der verschiedenen osteogenen Differenzierungsmedien und zum Nachweis

der abgelaufenen Matrixmineralisierung werden folgende Methoden herangezogen:

4.9.1.1 Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP)

Die Alkalische Phosphatase ist ein in Leber, Knochen und Plazenta produziertes Enzym und

kann vor allem im wachsenden Knochen und Gallenflüssigkeit in hohen Konzentrationen

nachgewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus beruht auf einer Phosphatabspaltung

durch die Alkalische Phosphatase. Das farblose Substrat 4 Nitrophenolphosphat (pNPP) wird

in das gelb gefärbte 4 Nitrophenol (pNP) umgesetzt.


4 Nitrophenolphosphatdinatriumsalz Sigma, München (71768) Hexahydrat (pNPP) -20 °C

4 Nitrophenollösung (pNP) 10 mM Sigma (N7660) Glyzin Sigma (G8898) Trizma-base Sigma (T1503) Magnesiumchlorid Hexahydrat (MgCl2 * 6 H2O) Sigma (M2670)


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Herstellung des AP-Aktivitätspuffers (pH = 10,5):

Endkonzentration

3,75 g Glyzin (MW: 75,07 g/mol) 50 mM 12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 203 g Magnesiumchlorid (MW: 203,31 g/mol) 1 M 1 L H2O pH auf 10,5 mit NaOH einstellen

Nun berechnet man das benötigte Volumen:


Nach Ermittlung des benötigten Gesamtvolumens kann die gleiche Menge AP-

Substratlösung zubereitet werden:

Endkonzentration

2 mg 4 Nitrophenolphosphat (MW: 371,12 g/mol) 2 mg/ml 1 ml AP-Aktivitätspuffer (pH = 10,5)

Zuvor muss zur Bestimmung des Substratumsatzes der AP folgende Standardkurve (siehe

Abbildung 20) pipettiert und photometrisch die Extinktion bei λ = 405 nm ermittelt werden.

Abbildung 20: Schema zum Pipettieren der AP-Aktivität Standardkurve

Pipettierstandards, die zur photometrischen Bestimmung des Substratumsatzes der AP-Aktivität benötigt werden.

500 µl von 1

500 µl von 2

500 µl von 3

500 µl von 4

500 µl von 5

500 µl von 6

500 µl von 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1000 µM 500 µM 250 µM 125 µM 62,5 µM 31,25 µM 15,62 µM 7,81 µM 0

jeweils 500 µl AP-Aktivitäts-Puffer vorlegen

900 µl AP-Aktivitäts-Puffer +100 µl 4 Nitrophenollösung 10 mM

1000 µl AP-Aktivitäts-Puffer


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Somit kann jedem Extinktionswert eine bestimmte Substratkonzentration zugeordnet

werden. Die Werte können dann mittels der Software Microsoft Excel in einem

Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen werden, wobei die Substratkonzentration auf

der Abszissenachse und die Extinktion auf der Ordinate dargestellt wird. Durch die

Messpunkte wird eine Gerade gelegt und deren Funktion in der Form

bestimmt (siehe Abbildung 21).

Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität Standardkurve der AP-Aktivität, wobei auf der x-Achse die Konzentration des 4 Nitrophenol (pNP) aufgetragen wird und auf der y-Achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte.

Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst werden:

Zur Ermittlung der Substratkonzentration der Proben in µM muss der gemessene

Extinktionswert für y eingesetzt werden.

Das Kulturmedium vorsichtig von den Zellen absaugen, die AP-Substratlösung hinzugeben

und alles bei 37 °C inkubieren. Gleichzeitig wird AP-Substratlösung ohne Zellen zur

Standardkurve AP-Aktivität

0 100 200 300 400 5000

1

2

3

y = 0,005407x + 0,06280

R2 = 0,9978

pNP [µM]

OD

[

= 4

05

nm

]


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Ermittlung des Blindwertes und als negative Kontrolle inkubiert. Zur Messung werden immer

100 µl pro Well in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Inkubationszeit variiert je nach

vorhandener Enzymmenge (30 min bis Stunden), sobald jedoch eine Gelbfärbung erkennbar

ist, kann mit einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von = 405 nm (siehe

Abbildung 22) die gebildete 4 Nitrophenolmenge genau bestimmt werden. Durch

Verrechnung mit den Blindwerten (AP-Substratlösung ohne Zellen) und Einsetzen der

Extinktionswerte für y in die oben angeführte Gleichung ergibt sich die

Substratkonzentration in µM.

Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der AP-Substrat-Lösung bei 405 nm

Zum Normalisieren der AP-Aktivität auf die Zellmenge folgt im Anschluss eine Sulforhodamin

B Färbung (siehe Kapitel 4.5.1).

Wellenlänge [nm]

Ab

sorp

tio

n


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4.9.1.2 Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung

Durch diese Methode kann das Zytoplasma von AP-positiven Zellen blau angefärbt werden.


Echtblausalz Chroma, Münster (1A-140) Naphthol AS-MX-phosphatdinatriumsalz Sigma, München (N5000) 99,9 % Dimethylformamid Merck, Darmstadt (102375) Trizma-base Sigma (T1503) Magnesiumchlorid Hexahydrat (MgCl2 * 6 H2O) Sigma (M2670) Formaldehyd Merck (818708)


Herstellung der Lösungen:

1. 0,1 M Tris Puffer (pH = 8,5)

Endkonzentration

12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 1 L dH2o pH auf 8,5 mit HCl einstellen

2. AP-Färbepuffer

Endkonzentration

5 ml 99,9 % Dimethylformamid 0,5 % 407 mg MgCl2 * H2O (MW: 203,31 g/mol) 2 mM 1 L 0,1 M Tris Puffer

3. Formaldehyd (3,7%)

Endkonzentration

20 ml Formaldehyd (37%) 3,7 % 180 ml dH2O

4. AP-Färbelösung

Endkonzentration

0,6 mg Echtblausalz 0,06 % 0,1 mg Naphthol AS-MX-phosphat disodium Salz 0,01 % 1 ml AP-Färbepuffer filtrieren wegen Flockenbildung


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Zur Fixierung der Zellen saugt man das Kulturmedium vorsichtig ab und bedeckt den

Wellboden für 10 min mit 3,7 % Formaldehyd (unter dem Abzug arbeiten). Das benötigte

Gesamtvolumens der AP-Färbelösung beträgt:


Das Formaldehyd abnehmen (Sondermüll!), die AP-Färbelösung zugeben und für 30 min bei

37 °C inkubieren lassen. Anschließend die Färbelösung absaugen und nun kann unter dem

Lichtmikroskop die Blaufärbung der Zellen beobachtet werden (siehe Abbildung 23).


Fixierung 3,7 % Formaldehyd 10 min / RT

Färbung AP-Färbelösung 30 min / 37 °C

Tabelle 10: Arbeitsschritte der AP-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der AP-Färbung.

Abbildung 23: osteogen differenzierte Fettstammzelle in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.


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4.9.1.3 Van Kossa Färbung

Mit dieser Färbung können die extrazelluläre Kollagen-Matrix und deren Mineralisierung

dargestellt werden, wobei sich das Mineral dunkelbraun bis schwarz färbt.


Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Silbernitrat Merck, Darmstadt (1512) Natriumcarbonat Sigma, München (S2127) Formaldehyd 35 – 37 % Merck (818708) Natriumthiosulfat Pentahydrat (Na2S2O3) Merck (6516)


Herstellung der Lösungen:

1. 3 % Silbernitratlösung:

Endkonzentration

15 g Silbernitrat (MW: 169,9 g/mol) 3 % 500 ml dH2O

2. Natriumcarbonat-Formaldehydlösung

Endkonzentration

50 g Natriumcarbonat (MW: 105,99 g/mol) 5 % 250 ml Formaldehyd 35 – 37 % ~ 10 % 750 ml dH2O

3. 10 % Natriumthiosulfatlösung

Endkonzentration

100 g Natriumthiosulfat Pentahydrat (MW: 248,21 g/mol) 10 % 1 L dH2O

Zu Beginn wird das Medium abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde

bei -20 °C fixiert. Nun wird das Ethanol abgeschüttet und die Zellen dreimal unter

Leitungswasser gewaschen (mit schwachem Wasserstrahl, der nur den Wellrand trifft). Je

nach Wellgröße gibt man im Färbeschritt für 30 min bei Raumtemperatur folgende Menge

der 3 %igen Silbernitratlösung hinzu:


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Es folgt ein weiterer Waschschritt mit Leitungswasser wie oben beschrieben und nun gibt

man für 2 min Natriumcarbonat-Formaldehydlösung zur Reduktion des Silbernitrats hinzu.

Im Anschluss an einen weiteren Waschschritt wird für 5 min mit einer 10 %

Natriumthiosulfatlösung überschüssiges Silbernitrat entfernt. Noch dreimal mit

Leitungswasser spülen bevor das Färbeergebnis fotodokumentiert werden kann (siehe

Abbildung 24).


Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / - 20 °C

Waschen Leitungswasser 3 x

Färbung 3 % Silbernitratlösung 30 min / RT


Reduktion Natriumcarbonat-Formaldehydlösung

2 min / RT


überschüssiges Silbernitrat entfernen

10 % Natriumthiosulfatlösung 5 min / RT


Tabelle 11: Arbeitsschritte der van Kossa Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der van Kossa Färbung.

Abbildung 24: osteogen differenzierte Fettstammzelle in van Kossa Färbung dargestellt (Vergrößerung: 10 X) Mineralbestandteile werden durch die van Kossa Färbung dunkelbraun bis schwarz angefärbt.


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4.9.1.4 Alizarin Rot Färbung

Diese Methode ermöglicht eine Färbung der angereicherten Calciumionen und deren

quantitative Bestimmung mittels einer Absorptionsmessung.


Alizarin Rot S Sigma, München (5533) Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat Sigma (9002) Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Durchführung der Methode:


1. 0,5 % Alizarin Rot Lösung (pH = 4,0)

Endkonzentration

500 mg Alizarin Rot S (MW: 342,3 g/mol) 10 mM 100 ml H2O auf pH 4,0 einstellen im Wasserbad 37 °C lösen, ist max. 2 Monate haltbar

2. Cetylpyridiumchloridlösung 10 %

Endkonzentration

10 g Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat 10 % (MW: 358,01 g/mol) 100 ml H2O

Zur Bestimmung der Standardkurve wird folgendes Pipettierschema angewandt und die

Extinktion der einzelnen Proben bei λ = 562 nm bestimmt:

Standard # Cetylpyridiumchlorid

10% [µl] Alizarin Rot Lösung

0,5% [µl] Konzentration

[µmol]

1 1000 0 0

2 999,32 0,68 1

3 996,6 3,4 5

4 993,16 6,84 10

5 982,9 17,1 25

6 965,8 34,2 50

7 931,6 68,4 100

8 863,2 136,8 200

9 794,8 205,2 300

10 726,4 273,6 400

Tabelle 12: Schema zum Pipettieren der Alizarin Rot Standardkurve Pipettierstandards zur photometrischen Bestimmung der Alizarin Rot Konzentration in der extrazellulären Matrix .


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Mittels der erstellten Standardkurve (siehe Abbildung 25) kann jedem ermittelten

Extinktionswert eine bestimmte Konzentration Alizarin Rot zugeordnet werden. Die

Extinktion des Standard # 1 stellt den Blindwert der Messung dar. Mittels der Software

Microsoft Excel werden Extinktion und Konzentration in einem Punktdiagramm

gegeneinander aufgetragen, wobei die Extinktion auf der Ordinate und die Alizarin Rot

Konzentration auf der Abszisse dargestellt werden. Es wird eine Gerade durch die einzelnen

Messpunkte gelegt und deren Funtkion in der Form y = mx + c ermittelt. Man erhält

folgendes Diagramm:

Abbildung 25: Beispiel einer Standardkurve für Alizarin Rot Mittels der Standardkurve kann jedem gemessenen Extinktionswert die zugehörige Alizarin Rot Konzentration zugeordnet werden.

Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst:

Um die Alizarin Rot Konzentration der Proben in µmol berechnen zu können muss der

gemessene Extinktionswert für y eingesetzt werden.

Standardkurve Alizarin Rot

0 100 200 300 4000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

y = 0.0009399x + 0.03843

R2 = 0,9934

Alizarin Rot [µmol]

OD

[

= 5

62

nm

]


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Das Medium wird abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde bei -20 °C

fixiert. Danach wird das Ethanol abgenommen und die Zellen vorsichtig dreimal mit

Leitungswasser gewaschen. Zur Färbung der Zellen gibt man für 10 min 0,5 % Alizarin Rot

Lösung dazu, wäscht danach zweimal mit Leitungswasser und lässt alles bei Raumtemperatur

5 bis 10 min trocknen. Zur Quantifizierung wird der Farbstoff mit 10 % Cetylpyridium-

chloridlösung (150 µl / 48-Well) vollständig gelöst und die Absorption bei = 562 nm (siehe

Abbildung 26) gemessen.

Abbildung 26: Spektraluntersuchung der Alizarin Rot Färbelösung

Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der Alizarin Rot Färbelösung bei = 562 nm.


Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / -20 °C


Färbung 0,5 % Alizarin Rot Lösung 10 min / RT


Trocknen 5 - 10 min / RT

Farbstoff lösen / Quantifizierung

10 % Cetylpyridium-chloridlösung

bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT

Tabelle 13: Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung.

Wellenlänge [nm]

Ab

sorp

tio

n


Seite | 67

4.9.2 Nachweis chondrogener Eigenschaft: Alcianblau Kernechtrot Färbung

Histologisch können saure Mukosubstanzen mit der Alcianblau Kernechtrot Färbung

nachgewiesen werden. Diese Mukosubstanzen (Glykosaminoglykane) lassen sich mit

Alcianblau-Lösung, die einen pH-Wert von 2,5 hat, anfärben. Kollagene Fasern sind hier

tiefblau, die Kerne leuchtend rot und das Zytoplasma blassrosa bis schwach bläulich (Welsch

2005, S. 7).


Essigsäure 99,9 % Roth, Karlsruhe (3738.4) Alcianblau Roth (74240) Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung Roth (N069.1) 3,7 % Formaldehyd Lösung Fischar, Saarbrücken (6398013)


Herstellung der Alcianblau Färbelösung:

Endkonzentration

1 g Alcianblau 1 % 3 ml Essigsäure 3 % 97 ml Wasser

Die Zellen werden mit 3,7 % Formaldehyd für 10 min fixiert (unter dem Abzug arbeiten) und

anschließend zweimal mit dH2O gewaschen. Zuerst färbt man mit Alcianblau für 30 min,

schüttet dieses ab und wäscht verbleibende Farbreste vorsichtig mit Leitungswasser ab. Im

zweiten Färbeschritt gibt man die Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung für 5 min auf die

Zellen und wäscht erneut zweimal mit Leitungswasser. Das Färbeergebnis kann nun

fotografisch dokumentiert werden (siehe Abbildung 27).



Waschen dH2O 2 x

Färbung 1 Alcianblau Lösung 30 min / RT


Färbung 2 Kernechtrot-Aluminiumsulfatlösung 5 min / RT


Tabelle 14: Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung.


Seite | 68

Abbildung 27: Alcianblau Kernechtrot (Vergrößerung: 10 X) Ad-MSCs nach chondrogener Differenzierung mit Alcianblau Kernechtrot Lösung gefärbt,

die Zellkerne stellen sich rot und die Knorpelfasern blau dar.

4.9.3 Nachweis adipogener Eigenschaft: Ölrot O Färbung

Ölrot O ist ein fettlöslicher Farbstoff und färbt neutrale Lipide in kultivierten Zellen und der

Spongiosa rot.


Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) 3,7 % Formaldehyd Lösung Fischar, Saarbrücken (6398013) Ölrot O Sigma, München (O0625) Isopropanol Apotheke, MRI



Ölrot O Stocklösung:

Endkonzentration:

0,7 g Ölrot O (MW: 408,51 g/mol) 0,35 % 200 ml Isopropanol

Ölrot O Arbeitslösung:

Endkonzentration:

6 ml Ölrot O Stocklösung 0,2 % 4 ml ddH2O


Seite | 69

Zuerst wird das Medium vorsichtig abgesaugt und die Zellen mit 3,7 % Formaldehyd (unter

dem Abzug arbeiten) für 5 min bei Raumtemperatur fixiert. Das Formaldehyd wird abgesaugt

(Sondermüll) und die Zellen wie folgt mit Ölrot O Arbeitslösung bedeckt:


Nach 15 minütiger Schüttelinkubation bei Raumtemperatur, werden die Zellen dreimal mit

Leitungswasser gewaschen. Nun sind unter dem Mikroskop die rot angefärbten Fettvakuolen

gut zu identifizieren (siehe Abbildung 28).



Färbung Ölrot O Arbeitslösung 15 min / RT / Shaker


Tabelle 15: Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung.

Abbildung 28: Ölrot O Färbung Ad-MSCs nach adipogener Differenzierung mit Ölrot O gefärbt. Die Fettvakuolen

sind rot angefärbt und deutlich zu erkennen (Vergrößerung: 20 X).


Seite | 70

4.10 Densitometrische Auswertung

Benötigte Software:

Image J; NIH, USA-Bethesda, public domain (http://rbs.info.nih.gov/ij/)

Auswertung:

Die Intensität der einzelnen Banden des Agarosegels ist das semiquantitative Maß der

Genexpression. Die densitometrische Auswertung der Intensität der Banden erfolgte mit der

Software Image J. Dabei rechnet das Programm die im .jpg-Format dargestellten

Bandensignale nach Subtraktion des Hintergrundes in eine Pixelzahl um. Die

Pixelintensitäten werden durch die jeweilige Expositionszeit geteilt, um sicher zu stellen,

dass die Signale im linearen Belichtungsbereich liegen. Werte im Detektionslimit und

Sättigungsbereich werden aus der Berechnung herausgenommen. Als interner Standard wird

GAPDH verwendet. Dazu wird jeweils das Verhältnis der Bandenintensität des jeweiligen

Gens und der GAPDH-Intensität gebildet. Die Ergebnisse werden mit dem Programm

Microsoft Excel gespeichert.

4.11 Statistische Auswertung

Die Versuche werden mit mindestens 3 Spendern (N ≥ 3) und in Triplikaten (n = 3) oder

Quadruplikaten (n = 4) durchgeführt. Die genaue Anzahl der Spender wird bei jedem Versuch

explizit aufgeführt. Die Ergebnisse aller durchgeführten Methoden werden im

Softwareprogramm Microsoft Excel aufgelistet. Die statistischen Analysen und die

Diagrammerstellung erfolgt mit dem Programm Graph Pad Prism. Die Daten werden

zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung untersucht. Der Vergleich der

Ergebnisse erfolgt als parameterfreie Varianzanalyse (ANOVA). Ergeben sich signifikante

Unterschiede der Gruppen wird basierend auf der Verteilung der Daten der Dunnett’s Test

oder Bonferroni-Test als Post hoc-Verfahren angewendet. Für alle Analysen wird ein

Signifikanzniveau von p < 0,05 gewählt.

http://rbs.info.nih.gov/ij/

Ergebnisse

Seite | 71

5 Ergebnisse

5.1 Zellzahltest

Um für die nachfolgenden Versuche die Parameter der Reproduzier- und Vergleichbarkeit zu

gewährleisten, muss die maximal verwendbare Zellzahl pro cm² ermittelt und anschließend

als Standard festgelegt werden.

Für diesen Versuch wurde eine 96 Well Platte verwendet. In je drei Wells wurden 2.000

Zellen gegeben und die Zellzahl immer um weitere 2.000 Zellen bis auf 30.000 Zellen pro

Well gesteigert. Zur Kontrolle wurden die verbleibenden drei Wells nur mit Medium

bestückt. Nach einer Inkubationsdauer von 24 h bei 37 °C bei 5 % CO2 wurde mittels

alamarBlue® (siehe Kapitel 4.8) und SRB-Färbung (siehe Kapitel 4.5.1) ermittelt, wie viele

Zellen mit steigender Anzahl noch überleben bzw. adhärieren können.

Abbildung 29: Bestimmung der Zellviabilität mittels alamarBlue® R² = 0,9391, N = 3, n = 3; Die Darstellung zeigt, dass die Viabilität der Zellen bis 24.000 Zellen/cm

2 ansteigt, darüber hinaus

sinkt sie jedoch wieder ab.

Zellviabilität (alamarBlue®)

0 10000 20000 300000

20000

40000

60000

Zellzahl

alam

arB

lue®

[Ex

/Em

= 5

44

/59

0 n

m]

Ergebnisse

Seite | 72

Abbildung 30: Bestimmung der Zelladhärenz mittels SRB-Färbung R² = 0,9256, N = 3, n = 3; Bis zu einer Dichte von 26.000 Zellen/cm2 können die Zellen adhärieren, darüber hinaus beginnen sie zu verklumpen.

Bis 24.000 Zellen pro cm2 zeigte die alamarBlue® Messung (Abbildung 29) einen nahezu

linearen Anstieg. Die am Vortag in diesen Wells ausgesäten Zellen hatten weder Platz- noch

Nährstoffmangel. Ab jedoch 26.000 Zellen pro cm2 fielen die alamarBlue® Werte stark ab,

was ein beginnendes Absterben der Zellen signalisiert.

Ein ähnliches Bild lieferte die nachfolgende Adhärenzuntersuchung mittels SRB-Färbung

(Abbildung 30) bei der ebenso ein annähernd linearer Geradenverlauf bis 26.000 Zellen pro

cm2 und ein anschließender Abfall der gemessenen Werte zu beobachten war.

Dies zeigt, dass der Metabolismus bereits vor der maximalen Adhärenz sinkt, bedingt z.B.

durch Nährstoff- und O2-Mangel oder aber auch durch Kontaktinhibition (Seluanov, Hine et

al. 2009, S. 19352).

Da die folgenden Versuche auf einen Zeitraum von bis zu 21 Tage ausgelegt waren und die

Zellen im Wachstumsstadium weder einem Platz- noch Nährstoffmangel ausgesetzt werden

sollen, wurde eine Zellzahl von 10.000/cm² festgelegt (dies entspricht 4.000 Zellen pro Well

einer 96 Well Platte).

Zelladhärenz (SRB-Färbung)

0 10000 20000 300000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Zellzahl

SRB

OD

= 5

65

nm

- 6

90

nm

Ergebnisse

Seite | 73

5.2 Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell

erzeugten Medien

Zum Beweis, dass es sich bei den aus Fettgewebe isolierten Zellen auch wirklich um MSCs

handelt, wurde die chondrogene und adipogene Differenzierungsfähigkeit mittels industriell

hergestellter Medien überprüft (siehe Kapitel 4.6.2).

Zellen aus Passage drei wurden in eine 48 Well Platte ausgesät und je eine Hälfte der Platte

mit chondrogenem bzw. adipogenem Medium stimuliert. Der Mediumwechsel fand in einem

viertägigen Intervall statt, nach 24 Tagen wurden die Zellen fixiert und mittels Alzian Blau

Kernechtrot bzw. Ölrot O gefärbt.

Bei den chondrogen stimulierten Zellen war bereits nach 10 Tagen morphologisch die

beginnende Ausbildung von faserartigen Strukturen zu erkennen. Nach weiteren zwei

Wochen war das typische Stammzellbild verschwunden und alle Zellen hatten sich

faserförmig angeordnet. In der Alzian Blau Kernechtrot Färbung (siehe Kapitel 4.9.2) der

Präparate zeigten sich kollagene Fasern blau und die Kerne rot (Welsch 2005, S. 7). Die

unstimulierten Kontrollzellen blieben morphologisch unverändert, es färbten sich lediglich

die Zellkerne rot (siehe Abbildung 31).

Abbildung 31: Kontrollgruppe und chondrogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Alzian Blau Kernechtrot Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe), Kreis = Zellkern (Vergrößerung: 10 X). Die rechte lichtmikroskopische Aufnahme zeigt mit chondrogenem Medium stimulierte Zellen nach der Alzian Blau Kernechtrot Färbung, Kreis = Zellkern, Pfeil = Kollagene Fasern (Vergrößerung: 10 X)

Ergebnisse

Seite | 74

Die Differenzierung in Richtung adipogen war im Mikroskopbild erst nach ca. 16 Tagen zu

beobachten. Bereits im Nativpräparat konnte man viele kleine, in Gruppen angeordnete

Fettvakuolen erkennen, die sich in der Ölrot O Färbung leuchtend rot darstellten. In der

Kontrollgruppe waren keine Fettvakuolen sichtbar (siehe Abbildung 32).

Abbildung 32: Kontrollgruppe und adipogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Ölrot O Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe; Vergrößerung: 10 X), die rechte zeigt mit adipogenem Medium stimulierte Zellen nach der Ölrot O Färbung mit eingeschlossenen Fettvakuolen (Vergrößerung: 10 X)

5.3 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren

Zur Ermittlung der Zelleigenschaften wurden die undifferenzierten Ad-MSCs auf Expression

osteogener Oberflächenrezeptoren mittels RT-PCR untersucht. Primäre humane

Osteoblasten aus Knochen wurden als positive Kontrolle verwendet. Untersucht wurden die

TGF- Rezeptoren Typ I und II, der BMP Rezeptor Typ II, die Rezeptorentypen I und II des

insuline like growth factors wie auch der Retinoid X Rezeptor β und Vitamin D Rezeptor. Als

„house keeping gene“ wurde die Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase bestimmt.

Nach abgelaufener RT-PCR wurden die Proben wie folgt auf das Elektrophoresegel

aufgetragen:

Ergebnisse

Seite | 75

Abbildung 33: Bestimmung der Oberflächenrezeptoren auf Ad-MSCs und Osteoblasten Die Abbildung (invers dargestellt) zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese für die verschiedenen Oberflächenrezeptoren, nachgewiesen mittels RT-PCR; Ad-MSCs = Proben der vier verschiedenen Spender, OSÜ = humane Osteoblasten aus dem Kollagenaseüberstand, die als positive Kontrolle dienen, H2O = negative Kontrolle, puC19 Marker.

Ad-MSCs waren für alle untersuchten Gene positiv. Somit können BMPs, Vitamin D3 und IGF

aufgenommen werden. Die Signalstärke (Expressionslevel) der Rezeptoren war zwischen Ad-

MSCs und Osteoblasten vergleichbar. Lediglich Alk 1 wurde in Ad-MSCs stärker exprimiert als

in Osteoblasten. Alk 2, IGF-I Rezeptor und Vitamin D Rezeptor wurden in Ad-MSCs

schwächer exprimiert als in Osteoblasten. Am Beispiel des Vitamin D Rezeptors war deutlich

zu erkennen, dass die Expressionslevel jedoch unter den einzelnen Spendern stark variierten.

5.4 Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium

Zur Herstellung eines Basismediums für die osteogene Differenzierung wurden die

Supplemente, die auch in Osteoblastendifferenzierungsmedien verwendet werden, getestet.

Dazu wurde in Anlehnung an ein im Labor verwendetes Differenzierungsprotokoll (Ehnert,

Baur et al. 2010, S. 7) das Basismedium für die nachfolgende osteogene Differenzierung in

mehreren Versuchen durch Weglassen einzelner Zusätze variiert:

L-Ascorbinsäure-2-phosphat (c = 200 µM), -Glycerolphosphat (c = 10 mM), HEPES

(c = 25 mM) und CaCl2 (c = 1,5 mM), wobei HEPES eine Pufferfunktion bei der Zugabe von

Ascorbinsäure erfüllt.

Ad-MSCs H2O MarkerOSÜ

Alk 1

Alk 2Alk 3

Alk 5

Alk 6

IGF-I R

IGF-II R

TGF-RII

Retinoid-R

GAPDH

VitaminD-R

BMPRII

TGF-RI

β

Ergebnisse

Seite | 76

Als Mediumgrundlage diente Ad-MSC Kulturmedium mit 2,5 % FCS.

Folgende Medienkonstellationen wurden untersucht:

Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4

L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM

X X

HEPES 25 mM

X X

ß-Glycerolphosphat 10 mM

X

X

CaCl₂ 1,5 mM X X X

Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X

Tabelle 16: Auflistung der im Versuch verwendeten Medienzusammensetzungen Übersicht über die verwendeten Supplemente zur Herstellung der vier verschiedenen Basisdifferenzierungsmedien.

Es wurden in einer 48 Well Platte Ad-MSCs von vier verschiedenen Spendern ausplattiert.

Am nächsten Tag wurden jeweils vier Wells mit Basisdifferenzierungsmedium 1-4 stimuliert,

Mediumwechsel nach vier Tagen und Messung der AP-Aktivität am Tag acht (siehe

Abbildung 34).

Mit Basisdifferenzierungsmedium 1 stimulierte Zellen wiesen eine AP-Aktivität von im

Schnitt 11 nmol/h auf.

Durch die Zugabe von -Glycerolphosphat und CaCl2 (Basisdifferenzierungsmedium 2)

konnte die AP-Aktivität auf ca. 12 nmol/h leicht aber dennoch nicht signifikant erhöht

werden.

Im Basisdifferenzierungsmedium 3 wurden L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES und CaCl2

als Zusätze verwendet was ebenfalls eine Enzymaktivitätssteigerung auf durchschnittlich 14

nmol/h bewirkte.

Im Basisdifferenzierungsmedium 4 kamen alle vier Zusätze zum Einsatz was zu einem

signifikanten Anstieg der AP-Aktivität auf 18 nmol/h führte (p < 0,05 im Vergleich zum

Basisdifferenzierungsmedium 1).

Eine Verdünnungsreihe von Ascorbinsäure zeigte, dass bei einer Konzentration unter 200 µM

Ascorbinsäure die Zellen nicht beginnen zu differenzieren (hier nicht gezeigt).

Ergebnisse

Seite | 77

Abbildung 34: Zugabe verschiedener Supplemente und Ermittlung der AP-Aktivität N = 4, n = 4; Basisdifferenzierungsmedium 4 weist mit p < 0,05 (*) im Vergleich zu Basisdifferenzierungsmedium 1, in dem keine Zusätze enthalten sind, eine signifikant höhere AP-Aktivität auf.

Basisdifferenzierungsmedium 4 hat den höchsten Anstieg in der AP-Aktivität und wird

deshalb in den weiteren Versuchen zum Einsatz kommen, wobei es dort nur noch als

Basisdifferenzierungsmedium bezeichnet wird.

5.5 2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge

Für diesen Versuch wurden die Zellen in eine 48 Well Platte ausplattiert und je 6 Wells

wurden mit 0 %, 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 % und 15 % FCS-Konzentration in DMEM + 2 mM

L-Glutamin + 100 U/L Penicillin/Streptomycin versetzt. Nach einer Stimulationsdauer von 16

Tagen wurde die AP-Aktivität (Abbildung 35) bestimmt sowie die Zellviabilität mittels

alamarBlue® (Abbildung 36). Nach 24 Tagen wurde die gebildete mineralisierte Matrix durch

die Alizarin Rot Färbung (Abbildung 37) ermittelt.

Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4

L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM X X

HEPES 25 mM X X

ß-Glycerolphosphat 10 mM X X

CaCl₂ 1,5 mM X X X

Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X

Basisdifferenzierungsmedium (AP-Aktivität)

0

5

10

15

20

25

pN

P [

nm

ol/

h]

*

Ergebnisse

Seite | 78

Abbildung 35: AP-Aktivität bei verschiedenen FCS-Konzentrationen

Zu Beginn steigt die AP-Aktivität mit zunehmender FCS-Konzentration zügig an und erreicht ihr Maximum bei 5 % FCS. Danach nimmt die AP-Aktivität mit steigender FCS-Konzentration wieder ab. Die Medien mit 1 %, 2,5 %, 5 % und 10 % FCS weisen eine signifikant höhere AP-Aktivität auf mit p < 0,01 (**) bzw. p < 0,001 (***) im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe.

Abbildung 36: Zellviabilitätsmessung mittels alamarBlue® Bis 10 % FCS im Medium steigt die Viabilität an, wobei bereits ab 5 % ein Plateau erkennbar wird, darüber hinaus nimmt die Viabilität wieder ab. Alle FCS-Konzentrationen weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe eine signifikant (***; p < 0,001) höhere Viabilität auf.

Serumtest (AP-Aktivität)

0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0

5

10

15

20

25

30

35

**

***

***

***

FCS im Serum

pN

P [

nm

ol/h

]

Serumtest (alamarBlue®)

0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0

1000

2000

3000

4000

5000

***

***

*** ***

***

FCS im Serum

alam

arB

lue®

[Ex

/Em

= 5

44

/59

0 n

m]

Ergebnisse

Seite | 79

Abbildung 37: Matrixmineralisierung bei verschiedenen FCS-Konzentrationen

Oben: Die Matrixmineralisierung erzielt in den mit Serum versetzten Medien signifikant niedrigere Werte p < 0,001 (***) im Vergleich zum Medium ohne FCS.

Unten: Van Kossa Färbung der Ad-MSCs nach Behandlung mit den verschiedenen FCS Konzentrationen. Es ist deutlich zu erkennen, dass in der Gruppe ohne FCS (links) die größte Menge an mineralisierter Matrix angefärbt werden konnte.

5.6 Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungs-

eigenschaften des Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason

hingegen nicht

Zur weiteren Verbesserung des osteogenen Basisdifferenzierungsmediums wurden die zwei

Supplemente - Vitamin D3 und Dexamethason - die in zahlreichen Publikationen aufgelistet

werden, zuerst näher auf ihre zelltoxischen und osteogenen Eigenschaften untersucht.

Serumtest (Alizarin Rot)

0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0

20

40

60

80

100

600

800

1000

FCS im Serum

****** ***

******

Aliz

arin R

ot [µ

M]

Ergebnisse

Seite | 80

5.6.1 Bestimmung nicht toxischer Vitamin D3 Konzentrationen

Bei der Herstellung der Stocklösungen trat das Problem auf, dass Vitamin D3 sich nicht

vollständig in Ad-MSC Kulturmedium lösen ließ. Deshalb musste auf Ethanol (reinst) und

DMSO ausgewichen werden. Beide Substanzen weisen aber zellschädigende Eigenschaften

auf, weshalb ein Toxizitätstest der Optimierung des Differenzierungsmediums vorgeschaltet

werden musste.

In eine 96 Well Platte wurden jeweils 10.000 Zellen (sehr hohe Zellzahl auf kleiner Fläche,

dies stellt hier jedoch kein Problem dar, da die Zellen nur 48 Stunden in Kultur gehalten

wurden) von vier Spendern gebracht.

Die Vitamin D3 Stocklösungen wurden in einer Konzentration von je 10 mM mit den

Lösungsgrundlagen Ethanol (reinst) und DMSO angesetzt. Beginnend mit 20 µM Vitamin D3

in Ad-MSC Kulturmedium wurde eine serielle 1:2 Verdünnung angefertigt, so dass die Zellen

24 Stunden nach dem Ausplattieren mit je 100 µl pro Well folgender Vitamin D3

Konzentrationen beimpft wurden:

0 µM (Kontrolle), 0,3125 µM, 0,625 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM

Nach 24 Stunden wurde mittels alamarBlue® die Viabilität der Zellen untersucht:

Abbildung 38: exemplarische Darstellung des Viabilitätsverlaufes eines Spenders N = 4, n = 3; DMSO (rote Kurve) als Lösungsgrundlage für Vitamin D3 ist weniger toxisch für die Zellen als Ethanol (blaue Kurve) bei der höchsten eingesetzten Konzentration von Vitamin D3.

Vitamin D Toxizitätstest (alamarBlue®)

0

50

100

150

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

Ethanol (reinst)

DMSO

co

log10 (Vitamin D [µM])

Via

bilitä

t [%

de

r K

on

tro

lle

]

Ergebnisse

Seite | 81

Es war deutlich zu erkennen, dass Vitamin D3 in DMSO (rote Kurve) gelöst in höheren

Konzentrationen geringer toxisch auf die Zellen wirkte als nach Lösung in Ethanol (blaue

Kurve). Eine Konzentration von 5 µM wurde von den Zellen sehr gut toleriert und ist auch

noch ausreichend hoch, um auf die osteogene Differenzierung Einfluss nehmen zu können.

5.6.2 Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen

Im Gegensatz zu Vitamin D3 gab es bei Dexamethason keine Schwierigkeiten beim Ansetzen

der Stocklösung, es war vollständig in D-PBS löslich. Dennoch führten wir einen Toxizitätstest

durch, um sicher zu stellen, dass die in den Publikationen beschriebenen Dexamethason-

Konzentrationen nicht toxisch auf Ad-MSCs wirken.

Folgende Dexamethason-Konzentrationen wurden getestet:

0 nM (Kontrolle), 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM

Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde die Viabilität mittels alamarBlue® untersucht.

Abbildung 39: Viabilitätsbestimmung mittels alamarBlue® nach 24 h Inkubation mit Dexamethason N = 4, n = 6; Die Graphik zeigt einen konstanten Viabilitätsabfall um 11 % bis 800 nM Dexamethason.

Dexamethason Toxizitätstest (alamarBlue®)

0

20

40

60

80

100

120

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0log10(Dexamethason [nM])

Via

bili

tät

[% d

er K

on

tro

lle]

Ergebnisse

Seite | 82

In Abbildung 39 ist das prozentuale Überleben der Zellen bezogen auf die Kontrollgruppe bei

zunehmender Dexamethasonkonzentration aufgezeigt. Man konnte beobachten, dass bis zur

Höchstkonzentration von 800 nM die Viabilität um lediglich 11 % abnahm. Die in den

Publikationen verwendete Konzentration von 100 nM hat keinen signifikanten Einfluss auf

die Zellviabilität.

5.6.3 Vitamin D3 induziert die AP-Aktivität

Nachdem beide Zusätze einzeln auf ihre zellschädigende Wirkung getestet worden waren,

wurde ihr Einfluss auf die osteogene Differenzierung von Ad-MSCs näher untersucht.

Analog zum Basisdifferenzierungsmedium Test (siehe Kapitel 5.4) wurden wieder 4

Medienkonstellationen verwendet, die wie in Tabelle 17 beschrieben zusammengesetzt

waren.

Basisdifferenzierungsmedium ohne

Zusatz plus

Dexamethason plus

Vitamin D3

plus Dex. & Vitamin D3

Basisdifferenzierungsmedium X X X X

Dexamethason 100 nM

X

X

Vitamin D3 5 µM

X X

Tabelle 17: Vitamin D3- und Dexamethasonzugabe zum Basisdifferenzierungsmedium Verschiedene Konstellationen der Zugabe von Vitamin D3 und Dexamethason zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium

Die Ad-MSCs wurden in einer 48 Well Platte je Medium für 0, 1, 2, 4, 6 und 10 Tage

stimuliert und die AP-Aktivität gemessen (siehe Abbildung 40). Mediumwechsel fand alle vier

Tage statt.

Ergebnisse

Seite | 83

Abbildung 40: AP-Aktivitätsbestimmung nach Stimulation mit Vitamin D3 und Dexamethason

N = 3, n = 4 pro Tag und Medium; Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium führt im Vergleich zu den anderen Medienkonstellationen ab dem 2. Tag zu einem signifikanten Anstieg der AP-Aktivität mit p < 0,05.

Am Tag 0, also bei den unstimulierten Zellen, war bei allen vier Medien eine vergleichbare

basale Enzymaktivität zu erkennen.

Mit Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus

Dexamethason (blau) stimulierte Zellen zeigten im Verlauf der zehn Tage einen geringen

Anstieg ihrer AP-Aktivität von durchschnittlich 15 nmol/h auf 36 nmol/h.

Bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) hingegen war

keinerlei Zunahme der Enzymaktivität zu erkennen, was für ein Ausbleiben der osteogenen

Differenzierung sprechen kann.

Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)

0 2 4 6 8 10

0

25

50

75

100

125

150

Zeit [d]

pN

P [

nm

ol/h

]


0 2 4 6 8 10

0

25

50

75

100

125

150

Zeit [d]

pN

P [

µM

]

Basisdifferenzierungsmedium

Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason

Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D

Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D


0 2 4 6 8 10

0

25

50

75

100

125

150

Zeit [d]

pN

P [

µM

]

3

3

Ergebnisse

Seite | 84

Zellen, die mit dem Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) beimpft wurden,

verzeichneten bereits nach zwei Tagen eine deutliche Zunahme der AP-Aktivität. Im Verlauf

der nächsten acht Tage erreichte die AP-Aktivität bei ca. 123 nmol/h ihr Maximum und eine

beginnende Plateaubildung war zu erkennen.

Diese Daten zeigen, dass ein Medium bestehend aus L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES,

-Glycerolphosphat, CaCl2 und Vitamin D3 in der Lage ist, die für Osteoblasten typische

AP-Aktivität bei Ad-MSCs signifikant zu erhöhen. Die Messung kann schon nach einer

Stimulationsdauer von sechs bis zehn Tagen durchgeführt werden, da sich die Messwerte

nach diesem relativ kurzen Zeitraum bereits im Bereich der erreichbaren Maximalwerte

bewegen.

Abschließend konnte mittels der AP-Färbung (siehe Kapitel 4.9.1.2) die gebildete alkalische

Phosphatase blau angefärbt werden (siehe Abbildung 41).

Abbildung 41: osteogen differenzierte Ad-MSC in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.

5.6.4 Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von

Vitamin D3 und Dexamethason

Ein weiterer Anhaltspunkt für die Differenzierung in Richtung Osteoblasten ist der Nachweis

von mineralisierter Matrix.

Zur Ermittlung wann die Matrixmineralisierung einsetzt, wurden auf 48 Well Platten

Ad-MSCs ausplattiert. Die verwendeten Medien entsprechen den Medien-

zusammensetzungen aus Kapitel 5.6.3. Je 6 Wells einer Platte wurden mit den vier

Ergebnisse

Seite | 85

Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)

8 15 8 15 8 15 8 15 8 150

500

1000

1500

Zeit [d]

Aliz

arin

rot

[µ

mol

]

Basisdifferenzierungsmedium

Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason

Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D

Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D

Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS

3

3

Medienkonstellationen und Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS für 8 bzw. 15 Tage stimuliert.

Anschließend wurde die Menge an mineralisierter Matrix mittels Alizarin Rot Färbung

ermittelt (siehe Abbildung 42).

Abbildung 42: Bestimmung der mineralisierten Matrix nach 8- und 15tägiger osteogener Stimulation N = 1, n = 6; Die Graphik zeigt, dass nach 8 Tagen die Menge an mineralisierter Matrix bei allen 5 Medien vergleichbar ist. Nach 15 Tagen Stimulationsdauer kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason (blau) und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) ein signifikanter Anstieg der gebildeten Matrix von p < 0,001 (***) und bei Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) ein Anstieg von p < 0,0001 (****) im Vergleich zum Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS (grau) beobachtet werden.

Zellen, die nur acht Tage mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS bzw. den vier

Differenzierungsmedium behandelt wurden, zeigten sehr niedrige Alizarin Rot Werte.

Nach 15tägiger Stimulation jedoch waren die messbaren Alizarin Rot Werte bei allen vier

Differenzierungsmedien im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS beimpften

Kontrollgruppe um ein vielfaches höher. Die Mineralisierung war nach 15 Tagen schon so

weit fortgeschritten, dass nur geringe Unterschiede zwischen den einzelnen Medien messbar

waren. Abbildung 42 zeigt, dass mit Basisdifferenzierungsmedium und

Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 stimulierte Zellen, mehr mineralisierte Matrix

bilden konnten, als die mit Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason und

Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 behandelten. Um

aussagekräftigere Ergebnisse unter Berücksichtigung der Spendervarianz zu erhalten, wurde

Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)

8 15 8 15 8 15 8 15 8 150

500

1000

1500

Zeit [d]

Aliz

arin

ro

t [µ

mo

l] **** ****

*** ***

Ergebnisse

Seite | 86

der Versuch mit zusätzlichen vier Spendern (N = 4, n = 6) bei einer Stimulationsdauer von 12

Tagen wiederholt.

Die dabei gewonnen Daten zeigt Abbildung 43:

Abbildung 43: Bestimmung der gebildeten mineralisierten Matrix nach 12 Tagen osteogener Stimulation N = 4, n = 6; Im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten Kontrollgruppe erreichen die Gruppen Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 mit p < 0,001 (°°°) signifikant höhere Mineralisierungswerte. Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 erzielt mit p < 0,1 (*) im Vergleich zum Basisdifferenzierungsmedium ohne Zusätze das beste Mineralisierungsergebnis.

Abbildung 43 zeigt deutlich, dass die mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten

Zellen sich nur gering mit Alizarin Rot anfärben ließen.

Mit Basisdifferenzierungsmedium und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason

behandelte Zellen wiesen einen annähernd gleich hohen dennoch nicht signifikanten Anstieg

der Matrixmineralisierung im Vergleich zur Kontrollgruppe auf.

Jedoch konnte mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und

Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 eine weitere Zunahme der

Alizarin Rot Werte erzielt werden. Die große Standardabweichung ist durch eine sehr

Differenzierungsmediumtest 12 Tage(Alizarin Rot)

0

500

1000

1500

Aliz

arin

Ro

t [µ

mo

l]

*°°°

°°°

Basisdifferenzierungsmediumohne

Zusätzeplus Dexa-methason

plus Vitamin D3

plus Dex. & Vitamin D3

Kontrolle

Basisdifferenzierungsmedium X X X XDexamethason 100 nM X XVitamin D3 5 µM X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X

Ergebnisse

Seite | 87

ausgeprägte Spendervarianz zu erklären. Drei Spender wiesen Werte zwischen 90 und

220 µmol gebundenes Alizarin Rot auf, wohingegen diese beim vierten Spender bis 2000

µmol anstiegen.

5.7 BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7

BMP 2, 7, 9 spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Knochen und Knorpel (Cheng,

Jiang et al. 2003, S. 1544). Allerdings waren lange Zeit nur BMP 2 und BMP 7 synthetisch

herstellbar, weswegen nur diese Einsatz im klinischen Alltag fanden. Wir haben uns deshalb

auf diese beiden Wachstumsfaktoren konzentriert.

5.7.1 Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht

Für den Versuch wurden Ad-MSCs in eine 48-Well-Platte ausplattiert. Am nächsten Tag

wurden immer sechs Wells mit einem der vier verschiedenen Medien (siehe Tabelle 18) bzw.

mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 als Kontrollgruppe für acht Tage stimuliert.

Mediumwechsel fand nach vier Tagen statt.

Basisdifferenzierungsmedium plus

Vitamin D3 plus BMP 2 plus BMP 7

plus BMP 2 & BMP 7

Vitamin D3 X X X X

BMP 2 5 ng/ml

X

X

BMP 7 5 ng/ml

X X

Tabelle 18: Verschiedene Konstellationen der Zugabe von BMP 2 und BMP 7 zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium

Die Ergebnisse der AP-Aktivitätsmessung nach 8 Tagen sind in der nachfolgenden Abbildung

44 dargestellt:

Ergebnisse

Seite | 88

Abbildung 44: AP-Aktivtätsmessung nach 8tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7

N = 9, n = 6; Nach einer Stimulationsdauer von 8 Tagen kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 ein signifikanter Anstieg der AP-Aktivität von p < 0,01 (**) im Vergleich zur Kontrollgrupe beobachtet werden.

Die AP-Aktivitätsmessung nach acht Tagen (Abbildung 44) zeigt, wie aus den

Voruntersuchungen zu erwarten, beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 einen

signifikanten Anstieg. Beim Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 wurden vergleichbare

AP-Aktivitäts Werte erzielt wie beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3.

Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 7 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 &

BMP 7 wiesen eine niedrigere jedoch nicht signifikant geringere AP-Aktivität auf.

5.7.2 Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung

nicht

Analog zum vorherigen Versuchsaufbau (siehe Kapitel 5.7.1) wurden die Zellen für 12 Tage

stimuliert und mittels Alizarin Rot Färbung die mineralisierte Matrix bestimmt.


Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7

plus BMP 2 & BMP 7

Kontrolle

Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X

BMP-Test 8 Tage (AP-Aktivität)

0

50

100

150

200

** **

pN

P [

nm

ol/h

]

Ergebnisse

Seite | 89

Abbildung 45: Quantifizierung der gebildeten Matrix nach 12 tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7 N = 5, n = 6; Die Messung der Alizarin Rot Werte nach Stimulation der Zellen mit BMP 2 und/oder BMP 7 zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Medien.

In Abbildung 45 ist zu sehen, dass mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3

stimulierte Zellen etwas mehr mineralisierte Matrix produziert haben als Zellen, die BMPs im

Medium zugesetzt hatten. Jedoch war auch hier kein signifikanter Unterschied zwischen

dem Basisdifferenzierungsmedium und den Medien mit BMPs zu erkennen.

5.7.3 BRE Reporterassay

Da unsere Versuche entgegen vieler Publikationen keine Verbesserung der osteogenen

Differenzierung durch BMPs zeigten, haben wir die Aktivierung des BMP-Signalweges

mithilfe eines Reporterassays (siehe Kapitel 4.6.5) bestimmt.

BMP-Test 12 Tage (Alizarin Rot)

0

200

400

600

800

1000

Aliz

arin

Ro

t [µ

mo

l]


Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7

plus BMP 2 & BMP 7

Kontrolle

Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X

Ergebnisse

Seite | 90

Abbildung 46: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 2 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 konnte das Smad1-Signalling nur für 50 ng/ml und 100 ng/ml eingesetztem BMP signifikant (p < 0,001, ***) im Vergleich zur Kontrolle induzieren. Geringere Konzentrationen führten sogar zu einer Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 5 ng/ml BMP 2.

Abbildung 47: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 7 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht nachweisbar induzieren. Tendenziell gab es eher eine Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 50 ng/ml BMP 7.

Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)

5 10 50 100 Kontrolle0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*

*** ***

BMP 2 [ng/ml]

RLU

/µg

Pro

tein


RLU

/μg

Pro

tein

BMP 2 [ng/ml]


5 10 50 100 Kontrolle 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

*

BMP 7 [ng/ml]

RLU

/µg P

rote

in


RLU

/μg

Pro

tein

BMP 7 [ng/ml]

Ergebnisse

Seite | 91

Abbildung 48: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP2 und BMP 7 Konzentrationen

N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht signifikant verbessern.

Alle drei Diagramme weisen ein vergleichbares Basissignalling (Basisdifferenzierungsmedium

plus Vitamin D3 ohne BMPs = Kontrolle) auf. Bei BMP 2 konnte nur mit sehr hohen Dosen

(50 und 100 ng/ml) das Signalling induziert werden. BMP 7 konnte selbst in sehr hohen

Dosen keine Signalinduktion erreichen. Tendenziell zeigte BMP 7 eher eine Verminderung

des Signals. Auch eine kombinatorische Gabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Signalling

nicht induzieren.

5.8 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener

Differenzierung

Zum Nachweis, dass Ad-MSCs nach der osteogenen Differenzierung auch wirklich

osteoblastentypische Gene exprimieren, wurden die Zellen mittels RT-PCR weiter

untersucht. Nach 12 Tagen osteogener Differenzierung in den jeweiligen

Differenzierungsmedien (Basisdifferenzierungsmedium, Basisdifferenzierungsmedium plus

Dexamethason, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungs-

medium plus Dexamethason & Vitamin D3) wurden die Expressionslevel folgender Gene

bestimmt (siehe Abbildung 49):


5 10 Kontrolle0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

BMP 2 + 7 [ng/ml]

RLU

/µg P

rote

in


RLU

/μg

Prot

ein

BMP 2 & 7 [ng/ml]

Ergebnisse

Seite | 92

Alkalische Phosphatase, BMP Rezeptor II, BMP 2, BMP 4, Bone Sialoprotein 2, Matrix gla

Protein, Osteocalcin, Osteopontin, Osteoprotegerin, Osteoblast Specific factor 2 und RANKL.

Die densitometrische Auswertung mit dem Bildbearbeitungsprogramm Image J ergab, dass

das Basisdifferenzierungsmedium ((1) siehe Abbildung 49) die Expression aller untersuchten

Gene induziert hat. Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium (3)

verbesserte die Expressionslevel von BMPRII, MGP, OC, OP, OPG und RANKL weiter. Mit

Dexamethason versetzte Medien (2 und 4) verminderten die Expression aller untersuchten

osteoblastentypischer Gene.

Die densitometrische Auswertung (Abbildung 50) mehrerer Spender zeigte beispielsweise,

dass die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium die Expression von MGP

von dem 7,6 (1) auf das 13,7 fache (3) der Kontrolle verbessert hat, wohingegen in

dexamethasonhaltigen Medien nur eine 1,2 (2) bzw. 1,5 fache (4) Steigerung zu beobachten

war. Ähnliche Ergebnisse waren bei Osteopontin zu beobachten:

Basisdifferenzierungsmedium steigerte 14,2 fach, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin

D3 19,9 fach das Genexpressionslevel, Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason

bzw. plus Dexamethason & Vitamin D3 nur 6,3 bzw. 5,3 fach.

Ergebnisse

Seite | 93

Abbildung 49: Nachweis osteoblastentypischer Gene in den differenzierten Ad-MSCs im Vergleich zu humanen Osteoblasten (invers dargestellt) Repräsentative Abbildung der RT-PCR für osteoblastentypische Gene in Ad-MSCs, MSCs, die mit den vier unterschiedlichen Medienkonstellationen stimuliert wurden (1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3). Als positive Kontrolle wurden humane Osteoblasten und als negative Wasser verwendet, rechts ist der pUC19-Marker zu sehen.

differenzierte Ad-MSCs

OSÜ H2O Marker1 2 3 4

AP

BMPR II

BMP 2

BMP 4

MGP

OC

OP

OPG

OSF 2

RANKL

GAPDH

BSP 2

Ergebnisse

Seite | 94

Densitometrische Auswertung der untersuchten Gene:

Abbildung 50: Densitometrische Auswertung aller untersuchten Gene N = 5, n = 2; 1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3. Die Abbildungen zeigen das Vielfache der Bandensignale im Vergleich zur Kontrolle (humane Osteoblasten)

Alkalische Phosphatase

1 2 3 4 Kontrolle0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

BMPRII


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

BMP 2

1 2 3 4 Kontrolle0

1

2

3

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

BMP 4


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

BSP2

1 2 3 4 Kontrolle0

10

20

30

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

Matrix gla Protein

1 2 3 4 Kontrolle0

5

10

15

20

25

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

Osteocalcin

1 2 3 4 Kontrolle0

2

4

6

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

Osteopontin

1 2 3 4 Kontrolle0

10

20

30

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

Osteoprotegerin


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

OSF 2


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

RANKL

1 2 3 4 Kontrolle0

5

10

15

20

Vie

lfac

hes

der

Ko

nto

lle

*

Diskussion

Seite | 95

6 Diskussion

In dieser Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen aus humanem Bauchdecken- oder

Hüftfett isoliert, verschiedene Supplemente zur Herstellung und Optimierung eines

osteogenen Differenzierungsmediums getestet, um abschließend die ausdifferenzierten

Stammzellen mit primären humanen Osteoblasten auf ihren osteoblastentypischen

Phänotyp hin zu vergleichen.

Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien

Das „Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular

Therapy“ schlägt zur Definition von humanen mesenchymalen Stammzellen folgende

Mindestkriterien vor (Dominici, Le Blanc et al. 2006, S. 315):

1. MSCs müssen CD73, CD90 und CD105 Oberflächenmarker exprimieren und

dürfen CD11b, CD 14, CD19, CD34, CD45, oder CD79alpha und HLA-DR nicht

exprimieren.

2. MSCs müssen in der Zellkultur unter Standardbedingungen plastikadhärent sein.

3. MSCs müssen die Fähigkeit besitzen in vitro in Chondrozyten, Adipozyten und

Osteozyten zu differenzieren.

Wir untersuchten die isolierten Zellen mittels FACS Analyse und RT-PCR auf die Präsenz von

bestimmten Oberflächenmarkern. Die von uns isolierten Zellen waren in Passage drei CD13,

CD29, CD44, CD90, CD105 und CD166 positiv (Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).

CD13 (Aminopeptidase N) wird in großer Anzahl auf Stammzellen und leukämischen Blasten

exprimiert (Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88; Plesa, Chelghoum et al. 2008, S. 572).

Zusätzlich kann CD13 wichtige biologische Prozesse wie Zellwachstum, -invasion und

Angiogenese beeinflussen (Pasqualini, Koivunen et al. 2000, S. 722; Bhagwat, Lahdenranta et

al. 2001, S. 652; Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88). CD29 (Integrin β1) spielt eine wichtige

Rolle bei der Adhäsion und Migration der MSCs (Ode, Kopf et al. 2011, S. 26). CD 44 ist der

Rezeptor für Hyaluronsäure, Osteopontin, Kollagen und Matrix-Metalloproteasen und ist

somit in die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen involviert (Naor, Sionov et al. 1997, S.

241). CD90 (Thy-1) wird allgemein als positiver Marker für MSCs verwendet, nimmt aber

auch wie CD29 an Adhäsions- und Migrationsvorgängen teil (Mason, Yarwood et al. 1997, S.

Diskussion

Seite | 96

1233-1234; Kasten, Beyen et al. 2008, S. 47). CD105 (Endoglin) ist ein TGF-β Corezeptor und

ist an der TGF-β/BMP Signalkaskade beteiligt (Fonsatti, Sigalotti et al. 2003, S. 427). CD166

(activated leukocyte cell adhesion molecule = ALCAM) ist ein häufig aufgeführter Marker für

mesenchymale Stammzellen (Calloni, Cordero et al. 2013, S. 1456). CD166 ist zudem auf

Zellen nachweisbar, die in dynamische Wachstumsprozesse und/oder Migrationsvorgänge,

wie z.B. die Entstehung neuronaler Verschaltungen oder die Immunantwort involviert sind

(Swart 2002, S. 313). Zusätzlich wird CD166 auf Tumorstammzellen des Colon- (Dalerba,

Dylla et al. 2007, S. 10158), Prostatacarcinoms und malignen Melanoms exprimiert

(Jezierska, Matysiak et al. 2006, S. 263).

CD14, CD31, CD34, CD45 und CD147 Oberflächenmarker, die auf eine Verunreinigung mit

Monozyten, Makrophagen und anderen Zellen hinweisen (Bobis, Jarocha et al. 2006, S. 216;

Chamberlain, Fox et al. 2007, S. 2739), waren ab Passage drei nicht mehr nachweisbar,

weshalb für die Versuche ausschließlich Zellen aus Passage drei oder vier verwendet wurden

(Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).

Bei der Untersuchung der anderen Kriterien ergab sich, dass Ad-MSCs nach 12-24 h auf

Plastik adhärierten und sich problemlos in zwei (Chondrozyten und Adipozyten) der drei

geforderten Zellarten differenzieren ließen (siehe Abbildung 31 und Abbildung 32). Die

Differenzierung in Zellen der osteogenen Linie schließt sich in den nachfolgenden Versuchen

an.

Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren

Wir konnten zeigen, dass Ad-MSCs Alk 1, 2, 3, 5, 6, TGF-β Rezeptor II, BMP Rezeptor II, IGF

Rezeptor I u II, Retinoid X Rezeptor β und Vitamin D Rezeptor exprimieren. Basierend auf

diesen Ergebnissen sollten die Ad-MSCs in der Lage sein BMPs, Vitamin D3 und IGF

aufzunehmen.

- TGF- Rezeptoren sind transmembranöse Seronin/Threonin Kinasen. Bis heute sind

sieben Typ I Rezeptoren und fünf Typ II Rezeptoren (TGF-βRII, ActR-II, ActR-IIB,

BMPRII, AMHR-II) bekannt (Inman, Nicolas et al. 2002, S. 65). Die Typ I Rezeptoren

werden auch „Activin-receptor-like kinases“ genannt, kurz Alk 1-7. Für die

Signaltransduktion werden jeweils ein Typ I- und ein Typ II Rezeptor benötigt

Diskussion

Seite | 97

(Massague 1998, S. 753). Nach Ligandenbindung an den Typ II Rezeptor, verbinden

sich beide Rezeptoren miteinander. Abhängig von dem TGF- Liganden bilden

unterschiedliche Typ I und II Rezeptoren einen Komplex, somit ist eine spezifische

Signalübertragung des Liganden gewährleistet. Aufgabe der über 35 Mitglieder der

TGF- Familie ist die Entstehung und Stoffwechselregulation verschiedener Gewebe,

wobei deren größtes Vorkommen im menschlichen Körper im Knochengewebe zu

finden ist (Massague 1998, S. 753-754). Die Gruppe um Cheng hat das osteogene

Differenzierungspotential 13 verschiedener BMPs auf murine embryonale

Fibroblasten und C2C12-Zellen untersucht. Dabei verbesserten besonders BMP 2,

BMP 9 und in geringerem Maße auch BMP 7 die osteogene Differenzierung der Zellen

(Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544). Wir konnten zeigen, dass Alk 1, 2, 3, 5, 6, TGF-β

Rezeptor II und BMP Rezeptor II in den Ad-MSCs exprimiert wird. Vorarbeiten

unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass die kontinuierliche Exposition von TGF-β die

Reifung von primären Osteoblasten verhindert (Ehnert, Baur et al. 2010, S. 1).

Deshalb haben wir in unseren Versuchen auf die Stimulation mit TGF-β verzichtet. Da

bisher nur BMP 2 und BMP 7 klinische Anwendung fanden haben wir uns auf diese

beiden konzentriert.

Insulin like growth factor Rezeptoren Typ I und II sind an Zellwachstums-,

Differenzierungs- und Regulationsprozessen beteiligt. Sie weisen eine hohe Affinität

zu IGF-I und II auf, jedoch eine signifikant erniedrigte gegenüber dem Insulin (Bentov

Y. 2008). Versuche mit einer lokal (in Form beschichteter Implantate) applizierten

Kombination aus IGF I und TGF-β1 ergaben einen stimulierenden Effekt auf die

Frakturheilung (Schmidmaier, Lucke et al. 2006, S. 61), was einen Hinweis auf die

Mitbeteiligung dieses Substrats am Knochenstoffwechsel sein kann. Ergebnisse einer

anderen Arbeitsgruppe ergeben, dass IGF-I Knock out Mäuse eine höhere

Knochendichte aufweisen als deren Wildtypgattung. Dieses Ergebnis wird dadurch

erklärt, dass IGF-I die Osteoklastogenese durch die Expression von RANKL und RANK

unterstützt und regelt (Wang, Nishida et al. 2006, S. 1350). In einer anderen

Publikation wird beschrieben, dass IGF-I seinen Einfluss auf das skelettale System

nicht primär über die Fraktion der Osteoprogenitorzellen, sondern auf reifere Zellen

der osteoblastären Linie ausübt (Walsh, Jefferiss et al. 2003, S. 80). Parallel laufende

Diskussion

Seite | 98

Arbeiten in unserem Labor haben sich mit dem Effekt von Insulin (strukturell

verwandt mit IGF) auf primäre humane Osteoblasten befasst. In diesen Arbeiten wies

unsere Arbeitsgruppe nach, dass eine kontinuierliche Stimulation mit Insulin die

Expression und Aktivierung von TGF-β induzierte und dadurch die

Osteoblastenfunktion inhibierte (Freude, Braun et al. 2012, S. 1257). Aufgrund dieser

kontroversen Aussagen bezüglich der Wirkung von IGF auf die osteogene

Differenzierung, fiel der Entschluss auf dessen Einsatz im Optimierungsprotokoll zu

verzichten.

Der Vitamin D Rezeptor gehört zur Familie der Steroidrezeptoren und agiert, wie

auch andere Mitglieder aus dieser Gruppe, nach Aktivierung durch seinen Liganden

als Transkriptionsfaktor (Dusso, Brown et al. 2005, S. 8). Zusätzlich vermittelt Vitamin

D3 seine Wirkung über den in der Zellmembran gebundenen Rezeptor Protein

Disulfidisomerase A3 (PDIA3). Im Verlauf der osteogenen Differenzierung von

humanen MSCs wird die Expression des Vitamin D Rezeptors gesteigert wobei das

Expressionslevel von PDIA3 konstant bleibt (Olivares-Navarrete, Sutha et al. 2012, S.

1726). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass in der Frühphase der Differenzierung

die Vitamin D3 Aufnahme zum Großteil über PDIA3 erfolgt und im Verlauf des

Differenzierungsprozesses immer mehr vom Vitamin D Rezeptor übernommen wird.

Publikationen zeigen, dass Dexamethason durch Cholecalciferol (Vitamin D3) in der

osteogenen Differenzierung von humanen Stromazellen aus Fettgewebe (Zhou, Liu et

al. 2006, S. 1278; Zhou, Liu et al. 2012, S. 160) und von embryonalen Stammzellen

(zur Nieden, Kempka et al. 2003, S. 18) ersetzt werden kann. Aufgrund dieser ersten

Hinweise wurde dem Vitamin D3 in den Optimierungsversuchen eine besondere Rolle

beigemessen.

Der Retinoid X Rezeptor β ist ein nukleärer Rezeptor für 9-cis Retinoinsäure und ist

ein obligater Partner des Vitamin D Rezeptors bei der Vermittlung der Wirkung des

Cholecalciferols (Heyman, Mangelsdorf et al. 1992, S. 397; Sutton and MacDonald

2003, S. 778). Außerdem proklamieren Zhang et al. einen synergistischen Effekt

zwischen dem Retinoid Signalling und der Induktion der osteogenen Differenzierung

von mesenchymalen Progenitorzellen durch BMP 9 (Zhang, Deng et al. 2010, S. 1).

Die Gruppe um Chaudhry verwendete anstatt Dexamethason Retinoinsäure und

Diskussion

Seite | 99

konnten dadurch die Mineralisierung von embryonalen Stammzellen im 3D-Scaffold

induzieren (Chaudhry, Yao et al. 2004, S. 205). Die Arbeitsgruppe um Shibuya zeigte

jedoch, dass die Zugabe von Retinoinsäure die osteogene Differenzierung von

periodontalen Zellen der Sharpey Fasern inhibierte (Shibuya, Nemoto et al. 2005, S.

432). Aufgrund der gegensätzlichen Ergebnisse wurde Retinoinsäure nicht in den

Versuchen verwendet.

Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium

In den nächsten Versuchen wurde der Suche nach einem kostengünstigen Medium, das die

Zellen möglichst wenigen unterschiedlichen Substanzen aussetzt und dennoch hohes

Differenzierungspotential aufweist, nachgegangen. Diese Punkte sind ein wichtiger Aspekt,

um das Tissue Engineering für die Industrie interessant und lukrativ, für Kliniken und

Krankenkassen finanzierbar und für den Patienten sicher zu gestalten.

Calciumchloridsalz diente im Medium als Calciumquelle, L-Ascorbinsäure-2-phosphat und -

Glycerolphosphat als Phosphatlieferanten; interessanterweise induziert bereits die alleinige

Zugabe von L-Ascorbinsäure-2-phosphat in MSCs aus Nabelschnurblut die osteogene

Differenzierung (Mekala, Baadhe et al. 2013, S. 156). Ascorbinsäure spielt eine Schlüsselrolle

als Cofaktor bei der posttranslationalen Modifikation der Kollagenmoleküle (Geesin,

Hendricks et al. 1991, S. 6). Entscheidend war bei unseren Versuchen die Konzentration von

Ascorbinsäure-2-phosphat. Bei Konzentrationen unter 200 µM blieb die Induktion der AP-

Aktivität aus. Ähnliche Ergebnisse erhielt die Arbeitsgruppe um Kyllönen und Haimi, die

zeigten dass bei der osteogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen

aus Fettgewebe die runx2 (wichtiger Transkriptionsfaktor, der an Osteoblasten-

differenzierung und Skelettentwicklung beteiligt ist) Expression mit höheren

L-Ascorbinsäure-2-phosphat Konzentrationen stieg (Kyllonen, Haimi et al. 2013, S. 1). HEPES

dient zur Pufferung des Mediumansatzes.

Die Messung der AP-Aktivität (Abbildung 34) ergab, dass nur die Zugabe aller 4

Mediensupplemente einen signifikanten Anstieg der Enzymaktivität bewirkte. Basierend auf

diesem Ergebnis wurde für die Versuche folgendes Basisdifferenzierungsmedium verwendet:

L-Ascorbinsäure-2-phosphat (c = 200 µM), -Glycerolphosphat (c = 10 mM), HEPES

(c = 25 mM) und CaCl2 (c= 1,5 mM) gelöst in Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS.

Diskussion

Seite | 100

2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge

Eine auf den ersten Blick eher zweitrangige Inhaltsangabe in vielen Rezepturen ist die

Verwendung von 10 % FCS in Kultur- und 5 % FCS in Differenzierungsmedien. Die bisherige

Annahme, dass eine FCS-Reduktion lediglich den Wachstumsstimulus reduziert und dadurch

die anderen Mediensupplemente stärker ihre Differenzierungswirkung entfalten können,

sollte erneut überprüft werden. In Abbildung 36 bestätigt sich mittels alamarBlue®, dass bei

10 % FCS die optimalen Wachstumsbedingungen für die Zellen bestanden. Die besten

Ergebnisse für die Matrixmineralisierung (siehe Abbildung 37) konnten mit 0 % FCS erzielt

werden, während die höchste AP-Aktivität (siehe Abbildung 35) bei 5 % FCS gemessen

wurde. Um beiden Kriterien gerecht zu werden, wurde für das Differenzierungsmedium eine

FCS-Konzentration von 2,5 % festgelegt (in Anlehnung an: Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 4).

Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungseigenschaften des Basismediums,

Dexamethason hingegen nicht

In der Mehrzahl der osteogenen Differenzierungsprotokolle kommt hauptsächlich

Dexamethason und vereinzelt auch Vitamin D3 zum Einsatz (Beresford, Joyner et al. 1994, S.

941). Beide üben einen maßgeblichen Einfluss auf den Knochenstoffwechsel aus und sollen

den Differenzierungsprozess zeitlich und qualitativ optimieren.

Nach Ermittlung der Toxizitätsgrenzen für beide Substanzen wurde deren Einfluss auf die AP-

Aktivität und Matrixmineralisierung untersucht. Dabei bewirkte die Zugabe von Vitamin D3

zum Basisdifferenzierungsmedium einen signifikanten Anstieg der AP-Aktivität.

Vergleichbare Ergebnisse lieferte die Alizarin Rot Färbung, bei der der Zusatz von Vitamin D3

die Bildung mineralisierter Matrix signifikant induzierte. Dies wird durch Beobachtungen am

Patienten unterstützt, so findet Vitamin D3 zum Beispiel bei Therapie und Prophylaxe von

Osteoporose sowie bei der Rachitisbehandlung seine Verwendung. Vitamin D3 gehört zur

Gruppe der Steroide und arbeitet nach seiner Aktivierung mittels UV-Licht zum 1,25

Dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3) auf zwei Ebenen im Körper. Auf Genebene bindet es

an den Vitamin D Rezeptor und kann so regulatorisch auf die Gentranskription Einfluss

nehmen. Als nicht genomisches Wirkprinzip wird eine Sofortreaktion unter anderem auch in

Osteoblasten beschrieben, bei der 1,25(OH)2D3 über eine Aktivierung der Phospholipase C

und damit des Inositoltriphosphat/Diacylglycerol-Weges einen Anstieg der intrazellulären

Diskussion

Seite | 101

Calciumkonzentrationen induziert (Lieberherr, Garabedian et al. 1979, S. 47; Fritsch, Grosse

et al. 1985, S.639-644).

Die Leber produziert Calcidiol, die Vorstufe des metabolisch aktiven Calcitriols (Nair 2010, S.

491-492). Studien belegen, dass bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung der Vitamin

D3 Stoffwechsel verändert ist und der Vitamin D3 Serumspiegel sinkt (Arteh, Narra et al.

2010, S. 2624). Ebenso weisen Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz vermehrt eine

Hypovitaminose auf (Mawer, Taylor et al. 1973, S. 626). In beiden Patientengruppen findet

man ein erhöhtes Osteoporoserisiko, was zeigt, dass Vitamin D3 eine maßgebliche Rolle im

Knochenstoffwechsel spielt.

Die Zugabe von Dexamethason zum Basisdifferenzierungsmedium verbesserte die AP-

Aktivität nicht, dies beschreibt auch die Arbeitsgruppe um Khanna-Jain bei der osteogenen

Differenzierung humaner Stammzellen aus Zahnpulpa (Khanna-Jain, Mannerstrom et al.

2012, S. 1). Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit an Ad-MSCs zeigt, dass hohe Dexamethason

Konzentrationen (100 nM) die Zellproliferation und Expression von Kollagen Typ I

supprimieren, wohingegen eine geringe Dexamethason Konzentration (5 nM) in

Kombination mit einer hohen L-Ascorbinsäure-2-phosphat Konzentration (250 μM) die

osteogene Differenzierung begünstigen (Kyllonen, Haimi et al. 2013, S. 11). Die

Matrixmineralisierung nahm durch Dexamethason im Vergleich zum

Basisdifferenzierungsmedium nur wenig zu. Buttery und seine Mitarbeiter zeigten, dass die

Zugabe von Dexamethason mit L-Ascorbinsäure-2-phosphat und β-Glycerolphosphat ab Tag

14 und später, jedoch nicht davor, die Matrixmineralisierung von embryonalen Stammzellen

induzieren konnte (Buttery, Bourne et al. 2001, S. 89). Interessanterweise steigerte

Dexamethason in Kombination mit Vitamin D3 die Matrixmineralisierung signifikant obwohl

die AP-Aktivität in dieser Kombination nicht induziert wurde. Dexamethason ist ein

Kortikosteroid, das in der Medizin zur Therapie zahlreicher Indikationen eingesetzt wird.

Jedoch weist es auch eine lange Liste von unerwünschten Nebenwirkungen auf. Im Bezug auf

Knochen finden vor allem das osteoporosefördernde Potential, das bei hohen Dosen auch

schon nach kurzer Behandlungsdauer nachgewiesen werden kann, und das Risiko

aseptischer Knochennekrosen im Kopfbereich von Humerus und Femur Beachtung (Kaiser

2002, S. 137-138). Allerdings wird in vielen Protokollen zur Differenzierung von primären

Osteoblasten Dexamethason in physiologischen Konzentrationen zugefügt. Auch in den von

uns isolierten primären humanen Osteoblasten hat Dexamethason bessere

Diskussion

Seite | 102

Differenzierungserfolge erzielt als dessen Ersatz durch Vitamin D3. So konnten wir zeigen,

dass bei Ad-MSCs, Knochenmarkstammzellen und Osteoblasten desselben Spenders ein

vergleichbares Differenzierungsergebnis mit unterschiedlichen Medien erreicht werden

konnte (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 6). Dies wird bestätigt durch die Arbeit von Atmani et

al., die gezeigt haben, dass Calcitriol 1,25(OH)2D3 die osteogene Differenzierung von

Knochenmarkstammzellen vermindert, wohingegen Dexamethason diese fördert (Atmani,

Chappard et al. 2003, S. 364). Die osteogene Differenzierung von Ad-MSCs hingegen wurde

durch Vitamin D3 induziert und durch Dexamethason vermindert. Die bereits oben erwähnte

Gruppe um Khanna-Jain berichtet, dass bei der Stimulation humaner Stammzellen aus

Zahnpulpa mit Vitamin D3 signifikant höhere Expressionslevel von Osteopontin und

Osteocalcin erzielt werden konnten als bei der Stimulation mit Dexamethason (Khanna-Jain,

Mannerstrom et al. 2012, S. 6-8).

Zugabe von BMP 2 und/ oder BMP 7 verbessert die osteogene Differenzierung nicht

In Publikationen wird der osteoinduktive Effekt von BMP 2, BMP 7 und BMP 9 proklamiert

(Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544; Donati, Di Bella et al. 2008, S. 65; Azad, Breitbart et al.

2009, S. 267). Die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren zur Verbesserung der

Knochenheilung durch verschiedene Trägersysteme und direkte Injektionen wird seit vielen

Jahren untersucht. So konnte zum Beispiel eine verbesserte Heilung bei Zustand nach

Fraktur oder Osteotomie durch BMP 2 freisetzende Kollagenschwämme im Tiermodell

beobachtet werden (Welch, Jones et al. 1998, S. 1483; Bouxsein, Turek et al. 2001, S. 1219).

TGF-β1 zeigte eine starke chemotaktische Wirkung auf humane Osteoblasten. Die

Verabreichung dieses Zytokins im Hundemodell verstärkte die mechanische

Implantatfixation und das Knochenwachstum; interessanterweise war der Effekt bei

niedrigen TGF-β1-Konzentrationen (0,3 µg) ausgeprägter als bei dessen höher dosiertem

Einsatz (3,0 µg), jedoch in beiden Gruppen signifikant mehr im Vergleich zur Kontrollgruppe

(Lind 1998, S. 4).

Da nur BMP 2 und BMP 7 für den klinischen Einsatz zugelassen sind, haben wir deren Effekt

auf die osteogene Differenzierung der Ad-MSCs untersucht. Entgegen der gängigen

Meinung, dass BMPs die Osteogenese fördern, konnten wir weder durch BMP 2 oder BMP 7

noch die Kombination aus beiden die AP-Aktivität und Bildung mineralisierter Matrix

Diskussion

Seite | 103

verbessern. BMP 7 zeigte tendenziell sogar eine Verminderung der angestrebten osteogenen

Effekte.

Dabei ist zu unterscheiden, dass in vielen Publikationen (Helm, Alden et al. 2000, S. 191;

Cheng, Jiang et al. 2003, S. 1544) die BMPs häufig durch Überexpression in den Zellen selbst

ihre Wirkung entfalten konnten, in unserem Versuchsansatz jedoch auf rekombinante BMPs

zurückgegriffen wurde.

Obwohl Ad-MSCs die für das BMP Signalling benötigten Rezeptoren exprimieren konnten wir

keinen osteoinduktiven Effekt von BMP 2 und BMP 7 nachweisen. Deshalb untersuchten wir

die Aktivierung des Signalweges. Dabei zeigte sich, dass BMP 2 nur in sehr hohen Dosen das

Signalling aktivierte, wohingegen BMP 7 das Signalling tendenziell verminderte. Die

ausbleibende Signalaktivierung könnte den zuvor beobachteten fehlenden osteoinduktiven

Effekt erklären. Weiter muss untersucht werden, ob im Medium Faktoren enthalten sind, die

die BMP Wirkung vermindern oder sogar inhibieren, wie z.B. BMP 3 (Gamer, Nove et al.

2005, S. 156) , Noggin (Rosen 2006, S. 19) oder hohe Konzentrationen von TGF-β1 (Ehnert,

Baur et al. 2010, S. 1). BMP 2 könnte in sehr hohen Dosen einen positiven Effekt auf die

osteogene Differenzierung haben, jedoch ist dies mit sehr hohen Kosten verbunden. Da ein

Hauptziel der Arbeit darin bestand, ein Medium für den Routineeinsatz zu entwickeln, wurde

aus Kosten Nutzen Überlegungen auf die Zugabe von Wachstumsfaktoren verzichtet.

Weitere Aspekte sprechen für den Verzicht auf Wachstumsfaktoren:

- Untersuchungen im Tiermodell zeigten, dass die hochdosierte systemische Gabe von

Wachstumsfaktoren ernsthafte Nebeneffekte wie Gewebsläsionen in Leber,

Knochen, Niere, Herz, Pankreas und Magen (Terrell, Working et al. 1993, S. 43) mit

sich bringen kann.

- Die Verabreichung von IGF I führt bei Kindern mit fehlendem Wachstumsrezeptor zu

Hypoglykämien und einem vorübergehend erhöhten Kaliumspiegel (Wilton 1992, S.

137).

Die Ergebnisse nach Wachstumsfaktorengabe bei der Primärversorgung von Frakturen sind

immer vor dem Hintergrund zu betrachten, dass die Konsolidierung der Fraktur auch durch

den natürlichen Heilungsprozess des Patienten eingetreten sein kann. So zeigten

Schmidmaier et al., dass die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren den Prozess der

Frakturheilung anfänglich verbesserte, jedoch nach 84 Tagen vergleichbare Ergebnisse in der

Diskussion

Seite | 104

Gruppe ohne Wachstumsfaktorengabe nachweisbar waren (Schmidmaier, Wildemann et al.

2004, S. 514).

Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener Differenzierung

Ähnlich der AP-Aktivität und Matrixmineralisierung hatten die vier Differenzierungsmedien

einen starken Einfluss auf die Expression osteoblastentypischer Gene. Das

Basisdifferenzierungsmedium konnte die Expressionslevel aller untersuchten Gene (AP,

BMPRII, BMP 2, BMP 4, BSP 2, MGP, OC, OP, OPG, OSF 2, RANKL) verbessern. Durch die

Zugabe von Vitamin D3 konnte der osteoinduktive Effekt auf diese Gene weiter gesteigert

werden. Der RANK Ligand (RANKL) bindet an den Osteoklastenrezeptor RANK (NF κB) und ist

der wichtigste stimulierende Faktor für die Bildung reifer Osteoklasten, was einen Verlust

der Knochenmatrix zur Folge hätte. Allerdings hat Vitamin D3 auch die Expression von OPG

gesteigert, welches RANKL bindet und somit dessen osteoklastische Wirkung inhibiert

(Haima 2013, S. 4). Dieser Effekt wurde auch in Stromazellen beobachtet. Nach Stimulation

mit TGF-β1 wurde die Expression von OPG und weiteren Faktoren, die die Osteoklastogenese

inhibieren, gesteigert (Thirunavukkarasu, Miles et al. 2001, S. 36241). Im Gegensatz dazu

zeigten primäre humane Osteoblasten nach TGF-β1-Stimulation eine signifikant höhere

Sekretion von RANKL und eine gleichzeitige Abnahme der OPG-Bildung (Ehnert, Baur et al.

2010, S. 1). Die Expression des durch Vitamin D3 induzierbaren Matrix gla Proteins (Cancela,

Hsieh et al. 1990, S. 15040) konnte mit dem Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3

weiter gesteigert werden. Ebenso zeigt Wallin, dass in HTM Zellen MGP inhibitorisch auf die

BMP 2 induzierte AP-Aktivität und Mineralisierung wirkt (Xue, Wallin et al. 2006, S. 997).

Dies könnte eine weitere Erklärung für den ausbleibenden osteogenen Effekt des BMP 2 in

unseren Versuchen sein.

Die BMP 4 Expression wurde durch die Zugabe von Dexamethason stark reduziert.

Basisdifferenzierungsmedium und Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 hingegen

induzierten die Bildung des BMP 4, das unter anderem eine wichtige Rolle im

endochondralen Ossifikationsprozess spielt. Interessanterweise zeigte sich, dass

Dexamethason auch hier die Expressionslevel osteoblastentypischer Gene verminderte. Dies

war ein weiterer Grund für das Weglassen von Dexamethason in unserem Ad-MSC

Differenzierungsmedium.

Diskussion

Seite | 105

Die Wahl der Stammzellquelle ist Gegenstand vieler Publikationen. Die bereits oben

erwähnten Kriterien, die Dominici et al. von einer Stammzellgattung fordern (Dominici, Le

Blanc et al. 2006, S. 315), konnten von Ad-MSCs erfüllt werden. Jedoch gibt es Berichte, dass

deren osteogenes Differenzierungspotential im Vergleich zu B-MSCs wesentlich geringer ist

(Im, Shin et al. 2005, S. 845; Vishnubalaji, Al-Nbaheen et al. 2012, S. 419). Nachteil dieser

Studien ist, dass diese nie mit Zellen eines Spenders durchgeführt wurden, sodass eine

Spendervarianz aufgrund verschiedener Faktoren wie Geschlecht, Alter, Erkrankungen oder

Medikamenteneinnahme nicht ausgeschlossen werden kann (Ehnert, Häuser et al. 2011, S.

7). Deshalb untersuchten wir Ad-MSCs und B-MSCs von einem Spender und verglichen die

Ergebnisse für Zellproliferation, osteogene Differenzierung und Expression

osteoblastentypischer Gene mit spendereigenen Osteoblasten. Dabei zeigte sich, dass Ad-

MSCs durchschnittlich doppelt so schnell proliferierten wie korrespondierende B-MSC. Die

osteogene Differenzierung setzte in den B-MSCs geringfügig früher ein, jedoch zeigten beide

Gruppen nach einer Differenzierungsdauer von 21 Tagen vergleichbare Ergebnisse. Bei der

abschließenden Bestimmung von osteoblastentypischen Genen wie BSP 2, BMP 2, BMP 4,

OC und OP erzielten sowohl Ad-MSCs als auch B-MSCs gleichermaßen hohe Expressionslevel

wie die differenzierten primären Osteoblasten (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 5-7).

Ein Pool von 100.000 Knochenmarkzellen beinhaltet eine Stammzelle (Fraser, Wulur et al.

2006, S. 150; Polak and Bishop 2006, S. 357) bzw. aus einem Milliliter Knochenmark können

1 x 102 bis 1 x 103 Stammzellen gewonnen werden (Coleman 2006, S. 117). Eine

Stammzellpopulation aus dem Knochenmark ist ein heterogener Mix aus unterschiedlichen

Subpopulationen: endotheliale Progenitorzellen sowie hämatopoetische und mesenchymale

Stammzellen (Herzog, Chai et al. 2003, S. 3483). Fettgewebe hat prozentual den höchsten

Anteil an adulten Stammzellen von allen Geweben im Körper und so können aus 1 g

Fettgewebe ca. 5 x 103 Zellen isoliert werden (Coleman 2006, S. 117). Somit kann aus Ad-

MSCs innerhalb eines kurzen Zeitraums eine große Zellzahl, die z.B. bei der Transplantation

von Zellen in einen großen Knochendefekt nötig sind, gewonnen werden. Die stetige

Replikation bringt das Risiko einer ungewollten genetischen Veränderung mit sich. Da jedoch

wie oben erwähnt im Gegensatz zu B-MSCs die Ad-MSCs von Anfang an in großen Mengen

zur Verfügung stehen, kann mit nur wenigen Replikationszyklen eine große Menge an Ad-

MSCs gezüchtet werden.

Diskussion

Seite | 106

Unsere Ergebnisse zeigen somit, dass Ad-MSCs durch die Anpassung der unterschiedlichen

Differenzierungssupplemente vergleichbare Ergebnisse wie primäre humane Osteoblasten

erzielen können. Da die Gewinnung von Fettgewebe risikoärmer ist als die Gewinnung eines

Knochenmarkaspirats, daraus die Ausbeute an Fettgewebsstammzellen wesentlich höher ist

als an Knochenmarkstammzellen und die osteogenen Differenzierungsergebnisse beider

Zellarten vergleichbar sind, sind Ad-MSCs eine ideale alternative Zellquelle für das Tissue

Engineering (Ehnert, Häuser et al. 2011, S. 7-8).

Zusammenfassung und Ausblick

Seite | 107

7 Zusammenfassung und Ausblick

In dieser Arbeit wurde die osteogene Differenzierungsfähigkeit von Fettgewebsstammzellen

untersucht. Die Zellen wurden aus Hüft- oder Bauchdeckenfett isoliert und mit

verschiedenen Supplementen zur osteogenen Differenzierung angeregt. Der

Differenzierungserfolg wurde durch Ermittlung von AP-Aktivität und Matrixmineralisierung

überprüft. Besonders zu erwähnen ist, dass der Austausch von Dexamethason durch

Vitamin D3 die osteogene Differenzierung signifikant steigerte. Die Zugabe der

Wachstumsfaktoren BMP 2 und BMP 7 erbrachte dabei keine signifikante Verbesserung. Die

abschließende RT-PCR zeigte, dass mit dem optimierten Differenzierungsmedium die

Expression osteoblastentypischer Gene vergleichbar zu primären humanen Osteoblasten

war. Deshalb sind wir der Meinung, dass Ad-MSCs eine alternative Stammzellquelle für den

klinischen Einsatz darstellen.

Folgende Aspekte werden derzeit oder in Zukunft noch näher untersucht:

Momentan wird der Einfluss des Spenderalters auf die osteogene Differenzierung der Ad-

MSCs untersucht, wobei es erste Hinweise gibt, dass die osteogene Differenzierungsfähigkeit

mit dem Alter abnimmt. Dies wird auch durch Girolamo et al. bestätigt, die sowohl im 2D-

Modell als auch bei der Kultivierung im Scaffold eine signifikante Verringerung des

osteogenen Potentials mit zunehmendem Alter beobachten. Der Ertrag an Ad-MSCs älterer

Spender ist jedoch signifikant höher als der aus jungem Spendermaterial (de Girolamo, Lopa

et al. 2009, S. 793). Im Gegensatz dazu steht, dass B-MSCs von Spendern über 65 Jahren, die

höchsten AP-Aktivitätswerte erzielen. Beim Vergleich der Expressionslevel von osteogenen

Markergenen von B-MSCs aus Spendern jünger als 50 Jahre, zwischen 50 und 65 Jahre und

älter als 65 Jahre wurden keine signifikanten Unterschiede detektiert (Fickert, Schroter-

Bobsin et al. 2011, S. 224). Die Grenze von 50 Jahren für junge Spender ist dabei jedoch

kritisch zu betrachten. Für die Differenzierung von Ad-MSCs in Adipozyten und Myozyten

spielt das Spenderalter keine Rolle (Roura, Farre et al. 2006, S. 555). Zugrundeliegende

Mechanismen, wie z.B. Stoffwechselprozesse sind noch nicht geklärt. Um den Einfluss des

Alters auf das Differenzierungspotential näher zu untersuchen müssen die altersbedingten

Veränderungen der Stoffwechselprozesse in den Zellen näher betrachtet werden.

Wir beschränkten uns auf die Verwendung von Fettgewebe aus der Hüft- und

Bauchdeckenregion. Seit vielen Jahren ist bekannt, dass Frauen dazu tendieren im Gesäß-

Zusammenfassung und Ausblick

Seite | 108

und Oberschenkelbereich Fettgewebe anzulegen, wohingegen Männer eher in der

Bauchregion vor allem aber intraabdominell. Ebenso konnte gezeigt werden, dass besonders

das intraabdominelle Fettgewebe ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre oder metabolische

Krankheiten wie die koronare Herzkrankheit oder den Diabetes mellitus darstellt (Kissebah

1996, S. 25). Weiter unterscheidet man braunes und weißes Fett. Braunes Fettgewebe findet

man vor allem beim Säugling, durch Oxidation der Fettsäuren kann Wärme gewonnen

werden. Weißes Fettgewebe hingegen erfüllt seine Funktion als Speicher-, Isolier- und

Baufett. Diese verschiedenen Aspekte zeigen, dass die Untersuchung weiterer

Spenderregionen noch viele neue Erkenntnisse über mesenchymale Stammzellen aus

Fettgewebe bringen wird.

Informationen zu den Primern

Seite | 109

8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens..........................................12

Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle ...................................................................16

Abbildung 3: β-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat.....................................................18

Abbildung 4: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat ...........................18

Abbildung 5: HEPES ..........................................................................................................19

Abbildung 6: Calciumchloriddihydrat................................................................................19

Abbildung 7: Cholecalciferol .............................................................................................20

Abbildung 8: Dexamethason–Cyclodextrin-Komplex ........................................................20

Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings ..........................22

Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 ...............................................23

Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung .............................................................................32

Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung ........................................................33

Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer ..............................34

Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer

Zählkammer ................................................................................................35

Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay ........................................................40

Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung ..............................................44

Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt

(b) gelartiges Pellet enthält RNA ..................................................................47

Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) ........48

Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) .............................55

Abbildung 20: Schema zum Pipettieren der AP-Aktivität Standardkurve ............................57

Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität.........................................58

Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung ............................................59

Abbildung 23: osteogen differenzierte Fettstammzelle in AP-Färbung dargestellt

(Vergrößerung: 20 X) ...................................................................................61

Abbildung 24: osteogen differenzierte Fettstammzelle in van Kossa Färbung dargestellt

(Vergrößerung: 10 X) ...................................................................................63

Abbildung 25: Beispiel einer Standardkurve für Alizarin Rot ...............................................65

Abbildung 26: Spektraluntersuchung der Alizarin Rot Färbelösung.....................................66


Seite | 110

Abbildung 27: Alcianblau Kernechtrot (Vergrößerung: 10 X) ..............................................68

Abbildung 28: Ölrot O Färbung ...........................................................................................69

Abbildung 29: Bestimmung der Zellviabilität mittels alamarBlue® ......................................71

Abbildung 30: Bestimmung der Zelladhärenz mittels SRB-Färbung .....................................72

Abbildung 31: Kontrollgruppe und chondrogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach

Alzian Blau Kernechtrot Färbung .................................................................73

Abbildung 32: Kontrollgruppe und adipogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Ölrot

O Färbung ....................................................................................................74

Abbildung 33: Bestimmung der Oberflächenrezeptoren auf Ad-MSCs und Osteoblasten ...75

Abbildung 34: Zugabe verschiedener Supplemente und Ermittlung der AP-Aktivität ..........77

Abbildung 35: AP-Aktivität bei verschiedenen FCS-Konzentrationen ..................................78

Abbildung 36: Zellviabilitätsmessung mittels alamarBlue® .................................................78

Abbildung 37: Matrixmineralisierung bei verschiedenen FCS-Konzentrationen ..................79

Abbildung 38: exemplarische Darstellung des Viabilitätsverlaufes eines Spenders .............80

Abbildung 39: Viabilitätsbestimmung mittels alamarBlue® nach 24 h Inkubation mit

Dexamethason ............................................................................................81

Abbildung 40: AP-Aktivitätsbestimmung nach Stimulation mit Vitamin D3 und

Dexamethason ............................................................................................83

Abbildung 41: osteogen differenzierte Ad-MSC in AP-Färbung dargestellt

(Vergrößerung: 20 X) ...................................................................................84

Abbildung 42: Bestimmung der mineralisierten Matrix nach 8- und 15tägiger osteogener

Stimulation ..................................................................................................85

Abbildung 43: Bestimmung der gebildeten mineralisierten Matrix nach 12 Tagen

osteogener Stimulation ...............................................................................86

Abbildung 44: AP-Aktivtätsmessung nach 8tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7 .

....................................................................................................................88

Abbildung 45: Quantifizierung der gebildeten Matrix nach 12 tägiger Stimulation mit BMP 2

und/oder BMP 7 ..........................................................................................89

Abbildung 46: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 2 Konzentrationen .............90

Abbildung 47: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 7 Konzentrationen .............90

Abbildung 48: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP2 und BMP 7 Konzentrationen

....................................................................................................................91


Seite | 111

Abbildung 49: Nachweis osteoblastentypischer Gene in den differenzierten Ad-MSCs im

Vergleich zu humanen Osteoblasten (invers dargestellt)............................93

Abbildung 50: Densitometrische Auswertung aller untersuchten Gene ..............................94

9 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Materialien ..............................................25

Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Geräte ......................................................26

Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung ..................................................................33

Tabelle 4: Mediensupplemente ...................................................................................38

Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen .............................................................41

Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve .

....................................................................................................................42

Tabelle 7: PCR-Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß .....................................50

Tabelle 8: Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler ..................................50

Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer ..............................................53

Tabelle 10: Arbeitsschritte der AP-Färbung ....................................................................61

Tabelle 11: Arbeitsschritte der van Kossa Färbung .........................................................63

Tabelle 12: Schema zum Pipettieren der Alizarin Rot Standardkurve .............................64

Tabelle 13: Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung ......................................................66

Tabelle 14: Arbeitsschritte der Alcianblau Kernechtrot Färbung ....................................67

Tabelle 15: Arbeitsschritte der Ölrot O Färbung .............................................................69

Tabelle 16: Auflistung der im Versuch verwendeten Medienzusammensetzungen ........76

Tabelle 17: Vitamin D3- und Dexamethasonzugabe zum Basisdifferenzierungsmedium .82

Tabelle 18: Verschiedene Konstellationen der Zugabe von BMP 2 und BMP 7 zum zuvor

ermittelten Basisdifferenzierungsmedium ...................................................87


Seite | 112

10 Informationen zu den Primern

10.1 Alk 1

>NM_001077401.1 Homo sapiens activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1), transcript variant 2, mRNA

product length = 256 Forward primer 1 GCTCAGACACGACAACATCC 20 Template 896 .................... 915 Reverse primer 1 ATTGCGGCTCTTGAAGTCG 19 Template 1151 ................... 1133

>NM_000020.2 Homo sapiens activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1), transcript variant 1, mRNA

product length = 256 Forward primer 1 GCTCAGACACGACAACATCC 20 Template 1033 .................... 1052 Reverse primer 1 ATTGCGGCTCTTGAAGTCG 19 Template 1288 ................... 1270

10.2 Alk 2

>NM_001616.3 Homo sapiens activin A receptor, type IIA (ACVR2A), mRNA

product length = 253 Forward primer 1 CTTGCATTGCTGACTTTGG 19 Template 1159 ................... 1177 Reverse primer 1 CCAATTTCCTCCTCAAATGG 20 Template 1411 .................... 1392

10.3 Alk 3

>NM_004329.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IA (BMPR1A), mRNA

product length = 179 Forward primer 1 CACTGCCCCCTGTTGTCATAG 21 Template 958 ..................... 978 Reverse primer 1 ATCCTGTTCCAAATCACGATTGT 23 Template 1136 ....................... 1114

10.4 Alk 5

>NM_001130916.1 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor 1 (TGFBR1), transcript variant 2, mRNA







Seite | 113

product length = 287 Forward primer 1 TGTTGGTACCCAAGGAAAGC 20 Template 805 .................... 824 Reverse primer 1 AACATCGTCGAGCAATTTCC 20 Template 1091 .................... 1072

>NM_004612.2 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor 1 (TGFBR1), transcript variant 1, mRNA

product length = 287 Forward primer 1 TGTTGGTACCCAAGGAAAGC 20 Template 1036 .................... 1055 Reverse primer 1 AACATCGTCGAGCAATTTCC 20 Template 1322 .................... 1303

10.5 Alk 6

>NM_001256794.1 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B), transcript variant 4, mRNA

product length = 130 Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 158 ...................... 179 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 287 ....................... 265






product length = 130






Seite | 114

Forward primer 1 CTTTTGCGAAGTGCAGGAAAAT 22 Template 278 ...................... 299 Reverse primer 1 TGTTGACTGAGTCTTCTGGACAA 23 Template 407 ....................... 385

10.6 TGF-ß-RII

>NM_003242.5 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) (TGFBR2), transcript variant 2, mRNA

product length = 258 Forward primer 1 ATGCTGCTTCTCCAAAGTGC 20 Template 726 .................... 745 Reverse primer 1 AGGTTGAACTCACGTTCTGC 20 Template 983 ............GC...... 964

>NM_001024847.2 Homo sapiens transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) (TGFBR2), transcript variant 1, mRNA

product length = 258 Forward primer 1 ATGCTGCTTCTCCAAAGTGC 20 Template 801 .................... 820 Reverse primer 1 AGGTTGAACTCACGTTCTGC 20 Template 1058 ............GC...... 1039

10.7 BMPRII

>NM_001204.6 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) (BMPR2), mRNA

product length = 154 Forward primer 1 CCACCTCCTGACACAACACC 20 Template 1542 .................... 1561 Reverse primer 1 GACCTTGTTTACGGTCTCCTG 21 Template 1695 ..................... 1675

10.8 IGF1R

>NM_000875.3 Homo sapiens insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R), mRNA

product length = 241 Forward primer 1 TCGACATCCGCAACGACTATC 21 Template 160 ..................... 180 Reverse primer 1 AGGGCGTAGTTGTAGAAGAGTTT 23 Template 400 ....................... 378





Seite | 115

10.9 IGF2R

>NM_000876.2 Homo sapiens insulin-like growth factor 2 receptor (IGF2R), mRNA

product length = 146 Forward primer 1 GTGGAAGTGTGGATATTGTCCAG 23 Template 354 ....................... 376 Reverse primer 1 ACAGCTCACTGTTGTGTTGAA 21 Template 499 ..................... 479

10.10 RetinoidXR ß

>NM_021976.3 Homo sapiens retinoid X receptor, beta (RXRB), mRNA

product length = 236 Forward primer 1 TGGGCTCTCCCTTTCCAGT 19 Template 565 ................... 583 Reverse primer 1 GATTGCACATAGCCGTTTGCC 21 Template 800 ..................... 780

10.11 GAPDH

>NM_001256799.1 Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), transcript variant 2, mRNA

product length = 420 Forward primer 1 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 20 Template 918 .................... 937 Reverse primer 1 AGGGGTCTACATGGCAACTG 20 Template 1337 .................... 1318

>NM_002046.4 Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), transcript variant 1, mRNA

product length = 420 Forward primer 1 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 20 Template 894 .................... 913 Reverse primer 1 AGGGGTCTACATGGCAACTG 20 Template 1313 .................... 1294

10.12 BMP 4

>NM_130851.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein 4 (BMP4), transcript variant 3, mRNA

product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 570 ..................... 590





Seite | 116

Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 699 ...................... 678


product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 516 ..................... 536 Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 645 ...................... 624


product length = 130 Forward primer 1 TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG 21 Template 725 ..................... 745 Reverse primer 1 GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA 22 Template 854 ...................... 833

10.13 BSP 2

>NM_004967.3 Homo sapiens integrin-binding sialoprotein (IBSP), mRNA

product length = 202 Forward primer 1 TGACTCATCCGAAGAAAATGGAG 23 Template 290 ....................... 312 Reverse primer 1 CTGGATTGCAGCTAACCCTGT 21 Template 491 ..................... 471

10.14 MGP

>NM_001190839.1 Homo sapiens matrix Gla protein (MGP), transcript variant 1, mRNA

product length = 102 Forward primer 1 AGATGGAGAGCTAAAGTCCAAGA 23 Template 348 ....................... 370 Reverse primer 1 GTAGCGTTCGCAAAGTCTGTA 21 Template 449 ..................... 429

>NM_000900.3 Homo sapiens matrix Gla protein (MGP), transcript variant 2, mRNA

product length = 102 Forward primer 1 AGATGGAGAGCTAAAGTCCAAGA 23 Template 273 ....................... 295 Reverse primer 1 GTAGCGTTCGCAAAGTCTGTA 21 Template 374 ..................... 354





Seite | 117

10.15 OSF 2

>NM_006475.2 Homo sapiens periostin, osteoblast specific factor (POSTN), transcript variant 1, mRNA

product length = 140 Forward primer 1 TAAGTTTGTTCGTGGTAGCACC 22 Template 2077 ...................... 2098 Reverse primer 1 GTGTGGGTCCTTCAGTTTTGATA 23 Template 2216 ....................... 2194

10.16 Alkalische Phosphatase

>NM_000478.4 Homo sapiens alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (ALPL), transcript variant 1, mRNA

product length = 476 Forward primer 1 ACGTGGCTAAGAATGTCATC 20 Template 403 .................... 422 Reverse primer 1 CTGGTAGGCGATGTCCTTA 19 Template 878 ................... 860





10.17 Osteoprotegerin

>NM_002546.3 Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (TNFRSF11B), mRNA

product length = 313 Forward primer 1 CCGGAAACAGTGAATCAACTC 21 Template 880 ..................... 900







Seite | 118

Reverse primer 1 AGGTTAGCATGTCCAATGTG 20 Template 1192 .................... 1173

10.18 BMP 2

>NM_001200.2 Homo sapiens bone morphogenetic protein 2 (BMP2), mRNA

product length = 150 Forward primer 1 CCCCCTACATGCTAGACCTGT 21 Template 1012 ..................... 1032 Reverse primer 1 CACTCGTTTCTGGTAGTTCTTCC 23 Template 1161 ....................... 1139

10.19 Osteopontin

>NM_001251830.1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 5, mRNA

product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 657 ..................... 677 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22 Template 913 ...................... 892






product length = 257 Forward primer 1 CTCCATTGACTCGAACGACTC 21 Template 468 ..................... 488 Reverse primer 1 CGTCTGTAGCATCAGGGTACTG 22







Seite | 119

Template 724 ...................... 703 >NM_000582.2 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 2, mRNA


10.20 Osteocalcin

>NM_199173.4 Homo sapiens bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein (BGLAP), mRNA

product length = 138 Forward primer 1 CACTCCTCGCCCTATTGGC 19 Template 86 ................... 104 Reverse primer 1 GCCTGGGTCTCTTCACTACCT 21 Template 223 ..................... 203

10.21 Vitamin D

>NM_001017536.1 Homo sapiens vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor (VDR), transcript variant 3, mRNA

product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 807 ..................... 827 Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 964 ................... 946


product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 538 ..................... 558 Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 695 ................... 677


product length = 158 Forward primer 1 GACATCGGCATGATGAAGGAG 21 Template 416 ..................... 436







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Reverse primer 1 GCGTCCAGCAGTATGGCAA 19 Template 573 ................... 555

10.22 Osteoprotegerin

>NM_002546.3 Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (TNFRSF11B), mRNA

product length = 313 Forward primer 1 CCGGAAACAGTGAATCAACTC 21 Template 880 ..................... 900 Reverse primer 1 AGGTTAGCATGTCCAATGTG 20 Template 1192 .................... 1173

10.23 RANKL

>NM_033012.3 Homo sapiens tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 11 (TNFSF11), transcript variant 2, mRNA

product length = 245 Forward primer 1 TCCCAAGTTCTCATACCCTGA 21 Template 1056 ..................... 1076 Reverse primer 1 CATCCAGGAAATACATAACACTCC 24 Template 1300 ........................ 1277

>NM_003701.3 Homo sapiens tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 11 (TNFSF11), transcript variant 1, mRNA

product length = 245 Forward primer 1 TCCCAAGTTCTCATACCCTGA 21 Template 895 ..................... 915 Reverse primer 1 CATCCAGGAAATACATAACACTCC 24 Template 1139 ........................ 1116



Literaturverzeichnis

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Danksagung

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12 Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas K. Nüssler bedanken,

dass ich die Arbeit in der von ihm geleiteten Abteilung durchführen durfte. Mir wurden alle

benötigten Geräte, Materialen und Literatur zur Verfügung gestellt sowie stets eine

hochqualifizierte Unterstützung in der Planung und Durchführung entgegengebracht.

Ich möchte ebenfalls Frau Dr. sc. hum. Sabrina Ehnert für eine praktische und

wissenschaftliche Betreuung danken, die weit über das normale Maß hinaus ging.

Weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. rer. nat. Steven Dooley für die Bereitstellung der

adenoviralen Reporterkonstrukte sowie der Arbeitsräume.

optimierung der osteogenen differenzierung mesenchymaler ... · technische universitÄt mÜnchen...

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