1

2

جمهوري اسالمي ايراندانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی- درمانی قزوین

هاي نوين علوم زيستي جهاد دانشگاهي- ابن سيناپژوهشگاه فن آوري

پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد علوم تشریح

های بنیادی حاصل از خونبررسی توان تمایزی سلول تمایزیها با استفاده از محیطقاعدگی به کراتینوسیت

سه بعدی

اساتید راهنما :دکتر رضا شیرازی

دکترسمیه کاظم نژاد

اساتید مشاور:دکتر امیرحسن زرنانیدکتر داوود مهربانی

نگارش:مریم فرد

93دی ماه

فهرست مطالب

3

فص444444444444444444ل اول: مع444444444444444444رفی )س444444444444444444ابقه وهدف(..........................................................................

....................15 ( بی?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ان1-1

مسئله.......................................................................................................................................................16

2-1) اهداف.........................................................................................

.......................................................................17 ( ه????????????????????????دف ک????????????????????????اربردی1-2-1

پروژه........................................................................................................................17

( ه?????????????????????????????????????دف اص?????????????????????????????????????لی2-2-1پروژه.....................................................................................

........................................17 ( اه?????????????????????????????????داف اختصاص?????????????????????????????????ی3-2-1

پروژه...................................................................................................................17

( س????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????واالت3-1پژوهش.......................................................................................

........................................................18 ( فرض???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????یات4-1

پژوهش..............................................................................................................................................18

-( بی????????ان متغیره????????ای تحقی????????ق و تعری????????ف عملی????????اتی آن5-119ها.......................................................................................

4

( جامع?????????????????????????????????????????ه م?????????????????????????????????????????ورد6-1مطالعه........................................................................................

...............................................207-1)

کلیات..............................................................................................................................................................21

ه???????????????????????????????????????ای( س???????????????????????????????????????لول1-7-1بنی?ادی....................................................................................

......................................212-7-1)

خودنوزایی.......................................................................................................................................21

ه?????????????ای( تحقیق?????????????ات در زمین?????????????ه س?????????????لول3-7-1بنی?ادی....................................................................................

...22 ه????????????????????????ای( ان????????????????????????واع س????????????????????????لول4-7-1

بنی?ادی.................................................................................................................23

( براس?????????????????????????????اس ت?????????????????????????????وان1-4-7-1تمایزی...........................................................................

....................23 ( براس?????????????????????????????????????????????????????????????????اس2-4-7-1

منشا.............................................................................................................24

ه????????ای( من????????ابع گون????????اگون س????????لول1-2-4-7-124بنیادی.................................................

5

8-1) پوست.........................................................................................

...................................................................29-( کراتینوس??????????????????????????????????????????????????????????????????????????یت1-8-1

ها..............................................................................................................................32

( مارکره????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ای2-8-1تمایزی...................................................................................

.....................................34 ( س??????????????????????????????????????????????????????????????یتوکراتین1-2-8-1

14..................................................................................

....................342-2-8-1)

اینولوکرین...............................................................................................................35

3-2-8-1) p63.....................................................................................................

....................35

( خ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ون9-1قاعدگی.......................................................................................

.......................................................36 ( س?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????اختمان1-9-1

اندومتر.......................................................................................................................36

6

ه???????ای اس???????تروماله???????ای کلوژنی???????ک س???????لول( وی???????ژگی2-9-138اندومتر.............................................................

دهن??????ده کل??????ونی دره??????ای تش??????کیل( فن??????وتیپ س??????لول3-9-139اندومتر...........................................................

دهن????ده کل????ونی دره????ای تش????کیل( فع????الیت بنی????ادی س????لول4-9-140اندومتر.............................................

س????????????????????????????????از( مارکره????????????????????????????????ای پیش5-9-1اندومتر...................................................................................

..................416-9-1)

ماتریکس.....................................................................................................................................41

ه???????????????ای بنی????????????????ادی خ???????????????ون( س????????????????لول7-9-1قاعدگی..................................................................................

..........42-( هم10-1

کشتی.................................................................................................................................................44

ه?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ای( روش11-1کشت..........................................................................................

............................................44-فص444444444444444444444444444444ل دوم: م444444444444444444444444444444واد و روش

ه44ا.......................................................................................................46

7

( وس???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ایل و1-2تجهیزات......................................................................................

...............................................47 ه??????????ای بنی??????????ادی خ??????????ون( روش جداس??????????ازی س??????????لول2-2

47قاعدگی............................................................................... ه??????????????????????ای( روش جداس??????????????????????ازی س??????????????????????لول3-2

کراتینوسیت...............................................................................................49

ه??ا ب??ا اس??تفاده از میکروس??کوپ( بررس??ی رون??د رش??د و تکث??یر س??لول4-251اینورت..........................................

( روش5-2انجماد.........................................................................................

........................................................52 ه??????????????????????????ای( دفری??????????????????????????ز س??????????????????????????لول6-2

منجمد............................................................................................................................52

ه??????????????????????????ای( پاس??????????????????????????اژ س??????????????????????????لول7-2منجمد.........................................................................................

...................................53 ( ش???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????مارش8-2

سلولی............................................................................................................................................53

-( تع????????????یین درص????????????د زن????????????ده ب????????????ودن س????????????لول9-2ها...............................................................................................

................54

8

ه????ای بنی????ادی ب????ا روش( تع????یین مارکره????ای س????طحی س????لول10-255فلوسایتومتری..............................................

س??????????????????????????????????????????ازی( آم??????????????????????????????????????????اد11-2داربس??ت......................................................................................

...............................................58 ه???????ای بنی???????ادی خ???????ون قاع???????دگی ب???????ه( تم???????ایز س???????لول12-2

62کراتینوسیت..................................................................... های کنترل مثبت کراتینوس??یت به روش دستی از نمونهRNA( استخراج 13-2

-RNAه?????ای بنی?????ادی خ?????ون قاع?????دگی ب?????ا اس?????تفاده از و س?????لول

PLUS......................................................................................................63

RNAsyه??ای تمایزیافت??ه ب??ا اس??تفاده از س??لولRNA( اس??تخراج 14-2 mini

kit...................................65

اس????????????????????????????تخراجRNA( بررس????????????????????????????ی کیفیت 15-2شده...........................................................................................

...........66 ( الک????????????????????????????????????????????????????????????????????????????تروفورز ژل16-2

آگارز......................................................................................................................................68

اس????????????????????????????تخراجRNA از CDNA( تهی????????????????????????????ه 17-2شده...........................................................................................

......71 ه??????ای اختصاص??????یس??????ازی پرایم??????ر ژن( ط??????راحی و آم??????اد18-2

74تمایزی........................................................................ ه????ای اختصاص????ی ژنPCRس????ازی پرایم????ر ب????رای واکنش ( آم????اده19-2

75تمایزی....................................................

9

( انج??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ام واکنش20-2PCR....................................................................................................................

.................77

روی ژلPCR( الک?????????????????????????تروفورز محص?????????????????????????ول 21-2آگارز...........................................................................................

....79Real( انج????ام واکنش 22-2 Time-PCRه????ای م????ورد جهت بررس????ی زن

81نظر................................................-( آن????????????????????????????????????الیز آم????????????????????????????????????اری داده23-2

ها.......................................................................................................................................83

آم??????????????????????????????????????????یزی( رن??????????????????????????????????????????گ24-2ایمنوسیتوشیمی.............................................................................

..........................................84 فص44444444444444444444444444444444444444ل س44444444444444444444444444444444444444وم:نتایج...........................................................................

...............................................90 ه???????????ای بنی???????????ادی خ???????????ون( مورفول???????????وژی س???????????لول1-3

قاعدگی..............................................................................................91-( مورفول?????????????????????????????????وژی کراتینوس?????????????????????????????????یت2-3

ها..............................................................................................................................93

ه?????????ایه?????????ای اختصاص?????????ی س?????????لول( بی?????????ان ش?????????اخص3-3بنی???ادی........................................................................................

95.

10

ه???????????ای تم???????????ایزی ب???????????ر روی( بررس???????????ی س???????????لول4-3داربس??ت......................................................................................

..........97 ( نت????????????????????????????????????????ایج اس????????????????????????????????????????تخراج5-3

RNA...................................................................................................................

.................97

ه??ای تم??ایز دادهه??ای اختصاص??ی کراتینوس??یت در س??لول ژنmRNA( بی??ان 6-399شده.................................

روش ها در سلولهای اختصاصی کراتینوسیت( بیان ژن7-3 با تمایزیافته Realهای

Time-

PC

R.........................................................................................................................

................................................100

در طیp63 و 14های اینولوکرین، س??یتوکراتین ( بررسی تغییرات بیان ژن8-3 مراح?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????لتمایزی........................................................................................

................................................................................104 آم??یزی ایمنوسیتوش??یمی جهت تع??یین م??یزان بی??ان( نت??ایج حاص??ل از رن??گ9-3

ه?????????ایمارکره?????????ای اختصاص?????????ی کراتینوس?????????یتی در س?????????لولتمایزیافته.....................................................................................

...........................104-فص444444444444444444ل چه444444444444444444ارم: بحث و نتیج444444444444444444هگیری....................................................................

...........................107

11

( بحث و1-4نتایج...................................................................................

................................................................108-( نتیج??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ه2-4

گیری.....................................................................................................................................................116

3-4) پیشنهادات............................................................................

..........................................................................117 فص4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444ل پنجم:ضمائم..................................................................

...................................................118 فص44444444444444444444444444444444444444ل شش44444444444444444444444444444444444444م:منایع....................................................................

.................................................123

فهرست جداول

فصل اول: معرفی ) سابقه و هدف( : متغیره??????????????ای م??????????????ورد بررس??????????????ی در1-1ج??????????????دول

پزوهش..................................................................................................20

هافصل دوم: مواد و روش ( ج???????????دول زم???????????انی اس???????????تریل ک???????????ردن2-1ج???????????دول

داربس??ت................................................................................................61

12

مق????ادیر و غلظت م????واد م????ورد نی????از در واکنش س????نتز(???? 2-2ج????دول CDNA........................................................73

سنتز( برنامه زمانی 2-3جدول

cDNA...........................................................................................................73

PCR ( توالی پرايمرهاي م??ورد اس??تفاده ب??راي 2-4جدول Real-time ه??ایژن 75تمایزی..........................

( مقادیر و غلظت مواد م??ورد نی??از در واکنش زنج??یره ای پلیم??راز2-5جدول 78(.........................PCRاول )

( برنام???????ه زم???????انی واکنش زنج???????یره ای پلیم???????راز )2-6ج???????دول PCR.........................................................................)79

Real ( غلظت و مقدار مواد مورد نی??از ب??رای 2-7جدول time PCR Master

Mix..........................82

Real( برنام????ه زم????انی تع????یین ش????ده جهت انج????ام 2-8ج????دول time

PCR......................................................83

فصل سوم: نتایج ه???ای اس???تخراجی کن???ترلز نمون???ه اس???تخراجی اRNA( غلظت 3-1ج???دول

98مثبت.............................................. ه?????ای اس?????تخراجیز نمون?????ه اس?????تخراجی اRNA( غلظت 3-2ج?????دول

99تمایزی.......................................................

فهرست اشکال

فصل اول: معرفی )سابقه و هدف(

13

ه?????????????ای( ت?????????????وان تم?????????????ایزی س?????????????لول1-1ش?????????????کلبنی??ادی.........................................................................................

..................23 ( س????????????????????????اختار پوس????????????????????????ت1-2ش????????????????????????کل

انسان............................................................................................................................30

( س????????????????اختار اپی????????????????درم پوس????????????????ت1-3ش????????????????کل انسان.........................................................................................

......................31 ه??????????ای پوس??????????ت( نم??????????ایی از کراتینوس??????????یت1-4ش??????????کل

انسان.........................................................................................32

( تغی????????یرات س????????طح هورم????????ون در ط????????ول دوره1-5ش????????کل 37قاعدگی.............................................................................

گ???????ذاری- س???????یکل قاع???????دگی س???????یکل تخم???????ک(1-6ش???????کل 38رحم....................................................................................

ه?ای اس??ترومال و اپیتلی??ال ب?افتهای کوچک و بزرگ س??لول( کلونی1-? 7شکل 39اندومتر...............................

هافصل دوم: مواد و روش ( اج????????????????زای تش????????????????کیل دهن????????????????ده2-1ش????????????????کل

Epilife..........................................................................................................50

( مراح???????ل جداس???????ازی اپی???????درم از درم و اس???????تخراج2-2ش???????کل 51سلول.........................................................................

( الم هموس????????????????یتومتر جهت ش????????????????مارش2-3ش????????????????کل سلولی........................................................................................

...54

14

( رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین از پرده2-4شکل 58آمنیوتیک....................................................................

مرحل??ه– از پیل??ه ابریش??م بوم??بیکس م??وری فی??بروئین( اس??تخراج2-5شکل 59زدایی................................صمغ

مراحل ح??ل– از پیله ابریشم بومبیکس موری فیبروئین( استخراج 2-6شکل -زداییک??????????????????ردن فیبره??????????????????ای ص??????????????????مغ

شده...........................................................................................................................................................60

( تصویر میکروس??کوپ الک??ترونی روبش??ی از مورفول??وژی ن??انوفیبر2-7شکل تهی????????????????ه ش????????????????ده از فی????????????????بروئین ب????????????????ه روشالکتروریسندگی.............................................................................

...............................................................................61 ه???????ا در حض???????ورکش???????تی س???????لول( نم???????ایی از هم2-8ش???????کل

62ترانسول............................................................................. ( دس????????????????????????????????????????تگاه2-9ش????????????????????????????????????????کل

پیکودراپ................................................................................................................................67

ه??ای اس??تخراج ش??ده از س??لولRNA( نم??ودار م??یزان غلظت 2-10ش??کل کراتینوس???????????????یت ب???????????????ا اس???????????????تفاده از دس???????????????تگاهپیکودراپ.....................................................................................

..................................................................................68 اس????تخراج ش????ده ب????ر روی ژلRNA( عکس از محص????ول 2-11ش????کل

69آگارز......................................................... ( دس????????????????????تگاه ترموس????????????????????ایکلر2-12ش????????????????????کل

PCR.............................................................................................................74

15

روی ژلPCR( عکس نمون????????????ه از محص????????????ول 2-13ش????????????کل 81آگارز...........................................................................

Real( دس????????تگاه ترموس????????ایکلر مرب????????وط ی????????ه 2-14ش????????کل

Time................................................................................83

آمیزی مارکر اینولوکرین در بافت کنترل( رنگ2-15شکل 88مثبت................................................................

در سلول کنترل14آمیزی مارکر سیتوکراتین ( رنگ2-16شکل 89مثبت.....................................................

فصل سوم: نتایج و8،??? 4 در پاس???اژهای ص??فر، MenSCs( بررس???ی مورفول???وژی 3-1ش???کل

12..................................................92 و2،?? 1های کراتینوس??یت در پاس??اژهای ص??فر، ( مورفولوژی سلول3-2شکل

3........................................... 94 ه?????ای کراتینوس?????یت ج?????دا ش?????ده از نمون?????ه( س?????لول3-3ش?????کل

95ختنه.......................................................................... ه??????ای بنی??????ادی خ??????ون( نت??????ایج فلورس??????نت س??????لول3-4ش??????کل

96قاعدگی........................................................................... تم??ایزغیره??ای بنی??ادی اس??تخراج ش??ده از س??لولRNA( الکتروفورز 3-5شکل

-یافت???????????????ه خ???????????????ون قاع???????????????دگی و کراتینوس???????????????یتها...............................................................................................

...............................................................98 ه????ای بنی????ادی اس????تخراج ش????ده از س????لولRNAالک????تروفورز (3-6ش????کل

99یافته..................................................تمایز های اختصاصی به منظور تعیین گرادیانت دم??ایی مناس??ب( بیان ژن3-7شکل

ب?????????????????????????????ه عن?????????????????????????????وان کن?????????????????????????????ترل

16

مثبت...........................................................................................................................................................................100

Metl( نم??ودار 3-8ش??کل Curveه??ای جهت ژن اینول??وکرین در س??لولMenS

101تمایزداده شده.........Metl( نمودار 3-9شکل Curve جهت ژن p63ه?ای در س??لولMenSتم??ایزداده

102شده....................Metl( نم??ودار 3-10ش??کل Curve ه??ای در س??لول14 جهت ژن س??یتوکراتین

MenSتم?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ایزداده شده...........................................................................................

..................................................................................103Metl( نمودار 3-11شکل Curve و 14 جهت ژن سیتوکراتین p63به ص??ورت

تم??????????????ایزدادهMenSه??????????????ای مش??????????????ترک در س??????????????لولشده...........................................................................................

................................................103 ه??ای در س??لولp63ه??ای اینول??وکرین و ( نم??ودار م??یزان بی??ان ژن3-12ش??کل

104تمایزیافته............................. ( نمای ایمنوسیتوشیمی نشان دهنده میزان بیان مارکر3-13شکل

105اینولوکرین...................................... ( نم????ای ایمنوسیتوش????یمی نش????ان دهن????ده م????یزان بی????ان3-14ش????کل

106..............................14مارکرسیتوکراتین

17

چکیده:سابقه و هدف :

ه??ای بنی??ادی را از خ??ون قاع??دگی انس??اناخیرا محققین یک منبع غنی از سلول Menstural Blood Stemهای بنیادی خون قاعدگی )اند که سلولمعرفی کرده

Cells:MenSCsب??ه دلی??ل دسترس??ی آس??ان، س??هولت و ع??دم( نامی??ده ش??ده و گیری مورد توجه قرار گرفته است. اگرچ??ه م??دارکتهاجمی بودن روش نمونه

ه?ای بنی??ادی خ?ون قاع??دگی در درم??انمختلفی دال بر اس??تفاده ب??الینی س??لول های مختل??ف وج??ود دارد، لیکن اطالع??ات ک??املی در م??ورد پتانس??یل اینبیماری

ه??ای بنی??ادیلهای بنیادی به خص??وص در مقایس??ه ب??ا س??ایر س??لودسته از سلول موج??ود نیس??ت. ه??دف از این مطالع??ه بررس??ی ق??درت تکث??یر، خصوص??یات

ه??ایه??ا ب??ه س??مت س??لولایمونوفنوتی??پیکی و پتانس??یل تم??ایزی این س??لولباشد. میکراتینوسیتی

روش بررسی : ی س??نی زن سالم ب??ا مح??دوده5 میلی لیتر( از 2-5های خون قاعدگی ) نمونه

ه??ای بنی??ادی خ??ونآوری ش??د. کش??ت و جداس??ازی س??لول س??ال جم??ع22-?? 30-ی روش فایکول انجام ش??د. همهای جمع آوری شده بوسیلهقاعدگی از نمونه

20ه??ای ب??افت ختن??ه ن??وزادان های کراتینوسیت از نمونهچنین جداسازی سلول ه?ای ش?بهها ب??ه س?مت س??لولروزه انجام گرفت و در ادامه پتانسیل تمایزی آن

روز م??ورد14کراتینوسیتی با استفاده از یک پروتکل تمایزی ب??ه م??دت زم??ان

18

Realه?ای ارزیابی قرار گرفت و نت??ایج حاص??ل از طری??ق آزم??ون Time-PCR و هایایمونوسیتوشیمی سنجیده شد. نتایج به دست آمده نشان داد که در سلول

و اینول?وکرینp63،? 14س??یتوکراتین تمایزیافته مارکرهای کراتینوسیتی نظ??یر و پروتئین به صورت موفقیت آمیزی بیان شده است.mRNAدر سطح

ها :یافته ه??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی پس از تم??ایز تغی??یرات ب??ارزی از نظ??رس??لول

چنان مورفول??ويی اص??لی خ??ود را حف??ظمورفولوژی از خود نشان ندادند و هم نمودند. عالوه بر این، مارکرهای مد نظر در س??طح ژن، تغی??یرات چش??مگیری

های تمایزیافته از خود نشان دادند.از نظر بیان ژنی در سلولگیری :بحث و نتیجه

های بنیادی خون قاعدگی جمعیت منحصر ب??ه ف??رد ب??ا توان??ایی تکث??یر ب??االسلول باشند. ل??ذا ب??ههای کراتینوسیتی را دارا میبوده و توانایی تمایز به سمت سلول

ه?ا منب??ع مناس??بی جهت بررس??ی در ح??وزه س??لولرس??د ک??ه این س??لولنظر می های پوستی باشند. این مطالعه اولین گزارش است ک??ه ق??درتدرمانی بیماری

ه??ایهای بنیادی مشتق از خ??ون قاع??دگی انس??ان ب??ه س??مت س??لولتمایز سلول کند. بر اساس نتایج حاصله، یک پروتکل تمایزی ب??دونکراتینوسیتی را بیان می گردد.این ارائه می MenSCsهای کراتینوسیتی مشتق از سرم جهت ایجاد سلول

ه??ای م??زمن پوس??تی ب??ا اس??تفاده ازنتایج گامی اساسی به سوی درمان بیماریباشد.های بنیادی میسلول

،ه??ای کراتینوس??یته??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی، س??لولکلم??ات کلی??دی : س??لول، داربستپوست، تمایز

19

Abreviation List:

MNCs: mononuclear cells

DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium

FBS: fetal bovine serum

PBS: phosphate buffered saline

BSA: bovine serum albumin

SCs: stem cells

GCs: germ cells

ESCs: Embryonic stem cells

ASCs: Adult stem cells

FSCs: fetal stem cells

MSCs: Mesenchymal Stem Cells

HSCs: Hematopoietic Stem Cells

ICM: inner cell mass

BMSCs: Bone Marrow Stem Cells

MenSCs: Menstrual Blood Stem Cells

µ: micro

Bp: base pair

cDNA : complementary DNA

DMSO: Dimethyl sulfoxide

EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

FITC: fluorescein isothiocyanate

20

g : grams

h : hours

ICC: Immunocytochemistry

L: litre

m: milli

M: molar

Mg: milligram

Min: minute

RPM: Rotations per Minute

RT- PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

HKCs: Human Keratinocyte Cells

ADSCs: Adipose Tissue-Derived Steromal Cells

UCE: Umbilical Cord Epithelium

UCB: Umbilical Cord Blood

TBS: Tris-buffered Salin

PCR: Polymerase Chain Reaction

GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

IgG: Immunoglobulin G

Tm: Melting tempreture

21

فصل اول:عرفیم

)سابقه و هدف(

( بیان مسئله1-1

22

های بنیادی به کراتینوسیت نشان دهندهمطالعات گذشته در زمینه تبدیل سلول های بنیادی به کراتینوس??یتهایی در زمینه تمایز سلولاین است که موفقیت ه??ای بنی??ادی جنی??نی ب??هها بیشتر در زمینه تبدیل س??لولوجود دارد و این موفقیت

- و در زمین??ه تم??ایز س??لول[3-1]های پوستی مانند کراتینوسیت بوده استرده ها مطالعات اندکی صورت گرفته است. لذا در اینهای بنیادی بالغ به این رده

های بنیادی مزانش??یمی حاص??ل ازمطالعه سعی خواهد شد توان تمایزی سلول کشت داده شده بر روی داربست بعد از قرارگ??یری(MenSCsخون قاعدگی )

در محیط تمایزی غیرتماسی با کراتینوسیت بررسی گردد.

( اهداف2-1( هدف کاربردی پروژه1-2-1

اينهاي بنيادي مزانشيمي از خون قاعدگي هدف كاربردي از جداسازي سلول هاي بني??ادي اس??ت ك??ه عالوه ب??ريك منبع غني از سلول خون قاعدگي است كه

گ??يري، توان??اييفراواني، دسترسي آسان و ع??دم ته??اجمي ب??ودن روش نمون??ه

23

آلي جهت ك??اهش مش??كالت ناس??ازگارياي دارند و منبع ايدهتكثير فوق العاده هاي مرب??وطباشند. بنابراين، با توجه به محدوديتايمونولوژيكي پس از پيوند مي

رس??د خ??ون قاع??دگي منب??ع مناس??بيهاي بنيادي، به نظر ميبه منابع ديگر سلول باشد. موفقيت در تمايز اين دسته ازجهت سلول درماني و مهندسي بافت مي

-هاي پوستي بيهاي بنيادي به سلولهاي پوستي، گام مهمي در توليد سلولسلول ه??ا و س??اير ض??ايعات ودرم??اني مختص ه??ر ف??رد در درم??ان زخمخطر و س??لول

باشد. هاي پوستي ميبيماري

( هدف اصلی پروژه2-2-1 هاي بنيادي حاصل از خ??ون قاع??دگي ب??ههدف اصلي پروژه حاضر، تمايز سلول

باشد.هاي اپيتليال پوست با استفاده از محيط تمايزي سه بعدي ميسلول

( اهداف اختصاصی پروژه3-2-1 ه??اي بني??ادي مزانش??يمي از خ??ون قاع??دگي و تع??يينجداسازي و كش??ت س??لول

هاهويت آن هاي بنيادي مزانشيمي حاص??ل از خ??ون قاع??دگيالقاي تمايز اپيتليالي در سلول

در محیط سه بعدی هاي مخصوص سلول هاي اپيتليالي پوست بررسي بيان ماركرها و ژن

( سواالت پژوهش3-1 هايي كه با پروتكل به كار برده شده در اين پ??روژه از خ??ون قاع??دگيآیا سلول

ب??وده و Multipotentه??اي بني???ادي مزانش??يمي ش??وند، س???لولاس??تخراج مي-ه?ا را نش?ان ميمورفولوژي، الگوي بيان ژن و ماركره?اي س?طحي اين س?لول

دهند؟ ه??ا درهاي بنيادي مزانش??يمي خ??ون قاع??دگی ب??ا کراتینوس??یتکشتی سلولآیا هم

های اپیتلیال پوست موثر است؟تمایز به سلول

24

کش??ت داده ش??ده ب??ر رویهاي بني??ادي مزانش??يمي خ??ون قاع??دگیآی??ا س??لول ه??اکشتی با کراتینوسیتتلیال پس از همهای اپی توان تمایز به سلولداربست

؟دهندها را نشان میو مارکرهای سطحی و الگوی بیان ژن این سلولدارند

( فرضیات پژوهش4-1 هايي كه با پروتك??ل ب?ه ك?ار ب?رده ش?ده در اين پ?روژه از خ?ون قاع?دگيسلول

ب??وده و Multipotentه??اي بني??ادي مزانش??يمي ش??وند، س??لولاس??تخراج مي-ه?ا را نش?ان ميمورفولوژي، الگوي بيان ژن و ماركره?اي س?طحي اين س?لول

دهند. ها در تم??ایزهاي بنيادي مزانشيمي خون قاعدگی با کراتینوسیتکشتی سلول هم

های اپیتلیال پوست موثر است.به سلول کشت داده شده بر روی داربس??ت،هاي بنيادي مزانشيمي خون قاعدگیسلول

ه??ا را دارا ب??ودهکشتی با کراتینوسیتهای اپیتلیال پس از همتوان تمایز به سلول.دهندها را نشان میو مارکرهای سطحی و الگوی بیان ژن این سلول

ها( بیان متغیرهای تحقیق و تعریف عملیاتی آن5-1گاه انسان: های بنیادی کراتینوسیت از پوست ختنهسلول

گ??اه انس??ان جداس??ازیها به روش استاندارد از پوس??ت ختن??هچنانچه این سلول شده و در ظروف مخصوص کشت داده شوند قادر به چسبیدن به کف ظرف

س??اعت ب??ا میکروس??کوپ قاب??ل18-24بوده و این چسبندگی پس از گذش??ت مشاهده خواهد بود.

های بنیادی خون قاعدگی از خون قاعدگی: سلول ها به روش استاندارد از خون قاعدگی تازه انسان جداسازیچنانچه این سلول

شده و در ظرف مخصوص کشت داده شوند قادر به چسبیدن به ک??ف ظ??رف

25

ب????وده و پس از گذش????ت چن????د روز این چس????بندگی از طری????ق مش????اهدهمیکروسکوپی قابل رویت خواهد بود.

های کراتینوسیتی: مورفولوژی کلونی ه??ا ظ??اهره??ای کراتینوس??یتی ظ??اهری سنگفرش??ی داش??ته و س??لولکل??ونی

باشند.ای بزرگ میسیتوپالسمی مضرسی و دارای هستههای خون قاعدگی:های سلولمورفولوژی کلونی

ها دارای مورفولوژی کش??یده وها ظاهری سنگفرشی داشته و سلول این کلونیباشند.هسته کوچک می

متغیرهای مورد بررسی در این پژوهش در جدول زیر نشان داده شده است:

ردی???ف

نقشنوع متغیرنام متغیرمتغیر

-نحوه و واحد ان??دازهگیری

ه?ای بنی??ادی خ?ونس?لول1قاعدگی

کیفیاسمی

-مستقل

کیفیهای کراتینوسیتسلول2اسمی

-مستقل

ه???ایتم???ایز ب???ه س???لول3اپیتلیالی

کیفیایرتبه

-وابسته

کیفیIVLبیان پروتئین 4اسمی

ایمنوسیتوشیمیوابسته

کیفیK14بیان پروتئین 5اسمی

ایمنوسیتوشیمیوابسته

ایمنوسیتوشیمیوابسته کیفیp63بیان پروتئین 6

26

اسمی کمیIVLبیان ژن 7

پیوستهReal Time-PCRوابسته

کمیK14بیان ژن 8پیوسته

Real Time-PCRوابسته

:متغیرهای مورد بررسی در پژوهش1-1جدول

( جامعه مورد مطالعه6-1 های بنیادی حاصل از خونجامعه مورد مطالعه در این تحقیق عبارتند از سلول

ه??ایه??ا ب??ا س??لول( و نت??ایج حاص??ل از تم??ایز این س??لولMenSCsقاع??دگی )(Human Keratinocyte Stem Cells:HKSCsکراتینوسیتی انسانی )

( کلیات7-1های بنیادی( سلول1-7-1

Stemهای بنیادی )سلول Cellsها در هر ارگان و ب??افتی در ب??دن می(، پایه سلول- هایی با تخصص ویژه که با تقسیم میتوز وظیفه تشکیل و س??اختسلول. باشند (Fertilizationه??ا را از ابت??دا ب??ر عه??ده داش??ته و بالفاص??له پس از لق??اح )ب??افت

کنند. در طول دوران زندگی، تم??امی عملکرده??ا نظ??یرعملکرد خود را آغاز می ه??ای پوس??ت،هایی نظ??یر س??لولچنین سلولهای آسیب دیده و همجایگزینی بافت

روند،مو، خون و دستگاه گوارش که هر روز به دلیل عوامل مختلف از بین می.[4]باشدها میبر عهده این سلول

27

شود که توانایی خودنوزایی )هایی گفته میهای بنیادی به سلولدر تعریف، سلولself renewingهای سازنده ب??دن را دارا میهای متنوع از سلول( و تمایز به رده-

باش??ند. این دو خصیص??ه بس??یار مهم دانش??مندان را ب??ر آن داش??ته اس??ت ت??ا ه??ای مختل??فه??ا ب??ه س??لولنها جهت تم??ایز آتحقیقات وسیعی بر روی این سلول

های مخ??الفها جهت درمان بیماریانجام داده و آزمایشاتی از طریق این سلول.[5]به عمل آورند.

( خود نوزایی2-7-1دو مکانیسم وجود جمعیت یک سلول بنیادی عبارتند از:

( رونویسی بی تقارن الزامیObligatory Asymmetric Replication : ) یک سلول بنیادی به یک سلول پدر که شبیه سلول بنی??ادی اص??لی ب??وده و ی??ک

شود.یابد، تقسیم میسلول دختر که تمایز می ( تمایز اتفاقیStochastic Differentiation: )

ش??ود، و هنگامی که یک سلول بنیادی به دو سلول دخ??تر تمایزیافت??ه تب??دیل می ه?ایدیگری با فرآیند میتوز منجر به ایجاد دو سلول بنیادی با مشخصات س?لول

. [6]شود اصلی می

های بنیادی( تحقیقات در زمینه سلول3-7-1Ernestه??ای های بنیادی براس??اس یافت??هتحقیقات درباره رشد و تکثیر سلول A.

McCulloch و James E. Till در دانش??گاه تورنت??و آغ??از ش??د.1960 در س??ال Rudolf Ludwig Karl Virchowشناس??ی س??لولی و یکی از موس??س آس??یب

مخترعین اصول مدرن سلول درمانی اولین کسی بود که اصول بنیادینگی هر Julius Friedrich Cohnheimسلول از سلول دیگر را معرفی کرد. شاگرد او،

ها از مغز اس??تخوان خ??ارجهایی را که در ابتدای امر در جریان بهبود زخمسلول رسند، مورد بررس??ی ق??رار داد.شده و به وسیله جریان خون به محل زخم می

1950های بنیادی انسانی به منظور درم??ان ب??ه س??ال پیشینه استفاده از سلول در مرکزNobel Laureate E Donnall Thomasگردد. تیمی به سرپرستی بازمی

28

Fredمطالعات سرطان Hutchinsonهای تزریقی مغ??ز عنوان نمودند که سلول ه??ای جدی??دهای تخ??ریب ش??ده ش??وند و س??لولتوانند جایگزین سلولاستخوان می

ه??ای خودنوس??ازیخونی در بیماران ایجاد نمایند. اولین تعریف دقیق از فع??الیتErnestه??ای بنی??ادی مغ??ز اس??تخوان م??وش چن??د ده??ه پیش توس??ط س??لول A

McCulloch و James E Tillبه رش??ته تحری??ر درآورده ش??د. مطالع??ات انج??ام ،McCullochگرفته توس??ط Tillدهن??ده و همکارانش??ان ب??رای اولین ب??ار نش??ان ه??ای مش??تقهای طبیعی خونساز بود. آنها نشان دادند که س??لولگسترش کلونی

-توانند کل??ونیشوند( میهای خونساز نامیده میاز مغز استخوان )که اکنون سلول ،1976های متعددی از س??لولهای خ??ونی تم??ایز یافت??ه ایج??اد نماین??د. در س??ال

Friedensteinه??ای بنی??ادی چن??دتوان مزانش??یمی را از مغ??ز و همک??اران س??لول ها به منظور تکثیر در داخل ی??کآوری نموده و توانایی این سلولاستخوان جمع

inبافت مغز اس??تخوان در vivoه??ایاکن??ون تکنی??ک را کش??ف کردن??د. البت??ه هم ه??ای بنی??ادیهای بنی??ادی ب??الغ )ی??ا س??لولآوری و ازدیاد سلولبسیاری جهت جمع

رسد عملکرد فیزیولوژی ط??بیعیپیکری( از منابع متعدد وجود دارد. به نظر می.[9-7]های بنیادی یک عضو بالغ پایدار شده استدر سلول

های بنیادی( انواع سلول4-7-1 ( وDifferentiation powerهای بنیادی را می توان براساس توان تمایزی )سلول

:[10]بندی نمود( تقسیمOriginمنشا )

( براساس توان تمایزی1-4-7-1

29

های بنیادی( توان تمایزی سلول1-1شکل

ه??ای مختل??ف(توانایی یعنی بروز قدرت تمایزی بالقوه )توانایی تمایز به س??لول ه??ای بنی??ادی راپ??ذیری، س??لول براساس توان تمایزی و برگشتهای بنیادی.سلول

(،Pluripotent(، پرت??وان )Totipotentت??وان )ه??ای هم??هت??وان ب??ه ان??واع س??لولمی (Olgipotent( و اولگیپ???وتنت )Unipotentت???وان )(، ت???کMultipotentچن???دتوان ).[11]تقسیم نمود

سلول( های بنیادی همه توانTotipotent stem cell()Omnipotent) : جنی??نی. چ??نینهای س??لولی جنی??نی و غ??یرسلول بنیادی با قابلیت تمایز به گونه

.[12]باش??نده??ای متن??وع را دارا می هایی توانایی ساخت کامل ارگانیسمسلول ه??ای تولی??د ش??دهش??وند. س??لولها از ترکیب تخمک و اسپرم ایج??اد میاین سلول

. [13]ابتدا با تقسیمات اندک تخمک لقاح یافته نیز، همه توان هستندسلول( های بنیادی پر توانPluripotent stem cell :)

های همه توان که تقریبا توانایی تم??ایز ب??ه هم??ههای بنیادی از نسل سلولسلول را دارا میباشند.[14]های مشتق از سه الیه زایا به جز سلول[12]هاسلول

30

سلول( های بنیادی چندتوانMultipotent stem cell:) ه??ا ب??ا رابط??ه نزدی??ک ب??اهای بنیادی با قابلیت تمایز ب??ه تع??دادی از س??لول سلولهای خویشاوند. سلولتوان های بنیادی تکسلول(Unipotent stem cell :)

هایی از نوع خود را دارا بوده و ب??ه دلی??لهایی که تنها قابلیت تولید سلول سلولهای غیربنیادی هستند.نوسازی قابل تشخیص از سلولتوانایی خود

های بنیادی اولگیپوتنتسلول(Olgipotent stem cell :) ه??ایهای بنیادی ب??ا توان??ایی تم??ایز ب??ه تع??داد ان??دکی س??لول، مانن??د س??لولسلول

.[12](Myeloid( و میلوئید )Lymphoidلیمفوئید )

( براساس منشا2-4-7-1های بنیادی( منابع گوناگون سلول1-2-4-7-1

یابن??د. خص??ایصهای بنیادی بر طبق منبع و قابلیت انعطافش??ان تم??ایز می سلول ( به وسیله انواع متدها نظیرIn vitroهای بنیادی در محیط خارج از بدن )سلول

Clonogenicفرآیندهای کلونوژنیک ) Assaysکه در آن به منظ??ور درک م??یزان ) ه?ای. س??لول[15,? 8]ها آزمایش خواهند شدتوانایی خودنوسازی و تمایز، سلول

-توان براساس خصایصی مانند مارکرهای س??طحی جم??عچنین میبنیادی را هم باعث تغییر در رفتارهای In vitroآوری نمود. هرچند، شرایط کشت در محیط

Inه??ا نس??بت ب??ه محی??ط لسلولی گشته، و باعث عدم خلوص نس??بی این س??لو

vivoهای بنیادی براساس منشا به صورت زی??ر میشود. تقسیم بندی سلول می-باشد:

(Embryonic Stem Cells: ESCsهای بنیادی جنینی )سلول- 1

(Epiblastبالست )های سلولی مشتق بافت اپیهای بنیادی جنینی کشت سلولرده ( یا یکBlastocyst( یک بالستوسیست )Inner Cell Massتوده سلولی داخلی )

. بالستوسیست یک[16]باشند( زودرس در مرحله جنینی میMorulaموروالی ) 50-150 روزگی ج??نین انس??ان ب??وده و ح??اوی 5 ی??ا 4مرحله جنینی در ح??دود

های بنیادی جنینی پرتوان بوده و و در طول تکثیر به تمامباشد. سلولسلول می

31

(، م??زودرم )Ectodermشوند ک??ه ش??امل اکت??ودرم ) زایای اولیه تبدیل می الیه3Mesoderm( و اندودرم )Endodermتوانن??د درها میباشند. به عبارت دیگر، آن( می

های ب??الغ ب??دن نوع سلول تبدیل شده و تمام سلول200طول تکثیر به بیش از Extra-Embryonicه??ا در س??اخت غش??اهای خ??ارج جنی??نی )انسان را بسازند. آن

Membranes( و جفت )Placentaکنن??د. ان??دودرم س??ازنده احش??ای( ش??رکت نمی کن??د.ه??ا ب??وده و اکت??ودرم سیس??تم عص??بی و پوس??ت را ایج??اد میداخلی و ری??ه

مزودرم نیز در ساخت عضله، استخوان و خون و به عب??ارتی، ه??ر عض??وی ب??ه باشد. تقریبا در همهکند، دخیل میجز آنچه که اندودرم را به اکتودرم متصل می

( یاMouse Embryonic Stem Cellsهای بنیادی جنینی موش )تحقیقات از سلول ه??اشود. هر دو گروه از این س??لول( استفاده میESCsهای جنینی انسانی )سلول

های متفاوتی جهت پایداری در یکدارای خصایص ویژه بوده، اما نیاز به محیط. [17]سطح غیرتمایزی دارند

های بنیادی جنینی در درمان:معایب استفاده از سلول Inه??ا در ش??رایط های بنیادی جنینی به صورت جمعیت ناهمگنی از س??لولسلول

vitroهای تمایزیافت??ه حاص?لیابند. عملکرد طبیعی و فیزیولوژیک سلول تمایز می -های بنیادی جنینی باید ارزیابی شود. هم چنین، پیوند مش??تقات س??لولاز سلول

های بنیادی جنینی به انسان ممکن اس??ت س??بب ایج??ادهای تمایزیافته از سلول. [18]های بنیادی جنینی شودتومور از سلول

( Fetal Stem Cells:FSCsهای بنیادی نوزادی )- سلول2

ه??ای بنی??ادی ب??الغه??ای عملک??ردی مش??ابه ب??ا س??لولهای چندتوان با وی??ژگیسلولFetalه??ای جنی??نی )هستند که در بافت Tissue( ی??ا ض??مائم روی??انی )Embryonic

annexesه??ای بنی??ادیه??ای بنی??ادی جنی??نی دارای زیرگ??روه( وجود دارن??د. س??لول (2( خونس??از )موج??ود در خ??ون، کب??د و مغ??ز اس??تخوان(، )1ه??ای )س??لول

(3مزانش??یمال ) موج??ود در خ??ون، کب??د، کلی??ه، مغزاس??تخوان و پ??انکراس( )

32

( عصبی )موج??ود در مغ??ز و4اندوتلیال )موجود در مغز استخوان و جفت( و ).[20-19]باشندنخاع( می

( Adult Stem Cells:ASCsهای بنیادی بالغ )- سلول3 ه??ای و س??لول(Somaticهای بنیادی پیکری )چنین، با عنوان سلولها هماین سلول

Germبنیادی زایا ) lineها را در کودک??ان ن??یزشوند. البته این سلول( شناخته می های بنیادی بالغ پرتوان کمیاب و معموال کوچک بوده،. سلول[21]توان یافتمی

. تحقیق??ات[22]ش??وندها نظ??یر خ??ون بن??د ن??اف ی??افت میاما در تعدادی در بافت ه??ا در تقس??یم ی??ادهن??ده توان??ایی این س??لوله??ا نش??انبس??یار درب??اره این س??لول

-های بنیادی بالغ به صورت رده. بیشتر سلول[23]باشدخودنوسازی و تمایز می کنن??دهای محدود )چندتوان( بوده و معموال مانند بافت خویشاوند خود عمل می

های بنیادی مشتق از بافت چ??ربی سلول،(MSCsهای بنیادی مزانشیمی ))سلول(Adipose-derived Stem Cells( سلول بنیادی ان??دوتلیالی ،)Endothelial Stem

Cells( سلول بنیادی پ??الپ دن??دان ،)Dental Pulp Stem Cells).24]( و غ??یره- گیرن??د و درها در در دوران تکامل در ن??واحی خاص??ی ش??کل می. این سلول[25

ه??ایمانند و در صورت دریافت محرکیک وضعیت غیرفعال و خاموش باقی می-26]کنندموضعی، چرخه سلولی خود را آغاز ک?رده و ش?روع ب?ه مه?اجرت می

های بنیادی بالغ در تحقیقات و درمان به ان??دازه اس??تفاده از. کاربرد سلول[28 ه??ای بنی??ادی ب??الغباشد، زیرا تولید س??لولهای بنیادی جنینی بحث انگیز نمیسلول

نیازمند مداخله در بافت ی?ک ج?نین نیس?ت. ب?ه عالوه، ب?ه عن??وان مث?ال مح??ل های بنیادی جنینی نیازمند ت??داخلهای بنیادی بالغ همانند سلولدستیابی به سلول

باشند:های بنیادی بالغ دارای چندین زیرگروه می. سلول[29]باشدو تزریق نمی (Hematopoietic Stem Cells:HSCsهای بنیادی خونساز )الف( سلول

ای هستند که دارای منشا مزودرمال بوده و ترجیح??ا ازهای شناخته شدهسلولBonمغز استخوان ) Marrowناحیه ویژه نزدی??ک ب?ه اندوس??تئال اس??تخوان و ،)

ه??اش??ود. این س??لولاندوتلیوم سینوزوئیدها و از خون در گ??ردش جداس??ازی می

33

ه??ا، لنفاوی همانند نوتروفیل–های بالغ خونی ساز و تولیدکننده تمامی سلولپیش های دندریتیک وها، سلولسلها، ماستها، پالکتها، اریتروسیتها، ائوزینوفیلمونوسیت های بنیادیهستند. تحقیقات اخیر نشان داده است که سلول Tو B هایلنفوسیت

باالیی داشته و قادر به تم??ایز چن??دین رده و(Plasticityپذیری )خونساز انعطاف.[30]باشندسلول غیرخونی- لنفاوی می

(Mesenchymal Stem Cells: MSCsهای بنیادی مزانشیمال )سلول ب- ش?وند ولی ب?ا این ح?ال امک?انه?ا اص?وال از مغ?ز اس?تخوان ج?دا میاین س?لول

ه??ای دیگ??ر همانن??د ب??افت چ??ربی، پریوس??تئوم، غش??ایه??ا از ب??افتاس??تخراج آن-ها و غضروفسیتهای شیری، پریسینوویال، مایع سینوویال، عضله، درم، دندان

ه??ای بنی??ادی مزانش??یمال ت??وانهای مفصلی نیز وجود دارد. به طور کلی سلول ه?ا،ه?ا، استئوبالس??تهای وی?ژه مزودرم?ال همانن?د آدیپوس?یتتمایز به انواع سلول

ه??ا ق??ادر ب??ه تم??ایزها را دارند ولی با این حال برخی از آنها و کندروسیتمیوسیت.[34-31]باشندهای هر سه الیه زایا میسلول

:ADSCsه44ای اس44ترومال مش44تق ش44ده از ب44افت چ44ربی )پ- س44لول

Adipocyte Stem Cells )

ه??ای اس??تروماله??ای بنی??ادی مزانش??یمال مغ??ز اس??تخوان، س??لول همانند سلول ه??ای دارایه??ا و ب??افتمشتق شده از بافت چربی نیز دارای توان تمایز به سلول

-منشا مزودرمال همانند آدیپوسیت، غضروف، استخوان و عض??له اس??کلتی می.[35]باشند

(Umbilical cord stem cellsهای بنیادی بند ناف )- سلول4

:[36]های بنیادی وجود دارد در بند ناف دو منبع سلول(Umbilical Cord Epithelium: UCE )اپیتلیوم بند ناف الف-

34

شود و مش??خص ش??ده اس??ت ک??ه منب??عاز اپیتلیوم غشای آمنیوتیک مشتق می ]باش??ندهای اولیه انسانی بوده و ق??ادر ب?ه بازس??ازی اپی??درم میمهم کراتینوسیت

37-38].( Umbilical Cord Blood :UCB)خون بند ناف ب-

های بنی??ادی خونس??از در خون بند ناف دو نوع سلول بنیادی تحت عنوان سلول (UC-MSCsه?ای بنی??ادی مزانش?یمال بن?د ن?اف )و س??لول( UC-HSCs)بند ن?اف

های بنیادی خون بند ناف از لحاظ بیولوژیک نسبتوجود دارد. هرچند که سلول.[39]باشندبه خود فرد اتولوگ بوده اما دارای مقاومت ایمنی باالیی می

(Cancer stem cells)های بنیادی سرطانی - سلول5

ه??ای هماتولوژیک??ال ی??افتهای سرطانی هستند که در تومورها یا سرطانسلول-های بنیادی به انواع س??لولتوانند همانند سایر سلولها نیز میشوند. این سلولمی

-های دیگر تمایز یابند. باید به این نکته توجه داشت که ب??رخالف ب??رخی س??لول ه??ای بنی??ادی س??رطانی توم??ورزا هس??تند و ب??ا خاص??یته??ای س??رطانی، س??لول

توانن??د توموره??ای متن??وعی را ایج??اده??ا میخودنوسازی و تمایز به ان??واع س??لول.[40]کنند

(Amniotic fluid- مایع آمنیوتیک )6

ه??ایش??وند. این س??لولهای بنیادی چندتوان در مایع آمنیوتیک نیز ی??افت میسلول کننده به س??رعت گس??ترش یافت??ه وبنیادی بسیار فعال بوده، بدون مواد تغذیه

توانن??د ب??ههای بنیادی مایع آمنیوتیک چن??دتوان ب??وده و میتومورزا نیستند. سلول ( وHepaticس??از، ان??دوتلیالی، کب??دی )ساز، استخوانساز، عض??لههای چربیسلول

.[41]های عصبی تمایز یابندحتی رده

Induced)ش44ده پرت44وان های بنیادی تحریک- سلول7 Pluripotent Stem

Cell)

35

های بنیادی ب??الغتر از سلولهای بنیادی بالغ نیستند، اما سریعها، سلولاین سلول ه??ایدهن??د. نمون??ههای پرتوانی خود را ب??روز میهای اپیتلیالی( توانایی)مثل سلول

ش??دهه??ای بنی??ادی تحری??کتوانن??د ب??ه عن??وان منب??ع س??لولخونی فریزشده نیز می ی??ابی ب??ه اینپرتوان استفاده شوند که این موضوع دریچه جدیدی به روی دست

. [42]ها گشوده استسلول

( پوست8-1 % کل وزن بدن را تشکیل15-20پوست بزرگترین عضو منفرد بدن است که

پوشاند. ب??ه این مترمربع را می5/1-2دهد. در بالغین پوست سطحی معادل می گوین??د. پوس??ت ش??امل دو بخش اس??ت:عض??و پوش??ش ی??ا الی??ه جل??دی ن??یز می

( که الی??ه اپیتلی??الی ب??ا منش??ا اکت??ودرم اس??ت وEpidermisروپوست یا اپیدرم ) ( که الیه ای از بافت همبن??د ب??ا منش??ا م??زودرمیDermisمیان پوست یا درم )

)1-2. ( شکل[43]است

36

( ساختار پوست انسان1-2شکل

ه??ای درم ب??ه ن??ام پ??اپیال وزدگیمحل اتصال درم و اپیدرم نامنظم اس??ت. ب??یرون رون?د. غ?دده?ای اپی?درمی در هم ف?رو میهای اپیدرم به ن?ام س?تیغفرورفتگی

ش??وند. در زی??ر درم، ب??افتعرق و سباس??ه، ن??اخن و م??و از اپی??درم مش??تق می ( ق??رار دارد. ه??ایپودرم از ب??افت همبن??دHypodermisزیرجل??دی ی??ا ه??ایپودرم )

ه??ایی از ب??افت چ??ربیسست تشکیل شده است و ممکن است حاوی بالش??تک کن??د و مع??ادلباشد. هایپودرم به سستی پوست را به ب??افت زی??رین متص??ل می

توانندهای پوست همانند پوشش لوله گوارش، میفاسیای سطحی است. سلول های شبیه خ??ود را بس??ازند. در ف??رد س??المدر سراسر عمر تکثیر یافته و سلول

شود. اساس مولکولی ترمیم پوس??ت ت??ادیده به سرعت ترمیم میپوست آسیب

37

توان??د ب??ه فهم به??تر اس??اسحد زیادی کشف شده است و اطالعات حاصل میهای دیگر کمک کند. ترمیم در ارگان

اپیدرم عمدتا از اپیتلیوم مطب??ق سنگفرش??ی ش??اخی س??اخته ش??ده اس??ت ک??ه اس??ت. س??ه ن??وع س??لول(Keratinocyte)هایی به نام کراتینوس??یت دارای سلول

ش??وند: س??لول تولیدکنن??ده پیگم??اندیگر نیز ب??ا ف??راوانی کم??تر در آن دی??ده می ژن )النگره??انس( و س??لول، سلول عرضه کننده آنتی(Melanocyte))مالنوسیت(

پوششی حساس به لمس )س??لول مرک??ل(. اپی??درم از ط??رف درم ب??ه س??متStratumای )خ??ارج ش??امل پنج الی??ه اس??ت: الی??ه پای??ه basale)( الی??ه خ??اردار ،

Stratum spinosum )?،دار )الیه دانهStratum granulosum( الیه شفاف ،)Stratum

lucidum)( و الیه شاخی Stratum corneum)[43] (1-3. ) شکل

( ساختار اپیدرم پوست انسان1-3شکل

یک محافظ در مقابل دنیای بیرون و س??دی در که پوستعقیده بر این است باشد و ب??ه عن??وان ایج??ادهای متنوع و شرایط مخرب میمقابل میگروارگانیسم

کن??د. این فرآین??د احی??اکننده عملکردهای هموستاتیک در طول زندگی عم??ل می اغلب وجود دارد مگر زمانی ک?ه عوام??ل خ?ارجی ی??ا فیزیولوژی??ک این توان?ایی

.[45-44]ثبات هموستاز پوست را تخریب کنند

38

ها( کراتینوسیت1-8-1

های پوست انسان( نمایی از کراتینوسیت1-4شکل

ه?ای عملک??ردی هماهن??گ ب?ا هم میباش??د ک?هاپیتلیوم شامل اجتماعی از س??لول ه??ای اپیتلی??الی درتمام سطوح آزاد بدن را پوشانده و محافظت میکن??د. س??لول

خط اول تماسی با فضای بیرون و هم چنین در تماس با ب??افت همبن??د زی??رین ها به وسیله مق??دار زی??ادی از اج??زای خ??ارج س??لولی وباشند. این تماسخود می

هایی میباشند کهشود که حاوی پروتئینغشای پالسمایی تخصص یافته انجام می ه??ای زی??ریندهن??د. در الی??ههمراه با هم م??اتریکس خ??ارج س??لولی را ش??کل می

ای ک??ه کراتینوس??یتهای چند الیهاپیتلیوم مطبقی قرار دارد که به وسیله سلول های اپیدرمی که به عنوان کراتینوسیتسلولشوند ایجاد شده است. نامیده می

چ??نین بازس??ازی اپی??درم را داراشناخته میشوند، توان??ایی رش??د و کش??ت و هم ه??ای کراتینوس??یت در ب??االی درم، ب??ه ص??ورت چن??د الی??ه و. سلول[46]میباشند

ای، س??هشوند. براساس میزان رشد، عملکرد و انتشار منطق??همنظم دیده می ه??اینوع کراتینوسیت در اپیدرم شناسایی شده است: ن??وع اول ش??امل س??لول

39

ه??ایان??د. ن??وع دوم س??لولک??ه محکم ب??ه ب??ازال المین??ا چس??بیده پای??ه است-های پایه به میزان بیشتری تکث??یر میتکثیرشونده و گذرایی که نسبت به سلول

یابن?د. ن?وع س?ومشوند و به ی?ک ی?ا چن??د ن?وع س?لول تخص??ص یافت??ه تم?ایز می میرن?د. این ن?وع ازه?ای تم?ایز یافت?ه نه?ایی هس?تند ک?ه متعاقب?ا میکراتینوس??یت ه??ادهن??د. این س??لولهای خارجی الی??ه خ??ارجی را تش??کیل میها سلولکراتینوسیت

-های اس??تروما در درم ب??ه دس??ت میمواد غذایی و فاکتورهای رشد را از سلول ه??ایکنن??د ک??ه س??اختمانهای پایه مواد چسبنده ای را تولید میآورند. کراتینوسیت

ه??ایدهند و همچنین مواد غذایی مختلف و مولک??وللنگری اپیدرم را تشکیل می کنند که اعمال ات??وکرین، پ??اراکرین وها را ترشح میکننده شامل سیتوکینتنظیم

-کنن??د و وارد جری??ان خ??ون میاندوکرین را انجام داده و از غشای پایه عبور می ه??ایی ب??ه ن??امه??ا در مراح??ل آخ??ر متم??ایز ش??دن پروت??ئینش??وند. کراتینوس??یت

کراتولی?نین، فیالگ?رین و لوریس?ین س??اخته در مج?اورت س?طح داخلی غش?ای چس??بانند. این م??واد ب??رای ک??راتین درهای ایزوپپتید میسیتوپالسمی خود با بست

ه??ا بیوس??نتزت??رین عم??ل کراتینوس??یتآینده به منزله یک پ??اکت مهم اس??ت. مهم-ه?ای سیتواس??کلتال ایج??اد میپروتئین کراتین است که از متمایز ش??دن فیالمنت

نشان داده و معتقدند انواع مختلفی دارد:Kشود. این کراتین را با وK5های ب??ازال ح??اوی ش??بکه ظ??ریفی از ک??راتین اس??ت و سیتواسکلت سلول

K14ش??ودهای خ??اردار تهی??ه میگذاری شده است. نوع کراتینی که در سلول نام K1 و K10ت??ر هس??تند. بعض??ی ازگ??ذاری ش??ده و از ان??واع قبلی ض??خیم ن??ام

lان??د. ک??راتین ن??وع ه?ا تقس??یم ک??رده آنPHدانشمندان انواع کراتین را برمبنای

باش??د و معم??وال در اپیتلی??وم س??اده میK18 و K8اسیدی ب??وده و ش??امل ان??واع K10، K11 واکنش قلیایی داشته شامل انواع ll شود، اما کراتین نوعیافت می

های اپیدرمی از س??طح ب??ه عم??ق ح??اویباشد. بطور کلی کراتینوسیت میK14و ]ش??وند میll بوده، تدریجا مبدل به نوع قلی??ایی یع??نی ن??وع lکراتین اسیدی نوع

های اپیتلیالی ب??ا توان??ایی تش??کیل اپیتلی??وم مطب??ق ب??هها سلولکراتینوسیت.? [43 وسیله فرایندهای بلوغ بوده که منجر به تشکیل طبقه ش?اخی ش??ده میش?وند.

40

ها دارای توانایی تشکیل اپیتلیوم مطب?ق ب?ه وس??یله فراین?دهای بل??وغاین سلول ه??ا ک??ادهرینشوند. کراتینوسیتبوده که منجر به تشکیل طبقه شاخی شده می

)14 و حالت نابالغ تکثیری س??یتوکراتین (E-Cadherinاپیتلیالی ) K14را بی??ان ) که نوع ی??ک ک??ادهرین اس??ت کلی??د تنظیم??اتE-Cadherinمی نمایند. در واقع

باشد. درهای جنینی و بزرگسال میاتصاالت سلول به سلول در اپیتلیال در بافت- در ه??ر دو الی??ه اپیتلی??الی آش??کار میE-Cadherinهنگام ایجاد اپیدرم و پریدرم

های پوستی طبیعی منج??ر ب??ه رونویس??یها با فیبروبالست. کراتینوسیت[47]شود ، افزایش تکثیر فیبروبالست وIII و I به منظور تولید کالژن نوع mRNAسریع

ش??وند. بن??ابراین، توان??ایی تکث??یری وتجم??ع م??اتریکس خ??ارج س??لولی می-مهاجرتی کراتینوسیت برای فرآیندهای عملکردی سطح پوس??ت ض??روری می

.[48]باشد

( مارکرهای تمایزی2-8-1(K14 )14( سیتوکراتین 1-2-8-1

K14ای که نوع یک کراتین میباشد، به طور ساختاری در کراتینوس??یت قاع??ده در مراح??ل جنی??نی بس??یاری از.?? [47]اپیتلی??وم مطب??ق و اپی??درم وج??ود دارد

ش??وند و بع??د از آن درمارکرهای ایجاد کننده فراورده ه??ای پوس??تی آش??کار می K14های کراتینوسیتی ب??ا م??ارکر های اکتودرمی بیان سلولمراحل نهایی، سلول

ه?ای اپیتلی??ال ک??هپس از بیان مارکرهای ابت??دایی س??لول.? [49]دهندرا انجام می هس??تند در محی??ط تم??ایزی کراتینوس??یت ق??رار گرفت??ه وK8 و K18ش??امل

،6، اینتگ?رین آلف?ا 5، ک?راتین 14مارکرهای اولیه کراتینوسیت شامل کراتین ش?وند. الزم ب?ه ذک?ر اس??ت و المینین به وضوح بیان می7،کالژن 4اینتگرین بتا بیان میK14میزان اثبات به تمایز انتهایی مراحل در یعنی[50,? 3-2]رسد .

یابن??د، ک??اهش بی??انترین قسمت اپیتلی??وم تم??ایز میهای شاخیهنگامی که سلولmRNA کدکننده این مارکر در سیتوپالسم باعث تحریک نوع جدیدی از کراتین-

چ??نین بی??ان اینش??ود. همهای ویژه و تخصصی شدن برنامه تم??ایز اپیتلی??وم می

41

ه??امارکر در اپیتلیوم به شخصه، باعث بازسازی دوباره ش??بکه فیالمنت ک??راتین. [51]شودمی

(IVL: Involucrin)( اینولوکرین2-2-8-1

ناگفته نماند که مارکرهایی نظ??یر اینول??وکرین )پروت??ئین پردازش??گر در تکام??ل آی??دمراحل نهایی تمایز کراتینوسیت(، نیز جزو مارکرهای تاخیری به حساب می

.[50,? 3-2]شودکه در الیه سوپرا بازال در اپیتلیوم مطبق پوست مشخص می اینولوکرین یک پروسسور پروتئینی در ناحی??ه زیرغش??ایی الی??ه ش??اخی ب??وده و

. اینولوکرین انسانی، ابت??دا[52]باشدمتعاقبا در الیه شاخی پوست مشخص می گلوتامین??ازه??ای غش??ایی و ت??رانسها و نهایتا ب??ه پروت??ئیندر سیتوزول کراتینوسیت

متصل شده و به عنوان یک الیه محافظ و یک کاور غیرقاب??ل ح??ل زی??ر غش??ای گیرد. هرچند که عملکرد و سیر تکاملی اینولوکرین ش??ناختهپالسمایی قرار می

-. هم[53]باشد، طریقه بیان ژن آن هنوز ب??ه خ??وبی قاب??ل فهم نیستشده می های کراتینوسیت جداسازی شده از الی??ه اپی??درم در سیتوپالس??ملچنین در سلو

شوند. اینول??وکرین ب??ه عن??وانهای نزدیک به غشا دیده میسلولی بیشتر در الیه کن??د. وزنگلوتامین??از ش??رکت میی??ک گیرن??ده آمین در واکنش کات??الیز ت??رانس

ژنی اینول??وکرینمولکولی، آرایش آمینواس??ید، ق??ابلیت انحالل و خصاص??ی آن??تی شناخته ش??ده و در برنام??ه تم??ایز کراتینوس??یتی ب??ه عن??وان م??ارک ت??اخیری ب??ه

ه??ایچ??نین س??نتز اینول??وکرین س??بب اف??زایش حجم س??لولآین??د. همحس??اب می. [54]شودکراتینوسیتی نیز می

p63( فاکتور 3-2-8-1

فاکتوره??ای رونویس??ی ن??یز ب??ه عن??وان مارکره??ای چش??مگیر تخصص??ی ب??رای ف??اکتور رونویس??ی میباش??د وp63کراتینوسیت استفاده میش??وند ب??رای نمون??ه

ه??ای اپیتلی??الی مرتب??ط وی??ژهه??ای س??لولبیان این ژن برای کراتینوسیت و گونه بوده و برای تکامل اپیدرم و مشتقات آنp53 عضوی از خانواده P63میباشد.

42

باش???د. این ف???اکتور هم چ???نین ب???رای نگه???داریداران ض???روری میدر مه???ره ه??ای درهای بنی??ادی ض??روری ب??وده و در تم??ام س??لولداری سلولفرآیندهای نگه

-باش??د. همهای کراتینوسیت با توانایی رش??د ب??اال موج??ود میحال رشد در کلونیzingچنین فاکتور رونویسی بازونوکلین شامل سه جفت مجزا fingerب??وده و

ای در اپی??درم و اپیتلی??وم سنگفرش??ی وج??ود دارد و رش??ددر س??لول قاع??ده مطالع??ات دیگ??ر نش??ان دهن??ده این.?? [49,?? 3]کندکراتینوس??یت را تس??ریع می

ب??ه عن??وان مارکره??ای رونویس??ی وK14 و p63موضوع میباشد که مارکره??ای تمایزی کراتینوسیت در مراحل اولیه وجود خواهند داشت ب??ه این ص??ورت ک??ه

مهاجرت های س??لولی قب??ل ازOct4های جنینی با از بین رفتن فاکتور در سلول موی??د مرحل??هK14 در غی??اب p63 رخ خواه??د داد. حض??ور p63پی??دایش م??ارکر

ها در تمامی مراحل مه??اجرت س??لولی وج??ود خواهن??دبعدی میباشد. این سلول داشت و در مراحل بعدی حضور این دو مارکر با هم نش??ان دهن??ده این اس??ت

باشد. با گذشت زم?ان و مه?اجرت بیش?ترکه سلول تمایزیافته کراتینوسیت میK14شوند و چون این دو تقریبا در یک زمان ظ??اهر می و بازونوکلین ظاهر می-

پروتئین تغییر. [3]باشدشوند حضور هر دو برای شروع مرحله بعد ضروری می باشد و نقش کلی??دی در( القاگر تمایز اپیدرم میBMP4دهنده استخوان )شکل

کنن??دههای مختلف بازی میکند. رتینوئیک اسید, تنظیمپیام تکامل اکتودرم گونه-هایی بوده که به شدت در تکام??ل ج??نین دخی??ل میقوی در تمایز و تکثیر سلول

ی رتینوئی??ک اس??ید ب?اباشد. در محیط آزمایشگاهی, مهار تمایز نهایی بوس??یله ب??هBMP4. این مکانیس??م در [55] نش??ان داده ش??ده استp63تع??دیل بی??ان

ه??اهای اپیتلیالی ب??ه کراتینوس??یتصورت مهار تحریک عصبی و ثبات تبدیل سلول- به تنهایی با قرارگیری در یک ماتریکس مترش??حه میBMP4چنین میباشد. هم

های بنیادی انسانهای زایای اکتودرمی از سلولتواند باعث رشد زودرس سلول. [50, 2]شود

( خون قاعدگی9-1

43

(Endometrium( ساختمان اندومتر )1-9-1 ترین الیه رحم و ب??ا ق??درت بازس??ازی باالس??ت ک??ه ب??ر روی الی??هاندومتر داخلی

-56]( ق??رار گرفت??ه استMyometriumعضالنی ضخیم رحم ب??ه ن??ام میوم??تر )57] .

شود:اندومتر از لحاظ عملکردی و ساختمانی به دو دسته تقسیم می این الیه دوسوم فوقانی بافت رحم را تش??کیل(:Functional- عملکردی )1

Surfaceداده و ش??امل غ??ددی اس??ت ک??ه از اپیتلی??وم س??طحی ) Epithelium) ش??ود.داری و حمایت می( نگهStromaگسترش پیدا کرده و به وسیله استروما )

( این الیه دچار تغییراتی به صورتMenstural Cycleدر طول سیکل قاعدگی ) شود. تکثیر و تمایز سلولی در این الیه ب??ه واس??طه تغی??یراتیرشد و ریزش می

-ده??د، تنظیم میه??ای اس??تروئیدی در ط??ول س??یکل رخ میکه در میزان هورمون(1-6. ) شکل [58]گردد

Grandularاین الی??ه ش??امل ناحی??ه ب??ازال غ??ددی )(:Basal 44ساختمانی )-?? 2

Basal)،( اس??ترومای فش??رده Impact Stroma( و تجم??ع لنفوئی??دی )Lymphoid

aggregates)ه??ایباشد. این الیه نسبت ب??ه الی??ه عملک??ردی کم??تر از هورم??ون می .[59]باشداستروئیدی تاثیر پذیرفته و مسئول ایج??اد الی??ه عملک??ردی جدی??د می

(1-5)شکل

44

( تغییرات سطح هورمون در طول دوره قاعدگی1-5شکل

سیکل (a( 1-6شکل ( سیکل قاعدگی رحمbگذاری تخمک

های استرومال اندومترهای کلونوژنیک سلول( ویژگی2-9-1 باش?د، بطوریک?ه درط?ولبافت اندومتر دارای توانایی تکثیر و ترمیم ب?االیی می

سیکل ازتکثیر سلولی، تم??ایز400های تولید مثل این بافت تحت بیش از سال ی??ک(Angiogenesis)زایی گ??یرد. درط??ول س??یکل قاع??دگی رگو ریزش قرار می

10 الی4باش??د و ه??ر م??اه در ط??ول پروسه حیاتی و مهم در تکثیر ان??دومتر می 7 ت??ا 4م??تر ب??ه میلی1 الی 5/0روز ابتدای این س??یکل ض??خامت این ب??افت از

رسد .متر میمیلی ه??ای بنی??ادین ک??هه??ایی ب??ا وی??ژگینظریات و پیشنهادات مبت??نی برحض??ور س??لول

1980باش??ند ب??ه ده??ه مسئول تکثیر، ت??رمیم و آنژی??وژنز در ب??افت ان??دومتر می ه??ا براس??اس ش??واهد و م??دارکگ??ردد ک??ه در آن زم??ان تم??ام دانس??تهب??رمی

.[58]غیرمستقیم بود وChan توس??ط 2004تا اینکه اولین م??درک عملک??ردی در این م??ورد درس??ال

همکارانش منتشر گردید. در این مطالعه پس از بدست آوردن سوسپانسیون

45

درص??د22/0خالص تک سلولی از نمونه های بافت اندومتر مشخص ش??د ک??ه های استرومال ب??افت ان??دومتر در درصد از سلول25/1های اپیتلیالی و از سلول

- نوع کلونی از هرکدام از سلول2توانند تشکیل کلونی بدهند. روز می15طول ها بدست آمد:

سلول بهم فشرده وکوچک بودن??د4000های بزرگ که حاوی بیش از - کلونی1باشد.ساز اندومتر میهای پیشها سلولو احتماال منشا آن

ه??ای ب??زرگ و دور از هم ب??ا نس??بت هس??ته ب??ههای کوچک حاوی سلول- کلونی2TA)Transitه??ای سیتوپالسم پایین که ب??ه نظ??ر میرس??د س??لول Amplifying)ب??ا

باش??ندان??د، میهایی که کامال تمایز یافت??ههای بنیادی و سلولهایی بین سلولویژگی ه??ای بنی??ادی داش??ته و)این سلولها قدرت تکثیری محدودتری نس??بت ب??ه س??لول

گیرند تا به فرم تمایز یافته تبدیلتحت تاثیر چندین تقسیم سلولی باید قرار میشوند.(

های اس??ترومال و اپیتلی??ال کلوژنی??کمطالعات بیشتر نشان داد که درصد سلول .[61-60]اندومتر انسان در دو فاز تکث??یری و ترش??حی ب??ا هم تف??اوتی ندارند

(1-7)شکل

هایکلونی (1- 7شکل های استرومال و اپیتلیال بافت اندومترکوچک و بزرگ سلول

های تشکیل دهنده کلونی در اندومتر( فنوتیپ سلول3-9-1

46

EP-CAM)Eplithelialه??ای کوچ??ک اپیتلی??ال، مارکره??ای کل??ونی cell adhesion

molecule(ه??ای ب??زرگ بی??ان و س??ایتوکراتین را بی??ان میکنن??د درحالیک??ه کل??ونی اینتگرین را بیان میکنند .6αضعیفی از این مارکرها دارند ولی

که یک مارکرفیبروبالستیCD90های استرومال های بزرگ و کوچک سلولکلونیاست را بیان میکنند.

های بیان کنندههای استرومايي حاوی سلولهمچنین درصد معنی داری از کلونی اکتین ماهیچه صاف هستند که نشان دهنده تمایز به میوفیبروبالس??تαمارکر

.[60]باشدو یا ماهیچه صاف می

های تشکیل دهنده کلونی در اندومتر( فعالیت بنیادی سلول4-9-1 های بزرگ قدرت تکثیری باالیی دارن??د بطوریک??همطالعات نشان داده که کلونی

ب??ار32 الی 20ها را قبل از این که دچار ترانس فورماسیون ش??وند میتوان آن .[62]پاساژ داد

ه?ا خاص??یت خ?ود تجدیدش??وندگی ن?یزبا توجه به کلونین?گ س??ریالی، این س??لول تر نیز در مطالعات کینتی??ک م??وردها پیشدارند. پتانسیل تکثیری باالی این سلول

درص??د50توجه ق??رار گرفت??ه ب??ود بطوریک??ه پس از پاس??اژ س??ریالی، بیش از گیرن???د ب???دون این ک???ه دچ???ار پاس???اژ ق???رار می24ه???ا تحت بیش از نمون???ه

س??ازترانسفورماس??یون ش??وند و ب??ه نظ??ر رس??ید ک??ه احتم??اال چن??دین پیش ها حضور دارند که مسئول این توانایی تکثیری باال میاسترومالی در این کشت

.[63]باشند ه??ای بنی??ادی مزانش??یمی مغ??زتوانند مانند س??لولهای بزرگ استرومايي میکلونی

اس??تخوان ب??ه چن??دین رده مزانش??یمی از جمل??ه ماهیچ??ه ص??اف، آدیپوس??یت، ه??ای کوچ??ککندروس??یت و استئوبالس??ت تم??ایز پی??دا کنن??د. درح??الی ک??ه کل??ونی

اپیتلیال و استرومال قدرت کلونینگ سریالی کمی دارند که نش??ان میده??د این ها تمایز یافته تر بوده و ق??درت تکث??یری کم??تری دارن??د. تم??ام این ش??واهدکلون

های اپیتلیالی و استرومايي است ک??ه ق??ادرحاکی از وجود درصد کمی از سلول

47

س??ازهای اپیتلی??الی وهای پیشهای بزرگ بوده و به ترتیب ویژگیبه تشکیل کلونی های بنیادی مزانش??یمی را داش??ته و ب??ه نظ??ر مس??ئولهایی شبیه به سلولسلول

.[63-62]باشندقابلیت ترمیمی اندومتر در طی سیکل قاعدگی می

های پیش ساز اندومتر:( مارکر سلول5-9-1 هایی شبیه بههای استرومال بافت اندومتر که ویژگیبه نظر می رسد که سلول

Basalهای بنیادی مغز استخوان را دارند، در نزدیکی عروق خونی درالیه سلول

ه?ای ض?دب??ادی چن??دین مطالع?ه ب?ا اس?تفاده از آن??تی2007قرار دارند. ت??ا س??ال ،CD45مارکرهای هماتوپوئتیک از جمل??ه CD14، CD56، CD34 و CD38نش??ان

CD90دادند که این سلولها مارکرهای یادش??ده را بی??ان نمی کنن??د درحالیک??ه ، CD73، CD105 وCD29کنند. )مارکرهای مزانشیمی( را بیان می

ه??ای اس??ترومایی از ب??افتپس از آن نیز مطالعات مختلفی با جدا کردن سلول ها به بررسی بیان مارکرهای مزانشیمی و هماتوپوئیتیک دراندومتر و کشت آن

،CD29ه???ا پرداختن???د. این مطالع???ات بی???ان مارکره???ای این س???لول CD73، CD90،MMP3 و CD105 و OCT-4 ع??دم بی??ان مارکره??ای CD45، CD14 ،CD19،

CD16، CD56، CD34، CD38[64] را تائید کردند.

( ماتريكس6-9-1 ه??اي بني??ادياگر چه فاكتورهاي رشد نقش مهمي را در طي تمايز و نمو سلول

ه??اي بني??ادي تاثيرگ??ذارعوامل ديگ??ري ن??يز در سرنوش??ت س??لولبازي مي كنند، است. چندين كالس از رسپتورها در چسبندگي و اتصال س??لول ب??ه م??اتريكس

( م??وثر هس??تند ك??ه غ??الب ت??رين ن??وع ش??ناخته ش??ده آنه??اECMخارج سلولي ) ه?اي بني??ادي جهت بق??اي س??لولß-1ايتتگرين ها مي باشند. بيان ب??االي اينتگ??رين

ه??ا از در تنظيم تم??ايز س??لولß-1رس??پتور اينتگ??رين الزم اس??ت. عالوه ب??ر آن، ها سبباينتگرين.? [66-65] كيناز تاثيرگذار استMAPطريق مسير سيگنالينگ

ه??اي بني??اديها مي شوند و از بين رفتن آنها س??بب آپوپت??وز س??لولپايداري سلول

48

مي شود. همچنين آنه??ا مي توانن??د رس??پتور ه??اي فاكتوره??اي رش??د را ب??ه ط??ور.[67] مستقيم فعال كنند

هاي ماتريكس خ??ارج س??لولي از عوام??ل تنظيم كنن??ده بي??ان و فع??اليت پروتئين هستند. همچ??نين تغي??ير موض??عي در ت??ركيب غش??ائ پاي??ه توس??طβ1اينتگرين-

ماتريكس خارج سلولي تنظيم مي ش??ود ك??ه نقش مهمي در پاي??داري و توزي??ع عالوه ب??ر آن س??اختار م??اتريكس مي توان??د غلظت.[68]هاي بني??ادي داردسلول

راه??اي بني??ادي ( س??لولNicheموضعي فاكتورهاي ترشحي موج??ود در آش??یانه ).[69]تنظيم كند

های بنیادی خون قاعدگیسلول (7-9-1 ه??ای بنی??ادی اس??ت ک??ه ب??ه آس??انی در ه??ربافت اندومتر یک منبع غنی از سلول

رود. این در حالیس??ت ک??ه مطالع??ات اخ??یر نش??انسیکل قاعدگی از دس??ت میMensturalهای بنیادین حاص??ل از خ??ون قاع??دگی )داده که سلول Blood Stem

Cell ??)ها است که دارای خصایصی مش??ابه ب??انظیری از سلولدارای جمعیت بی . شواهد مشهود این فرضیه را حمایت[71-70]های بنیادی بالغ میباشند سلول

-میکند که توانایی باالی بازسازی اندومتر در انسان به وسیله فرایندهای دوره .[72]ای تکثیر سلولی، تمایز و خونریزی )مراحل قاعدگی( مشخص میش??ود

ه?ای بنی??ادیه?ا دارای خص??ایص ه??ر دو ن??وع س??لولب??ه نظ??ر میرس??د این س??لول ه??ای. ض??من اینک??ه خط??ر ناهنج??اری[71-70]مزانش??یمی و جنی??نی باش??ند

ه??ایگیری تومور یا سرعت تکث??یر توم??وری در م??دلکروموزومی، توانایی شکل . عالوه ب??رآن، این منب??ع غ??نی[74-73]ه??ا ح??داقل استحی??وانی در این س??لول

دارای ق??ابلیت خودنوس??ازی ط??والنی م??دت و رش??د س??ریعتری در مقایس??ه ب??ا ه??ای. این حقیقت ک??ه س??لول[74]های بنیادی مزانشمیال بند ناف میباشدسلول

استرومایی میتوانند به اکتودرم و مزودرم تمایز یابند چندتوانی آنه??ا را آش??کار ه??ای بنی??ادی اس??ترومال در ب??افت ان??دومتریال. این س??لول[75,?? 60]میکند

ه??ا ب??ه ص??ورت مس??تقیماند. هر چند به دست آوردن این س??لولشناسایی شده

49

ممکن اس??ت ته??اجمی باش??د. پوش??ش آن??دومتریال رحم توان??ایی ب??االیی در بازسازی دارد. لذا در طول هر دوره قاعدگی رشد زیاد بافت و ع?روق خ??ونی

ها، ح??اوی جمعیتوجود دارد که در پایان هر دوره از بین می رود. خون و بافت ه??ای بنی??ادی. س??لول[73]ها با توانایی بازسازی میباشندناهمگن از بعضی سلول

های چند توان مغز اس??تخوانها خصایصی شبیه سلولحاصل از این خون و بافت ان??د وهای مزانش??یمی مغ??ز اس??تخوان نش??ات گرفت??هدارند که عموما از سلول

های مغ??ز اس??تخوانها طی مهاجرت از سلولفرضیه بر این است که این سلول ه??ای بنی??ادیدر دوران جنی??نی در ان??دومتر ج??ایگزین ش??ده و خص??ایص س??لول

. یکی دیگ??ر[78-76]دهنداسترومال با منشا مغز استخوان را از خود ب??روز می آوری آنه??اهای بنیادی قاعدگی این است که روش جمعاز مهمترین فواید سلول و با وج??ود دوره قاع??دگی در زن??ان در س??نین[80-79]کامال غیرتهاجمی بوده

ها که در الیه اندومتریال رحم موجود است ماهانه به صورتباروری این سلول چنین، عالوه بر فراوانی و در دسترس بودن. هم[71]تازه وجود خواهد داشت

ه??ا، خ??ونرسد ب??ا توج??ه ب??ه امک??ان بک??ارگیری اتول??وگ این س??لول، به نظر می الی جهت کاهش مشکالت ناسازگاری ایمونولوژیکی پس ازقاعدگی منبع ایده

ه??ای بنی??ادی خ??ون. بن??ابراین س??لول[81]ه??ای پوس??تی ن??یز باشدپیوند در بیماریها مزایای متعددی دارند:قاعدگی در مقایسه با سایر سلول

توان از خود زنان بیمار تهیه نمود و بدین ترتیب مشکل- خون قاعدگی را می1محدود بودن فرد اهداکننده را کاهش داد.

ه??ای بنی??ادی خ??ون- براساس توانایی باالی خودجایگزینی، اس??تفاده از س??لول2شود.قاعدگی تایید می

های بنیادی خون قاع??دگی خ??ود بیم??ار، امک??ان رد پیون??د- با استفاده از سلول3 تر ش??دن عم??ر بیم??ار پس از پیون??دیابد که سبب طوالنیایمونولوژیک کاهش می

شود.میهای بنیادی خون قاعدگی به آسانی قابل انجام است.- جداسازی سلول4

50

پ??ذیر- تهیه نمونه به صورت ماهیانه و بدون بک??ارگیری روش ته??اجمی امک??ان5است.

ها در م??وارد مختل??ف ب??الینی ب??ه اثب??ات رس??یده- اثرات استفاده از این سلول6است.

های بنیادی خون قاع?دگی به?تر- از نظر کاربردی و اخالقی استفاده از سلول7 ه??ای بنی??ادیهای بنیادی بالغ دیگر یا س??لولهای بنیادی نظیر سلولاز سایر سلول

. [82, 74]باشدجنینی می

کشتی( هم10-1 کشتی به صورت رشد جداگانه دو گونه سلول در یک محیط کشت مخلوطهم

inهای شود که همانند سایر محیطبیان می vitroتواند مس??یر مورفول??وژیکی می ه??ا ب??ه منظ??ورکش??تیها ایج??اد نمای??د. همهای داخل بدن و عملکرد آنهمانند بافت

دهی بین دو نوع س??لول متف??اوت بس??یارمدلسازی و مطالعه واکنش و سیگنال توانن??د ب??ه منظ??ور بررس??ی ارتباط??ات بینچنین میها همکشتیباشد. هممفید می

سلولی، دینامیک مهاجرت سلولی و تحریک و ثب??ات عملک??رد و تم??ایز س??لولی های ان??دوتلیال وکشتی سلولاستفاده شوند. برای مثال، مطالعه بر روی هم

کشتی به طور بس?یار واض?ح س?اختارهای ماهیچه صاف نشان داد که همسلول.[83]دهد را نشان میin vivoای به اندوتلیال در محیط های ماهیچهتبدیل سلول

های کشت( روش11-1به كف ظرفاي سلوسادهترين? نوع? كشت? س?لولي،? كش?ت? ت?ك? الي?ه لها

چس?بيده? ،? رش?د? مينمايند.? به? طور? معمول? در? اين? نوع? كشت? ،? عالوه? ب?ر سلولهاي? اصلي? مورد? نظر،? انواع? مختلفي? از? س?لوله?ا? مانند? فيبروبالست وجود دارند كه با انج??????ام چن??????دين پاساژ سلولي جمعيت سلولي خالصتر

الي?ه تك? كش?ت? ه?دفميشود.? ب?ا بيش?تر اس?تخواني ه?اي س?لول اي . تحقیقات در زمینه بافت و سلول بنیادی[84]تحقيقات اوليه? صورت ميگيرد

51

شناسی مولکولی در مرحله اول منوط ب??ه کش??ت س??لولی در ظ??روفو زیست باشد که این تکنیک ام??روزه ب??ه عن??وان کش??ت در محی??طپالستیکی مسطح می

دوبعدی شناخته میشود. با پیشرفت تکنولوژی پلیمر امروزه ظ??روف وی??ژه ب??ا ها ستفاده میشود. یک بافتها و فالسکهای باالتری نظیر انواع پتری دیشقابلیت

.[85]ه??ای س??اختمانی و مک??انیکی داردبرای انجام عمل خود یک سری وی??ژگی چنین یک شیوه معمول در مهندسی بافت اس??تفاده از پروسس??ورهای چن??دهم

باش??د.ه??ای مولک??ولی می( و پیامScaffoldsها )بعدی بافتی نظیر سلول، داربست ه?ا درمقیاس طراحی دقیق برای ساختارهای مهندس??ی ب??افتی از رش??د س??لول

-های خیلی ظریف مانند پوست در محی??طکند. برای بافتداربست حمایت می . ی??ک[86]بع??دی میباشدهای کشت خارج از بدن بیشتر به صورت سطوح سه

ه??ای س??اختمانی و مک??انیکی دارد.بافت برای انجام عمل خود یک سری ویژگی ها در یکیابی به این شرایط در خارج از بدن، سلولبرای همین به منظور دست

هاسیستم مصنوعی پشتیبانی )داربست( میشوند که قادر به حمایت این سلول . هر داربست بر اس??اس خ??واص[87]بعدی مورد نظر هستندهمانند بافت سه

تواند مهم??ترینشود. انتخاب نوع و جنس داربست میبافت هدفش طراحی می دی??ده میش??ود.بخش باشد زیرا که در نهایت این داربست جایگزین بافت آس??یب

]ش??وندها از لحاظ منشا به دو نوع زیس??تی و س??نتزی تقس??یم بن??دی میداربست ه??ایهای زیستی از استخراج بافت به دست می آیند ام??ا داربس??ت. داربست[88

ش??وند ک??ه س??ازگار ب??ا ب??دن،سنتزی به صورت مصنوعی به ش??کلی س??اخته می Polyقابل تجزیه و جذب باشند. ی??ک ن??وع از این پلیمره??ای س??نتزی داربس??ت

Lactic Acid ها به صورتبوده که به صورت پلیمر تهیه میشود که این داربست بع??دی ب??اه??ای س??هبع??دی ب??وده ب??ه این مع??نی ک??ه ب??ه راح??تی ب??ه م??اتریکسسه

ه??ا، پلیمره??ایش??وند. در مقایس??ه ب??ا این داربس??تساختارهای متن??وع تب??دیل می-ها به صورت ساده در همان محیطدوبعدی وجود دارند که در این روش سلول

ه??ای س??ه بع??دی از نظ??ر حجم وشوند. محیطهای آزمایشگاهی کشت داده می ت??ر و به?تری را ب??رای کش??ت س??لول نس??بت ب??همیزان تخلخل، محی??ط پیچی??ده

52

ی??ک ن??وع از این پلیمره??ای ط??بیعی ک??ه.? [89]محیط دوبعدی ایج??اد می نمایند رس??د ک??ه م??ورد مناس??بی جهت مهندس??یاستحکام خوبی داشته و به نظ??ر می

بافت پوست باش??د پ??رده آم??نیون اس??ت. این داربس??ت ب??ه دلی??ل در دس??ترس بودن، زیست سازگار بودن و عدم تحریک پاسخ ایمنی بسیار مورد توجه قرار

ه??ایی ب??ر پای??هه??ا، در این ط??رح داربس??ت. بنابر این وی??ژگی[91-90]گرفته است های مورد نظ??ر م??ورد اس??تفاده ق??رارآمنیون ساخته شده و جهت کشت سلول

میگیرند.

فصل دومهامواد و روش

53

( وسایل و تجهیزات1-2های مورد استفاده:دستگاه

(Eppendorf , Germanyسانتریفوژ )(Hettich , Germanyسانتریفوژ دور باال )

(Eppendorf mastercycler gradient , Germanyترموسایکلر ) (Picodrop , UKپیکودراپ )

(Olympus , Japanمیکروسکوپ معکوس )(Nikon, TE-2000, Japanمیکروسکوپ فلورسنت معکوس )

های بنیادی خون قاعدگیل( روش جداسازی سلو2-2مواد و وسايل

-F12محيط كش?ت DMEM ب?افر ،PBS تریپس?ین ،EDTA 25/0 ،درص?د Fetal

Bovin Serum %10 ،پنیآنتی Fungizone(? ،? 100xاسترپتومایسین)سیلین- بیوتیک

(Gibco, UK)اسیدآمینه ،( های غیرضروریX100()Gibco, UK ?،)کربنات سدیم )بیSigma Aldrich, USA )?،L-glutamin 2Mm )Gibco, UK( ،فايكول g/ml 1/077

(GE healthcare ،)سوئد ،Diva cup )Lunette, Finland( ، ( پیپت پاس??تورISO

Lab, Germany )،

روش کارگیرینمونه

54

زن س??الم ب??ا6 سی سی از 5پس از کسب رضایت، خون قاعدگی به مقدار Diva سال به وسیله 26-36متوسط سن cupجمع آوری و ب??ه لول??ه ف??الکون

منتقل گردید. EDTA 0/5mM PBS میلی لیتر5محتوی

جداسازي سلول هاي تك هسته اي از نمونه خون قاعدگی براي جداسازي سلول هاي تك هسته اي، نمونه ه?ای خ?ون قاع?دگی ب?ا حجمی

رقيق گشته و به1 : 4 به نسبت PBS EDTA 0/5mM میلی لیتر با 5 تا 1حدود اضافه شد. بدين ترتيب كهg/ml 077/1 بر روی فايكول با دانسيته 1:1نسبت در يكPBS EDTA 0/5mM ميلي ليتر 15 را با ميلي ليتر خون قاعدگی5مقدار

میلی لیتر از مخلوط باال را20 ميلي ليتري ريخته شد، سپس 50لوله فالكون دقیق??ه ب??ا دور 20ضافه گشته و به م??دت فایکول ا ميلي ليتر 20به آرامي به

g600 ،الیه جدا شد که از پائین به4 سانتریفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ باال عبارتند از:

گلبول های قرمزفایکول

حلقه سلول های تک هسته ای پالسما

آوریپس از اتمام سانتریفیوژ، الي??ه س??لول هاي ت??ك هس??ته اي ب??ه آرامی جم??ع PBS برابر حجمی که اليه سلول هاي تك هس?ته اي ج?دا ش??ده اس??ت 2شدند و

EDTA 0/5mM اض??افه می ک??نیم و ب??ا دور g400 20 ب??ه م??دت زم??ان دقیق??ه PBS ميلي لي??تر 2 روی رس??وب بدس??ت آم??ده ب??ه م??یزان سانتریفیوژ می کنیم.

EDTA 0/5mM اضافه کرده و با دور g300 سانتریفیوژ20 به مدت زمان دقیقه EDTA حاويPBS ميكروليتر 100می کنیم. مقدار 0/5mMبه آن اضافه ش??د و

سلول ها به حالت سوسپانسيون در آورده شدند ب??دين ت??رتيب س??لول هاي ت??ك.[62]هسته اي از نمونه خون قاعدگی جدا شدند

های کراتینوسیت سلول( روش جداسازي 3-2

55

مواد و وسایلDMEM-F12اس??ترپ )پ?نی س?یلین- استرپتومایس?ن( )، پنx100 ??، ?)Fungizone

(Gibco, UK) ، PBS، Dispase ، HBSS ، Dellution Medium )Gibco, UK( ،

Collagen IV )Gibco, UK( ، Epilife )Gibco, UK( ، DMEM-HG

روش تهیه نمونه پوستی پس از كس??ب رض??ايت ب??ا ج??راحیForeskinه??ای نمون??هCircumcisionعم??ل

گرفت??ه ش??د. نمون??ه درته??رانمتخصص جراحی عمومی از بيمارستان الغ??دیر ب??دون س??رم،DMEM-F12 سی س??ی 4حاوی ميلي ليتري كه 50لوله فالكون ب??ود جمع آوري گردي??د و در میکرولی??تر120 هر ک??دامFungizoneپن استرپ و به آزمايشگاه كشت سلول منتقل گشت.C10دماي كمتر از

جداسازي سلول های تک هسته ای از بافت پوست براي جداسازي سلول ها، نمونه پوس??تی ابت??دا جهت زدودگی ض??ایعات و خ?ون

میکرولیتر پن استرپPBS، 120 سی سی 4در پنج پتری دیش هرکدام حاوی . سپس نمونه به قطع??ات کوچ??ک تقس??یم شست و شو داده شدFungizoneو

سی سیDispase،3 سی سی 1 میلی لیتری حاوی 15شده و در یک فالکون HBSSمیکرولیتر پن استرپ و 80 و Fungizone 12-14 ریخته شده و به مدت

درجه جهت جداسازی اپیدرم از درم نگه داری شد. 4ساعت در دمای ه??ا را می خ??واهیم در آنبعد از گذشت این مدت ابتدا فالسک مب??دا ک??ه س??لول

DelluTion میکرولی???تر 258ق???رار دهیم را ب???ا مخل???وط Medium 58/2 و دقیقه باقی بماند و سپس به مدت30میکرولیتر کالژن کاور کرده و به مدت

ه?ا را در ی??ک پ?تری دیشیک ربع بماند تا کامال خشک شود. در این مدت نمونه-خالی کرده و به کمک دو پنس اپیدرم به راحتی از درم ج??دا میش??ود. اپی??درم

با اسکالپ ک??امال خ??ردPBS سی سی 2های جدا شده را در یک طرف حاوی % اضافه ک??رده و در انکوب??اتور ب??ه25/0کرده و همان مقدار به آن تریپسین

56

سی سی5 دقیقه قرار داده شد. بعد از گذشت این مدت به اندازه 15مدت دقیقه با5 اضافه کرده و خوب پیپتاژ شده و بعد به مدت DMEM 10%به آن

س??ی2ها سانتریفوژ ش??د محل??ول رویی دور ریخت??ه ش??ده سلولrpm1000دور ه??ا را ب??ه آرامی ب??ه آن اض??افه ش??ده س??لولDMEM-F12 ی??ا DMEM-HGسی

پیپتاژ کرده و دوباره سانتریفوز به همان شکل اول تک??رار ش??د. محل??ول رویی ها اضافه شده و به سلول(2-1شکل ) Epilife سی سی 2دور ریخته شده و

شمارش سلولی انجام شده و در فالس??ک ریخت??ه می ش??ود. پس از مش??اهده ها با ش??مارش س??لولی و ص??حت آنه??امیکروسکوپی و اطمینان از مقدار سلول(2-2. )شکل [92]فالسک در انکوباتور قرار داده می شود

Epilife( اجزای تشکیل دهنده 2-1شکل

57

( مراحل جداسازی اپیدرم از درم و استخراج سلول2-2شکل

ه444ا ب444ا اس444تفاده از( بررس444ی رون444د رش444د و تکث444یر س444لول4-2میکروسکوپ اینورت

ه??ا ادام??ه ی??افت،پس از کشت اولیه و نیز طی روزه??ای بع??د ک??ه تکث??یر س??لول ها مورد مطالعه ق??رار گ??رفت و در روزه??ای مختل??ف پس ازفرآیند رشد سلول

ه??ای تکث??یر یافت??ه ب??ه وس??یلهکش??ت و ن??یز پس از پ??ر ش??دن پلیت، از س??لولمیکروسکوپ اینورت، تصاویر میکروسکوپی تهیه شد.

58

( روش انجماد5-2مواد و وسايل

، مستر فراسترml5/1کرایوویال ، DMSOسرم استريل جنين گاو،

روش کار ابتدا محيط روي سلول ها دور ريخت??ه ش??د، س??پس آنه?ا تريپس?ينه ش??دند ت?ا از

س??لول در ي??ك ميلي لي??تر106بستر كشت ره?ا ش??وند. ب??راي انجم?اد، ح?داقل محيط نگهدارنده مورد استفاده قرار گرفت تا تع??داد س??لول هاي زن??ده بع??د از ذوب كردن براي اس??تفاده مناس??ب باش??د. ب??دين منظ??ور ب??ه ي??ك ميلي لي??تر از

درص?د10 درص?د س?رم اس?تريل ج?نين گ?او و 90رسوب سلول ها به م?يزان DMSOاض??افه ش??د. ب??راي حص??ول نتيج??ه مطل??وب الزم اس??ت ت??ا دم??اي

سوسپانسيون سلول ها را به آرامي كاهش داد تا به دماي الزم رسانده ش??ود. بدين منظور ابتدا نمونه هاي آماده شده جهت فريزر در لول??ه ه??اي مق??اوم ب??ه

دقيقه در يخچال خنك شده، سپس بمدت ي??ك20فريز )كرايوتيوپ(، به مدت - وC70- نگهداري شد. پس از آن، كرايوتيوبها ابتدا ب??ه فري??زر C20ساعت در

- انتقال داده شدند.C196 ساعت به تانك ازت 48 تا 24پس از

هاي منجمد( دفریز سلول6-2مواد و وسایل

، فالسک کشتDMEM-F12محیط سرم استريل جنين گاو،

روش کار ق??رار داده ش??د ت??اC37سلول ها را سريعاً از ازت مايع خارج كرده و در دماي

ذوب گردند. سپس محتويات لوله انجماد به ي??ك لول??ه اس??تريل ح??اوی محی??طDMEM منتقل شد و در rpm1500 دقيقه در دم??اي 5 به مدت C4س??انتريفيوژ

گردي??د. رس??وب ح??اوي س??لول ه??ا را ب??ا محي??ط كش??ت س??لولي ب??ه ص??ورت

59

سوسپانسيون در آورده و پس از انتقال به فالسك كشت س?لول در انكوب??اتورCO2 دار در دماي C قرار داده شد. به??تر اس??ت پس از ي??ك ش??ب تع??ويض37

محيط انجام گردد. سپس اجازه مي دهيم كه سلولها در فالسك رشد كنند. هر-80 روز يكبار، تعويض محيط كشت انج??ام گ?رفت. بع?د از اينك??ه س??لول ها 3

-% كف فالسك را پر كردند آنها را از کف فالس??ک ج??دا ک??رده و پاس??اژ می70دهیم.

هاي منجمد ( پاساژ سلول7-2 ق??رار داده ش??د ت??اC37سلول ها را سريعاً از ازت مايع خارج كرده و در دماي

ذوب گردند. سپس محتويات لوله انجماد به يك لوله استريل منتقل ش??د و درrpm1500 دقيق??ه در دم??اي 5 به مدت C4س??انتريفيوژ گردي??د. رس??وب ح??اوي

سلولها را با محيط كشت سلولي به صورت سوسپانسيون در آورده و پس ازCدماي دار در CO2انتقال به فالسك كشت سلول در انكوباتور ق??رار داده37

شد. بهتر است پس از ي??ك ش??ب تع?ويض محي??ط انج??ام گ?ردد. س??پس اج?ازه روز يكب?ار، تع?ويض محي?ط3ها در فالس??ك رش?د كنن?د. ه?ر مي دهيم كه سلول

% كف فالسك را پ??ر كردن??د70-80كشت انجام گرفت. بعد از اينكه سلول ها آنها را از كف فالسك جدا كرده و پاساژ مي دهيم.

( شمارش سلولي8-2 به منظور شمارش سلولي، پس از تريپسينه كردن و جدا نم??ودن س??لول ها از

rpmكف فالسك محيط حاوي سلول به لول??ه اس??تريل منتق??ل ش??ده و ب??ا دور

ml دقيقه سانتريفيوژ شد. سپس مايع رويي دور ريخته شد و 5 به مدت 1000

به رسوب اضافه و با پيپت پاستور استريل ك??امالً مخل??وطDMEM از محيط 1 گرديد، سپس با استفاده از الم نئوبار تعداد سلول ها در خانه ه??اي مرب??وط ب??ه گلبول سفيد شمارش شد و از فرم?ول زي?ر تع?داد س??لول ها در ي?ك ميلي لي?تر

محاسبه شد.

تعدادسلول هايسلولها =زنده بودن درصدزنده

سلول ها تعدادكل60

( الم هموسیتومتر جهت شمارش سلولی2-3شکل

(:Viability test( تعيين درصد زنده بودن سلول ها )9-2 ميكروليتر از رنگ تريپان بلو100 ميكروليتر از سوسپانسيون سلولي با 100 دقيقه يك قطره از اين مخلوط را برداشته3 تا 2% مخلوط شد، پس از 4/0

و با استفاده از الم نئوب??ار و در خانه ه??اي مرب??وط ب??ه ش??مارش گلب??ول س??فيدتعداد سلول ها شمارش شد.

مكانيسم اين عمل اين است كه به دليل وجود پمپ هاي سديم و پتاسيم رن??گ تريپان بلو در سلول هاي زنده باقي نمي ماند در صورتيكه در سلول هاي م??رده رنگ نفوذ كرده و نمي تواند خارج ش?ود ل?ذا س?لول هاي م?رده رن?گ آبي را ب?ه خود مي گيرند با شمارش سلول هاي زنده بي رنگ و سلول هاي مرده آبي رنگ

.[67]و با استفاده از فرمول زير درصد زنده بودن سلول ها تعيين شد

4 × ميانگين تعداد سلول هاي شمارش شده در104 ميلي ليتر = 1تعداد سلول در خانه

61

ه44ای بنی44ادین ب44ا روش( تع44يين ماركره44اي س44طحي س44لول10-2 فلوسايتومتري

های بنیادین خون قاعدگی درصد بی??ان تع??دادیبه منظور بررسی ماهیت سلول،CD10ه?ای س??طح س??لولی بنی??ادین مزانش??یمی نظ??یرژناز آن??تی STRO1، CD9،

CD29، CD73، CD44 وCD105و برخی مارکره?ای داخ?ل س??لولی مرتب??ط ب??ا ب??ا روش فلوس??ایتومتری ارزی??ابی ش??دند.OCT-4های بنیادین جنینی نظیر سلول

ه??ای هماتوپوئتی??ک، بی??انهمچ??نین ب??ه منظ??ور بررس??ی ع??دم آل??ودگی س??لول،CD34ه??ا نظ??یر مارکره??ای اختصاص??ی این س??لول CD38، CD133 و CD45در

های کشت داده شده مورد بررسی قرار گرفت. سلول

مواد و وسايل PBS%2لوله فالکون، –FBSمحل?ول ف?رم آلدهي?د جهت فيكس ك?ردن نه?ايي ،

هاسلول

FITC-conjugated mouse anti human CD45آنتي بادي های مونوكلونال

FITC-conjugated mouse anti human CD34آنتی بادی مونوکلونال FITC-conjugated mouse anti human CD38آنتی بادی مونوکلونال

FITC-conjugated mouse anti human CD9آنتی بادی مونوکلونال FITC-conjugatedآن??تی ب??ادی مونوکلون??ال mouse IgG1k negative control

(isotope control) un-conjugated mouse anti human STRO1آنتی بادی مونوکلونال

FITC-conjugated sheep anti mouseآنتی بادی پلی کلونال

62

un-conjugated rabbit anti human OCT-4آنتی بادی پلی کلونال

FITC-conjugated goat anti rabbitآنتی بادی پلی کلونالPE-conjugated mouse anti human CD29آنتی بادی مونوکلونال

PE-conjugated mouse anti human CD73 آنتی بادی مونوکلونال

PE-conjugated mouse anti human CD133آنتی بادی مونوکلونال

PE-conjugated mouse anti human CD105آنتی بادی مونوکلونال PE-conjugated mouse anti human CD44آنتی بادی مونوکلونال PE-conjugated mouse IgG1k negative control (isotopeآنتی بادی مونوکلونال

control)

Anti- P63 antibodyآنتی بادی مونوکلونال

Anti- Involucrin antibodyآنتی بادی پلی کلونال

Anti-Cytokeratin 14 antibodyآنتی بادی مونوکلونال ساپونین

تهی??هAbcam(USA) و BD(USA)،eBioscience(USA)ه??ای ه??ا از ش??رکتآن??تی ب??ادی تهیهSigma-USA از شرکت FITC-conjugated goat anti rabbitشدند. آنتی بادی

FITC-Conjugatedب??ادی و آنتی goat anti rabbitدر پژوهش??گاه ابن س?ینا تولی??د شده است.

روش آزمايش فلوسايتومتري 7 س??لول ریخت??ه و ب??ه م??دت2×105در لول??ه تس??ت و کن??ترل منفی هرک??دام

ح??لPBS-FBS%2 سانتریفیوژ ش??د. رس??وب ج??دا ش??ده درg200دقیقه در دور های ذک??ر ش??دههای تست آنتی بادیشده و سه بار شسته شدند. سپس به لوله

50ه??ا ب??ه م??دت های کنترل منفی ایزوتیپ کنترل اضافه ش??د. س??لولو به لوله دقیقه در ت??اریکی و روی یخ در حض??ور آن??تی ب??ادی انکوب??ه ش??دند. پس از این

دقیق??ه س??انتریفیوژ ش??دند.7 به مدت g200 در دور PBS-FBS%2 بار با 3مدت % فيكس و تا1بعد از آخرین شستشو رسوب سلولی در محلول فرم آلدهيد

63

ب??ادیآم??یزی ب??ا آن??تی ق??رار داده ش??د. ب??رای رن??گC4زم??ان آن??اليز در يخچ??ال ها ب??ه م??دت سلولPBS-FBS%2ها با پس از شستشوی سلولSTRO1غیرکنژوگه

%2 بار با 2 انکوبه شدند. پس از این مدت STRO1بادی اولیه دقیقه با آنتی40PBS-FBSب??ادی ثانوی??ه شسته و با آنتیFITC-conjugated sheep anti mouseب??ه

شس??ته وPBS-FBS%2ها سه بار ب??ا دقیقه انکوبه شدند. سپس سلول30مدت ق??رار دادهC4% فیکس و تا زمان آن??اليز در يخچ??ال 1در محلول فرم آلدهيد

پس ازOCT-4ها با آنتی بادی داخ??ل س??لولی شدند. در مورد رنگ آمیزی سلول % فیکس4 دقیق??ه درف??رم آلدهيد10 ، ب??ه م??دت PBSشستشوی س??لول ه??ا با

شسته وبه منظور افزایش نفوذپ??ذیریPBSها با شدند. پس از این مدت سلول دقیقه در دور7/. % حل و 1آنتی بادی در سلول رسوب سلولی در ساپونین

g200دقیق??ه ب??ا آن??تی ب??ادی40ه??ا ب??ه م??دت س??انتریفیوژ ش??د. س??پس س??لول ب??ار ب??ا س??اپونین2ه??ا انکوبه شدند. پس از این مدت سلولOCT-4غیرکنژوگه

FITC-conjugated شسته و ب??ا آن??تی ب??ادی ثانویهg200% در دور 1/0 goat anti

rabbit بار با 3ها دقیقه انکوبه شدند. سپس سلول30 به مدت PBSشس??ته و ق??رار دادهC4% فیکس و تا زمان آن??اليز در يخچ??ال 1در محلول فرم آلدهيد

Partec (Germany)شدند. آناليز نمونه ها با استفاده از دستگاه فلوسايتومتري

انجام شد.

سازی داربست( آماده11-2 به منظور تهیه داربست، از پرده آمنیوتیک به عنوان بس??تر اس??تفاده ش??د. این

با نانوفیبر فیبروئین استخراج ش??ده بستر با استفاده از روش الکتروریسندگیاز پیله ابریشم بومبیکس موری پوشانده شد.

به منظور آماده س??ازی پ??رده آمنیوتی??ک، پ??رده آمنیوتی??ک پس از جداس??ازی از جفت جنین به دنیا آم??ده ب??ه روش س??زارین، ب??ا محل??ول ب??افر نمکی فس??فات

64

ه??ای اپیتلی??وم، از آن??زیمش??د. س??پس ب??ه منظ??ور زدودن س??لولشستش??و داده شد. برای سهولت استفاده از پرده به عنوان داربست ازترموالیزین استفاده

روش خشکاندن انجمادی استفاده شد. به منظ??ور اطمین??ان حاص??ل ک??ردن از ائوزین به ک??ار ب??رده ش??د.آمیزی هماتوکسیلین زدایش الیه اپیتلیوم، روش رنگ

زدایی در فرم??الین تث??بیت ک??رده، درپ??رده آمنیوتی??ک را قب??ل و پس از س??لول(2-4آمیزی انجام شد. )شکل پارافین خوابانده و از آن برش تهیه کرده و رنگ

DAزدایی وقبل از سلولA –( رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین از پرده آمنیوتیک 2-4شکل

زداییپس از سلول

اولین مرحله استخراج فیبروئین، صمغ زدایی کردن تارهای ابریشم بومبیکس ه??ای بوم??بیکس م??وری ب??از وزدایی، ابت??دا پیل??هموری است. ب??ه منظ??ور ص??مغ

02/0ها در محلول شفیره کشته شده با بخار آب از آن خارج شد. سپس پیله پیل?ه،3موالر کربنات سدیم به مدت یک ساعت جوش??انده ش??د. ب?ه ازای ه?ر

باشد. الیاف به دس??تلیتر از این محلول ضعیف قلیایی مورد نیاز می میلی750 زدایی شده سرد و گرم شستش??و داده ش??د و مرتبه با یک لیتر آب یون3آمده

به مدت یک شب در زیر هود خشک شد. در مرحله بعد، از یک محل??ول غلی??ظ زداییه??ای ص??مغ موالر لیتیوم برماید( برای حل ک??ردن پیل??ه3/9نمک )محلول

درج??ه55% وزنی( و این مرحل??ه در دم??ای 10شده استفاده شد )ب??ا نس??بت س??اعت انج??ام گ?رفت. در مرحل??ه بع?د، ب?ه منظ?ور ب?ه5سانتی گرادبه مدت

65

دست آوردن محلول فیبروئین عاری از نمک، محلول غلی??ظ نم??ک و فی??بروئین 12 س??اعت در غش??ای دی??الیزی ب??ا ض??ریب خ??روج مولک??ولی 36ب??ه م??دت

مرتب?ه آب6 الی 5کیلودالتون در آب ف?وق خ?الص دی?الیز ش?د. در این م?دت تعویض شد. در مرحله نهایی ب??ه منظ??ور ب??ه دس??ت آوردن پ??ودر فی??بروئین، از

()ش??کل2-5روش خشکاندن انجمادی برای تصعید آب اس??تفاده ش??د. )ش??کل 6-2)

زدایی مرحله صمغ– از پیله ابریشم بومبیکس موری فیبروئیناستخراج( 2-5شکل

66

مراحل حل کردن– از پیله ابریشم بومبیکس موری فیبروئین( استخراج 2-6شکل شده در محلول غلیظ نمک و دیالیز محلول حاصلزداییفیبرهای صمغ

برای تهیه نانوفیبر از روش الکتروریسندگی استفاده شد. در این روش از یک منبع ایجاد اختالف پتانسیل باال بین خروجی مخزن حاوی محلول پلیمری مورد

کننده وکننده )کالکتور( برای حرکت محلول پلیمری به سمت جمعنظر و جمع شود. پس از تهیه محلول از فیبروئین استخراج ش??ده،ریسیدن آن استفاده می

ن??انوفیبر ب??ه ص??ورت100ش??دند. نانوفیبرها بر روی پ??رده آمنیوتی??ک ریس??یده گیری قطر آنها اندازهImageJتصادفی انتخاب شده و با استفاده از نرم افزار

(2-7 نانومتر است. ) شکل 250شد و قطر حاصل

67

( تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از مورفولوژی نانوفیبر تهیه شده از2-7شکل فیبروئین به روش الکتروریسندگی

در این مرحل??ه جهت اس??تریل نم??ودن اس??کفولدهای تهی??ه ش??ده، ب??ه ان??دازه خانه بریده شده و در ت??ه چاه??ک ق??رار گرفت??ه24مساحت یک چاهک از پلیت ه??ای مخص??وصت??وان از حلق??هداش??تن داربس??ت میشد. ب??ه منظ??ور ث??ابت نگ??ه

ان??د اس??تفاده نم??ود. ب??رای اس??تفاده ازنگهداری داربست که قبال استریل شده را به روش??ی ک??هداربست به منظور ریختن سلول روی آن ابتدا باید داربست

نشان داده شده استریل نمود:2-1در جدول

زمان )دقیقه(عملکرد30الکل استریل

PBS5بار تکرار نمود(3توان )می Overnightمحیط بدون سرم

( جدول زمانی استریل کردن داربست2-1جدول

ه?ا جهت اطمین?ان از ع?دمبعد از اضافه نمون?دن محی?ط ب?دون س?رم داربس?ت در انکوباتور قرار داده شدند. Overnightآلودگی

68

ه44ای بنی44ادی مش44تق از خ44ون قاع44دگی ب44ه( تم44ایز س44لول12-2کراتینوسیت

مواد و وسایلEpilifeمحی???ط کش???ت ) life technologies, gibco.UK( ،ترانس???ول

Transwell)Thincert, greiner, nederlands( ، محیط کشتDMEM F-12 (Gibco,

UK)( سرم جنین گاو ،FBS)

روش کار×104تع??داد خان??ه ک??ه روز قب??ل24 در ه??ر چاه??ک پلیت MenSCs س??لول 3

DMEM-F12داربست در آن آماده ش??ده ب??ود، ریخت??ه ش??د و در محی??ط کش??ت

Confluency ب??ه م??دت ی??ک ش??ب انکوب??ه ش??د. وق??تی ک??ه FBS%?? 10محت??وی

% رسید محیط رویی را خ?الی ک??رده و داخ?ل ه?ر چاه??ک ی??ک100سلولها به ×104 ق??رار داده ش??ده و ب??ه م??یزان Transwellعدد س??لول کراتینوس??یت3

س??ی4ها و ترانس??ول ب??ا داخل ترانسول ریخته می شود. چاهک محتوی سلول روزه21 روز یکبار در طول یک دوره 3 پر شده و این پروسه هر Epilifeسی

تکرار می شود.

ها در حضور ترانسولکشتی سلول( نمایی از هم2-8شکل

69

ه44ای کن44ترل مثبت از نمون44ه به روش دستیRNA( استخراج 13-2 ه44ای بنی44ادی خ44ون قاع44دگی ب4ا اس4تفاده ازکراتینوس44یت و س44لول

RNA-PLUSمحلول

مواد و وسايل,Merkکلروف??رم خ??الص ) Germany )??،75ات??انول( ?% Merk, Germany)،

)100ایزوپروپ??انول ?%Merk, Germany )??، محل??ولRNA-PLUS )Cinnagen(، ، آب مقطرml Pyrogen SAFE) 1.5 (DNase, RNase (G.Kisker)میکروتیوب

DEPCدوبار تقط??یر اس??تریل treatedس??یناژن،ای??ران(، دس??تگاه س??انتریفیوژ( ,Hettichیخچ???ال دار ب???ا دور ب???اال ) Germany( س???مپلر متغ???یر ،)Eppendorf,

Germany( دستگاه ورتکس ،) Hettich, Germany( دستکش یک بار مص??رف ،)Arista Powder Free, Indonesia آنزیم ،)DNase I )Fermantase)،

روش کار RNA شرايط وي??ژه و اي??زوله اي را مي طلب??د، زي??را از ي??ك ط??رف RNAكار با

درRNaseناپايدار است و از طرف ديگر حضور گسترده آن?زيم بس?يار مق?اوم ش??رايطRNAفضا و وسايل و سطوح كار، همه باعث شده اند كه براي كار با

موج??ود ب??ر رويRNaseخاصي رع??ايت ش??ود. معم??والً جهت غيرفع??ال ك??ردن وس??ايل، دس??تكش ها و ظرف ه??اي پالس??تيكي از م??اده دي اتي??ل پيروكربن??ات )

DEPCاستفاده مي شود. اين ماده فعاليت بازي نمون??ه را اف??زايش داده و ب??ا ) را ب??ا اتوكس??ی فرميل??ه ك??ردن گ??روه هس??يتديلRNaseاين كار فعاليت آنزيم

متوقف مي كند. آماده شده س??پس ظ??روف، سرس??مپلرها وDEPC% از 1/0ابتدا محلول آبي

Cميكروتيوپ ها در اين آب به مدت يك ساعت در ي??ا ي??ك ش??ب در دم??اي37 دقيقه ات??وكالو ش??د و آب آنه??ا خ??ارج20اتاق قرار داده شده، سپس به مدت

دقيق?ه ات?وكالو ش??د و پس از خش??ك ش??دن م?ورد25گردید و مجدداً به مدت استفاده قرار گرفت.

70

از تانك الكتروفورز ابتدا تانك و شانه و كليه وسايلي كه بهRNaseبراي حذف نحوي با ژل در تماس هستند شسته شد و سپس با اتانل مطلق خشك گردید

قرار داده سپس آنرا خ??الي ك??رده و ب??ا آبH2O2 3% دقيقه در 10و به مدت DEPCشسته و مورد استفاده قرار گ??رفت. ظرف ه??ا و وس??ايل شيش??ه اي در زدايي شد.RNase ساعت با فور، 2 درجه به مدت 200دماي

ب??ار3پس از جداسازي سلول ه??ای م??ورد نظ??ر از ك??ف پليت و ی??ا فالس??ک و )x)1شستشو با PBS سانتریفیوژ با دور ،rpm1500 دقیق??ه5 ب??ه م??دت زم??ان

ميكرولي??تر از محل??ول1000انجام شد. به ازاي هر يك ميليون سلول مق??دار RNA-PLUS دقیقه چندين بار مخلوط گرديد تا1سرد اضافه و به مدت زمان

حف??ظRNA از آنجائیکه در تمام مراح??ل اس??تخراج .سلول ها كامال ليز شوند -20زنجیره سرمایی ضروری می باشد، تمامی مواد مورد استفاده در دم??ای

ثانی??ه محل??ول ف??وق را3درج??ه س??انتیگراد نگه??داری ش??دند. ب??ه م??دت زم??ان حجمی( كلروف??رم ب??ه ه??ر٪20 میكرولی??تر )200ورتکس و هم??وژن ش??د.

دقیق??ه انکوباس??یون در دم??ای ات??اق انج??ام ش??د.5میکروتیوب اضافه گردید و میزان کلروفرم وابسته به میزان پروتئین سلول و بافت متغییر است. محلول

درج??ه4 دقیق??ه در دم??ای 5 ثانی??ه تك??ان داده ش??د و 16فوق به م??دت زم??ان سانتیگراد انکوباسیون انجام گرفت. پس از طی زمان مورد نظر میکروتی??وب

درجه سانتیگراد سانتریفیوژ4 دقیقه در دمای 15 به مدت rpm 15000با دور شد. پس از سانتریفیوژ دو فاز به دست آمد ؛ فاز آلی )آبی رنگ و حاوی فن??ل

، در قس??متRNAو كلروفرم، درقسمت پایین( و فاز آبی )بی رن??گ و ح??اوی باال(. در بین دو فاز نیز الیه نازک و سفید رنگی ک?ه ح?اوی پروت?ئین ب?ود دی?ده شد. فاز آبی به آرامی جدا شد و به میکروتیوب جدید منتقل گردید. به منظور

، هم حجم مایع جدا شده، ایزوپروپانل خالص اضافه ش??د وRNAرسوب دادن - درج?ه س??انتیگراد انکوب??ه ش??د. پس از20 دقیقه در دمای30حداقل به مدت

دقیق??ه،15 به مدت rpm15000 درجه سانتیگراد با دور 4سانتریفیوژ در دمای 1ها به آرامی برگردانده شدند تا مایع موج??ود در آنه??ا خ??ارج ش??ود. میكروتیوب

71

ه?ا اض?افه گردی?د رس??وب ب?ه به رسوب انتهای میكروتیوب٪75میلی لیتر اتانل خوبي ورتكس شد تا از ته ميكروتي??وب ج??دا گش??ته و در الک??ل شس??ته ش??ود.

دقیق??ه8ب??ه م??دت rpm7500 درج??ه س??انتیگراد ب??ا دور 4سانتریفیوژ در دمای ها به آرامی برگردانده شدند تا اتانل اضافی خارج ش??ود.انجام شد. میكروتیوب

ها به صورت وارونه قرار داده شدند تا الك??ل ب??ه ط??ور كام??لسپس میكروتیوب خارج و رسوب خشك شود. البت??ه بای??د دقت ك??رد رس??وب ب??ه م??دت ط??والنی

به شدت در آب مقط?ر ك?اهشRNAخشك نشود زیرا در این صورت حاللیت 20 دقیق??ه می باش??د. رس??وب در 12پی??دا می كن??د زم??ان م??ورد نظ??ر ح??دود

درصد( حل شد. به نمونه به ميزان01/0 )DEPCميكروليتر آب تيمار شده با RNA احتم??الي موج?ود در DNA جهت ح??ذف DNase Iيك ميكروليتر از آنزيم

درج??ه37 دقيق??ه در دم??اي 15اس??تخراج ش??ده، اض??افه گردي??د و ب??ه م??دت درج??ه60 دقيق??ه در دم??اي 5سانتي گراد انكوبه شد. مخلوط ف??وق ب??ه م??دت

انكوبه شد.DNase I براي حذف EDTAسانتي گراد با

RNeasyهای تمایزیافته با استفاده از ) سلولRNA( استخراج 14-2

Mini Kit Qiagen USA)

محتویات کیت شامل موارد ذیل می باشد: که شامل اتانلRW1 که محتوی گوانیدین تیوسیانات می باشد، بافر RLTبافر

RNase که حاوی گوانیدین هیدروکلری??د می باش??د، RPEمی باشد، بافر –free

water ، تیوپ جمع آوریml RNeasy، فیلتره??ایی ب??ه ن??ام 2 و 5/1 Mini spin

columns

، RLTنکته: قبل از استفاده از بافر µL10بتا-مرکاپتواتانول ب??ه ازاء ه??ر میلی م??اه قاب??ل نگه??داری در دم??ای ات??اق می1لیتر از بافر اضافه شد. این بافر تا

باشد.

72

ها، ابتدا سلولها ب??ا اس??تفاده از تریپس??ین از ک??ف از سلولRNAبرای استخراج ب??ه م??دتg500 سلول جدا شده و پس از شمارش با ش??رایط داربست کشت

درPBS س??لولی ب??ا pellet بارشستش??وی 3 دقیقه سانتریفوژ شدند. بع??د از 5 ح??ل ش??د. در مرحل??ه بع??دRLT میکرولیتر ب??افر 350نهایت رسوب سلولی با

و % ب???ه آن اض???افه و ب???ه آرامی پیپت???اژ شد70 میکرولی???تر اتان???ل 350 میلی لی??تری2سوسپانسیون بدست آمده به س??تونی ک??ه ب??ر روی ی??ک تی??وب

gسوار بود انتقال داده شد و در شرایط ثانی??ه س??انتریفوژ15 به م?دت 8000 میکرولی??تر از700شد. پس از سانتریفوژ مایع زیری دور ریخت??ه ش??د س??پس

g به روی ستون ریخت??ه ش??د و دوب??اره در ش??رایط RW1بافر 15 ب??رای 8000 ثانیه سانتریفوژ شد. پس از اتمام سانتریفوژ دوباره مایع زیری دور ریخته شد و با دقت ستون از لوله جدا گردید به گونه ایکه ستون ب??ا م??ایع زی??ری تم??اس

میلی لیتری گذ اشته شد و2نیابد. در این مرحله ستون روی یک تیوب جدید بهg 8000 روی ستون ریخته و با شرایط RPE میکرولیتر از بافر 500این بار

میکرولی??تر از500 ثانیه سانتریفوژ شد. پس از تکرار مرحل??ه قب??ل، 15مدت g دقیق??ه و ب??ا دور 2 ب??ه روی س??تون ریخت??ه ش??د و این ب??ار RPEب??افر 8000

سانتریفوژ شد. پس از تعویض لوله زیر ستون بدون اینکه بافری به آن اضافه سانتریفوژ شد.13200 دقیقه در دور 1شود ستون برای

سی سی معمولی گذاشته شد و پس از5/1در مرحله بعد ستون روی تیوب g دقیقه با دور 1به مدت RNease Free میکرولیتر آب50 تا 20اضافه کردن

.[93]- نگهداری شدC20 سانتریفوژ شد و در دمای 8000°

استخراج شدهRNA( بررسي كيفيت 15-2 اس??پکتروفتومتري وUV، کميت و کيفيت آن ب??ا روش RNAپس از اس??تخراج

الکتروفورز ژل آگارز بررسي گرديد.

Picodropدستگاه اسپکتروفتومتر

73

نمون??ه م??ورد نظ??ر ب??ا اس??تفاده ازODب??ا اس??تفاده از این دس??تگاه، غلظت و سرسمپلر های طراحی شده برای این دستگاه م??ورد بررس??ی ق??رار می گ??یرد.

DNA و RNA نانومتر جذب280 و پروتئين در طول موج 260در طول موج حائز اهميت است، م??يزان پروتئي??نيRNAدارند. نكته ديگري كه در استخراج

RNAاست ك?ه ب?ه هم?راه آن اس?تخراج مي ش??ود جهت تع?يين درج?ه خل?وص

نانومتر ب??ه ج??ذب در260استخراج شده از نسبت جذب نمونه در طول موج است. پايين1/2 تا 7/1 نانومتر استفاده مي شود كه بهترين نسبت بين 280

بودن اين نسبت نشان دهنده آلودگي به پروتئين است.

( دستگاه پیکودراپ2-9شکل

مواد و وسایل ،)UVpette )Picodrop, UKسرسمپلر ،?( Picodrop, UKدستگاه اسپکتروفتومتر )

)P2 (Gilson, Franceسپملر

روش کار

74

میکرولیتر ب??ه داخ??ل سرس??مپلر کش??یده و س??ر3از هر نمونه حجمی برابر با سمپلر را وارد محفظه مخصوص تعبیه شده در دستگاه ش??د ت??ا ان??دازه گ??یری

نوری انجام شود. RNase بايد توسط وسايل RNAنكته: تمام مراحل كار با freeو ب??ا دس??تكش

انجام شود.

های کراتینوسیت استخراج شده از سلولRNA( نمودار میزان غلظت 2-10شکل با استفاده از دستگاه پیکودراپ

( الكتروفورز ژل آگارز16-2 اس??تخراج ش??ده و اطمين??ان از ع??دم تجزي??ه آن درRNAجهت بررسي كيفيت

درصد و رنگ آم??يزي اتي??ديوم1طي مراحل استخراج الكتروفورز با ژل آگارز نیز ازPCRبرمايد انجام شده است. به منظور بررسي و مشاهده ي محصول

ژل آگارز استفاده گردید. سالم بودن باندهاي ريبوزومي و قدرت آنها نش??انگر مورد نظر ما است. نمونه هايي ب??ا کيفيتRNAقدرت استخراج و سالم بودن

75

.عالي، حداقل اسمير را در باال، بين و پ??ايين بان??دهاي م??ذکور نش??ان مي دهند

(2-11)شکل

استخراج شده بر روی ژل آگارزRNA( عکس از محصول 2-11شکل

مواد و وسايل ( بروموفن??ل بل??و، رن??گX6ب??افر س??نگين کنن??ده )، TAE(X1بافر الکتروفورز )

,mg/ml200()Rochاتی??دیوم برومای??د ) Germany پ??ودر آگ??ارز ،)(Rochپ??ودر ،) Tris-baseتریس )Plusone, Sweden( ،( اس??ید اس??تیکMerck )??،ش??اخص وزن

Geneمولک??ولي ) Ruler 100 bp DNA ladder ??)(Fermantaseمنب??ع تغذي??ه ،) UVالکتريکي، دستگاه ترانس لوميناتوريا Doc )UVP, USA( ،سمپلر متغ??یر

10-5/0( Eppendorf, Germany ) ?، ،تانک الکتروفورز افقي، قالب ژل وترازو ( BioRad)شانه مخصوص

روش كار براي تهيه ژل، پودر آگ??ارز را پس از تع??يين درص??د ژل وزن ك??رده و درمق??دار

حل گردید. درصد ژل اس??تفاده ش??ده در اين مطالع??ه ب??رايTAE(1X)مناسب است. بسته بهPCR 2% و براي مشاهده ي محصول RNA 1%بررسي کيفيت

درصد آگارز در ژل و حجم نهايي ژل، مقداري پودر آگ??ارز وزن مي ش??ود و ب??ه ح??ل ش??د.TAE(1X)كمك حرارت و همزدن م??داوم در حجم مناس??بي از ب??افر

درج??ه رس??يد،55 تا 50پس ازاين كه محلول شفاف گرديد و دماي محلول به

76

ب??ه طوريك??ه ديگ??ر بخ??اري از آن متص??اعد نش??ود، از محل??ول اتي??ديوم برماي??د،مقداري به ژل اضافه گردي??د، بطوريك??ه غلظت نه??ايي اتي??ديوم برماي??د در ژل

μg/ml باشد. محلول آگارز به سيني مخص??وص ژل ک??ه ح??اوي ش??انه هاي5/0 ويژه اي در جاي مشخص است، اضافه شده و اج??ازه داده ش??د ت??ا ژل س??فت

ميليم??تر5 تا 3شود. سپس شانه ها به آرامي برداشته شد. ضخامت ژل بايد باشد در غير اين صورت باندها به وضوح ديده نمي شوند. سینی ح??اوي ژل در

پ??ر ش??د ب??هTAE(1X)تانك الكتروفورز افقي گذاش??ته ش??د و تان??ك ب??ا محل??ول که برايTAEطوريكه محلول اندكي روي ژل را بپوشاند. ضروري است بافر

تهيه ژل استفاد ه ميشود و بافري كه در تان?ك ريخت?ه ميش?ود، از ي?ك اس??توك س??بب ايج??ادpHتهي??ه ش??وند زي??را ك??وچك ترين اختالف در ق??درت ي??وني ي??ا اثرRNA و DNAميدان هايي در ژل مي شود كه مي تواند روي حركت قطعات

حجم محلول به آن بافر سنگين کنن??ده اف??زوده ش??د و20/0بگذارد. به اندازه سپس به آرامي درون چاهک ريخته شد. جريان الكتريسيته مس??تقيم ب??ه تان??ك وصل شد، چاهكها طرف قطب منفي قرار گرفتن??د اس??يدهاي نوكلئي??ك داراي بار منفي هستند و بنابراين روي ژل به سمت مثبت حركت مي كنند. ولت??اژ ب??ه

(.V 100- 10 از طول ژل تنظيم شد. )معموال cm 1 به ازاي هر V 5-1صورت ب??هRNA با استفاده از رنگ مشخص مي گردد. وقتي ك??ه RNAميزان حركت

( پ?ايين آم?د جري?ان قط?ع گردی?د و ب?ا اس?تفاده از3/2اندازه كافي )بيشتر از دستگاه ژل داك یا ترانسلوميناتور از ژل عكس گرفت?ه ش??د. ب?ه چن??د دلي?ل از بافرسنگين کننده استفاده مي شود، بافرهاي راهنما از تركيب اص??لي رن??گ و ي??ك م??اده غلي??ظ و چس??بنده مث??ل گليس??رول ي??ا س??وكروز تش??كيل ش??ده ان??د. ويسكوزيته نمونه با استفاده از اين بافرها افزايش مي يابد و انتقال نمونه به داخل چاهك آسان مي گردد. با ايجاد رنگ در نمونه انتق??ال آن ب??ر روي ژل ب??ا اطمينان بيشتري انجام مي شود. رنگهاي مورد استفاده در بافر راهنم??ا خ??ود نيز باردار شده و همراه اسيد نوکلئيک به سمت آند ح??ركت مي كنن??د بن??ابراين

اگ??رRNAميزان حركت اسيد نوکلئي??ک قاب??ل پيش بي??ني مي ش??ود. در م??ورد

77

S28 و S18 س??الم باش??د، دو بان??د RNAتفكيك به خوبي صورت گرفته باشد و

ن??یز بان??د م??ورد نظ??ر قاب??لPCRدر ژل مشخص مي شود، در مورد محص??ول .رویت می باشد

استخراج شدهRNA از cDNA( تهيه 17-2RNA تک رشته ای و بسیار نا پایدار است. کیفیت نمونه حتی در دمای c°70با -

تجزی??ه می ش??ود. ب??رایRNAگذشت زمان کاهش می یابد و مقادیر زی??ادی از cDNA استخراج شده در حداقل زمان ممکن به RNAرفع این مشکل نمونه

که دو رشته ای و پایدار تر است تبدیل می شود. در فرایند رونویس??ی معک??وس راRNA به عنوان الگو، تک رشته ای مکملRNA با استفاده از RTابتدا آنزیم

ن??ام دارد و ي??ك رش??ته آن??تيcDNA ب??وده و DNAسنتز می کند. رشته حاص??ل اولی??ه در نمون??ه RNA متناسب با تعداد کپی ه??ایcDNA سنس است. مقدار

خواهد بود.

مواد و وسايلxبافر مخص??وص آن??زيم رونويس??ي معك??وس Buffer) 5)Invitrogene, Canada(

) First- strand ، dNTP غلظت رونويسي10mM(Roche, Germany)با آنزيم ، SuperScript™ǁ معكوس Reverse Transcriptase Enzyme (Invitrogene,

Canada( مهار کننده وRNase( 40 با غلظت u/ µl ?) (Fermentase, Germany،) 0/1 MDTT ((Invitrogene, Canada( نوکلئوتیدتری فسفات dNTPs ، دزاکسی

10 mM( ?)Roche, Germany ( پرایم??ر رن??دوم هگزام??ر ،)pmol/μl20 N6( ?)Fermentas, Germanyآب مقطر دوب??ار تقط??یر اس??تریل، س??مپلر های متغ??یر ،)

10-5/0 ??،100-10 ??،1000-100( Eppendorf ,Germany میکروتی??وب ،)μl

2/0Pyrogen SAFE ، DNase وRNase )G.KISKER ,Germany( ،دس??تگاه -1000سر سمپلر ،?( Eppendorfmastercycler gradient ,Germanyترموسایکلر )

100 ???،100-10 ???،10-5/0،Pyrogen Free،DNase وRNase )BOECO,

Germany(

78

روش كارμg ک???ه در نظ???ر گرف???تیم cDNAغلظت باش???د و ب???ر حس???ب غلظت می2

RNA بدست آمده میت?وان از محص??ولRNAبرداش?ت و طي مراح?ل زي?ر از ساخت.cDNAآنها

و ت??ك رش??ته ای ش??دن آن، حجمRNAبه منظور باز شدن پیچ خوردگی ه??ای از µL 1 هم??راه با2/0 را برداشته و در ی??ک میکروتی??وب RNAمورد نظر از

dNTPو µL 1 از رندوم هگزامر pm 20 ب??ار تقط??ير2 مخلوط ك??رده و ب??ا آب دقيقه5 درجه براي 65 رسانده شد. مخلوط فوق در µL 12استريل به حجم

ازRNAانكوبه شده و سپس فوراً بر روي يخ منتقل شد تا ساختارهاي ثانويه هم باز شده و فرص??ت ك??افي ب??راي س??اخته ش??دن مج??دد نداش??ته باش??ند. ب??ه

Xمخلوط فوق بافر واكنش U/µL، مهاركنن??ده ريبونوكلئ??از )µL 4 به م??يزان 5

درجه25 اضافه گرديد و در µL 2 به ميزان M DTT 1/0 و µL 1( به ميزان 40 super script از آنزيم ترانس كريپتاز معكوس µL 1 دقيقه انكوبه شد. 5براي

ǁ 200 u/µl درجه و س??پس25 دقيقه در 10 اضافه گرديد. مخلوط فوق ابتدا درج??ه72دقيق??ه در 15 درج??ه س??انتي گراد و 42 دقيق??ه در 50ب??ه م??دت

سانتي گراد در دستگاه ترموسایكلر قرار داده شد.

موادحجم4µlFirst- strand Buffer (5 x)

1µldNTPs Mix (10 m M)

1µlN6-Random Primer (20 pmol/

µl)

1µlRT-Enzyme (200U/ µl)

1µlRibolock RNase Inhibitore

(40u/ µl)

2µlo/1 M DTT

xµlآب مقطر دو بار تقطیر استریل

79

CDNAمقادیر و غلظت مواد مورد نیاز در واکنش سنتز ( 2-2جدول

ميکروتيوب ها دردستگاه ترموسايکلر که به طريق زير برنامه ريزي ش??ده ب?ودقرارداده شد :

cDNAسنتز ( برنامه زمانی2-3جدول

- درج??ه20 در فري??زر PCRس??اخته ش??ده ت??ا زم??ان انج??امcDNAنمون??ه ه??اي سانتيگراد نگهداري شد.

دم?????????????ا)س??انتی گراد

)زمان

2510

دقيقه

4250

دقيقه

7015

دقيقه

80

PCR( دستگاه ترموسایکلر 2-12شکل

,K14ه44ای اختصاص44ی ( ط44راحی و آم44اده س44ازی پرایم44ر ژن18-2

IVL,P63 وGAPDH

Realو PCRطراحی پرایمر ژن های هدف در بافت های مختلف جهت انج??ام

Time PCR با استفاده از پایگ??اه ه??ای اطالع??اتی NCBIو UCSCهمچ??نین ن??رم انجام گردید.Gene Runner وPrimer3افزارهای

تمامی پرایمره??ای ط??راحی ش??ده جهت محاس??به ط??ول محص??ول اختصاص??یPCR( محاس??به دم??ای ذوب ،Tmپرایم??ر و همچ??نین اطمین??ان از ع??دم وج??ود )

واقعPrimer Blast، با استفاده از نرم افزار PCRمحصوالت غیر اختصاصی در ه??ار م??ورد بررس??ی ق??رار گرفتن??د. در ط??راحي پرايمNCBIدر پایگاه اطالعاتی

بايستي به نكات زير توجه داشت: نوکلئوتید(.27 تا 18پرايمرها بايستي ا زنظر طول مناسب باشند )بین

%(.40-60غني باشند )GCپرايمرها بايستي از نظر ترادف پشت سر هم از پلي پيريميدين و پلي پورين نداشته باشند.

يك پرايمر نبايد داراي قسمت هاي مكملي كه لوپ تشكيل دهد، باشد.

81

دو پرایمر نباید با یکدیگر مكمل باشند و ايجاد پرايمر دايمر كنند. مناس??ب، فع??اليتAnnealingپرايمره??ا ط??وري ط??راحي ش??وند ك??ه در دم??اي

نمايند. به عنوان کنترل داخلي در نظرگرفته شدند.GAPDHنکته: ژن

( راFبراي طراحي پرايمرها، مطمئن ترين روش آن است که پرايم??ر س??نس ) ( را در ابتداي اگزون بع?دي ق?رارRدر انتهاي يک اگزون و پرايمر آنتی سنس )

ايDNA، در نمونه ه??ايي ک??ه آل??ودگي DNAدهيم. دراين حال از تکث??ير ش??دن دارند، جلوگيري به عمل مي آيد. در مورد کليه پرايمرها جستجو با اس??تفاده از

با ژنوم انجام شد تا از منحصر به فرد بودن محل جفت شدنBlastنرم افزار پرايمرها اطمينان حاصل شود. نتايج جستجو در ژن??وم انس??ان، نش??ان داد ک??ه کليه پرايمرها محل اتصال منحصر به فردي را دارا مي باشند. پرايمرها توسط

دانمارک به صورت ليوفيليزه سنتز شدند.Copenhagenشرکت برای استفاده و ذخیره سازی این پرایمرها ابتدا طبق مق??ادیر تع??یین ش??ده از سوی شرکت سازنده برای هر یک از پرایمرها، با افزودن آب مقطر اس??تریل

pmol/μLدوبار تقطیر، محلولي از پرايمرها با غلظت به دست آمد ک??ه ب??ه100 - نگهداري شد. جهت تهی??ه پرایم??ر ه??ایC20عنوان پرایمر ذخيره اي در دماي°

براب??ر رقي??ق ش??دند. ب??راي تهی??ه این10قاب??ل اس??تفاده، پرایمره??ای ذخ??یره آب مقطر استريلμL90 از پرایمر ذخیره را برداشته و به آن μL 10پرایمرها،

pmol/µLاضافه شد. پس از رقیق س??ازی، غلظت پرایمره??ای قاب??ل اس??تفاده

PCR خواهد بود که جهت انجام10 Real-timeاستفاده شد. این پرایمرها ن??یز - نگهداري گردیدند. جدول زیر توالی پرایمرهای طراحی شدهC20در دماي °

دهد. ژن بررسی شده نشان می4را برای

Anealing

Tempruture

Produe

size )bp(

SequenceGene

82

(C◦) 56.3129F 5- TCAACGAGGGACAGATTGCC 3'

R 5'- CAACCTGGGGTGGCTCATAA -3'

P63

56.9165F 5- GGCCTGCTGAGATCAAAGAC 3'

R 5'- GGTTCAACTCTGTCTCATACTTGG -3'

K14

55.5166F 5- CTCTGCCTCAGCCTTACTG 3'

R 5'- CAGTGGAGTTGGCTGTTTCA -3'

IVL

60114F 5-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCG3'

R 5'-ACGACCAAATCCGTTGACTC -3'GAPDH

های تمایزیژن PCR Real-time ( توالی پرايمرهاي مورد استفاده براي2-4جدول

K14,P63ه44ای جهت ژنPCR ( آماده سازي پرايمر براي واكنش19-2

IVLو

مواد و وسایل-1000، 10-100، 5/0-10آب مقطر دوبار تقطیر استریل، سمپلر های متغیر

100( Eppendorf, Germany میکروتیوب ،)μl 2/0 Pyrogen SAFE ، DNase و RNase )G.KISKER, Germany) 5/0-10،? 10-100،? 100-1000، سر سمپلر،

Pyrogen Free ، DNaseوRNase (BOECO, Germany)پرايم??ر مس??تقیم و ، های مورد نظر معکوس ژنروش کار

پرايمرها به صورت ليوفيليزه سنتز شده و برای استفاده و ذخیره س??ازی این پرایمرها ابتدا طبق مقادیر تعیین شده از سوی شرکت سازنده برای ه??ر ی??ک از پرایمرها، با افزودن آب مقطر استریل دوبار تقطیر، محل??ولي از پرايمره??ا

pmol/μLبا غلظت به دست می آید ک??ه ب??ه عن??وان پرایم??ر ذخ??يره اي در100 - نگه??داري میش??ود. جهت تهی??ه پرایم??ر ه??ای قاب??ل اس??تفاده،C20دم??اي °

83

ازμL 10 برابر رقيق شوند. براي تهیه این پرایمرها، 10پرایمرهای ذخیره باید آب مقط??ر اس??تريل اض??افه میش??ود.μL90پرایمر ذخیره را برداش??ته و ب??ه آن

خواهد بودpmol/µL 10پس از رقیق سازی، غلظت پرایمرهای قابل استفاده -C20ش??ود. این پرایمره??ا ن??یز در دم??اي ° اس??تفاده میPCRک??ه جهت انج??ام

.گردندنگهداري می

( PCR( انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز )20-2 -2- وا سرشت ش??دن 1 سه مرحله به صورت متوالي تکرار مي شود: PCRدر

- طويل سازي3جفت شدن پرايمرها درتمام واکنش ها دما در مرحله واسرشت شدن و طويل سازي ث??ابت اس??ت و

پرايمره??اي س??نتزTmتنها در مرحله جفت شدن پرايمرها است که بس??ته ب??ه شده، مي بايست دماي مناسب را تنظيم نماييم.

مواد و وسایلAmplicon )Roche, Germany( ، (10pm)N6 (Roche, Germany) ،پرایمر مستقیم

(10pm ?)Forward Primer )Copenhagen( ،( معکوس 10pm ?)Reverseپرایمر

Primer )Copenhagen( ، 100آب مقطر دوبار تقطیر استریل، سمپلر متغ??یر- μl 2/0 Pyrogenمیکروتیوب ،?( Eppenorf, Germany میکرولیتر ) 5/0-10 و 10

SAFE ، DNase وRNase )G.KISKER, Germany( ،( دس??تگاه ترموس??ایکلرEppendorf mastercycler gradient, Germany)

روش کارMasterها یک ابتدا به تعداد نمونهPCRبرای انجام Mixمتشکل از م??واد ذک??ر

µL 19 آماده به میزان Master Mix سپس از شود.شده در جدول زیر تهیه می

میلی لیتر ریخته شده و به هر میکروتیوب مق??دار2/0های در داخل میکروتیوبµL1 از نمونه CDNA با غلظت g/µLµ1گ??ردد. ب??ه این ت??رتیب در ه??ر اضافه می

84

µLمیکروتیوب حجم نهایی به میرسد. به منظور بررسی ع?دم آل?ودگی در20 ،PCRحین کار، به میکروتی??وب کن??ترل منفی واکنش µL1آب مقط??ر اس??تریل

ه?ا، آنه?ا را در الگ??و ب?ه میکروتی??وبDNAگردد. پس از اض?افه نم?ودن اضافه می داخل دستگاه ترموسایکر با برنامه زمانی ق??رار داده و بع??د از اتم??ام واکنش،

جهت اطمینان از تکثیر بهینه قطعه م??ورد نظ??ر و مش?اهده بان??دPCRمحصول .گردد ولت الکتروفورز می100% با ولتاژ 2محصول، بر روی ژل آگارز

(2-5جدول (PCRمقادیر و غلظت مواد مورد نیاز در واکنش زنجیره ای پلیمراز اول )

زمان(Cدما )˚مرحلهDenaturation

Cycle) 1( دقيقه953

Amplification

Cycles) 40(

ثانيه9430 ثانيه9630 ثانيه7230

Final extension72 7دقيقه

حجم ب4444ه ک4444اررفته

مواد Stockغلظت

10 μl10xAmplicon

1 μl10pmolPrimer F

1 μl10pmolPrimer R

7 μl DDW

1 μlcDNA

20 μlحجم نهايي

85

Cycle) 1( برنامه زمانی واکنش زنجیره ای پلیمراز( 2-6 جدول

(PCR)

ژل آگارز رویPCR( الكتروفورز محصول 21-2 % و رنگ آمیزی اتی??دیوم برومای??د2، از ژل آگارز PCRبه منظور بررسی نتایج

ب??ه دلی??ل حض??ور گ??روه فس??فات و ب??ار منفیDNAهای استفاده گردید. نمونه حاص??ل از آن از قطب منفی ب??ه ط??رف قطب مثبت می??دان الک??تروفورزی در

کنند، به گونه ای که با توجه به نسبت مساوی بار بهطول ژل آگارز حرکت می بر اس??اس ط??ول خودس??رعت ح??رکت متف??اوتی در ژلDNAهای حجم، رشته های کوتاه ت??ر ب??ه علت مق??اومت کم??تر، س??ریعتر ح??رکت ک??رده ودارند. رشته

ت??ر ب??ر طوی??لDNAکنند، در حالیک??ه قطع??ات فاصله بیشتری را از مبدأ طی می کنن??د. ب??ا اس??تفاده از م??ارکر دارایحسب طول خود فاصله کم??تری را طی می

تکث??یر ش??ده در طیDNAت??وان ط??ول رش??ته با اندازه معین میDNAقطعات ای پلیمراز را ارزیابی و تعیین نمود. نهایتاً به دلیل حضور رن??گواکنش زنجیره

اتیدیوم برماید در بین بازه??ا، ب??ا ت??ابش ن??ور م??اراء بنفش ب??ه ژل الک??تروفورز،گردند. ظاهر شده و قابل مشاهده میDNAباندهای

مواد و وسايلmg/mL ، رن??گ اتي??ديوم بروماي??د )TAE(1ب??افر الک??تروفورز )× 10( ?)Roche,

Germany)، پودر آگارز Low Melting)Roche, Germany( ، پ??ودر ت??ریسTris-

base)Merck, Germany(،( اس??ید اس??تیک Merck, Germany )??،م??ارکر وزن Loading، بافر نمونه )(DNA )DNA Marker VIII( )Roche, Germanyمولکولي

Buffer )?،تانک الکتروفورز افقي ،( قالب ژل و شانه مخصوصBiorad, USA)، ,UVItecدستگاه ترانس لومين??اتور )، منبع تغذيه الکتريکي United Kingdom)،

86

,Eppendorfس???مپلر ه???ای متغ???یر ) Germany)،( ت???رازو Sartoruis, United

Kingdom)

%2طرز تهیه ژل آگارز پودر آگارز را توسط ترازو وزنg 8/1% ابتدا مقدار2به منظور تهيه ژل آگارز

اض??افه نم??وده وTAE(1 )× ب??افرmL90نم??وده و در ی??ک ارلن ريخت??ه و ب??ه آن شود تا ژل يكن??واخت و ش??فافی حاص?ل ش??ود. س??پس پيش ازحرارت داده می

µLبسته شدن ژل و پس از پايين آمدن دماي ژل حدود اتيديوم برومايد ب??ه1 آن اضافه نموده، به آرامی آن را هم زده و مایع حاصل به ظرف قالب ژل كه از قبل شانه مربوطه درآن ق??رار داده ش??ده اس??ت، منتق??ل مي گ??ردد. پس از بس??ته ش??دن كام??ل ژل، ش??انه را ب??ه آهس??تگی خ??ارج ك??رده و ژل ب??ه تان??ك

منتق?ل مي گ?ردد. در اين مرحل?هTAE(? 1مخصوص الكتروفورز حاوي بافر )×µL را باPCR از محصولµL8حدود بافر نمونه مخل??وط نم??وده و س??پس ب??ه2

آرامی درون چاهك هاي ژل ریخته می شود. جهت داشتن استانداردي براي تشخيص سايز باندهاي به دست آم??ده در يكي

DNA ها مارکر از چاهک 100bpریخته می شود. س??پس جري??ان برق??رار وص??ل گ??ردد. پس از س??پری ش??دن م??دت ولت تنظیم مي100نموده و ولتاژ ب??ر روی

دقیقه، جريان را قطع نموده، ژل را درون دستگاه ترانس لومیناتور50زمان شود.گذاشته و با تاباندن اشعه ماوراء بنفش از ژل عكس گرفته می

روی ژل آگارزPCR( عکس نمونه از محصول 2-13شکل

87

های مورد نظر جهت بررسی ژنReal-time PCR( انجام 22-2لمواد و وسای

، آب مقط??ر دوب??ار تقط??یر اس??تریل،pmol/µL 10 و معک??وس پرایم??ر مس??تقیم ، دستگاهRNAaseو DNAase عاری از mL 5/0سمپلرهای متغیر، میكروتيوب

7500 Real Time PCR تایی 8، میکروتیوب های mL2/0

، ژاپنSYBR® Premix Ex Taq ™ II )2x(( Takara)بافر، روش کار

م??ورد نظ??ر طب??ق ج??دول زی??ر تهی??ه گردی??د. س??پس در ه??رMaster Mixابت??دا میکرولی??تر از مخل??وط س??اخته ش??ده8/8، مق??دار PCR Real timeمیکروتی??وب

م??ورد نظ??رcDNA میکرولی??تر از 1ها، مق??دار ریخته و به هر کدام از میکروتیوب وcDNA میکرولی??تر 1اضافه گردید، به طوری که به میکروتیوب کنترل مثبت،

به منظور بررسی عدم وجود آلودگی در حین کار ن??یز ب??ه میکروتی??وب کن??ترل میکرولی??تر آب مقط??ر1 میکرولیتر از مخل??وط واکنش ب??ه هم??راه 8/8منفی،

استریل اضافه شد.

مق4444دار/غلظتمواد مورد نیازStock

حجم م444444444444ورد(µLاستفاده )

SYBR® Premix Ex Taq™x2µL5

پرایم??????ر مس??????تقیم )Forward)pmol/µL 10µL2/0

پرایم??????ر معک??????وس )Reverse)pmol/µL 10µL2/0

آب مقط??ر دوب??ار تقط??یرشده

-µL4/3

cDNAµg/µL5/0µL1نمونه

88

µL8/8-حجم نهایی

Real time PCR Master Mix ( غلظت و مقدار مواد مورد نیاز برای2-7جدول

ه??ا،آنه??ا را کمی س??انتریفیوژ س??ریع وپس از آماده نمودن هر یک از میکروتیوب Realها، آنها را در دستگاه پس از اطمینان از بسته بودن کامل درب میکروتیوب

time PCR.قرار داده و برنامه زمانی مربوطه طبق جدول زیر اجرا گردید

زماندمامرحلهDenaturation )1 Cycle(˚C 9510ثانیه

Annealing & Extension )40 Cycle(˚C 955ثانيه ˚C 6034ثانيه

Dissociation stage )1 Cycle(

˚C 9515ثانیه ˚C 601دقيقه ˚C 9915ثانیه ˚C 6015ثانیه

Real time PCR( برنامه زمانی تعیین شده جهت انجام 2-8جدول

89

Real Time( دستگاه ترموسایکلر مربوط یه 2-14شکل

( آناليز آماري داده ها23-2 Realمرحله پایانی کار شامل آنالیز آماری داده های ب??ه دس??ت آم?ده از روش

Time PCR 7500 میباشد جهت آنالیز آماری داده ها نرم افزار های Software

)version 2.01) ABI Applied Biosystem، LinReg PCR.استفاده گردید (Imonucytochemistry :ICCآمیزی ایموسیتوشیمی)( رنگ24-2

مواد و وسايل لوله فالکون

PBS

محلول استون جهت فيكس كردن نهايي سلول ها FITC-conjugated sheep anti mouseآنتی بادی پلی کلونال

FITC-conjugated goat anti rabbitآنتی بادی پلی کلونالAnti- Involucrin antibodyآنتی بادی پلی کلونال

Anti-Cytokeratin 14 antibodyآنتی بادی مونوکلونال

FITC-conjugatedتهیه شدند. آنتی ب??ادی(Abcam)USAآنتی بادی ها از شرکت

goat anti rabbit از شرکتSigma-USA تهیه و آنتی بادی FITC-Conjugated

goat anti rabbit.در پژوهشگاه ابن سینا تولید شده است

90

)TBS) Tris Base Salinروش تهیه محلول

مواد و وسایلNaCl، Tris Baseآب مقطر،

روش کارTris گ??رم 3 را ب??ه هم??راه NaCl گ??رم 4/3 Base 500 وزن ک??رده و ب??اmlآب

رسانده و در دمای اتاق نگهداری شد.4/7 آن را به PHمقطر اضافه

ژن کردن آنتیRetrivalروش تهیه محلول جهت شود که به هم??راهبرای این منظور از محلول تری سدیم سیترات استفاده می

ژن را ک??ه در فرآین??د فیکساس??یون از هم ج??دا ش??ده، دوب??اره ب??ه همگرما آن??تیآورد.متصل نموده و احیا کرده روی سلول می

(Tri Sodium Cytrateروش تهیه تری سدیم سیترات )مواد و وسایل

Tween 20تری سدیم سیترات، آب مقطر،

روش کار: PHسی حل ک??رده سی1000 گرم تری سدیم سیترات را وزن کرده در 94/2

ماه6 به آن اضافه کرده و تا Tween المبدا 500رسانیم، سپس می6آن را به توان نگهداری نمود. ماه در دمای اتاق می3 درجه و 4در دمای

(Blockingروش تهیه محلول مسدودکننده )Trisب??رای این منظ??ور از محل??ول Base ب??ه هم??راه Bovine Serum Albumin

ه??ای غیراختصاص??یش??ود ت??ا گیرن??دهش??ود. این محل??ول ب??اعث میاس??تفاده میبادی اختصاصی به گیرنده اختصاصی متصل شود.مسدود شده و آنتی

91

TBS/BSAروش تهیه

مواد و وسایلBSA 1%, BSA 0.5%

TBS

روش تهیه س??ی س??ی100 گ??رم وزن ک??رده در 1 به میزان BSA1%از جهت شستشو:

TBS شود. درجه نگهداری می4 حل نموده و در دمای- سی200 گرم وزن کرده در 1 به میزان BSA0.5%از جهت رقیق نمودن:

شود. درجه نگهداری می4 حل نموده و در دمای TBSسی

:بادی اولیه رقیق شدهروش تهیه آنتی مش??خصهاي كراتينوسیت با نسبت سلولICCبادي اوليه مورد استفاده در آنتي

در محل??ول مس??دود كنن??ده رقي??ق ش??د )ب??ه هنگ??امجهت هر مارکر م??ورد نظراستفاده پيپتاژ آرام انجام گرفت(.

(ICCروش ایمنوسیتوشیمی ) ه??ا ب??ه وس??یله تریپس??ین از روی اس??کفولد ج??دا ش??ده، ب??ر روی المس??لول

( گشته.CytoSpinسایتواسپین )- درجه ماندند تا خشک شدند.4 دقیقه در دمای 30- به مدت

- درج??ه20 دقیقه در دم??ای 5- در محلول استون جهت فیکساسیون به مدت قرار داده شدند.

دقیقه قرار داده شدند.5- درجه به مدت 4- در دمای دقیقه قرار داده شدند.45- در دمای اتاق به مدت

ها را ب??ا بعد از مشخص نمودن محل سلول و خط کشیدن دور آن، روی نمونهPBS( سپس از5 پوشانده ،)دقیقه

92

و Sheep Serum 5%(K14)محلول مسدودکننده IGg Rabbit)IVL(محلول در TBS/BSA( 1:50 آماده نموده ??)PBSه??ا را زدوده و محل??ول را روی روی نمون??ه

دقیق??ه(. در45ها زده به صورتی که روی آنها را ک??اور نمای??د )ب??ه م??دت نمونهAnti-Cytokeratinه??ای اولی??ه ه??ر م??ارکر، یع??نی بادینهایت آنتی 14 Antibodyو

Anti-Involucrin Antibody (1:100) را در محلول TBS/BSAرقیق نموده و روی ش??ودگراد قرار داده می- درجه سانتی4 در دمای Overnightها زده شده و نمونه

ساعت).18-15) دقیق??ه در س??ه ظ??رف ب??ه5ه??ا ب??ه م??دت پس از گذشت این زمان ابتدا نمونه

،PBSترتیب حاوی TBS/BSA ب??ادی شستشو داده شده، سپس آن??تیPBS و 1% Goat anti-Rabbit(IVL) و پلی کلونال Sheep anti-mouse(K14ثانویه منوکلونال )

رقیق شده و در تاریکی رویTBS/BSA را که در محلول FITC ( 1:50)کنژوگه با ه?امانن??د. نمون?ه دقیقه در همین حال ب?اقی می45ها ریخته شده به مدت نمونه

DAPI شستشو داده شده اینبار رنگ TBSدوباره در ظرف حاوی م??اکروگرم5 5ه??ا زده ش??د ) ب??ه نمون??هTBS/BSA رقیق شده در محل??ول 1:1000با نسبت

-ها شستش??و داده ش??ده، خش??ک گش??ته و پس از الم??لدقیقه(. در نهایت نمونه ها جهت مشاهده میکروسکوپی با میکروس??کوپ فلورس??نتگذاری روی نمونه

آماده شدند. ه??ای تمایزیافت??هجهت تعیین مارکرهای اختصاصی کراتینوسیتی ب??ر روی س??لول

آمیزی گردید که نتایجهای هر مارکر بر روی بافت کنترل مثبت رنگبادیابتدا آنتیباشند:آن از قرار زیر می

Anti-Involucrinبادی آنتی antibody بر روی بافت Frozenپوس?ت س?ر ب?ا روش گذاشته شد ک??ه عکس زی??ر در قس??مت خ??ارجی )ش??اخی( پوس??تICCمشابه

باشد: دهنده تجمع مارکر اینولوکرین به صورت سیتوپالسمیک مینشان

93

(X10آمیزی مارکر اینولوکرین در بافت کنترل مثبت )پوست سر()( رنگ2-15شکل

Anti-Cytokeratinبادی آنتی 14 antibodyهای کراتینوسیت ب??ه نیز بر روی سلول دهن??ده گذاشته شد که عکس زی??ر نش??انICCعنوان بافت کنترل مثبت با روش

باشد:ها می به صورت سیتوپالسمیک در این سلول14تجمع مارکر سیتوکراتین

94

(x20 در سلول کنترل مثبت )کراتینوسیت()14آمیزی مارکر سیتوکراتین ( رنگ2-16شکل

95

فصل سومنتايج

-های بنیادی خون قاعدگی به س??لولدر این مطالعه بررسی توان تمایزی سلول های کراتینوسیت در محیط تمایزی سه بعدی مورد بررس??ی ق??رار گ??رفت ک??ه

باشد:نتایج آن به شرح زیر می

96

های بنیادی خون قاعدگی( مورفولوژی سلول1-3 میلیون س??لول ت??ک10 الی 8سی خون قاعدگی سی5به طور میانگین از هر

تقس??یم ش??د.75 فالس??ک 3( ج??دا گردی??د ک??ه این تع??داد در MNCs)هسته ای ه??ایدهن??د. س??لول تش??کیل میMenSCs درصد از این تع??داد را 15 الی 5حدود

چس??بند. اینبنیادی خون قاع??دگی پس از ی??ک ش??بانه روز ب??ه ک??ف فالس??ک می ت??رنی بوده و پس از یک الی دو بار پاس??اژ کش??یدهوها قادر به تشکیل کلسلول

80 الی 70 روز 10کنند. بعد از ح??دود شوند و ظاهری فیبروبالستی پیدا میمی ه??ای بنی??ادین خ??ون قاع??دگیکنند. س??رعت رش??د س??لولدرصد فالسک را پر می

باشد بطوریکه پس از رسیدن به ف??ازهای بنیادین مزانشیمی میبیشتر از سلول(3-1باشد. )شکل ها در هفته می بار پاساژ این سلول2لگاریتمی رشد نیاز به

97

(.x100 )12 و 8، 4 در پاساژهای صفر، MenSCs( بررسی مورفولوژی 3-1شکل

شود با افزایش تعداد پاساژها و عمر سلول مورفولوژیهمانطور که در شکل مشاهده میرودها به سمت دوکی شکل پیش میاین سلول

98

ها( مورفولوژی کراتینوسیت2-3 MenSCsهایی که از نمونه پوس??تی ج??دا می ش??ود بس??یار کم??تر از تعداد سلول

ای ک?ه ازه?ای ت?ک هس?ته% از س??لول87های کراتینوس??یتی ح?دود است. سلول ه??ا پس از ی??ک ش??بانهدهن??د. این س??لولشوند را تشکیل مینمونه اپیدرم جدا می

درص??د فالس??ک را80 الی 70 هفت??ه 2چسبند و پس از روز به کف فالسک می ه??اي کراتینوس??یتی كش??ت داده ش??ده تغي??يرات ب??ارزي را درکنن??د. س??لولپر می

دهند به ط??وري ك??ه در پاس??اژهاي اولي??ه اين س??لول هااندازه و شكل نشان می و باالتر به صورت دوکی و کشیده8به صورت چندوجهی بوده و در پاساژهاي

درمي آيند. به عالوه در پاساژهاي باال سيتوپالسم داراي گران??ول ش??ده و ذرات ريز حاصل از جدا شدن سلول ها، در فالسك كشت سلول دي??ده مي ش??ود. در

های بنیادین خون قاع??دگی مرفول??وژی دوکی ش??کل خ??ود را درحالی که سلول(3-2. )شکل کنندپاساژهای باال نیز حفظ می

99

(. باX100 )3 و 2، 1های کراتینوسیت در پاساژهای صفر، ( مورفولوژی سلول3-2شکل

ها جدا شده و نمای مضرسیافزایش تعداد پاساژ سلول-های شاخی مرده از کراتینوسیتشود.ها نمایان میسلول

100

آم??یزی ب??ا تریپ??ان بل??و و ش??مارشپس از تهی??ه سوسپانس??یون س??لولی و رن??گ×106م??ترمربع از نمون??ه پوس??ت، سلولی، مشخص شد که به ازای هر س??انتی

س??لول ب??ه دس??ت آم??ده اس??ت و ب??ا غلظت مطل??وب دیس??پاز و م??دت5/2(3-3ها زنده میمانند. )شکل % سلول90انکوباسیون کافی، بیش از

های کراتینوسیت جدا شده از نمونه ختنه( سلول3-3شکل

: ( بیان شاخص های اختصاصی سلول های بنیادی3-3 ،CD105 نتایج آنالیز فلوسایتومتری نشان می دهد که درص??د بی??ان مارکره??ای

CD29، CD44، CD73 ، CD10 وCD90های بنی??ادی خ??ون قاع??دگی ب??ه در سلول باشد. این در حالیست که می%98و %97%،? 99%،? 99%،? 99%،? 95ترتیب

CD133 و CD45، CD34، CD38های هماتوپوئتیک از جمله مارکرهای ویژه سلول

بنی??ادی ه??ایسلول عالوه بر این. ها بیان قابل توجهی نشان ندادند.در این سلولOCT-4 توجه قابل بیان به قادر قاعدگی خون ه??ایهمچنین سلول. بودند (96%)

نمی باش??ند. اين نت??ايج از ي??كSTRO1بنیادی خون قاعدگی قادر به بیان مارکر و از سوي ديگر مويد كيفيتMenSCsسو نشان دهنده وي ژگي منحصر به فرد

و ح???ذف س???لول هاي هماتوپوئيتي???ك در طي جداس???ازيMenSCsجداس???ازي (3-4سلول هاي استرومال از خون قاعدگي مي باشد. )شکل

101

CD29CD44

CD73 CD105

CD9

CD34 CD38

CD45

CD133CD10OCT-4

CD90

PE Isotype control FITC Isotype control

خون قاعدگی بیان یا عدم بیان های بنیادی( نتایج فلوسایتومتری سلول3-4شکل باشدهر مارکر به خوبی در تصویر باال مشخص می

های تمایزی بر روی داربست( بررسی سلول4-3 ب??دلیل م??ات ب??ودن داربس??ت فی??بروئین س??یلک و ع??دم امک??ان مش??اهده

ه??ا ب??ه منظ??ورمیکروس??کوبی و عکس??برداری، امک??ان دنب??ال ک??ردن س??لول

102

-ها وجود ندارد. اما به نظر میرس??د ک??ه س??لولعکسبرداری از روی این داربست نمایند و مورفولوژی قبلی خود را حفظهای تمایزی از لحاظ شکل تغییری نمی

کنند.می

RNA( نتایج استخراج 5-3

های کراتینوس??یت ب??ا خوان??دن و سلولMenSCs استخراج شده از RNAکیفیت چ??نین الک??تروفورز نانومتر و هم280 نانومتر به جذب 260نسبت جذب نوری

RNA 18 بان??د 2 انجام ش??د و در الک??تروفورزsrRNA 28 وsrRNA.مش??اهد ش??د (3-5)شکل

103

تمایز یافته خونغیرهای بنیادی استخراج شده از سلولRNA( الکتروفورز 3-5شکل هاقاعدگی و کراتینوسیت

های استخراجی کنترل مثبتز نمونه استخراجی اRNA( غلظت 3-1جدول

های تمایزیافت??ه ن??یز ب??ا خوان??دن استخراج شده از سلولRNAهمینطور کیفیت چ??نین الک??تروفورز نانومتر و هم280 نانومتر به جذب 260نسبت جذب نوری

RNA (3-6 انجام شد و باندهای مورد نظر مشاهد شد. )شکل

یافتهتمایزهای بنیادی استخراج شده از سلولRNAالکتروفورز ( 3-6شکلConcentrationOD 260/280Type fo Cell

34/3916/2Diff Cellsهای استخراجی تمایزیز نمونه استخراجی اRNA( غلظت 3-2جدول

ConcentrationOD 260/280Type of Cell68/54782/1MenSCs

56/29242/3HKCs

104

در س44لول هايکراتینوس44یت ه44اي اختصاص44ي ژنmRNA( بي44ان 6-3:تمايز داده شد

،14س??یتوکراتین ه??ای بهینه هیبرید شدن برای تکث??یر ژنبه منظور تعیین دمای masterها ب?ا مایی برای هر کدام از جفت پرایمرگرادیانت د p63اینولوکرین و

mixه??ای بر روی سلولها توضیح داده شده در قسمت مواد و روشHKCsب??ه درص??د2 ب??ر روی ژل آگ??ارز PCRمثبت انج??ام و محص??والت عن??وان کن??ترل

ها نش??ان داده ش??ده اس??ت در تم??امی همانطور که در شکلالکتروفورز شدند. و اینول??وکرین14س??یتوکراتین ه??ای مورد نظر بیان قابل توجهی از ژندماهای

(3-7دیده شده است. )شکل

های اختصاصی به منظور تعیین گرادیانت دمایی مناسب به عنوان( بیان ژن3-7شکل کنترل مثبت

105

ه44ایهای کراتینوسیتی در سلولهای اختصاصی سلول( بیان ژن7-3Real Time- PCRتمایز یافته با روش

Real با اس??تفاده از تس??ت p63، اینولوکرین و 14بیان ژن سیتوکراتین Time-

PCRش??وده??ای زی??ر دی??ده می مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در ش??کل ( و3-8 )ش??کل 5/85( و اینولوکرین 3-10 )شکل 14پیک دمایی سیتوکراتین

p63پی??ک دم??ایی ب??ا محص??ولWater( ب??وده و پی??ک نم??ودار 3-9 )ش??کل 5/84 ها از س??لولدهنده عدم آلودگی است. در تمامی واکنشمتفاوت است که نشان

کراتینوس??یت ب??ه عن??وان کن??ترل مثبت اس??تفاده ش??ده و هم??انطور ک??ه در ب??اال های تمایزیافتهنمودار آن قرار داده شد پیک محصول آن با پیک محصول سلول

دهنده صحت محصول اصلی در واکنش است. یکسان است که نشان

106

MenSهای جهت ژن اینولوکرین در سلولMetl Curve و Amplification( نمودار 3-8شکل

تمایزداده شده

107

MenSهای در سلولp63 جهت ژن Metl Curve و Amplification( نمودار 3-9شکل

تمایزداده شده

108

تمایزدادهMenSهای در سلول14 جهت ژن سیتوکراتین Metl Curve( نمودار 3-10شکل شده

بهp63 و 14 جهت ژن سیتوکراتین Metl Curve و Amplification( نمودار3-11شکل تمایزداده شدهMenSهای صورت مشترک در سلول

109

14های اینولوکرین، س44یتوکراتین ( بررسی تغییرات بیان ژن 8-3 در طی مراحل تمایزیp63و

های تمایزیافت??ه ب??ههای خون قاعدگی و سلولتغییرات در سطح ژنی بین سلول س??مت کراتینوس??یت بس??یار ف??احش ب??ود. ب??دین ص??ورت ک?ه، س??طح بی??ان ژن

های تمایزنیافته بسیار زی??اد ب??وده( بعد از تمایز نسبت به سلولIVLاینولوکرین ) باش??د ک??هده??د. این در ص??ورتی می براب??ری را نش??ان می5495و م??یزان بی??ان

ه??ای تمایزنیافت??ه در س??لول14بررسی تغییرات حاص??ل از م??ارکر س??یتوکراتین چنین، بررس??ی م??یزان تغی??یراندهد. هم برابری را نشان می4078میزان بیان

براب??ری نس??بت ب??ه512 ن??یز ف??احش ب??وده و م??یزان بی??ان p63ژنی در مارکر (12-3( )شکل p=0/001دهد. ) های تمایزنیافته را، نشان میسلول

های در سلولp63و 14های اینولوکرین، سیتوکراتین ( نمودار میزان بیان ژن3-12شکل تمایزیافته

آم44یزی س4لولی )ایمنوسیتوش4یمی( جهت( نتایج حاصل از رنگ9-3 هایتعیین میزان بیان مارکرهای اختصاصی کراتینوسیت در سلول

تمایزیافته

110

پس از مشخص نمودن مارکرها در ب??افت کن??ترل مثبت، دوب??اره این مارکره??ا ه??ایه??ای تمایزیافت??ه س??نجیده ش??دند. ب??ه این ص??ورت ک??ه س??لولروی س??لول

تمایزیافته از سطح داربس??ت برداش??ته ش??ده و روی الم سایتواس??پین گش??ته، های کراتینوس??یتیسپس به روش ایمنوسیتوشیمی مارکرهای اختصاصی سلول

های تمایزیافته سنجیده شد. در سلول دهن??ده بی??ان اینهای تمایزیافت??ه نش??اننتایج بررسی مارکر اینولوکرین در سلول

باش??د ک??ه در عکس زی??ر ب??ه خ??وبیه??ا میم??ارکر سیتوپالس??می در این س??لولمشخص است:

( نمای ایمنوسیتوشیمی نشان دهنده میزان بیان مارکر اینولوکرین در هر سه3-13شکل (x20گروه باال )

111

-ه??ای تمایزیافت??ه نش??ان در س??لول14چنین نتایج بررسی مارکر س??یتوکراتین هم باش??د ک??ه در عکس زی??رها میدهنده بیان این مارکر سیتوپالسمی در این سلول

به خوبی مشخص است:

در هر14( نمای ایمنوسیتوشیمی نشان دهنده میزان بیان مارکرسیتوکراتین 3-14شکل (x20سه گروه باال )

112

( بحث و نتایج1-4 های شگرفیهای بنیادی پیشرفتهای اخیر در زمینه علم وابسته به سلولدر سال

ت??رین این پیش??رفت ه??ا می ت??وان ب??ه ظه??ورحاصل شده است. از جمل??ه مهم ها برای درم??ان طی??فروش سلول درمانی اشاره کرد، که در این روش سلول

ه?ای بنی??ادیتحقیقات درباره س??لول.? [94]شوندها استفاده میوسیعی از بیماری-انگ??یزترین م??وارد علم پزش??کی می انگ??یزترین و بحثبدون شک یکی از هیجان

- و کشت س??لول1960( در سال BMSCsباشد. از اولین پیوند مغز استخوان ) ، شواهد زیادی در زمینه فهم1980( موش در سال ESCsهای بنیادی جنینی )

ه??ای بنی??ادیهای بنیادی یافت شده است. تحقیقات درباره سلولبیولوژی سلول .[95]جهانی بوده و الزمست که مباحث اخالقی در رابطه با آن رعایت ش??ود

ه??اتوانند به صورت مص??نوعی در محی??ط آزمایش??گاههای بنیادی اکنون میسلول

113

ه??ای تخصص??ی ب??ارشد و تکثیر یافته و در طول کشت سلولی به ان??واع س??لول های مختلف مانند عضالت، اعصاب یا اپیتلی??الیهای بافتخصایصی همانند سلول

ها ، تحقیقات مختلف نشان داده است که تزریقدر طول سال.? [7]تمایز یابند توان??د ت??اثیر ش??گرف و س??ریعی در بهب??وده??ای بنی??ادی میان??واع مختل??ف س??لول. [95]دیده بگذاردعملکرد اعضای آسیب

های پوس??تی در سراس??ر جه??ان ب??ا اف??زایش مص??رف مش??روبات الکلی،بیماری-هایی که پوست را ن??یز درگ??یر میهای ویروسی، سوختگی و سایر بیماریبیماری

ه??ای م??زمن،کند رو به افزایش است. در این میان ب??رای درم??ان اک??ثر بیم??اری ای جز پیوند پوست یا به حال خ??ود ره??اها چارههای حاد و بیماریبرخی از آسیب

کردن آن وجود ندارد، لیکن کمبود اهداکننده و مشکالت ایمنی سبب شده ک??ه.[33]به دنبال جایگزینی مناسب برای آن باشیم

های م??زمن، اس??کارهایهایی در روند ترمیم طبیعی اغلب به دلیل زخمپیچیدگی باشد ک??ه از ه??ر حیثهای پوستی میهای بدخیم و بیماریزیاد و یا حتی دگرگونی

تواند بهمشکالت پوستی می.? [97-96]کندبه سالمت بدن لطمه وارد می ه??ایی همچ??ون دی??ابت،های ناشی از بیم??اریهای مختلف مانند ایجاد زخمصورت

ه??ای ناش??ی ازهای پوستی ناشی از ایجاد چین و چروک و یا ایج??اد زخمناراحتی ه??ای بنی??ادی ش??امل انتق??ال. درمان با سلول[98]ها باشدانواع مختلف سوختگی

های سلولی به منظور درم??ان آس??یب ناحي??ه م??وردها و یا حتی گرافتاین سلول های بنیادی فعاالنه با قرار گرفتن در هر محیطی ب??هسلول.?? [99]باشدنظر می

ه??ا، فاکتوره??ای رش??د و م??اتریکس خ??ارج س??لولی رویوسیله ترشح سایتوکین]ه??ای همس??ایه )پ??اراکرین( اث??ر میگذارندهای خودی )ات??وکرین( ی??ا س??لولسلول های بنیادی بالغ یا جنینی در درمان ممکن است به صورت بالقوهسلول . [100

های پوست استفاده شوند که این امر به صورت پایداری منجر ب??هدر جایگزینی ش??ود. ب??هبازیابی سطح پوست و بازیابی کامل ارگ??ان از لح??اظ عملک??ردی می

ه??ای پوس??تی، در ه??رهای بنیادی با ق??ابلیت تب??دیل ب??ه س??لولمنظور تولید سلول

114

ه??ایه??ا در ط??ول تب??دیل ب??ه ردهصورت، ابتدا فهم چگونگی تمایز صحیح سلول.[101]پوستی ضروری میباشد

ه?ای اپیتلی??الی وهای بنیادی خون قاع??دگی ب??ه س??لولدر حال حاضر تمایز سلول-های پوستی و سوختگیها در درمان بیماریچنین امکان استفاده از این سلولهم

ها در بسیاری از نقاط جهان در ح??ال بررس??ی اس??ت. ب??رخی از پژوهش??گران]گ??یردهای بنیادی خون قاع??دگی از مغ??ز اس??تخوان منش??ا میمعتقدند که سلول

، اما در عین حال به دلیل جداسازی از اندومتر رحم خاصیت اپیتلی??ومی[102 توانند منبع جایگزینی خوبی جهت تمایزها میسلول . بنابراین این [60]نیز دارد

های کراتینوسیت باشند.به سمت سلول ه?ای تم??ایزیعالوه بر این وجود داربست خود باعث موثرتر بودن دریافت پیام

شود. امروزه تحقیقات در زمینه مهندس??ی ب??افت در س??طح وس??یعی رو ب??همی گسترش است به طوری که مهندسی بافت توانایی بالقوه برای ساخت عضو

دارد. به منظور بهتر شدن کارایی کشت سلولde vevoو بافت را به صورت inو بافت، نیاز به خلق شرایط سه بعدی بدن همانن??د محی??ط vivoدر ح??الت

های بافت مورد نظر( است. برای نیل به این هدف، سلولex vivoخارج بدن ) شوند، که این داربست ساختاری مبتنی ب??ر م??وادروی داربست کشت داده می

موجود در ماتریس خارج سلولی بوده و تمارهای مختلفی روی آن انجام شده است. در ابتدا این مواد صرفا جهت انتقال دارو و هورمون ب??ه ب??دن اس??تفاده

شد، اما تحقیقات بعدی نشان داد که این م??واد توان??ایی حف??ظ، نگه??داری ومی ها به بدن را دارند. روند پیش??رفت در زمین??ه پیون??د عض??و ب??هحتی انتقال سلول

سرعت رو به افزایش است و برای بهبود آن از مواد و ساختارهایی شبیه ب??ه-ه?ا تحقیق??ات همها روی داربس?تکنند. برای تکثیر سلولبافت هدف استفاده می

. لذا[89]چنان ادامه دارد تا بدین وسیله کارایی کشت سه بعدی افزایش یابد های بنیادی خون قاعدگی در این مطالعهبه منظور افزایش توان تمایزی سلول

دهن??ده اف??زایشاز داربست فیبروئین س??یلک اس??تفاده گردی??د ک??ه نت??ایج نش??انباشد. های تمایز بافته میمیزان بیان مارهای کراتینوسیتی در سلول

115

اما در مورد این مطالعه و با توجه به مباحث باال: های بنی??ادی خ??ون قاع??دگی دربا توجه به نتایج پژوهش ما، توانایی تکثیر سلول

ه??ای بنی??ادی خ??ونهای کراتینوسیت بسیار متفاوت بود. س??لولمقایسه با سلول های کراتینوسیت داش??تند و ب??اقاعدگی سرعت تکثیری باالتری نسبت به سلول

باال رفتن پاس??اژ س??لولی، س??رعت رش?د آنه?ا ن??یز اف?زایش ی??افت. در حالیک?ه ه??ای کراتینوس??یت بع??د از جداس??ازی دارای ت??وان تکث??یری کمی ب??وده وس??لول

های بنیادی خون قاع??دگی بس??یارها در مقایسه با سلولسرعت رشد این سلول باشد و با باال رفتن پاساژ سلولی این توان تکثیری بسیار کمتر شده واندک می

ه??ا تغی??یر رشد رشد بسیار کم شده و کاریوت??ایپ این س??لول5-6در پاساژهای ش??ود. این درنموده، گرانوله ش??ده و اج??زای س??لولی در فالس??ک مش??اهده می

باز پاساژ تغییر پی??دا64های بنیادی خون قاعدگی پس از حالی است که سلول های منحصر بف??رد این که این امر یکی از ویژگی [103,?? 74]نکرده است

شود. ها محسوب میسلول میزان قدرت تکثیری باالی سلول در مطالعات مربوط به پزشکی ترمیمی یک

ه??ا راشمار سلول توان منبعی غنی از تعداد بیشود، زیرا میامتیاز محسوب می در مدت زمان کوتاه بدس??ت آورد. در نتیج??ه کش??ت و اف??زایش تع??داد آنه??ا در

ه??ایتر از س??لولتواند آساندرمانی میمدت زمان کمتر، جهت استفاده در سلول نس??بت ب??هMenSه??ای کراتینوسیت صورت گیرد. باال بودن سرعت رشد سلول

نس??بت داد. این م??ارکر ازOCT-4ت??وان ب??ه بی??ان م??ارکر کراتینوس??یت را می-های مذکور سرعت رشد فوقهای بنیادی جنینی است و سلولمارکرهای سلول

ه??ایه??ای گذش??ته، بی??ان این م??اکر در س??لولای دارند. مطابق با پ??ژوهشالعاده نیک??و و2012. در س??ال [71]بنی??ادی خ??ون قاع??دگی مش??اهده ش??ده است

( Nikoo etهمکاران al با سلول .( اثر روی بر که خون پژوهشی بنیادی های

بر سلولقاعدگی تکثیری توانایی انجامروی محیطی خون مونونوکلئار های - توانایی تکثیری باال و خاصیت س??یگنالMenSCsدادند به این نتیجه رسیدند که

پذیری باالیی داشته و به راح?تی قادرن?د ک?ه مارکره?ای مولک?ولی ب?ه منظ?ور

116

ک??ه نت??ایجی ک??ه م??ا ب??ر روی این[104]باش??ندتبدیل به سلول هدف را دارا میخوانی دارد. پژوهش به دست آوردیم نیز، با این مطالعه هم

ه??ای بنی??ادی خ??وندر این مطالعه به منظور روشن شدن توان تم??ایزی س??لول ها در محیط کشت مختصهای کراتینوسیتی، این سلولقاعدگی به سمت سلول

-باش??د، ب??ه ص??ورت همهای کراتینوسیتی که ی??ک محی??ط ب??دون س??رم میسلولهای کراتینوسیتی مورد بررسی قرار گرفت. کشتی غیر تماسی با سلول

ها بعد از گذر دوره تمایزی نش??ان دهن??ده تغی??یر م??وثری درنتایج بررسی سلول های کراتینوسیتی نبود. اما بیانهای تمایزیافته به سمت سلولتغییر شکل سلول

بی??انگرmRNAمارکرهای کراتینوسیتی هم در سطح پروت??ئین و هم در س??طح ه??ا درهای انجام ش??ده در س??لولباشد. بررسیهای مورد بررسی میتمایز سلول

Realسطح ژنی به وسیله تکنیک Time-PCRدهن??ده بی??ان با این پروتکل نشان -ه??ای تمایزیافت??ه می در س??لولp63و 14هر سه مارکر اینولوکرین، سیتوکراتین

ه??ای تمایزیافت??ه وباشد. بدین صورت که نت??ایج مقایس??ه این تکنی??ک بین س??لول داریهای بنیادی خون قاعدگی )غیرتمایزیافته( نشان دهنده تف??اوت مع??نیسلول

(. چنانچه که مطالعات گذشته نیز بیان این مارکرها را تایی??دp=0/001باشد )می. [3]کندمی

های انج??ام ش??ده بوس??یله تکنی??ک ایمنوسیتوش??یمی در س??طح هم چنین بررسی در14ه??ای اینول??وکرین و س??یتوکراتین دهنده میزان بیان پروتئینپروتئینی نشان

باش??د ک??هباشد، هر چن??د ک??ه تغی??یرات ح??اکی از این میهای تمایز یافته میسلول ه??ایلمس??یر بی??ان پروت??ئین اینول??وکرین نس??بت ب??ه بی??ان این پروت??ئین در س??لو

-کراتینوسیتی اندکی تفاوت داشته بدین صورت که بیان این پروتئین در س??لول ( و سیتوپالسمی بوده ام??اNuclearای )های کراتینوسیت به صورت بیان هسته

( دیدهPrinuclearای )های تمایزیافته این بیان تنها به صورت دورهستهدر سلول ه??ای ب??ه روش??نی در س??لولp63ش??ود. لیکن این م??یزان بی??ان در پروت??ئین می

تمایزیافته مشخص نبوده و میزان بیان را بدرستی نشان نداد. این میزان بیان ه?ایی در م??ورد م??اهیتپروتئینی و ژنی همانطور که گفته شد بوس??یله دانس??ته

117

ه?ا س??نجیده ش??ده و نت??ایج آن ب??اای یا سیتوپالسمی مارکره??ا و پروت??ئینهسته .[3]باش??د، مقایس??ه گردیدسلول کنترل مثبت که همان سلول کراتینوسیت می

ایمحمدی و همک??اران، مطالع??ه خان2012در مقایسه با این تحقیق، در سال -های بنیادی خون قاعدگی با س??لولبر روی مقایسه توان تکثیر و تمایزی سلول

های بنیادی مغز استخوان به سمت غضروف انجام دادند. بدین صورت ک??ه در های بنیادی خون قاعدگی و مغ??ز اس??تخوان در روزه سلول21 و18یک پروسه ه??ایه??ای کندروس??یتی ق??رار گرفت??ه و س??پس س??لولکشتی با سلولمعرض هم

تمایز یافته در سطح مولکولی و پروتئینی سنجیده شدند. نت??ایج ب??دین ص??ورت ه??ای بنی??ادی مغ??زه??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی نس??بت ب??ه س??لولبود ک??ه س??لول

چنین پس از تم??ایز ب??ه س??متاستخوان دارای توان تکثیری باالتری بوده و هم های بنی??ادی خ??وندهنده این بود که سلولهای غضروفی نتایج حاصل نشانسلول

های بنیادی مغز استخوان دارای توان تمایزی بیشتریقاعدگی نسبت به سلول های غضروفی ب?ه نس?بتهای غضروفی بوده و مارکرهای سلولبه سمت سلول

های. البته در این پژوهش سلول[105]ها بیان شده استبیشتری در این سلول بنیادی خون قاعدگی ت??وان تم??ایزی آش??کار ب??ه نس??بت ب??االتری در مقایس??ه ب??ا

ایهای بنیادی خون قاعدگی از خ??ود نش??ان داده و ب??ا پ??ژوهش م??ا نتیج??هسلول همسو داشتند، اما در این پژوهش از محیط تمایزی دوبعدی اس??تفاده ش??ده و

ه??ا وکنن??دهه??ا از تحری??که??ا ب??ه س??مت کندروس??یتهمینطور برای تم??ایز س??لول رسان کندروس??یتی اس??تفاده ش??ده، زم??ان تم??ایز ن??یز از زم??انفاکتورهای پیام

چنین در هم??ان س??ال درزی و همک??اران ن??یزتمایزی پژوهش ما بیشتر بود. هم ه??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی ب??ه س??متای بر روی توان تم??ایزی س??لولمطالعه

ساز انجام دادند ک??ه نت??ایج ح??اکی از بی??ان ب??االی مارکره??ایهای استخوانسلول . نتایج این مطالع??ات[103]های بنیادی خون قاعدگی بوداستخوانساز در سلول

ه??ایبا مطالعه ما همسو بوده و بر نت??ایج مطالع??ه م??ا از نظ??ر توان??ایی س??لول گذارد. اگرچهبنیادی خون قاعدگی برای بیان مارکرهای کراتینوسیتی صحه می

در این مطالعه نیز از محیط تمایزی دوبع??دی اس??تفاده گردی??ده و جهت تم??ایز

118

های استخوانساز اس??تفاده گردی??د ک??ه در اینبهینه، از فاکتورهای مختص سلول م??ورد پ??ژوهش م??ا از هیچگون??ه ف??اکتور تم??ایزی اس??تفاده نگردی??ده اس??ت. در

های بنیادی خ?ون قاع??دگی را در ی??کمطلعه دیگری، رحیمی و همکاران، سلول بع??دی ب??ه س??مت روزه در محی??ط تم??ایزی دوبع??دی و س??ه24دوره زم??انی ها تمایز داده و در این زمینه به نتایج خ??وبی دس??ت پی??دا کردن??د.کاردیومیوسیت

ه??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی هم در محی??ط دوبع??دی ب??هبدین صورت که س??لول های هدف بیان شده و هم در محیط تمایز سه بع??دی ب??هخوبی به سمت سلول

-106]میزان بیان باالتری نسبت به محیط تمایزی دوبع??دی دس??ت پی??دا کردند که در این پژوهش نیز از همان نوع داربست که در پژوهش ما استفاده[107

ه??ا درگردید، استفاده شده اما میزان تخلخل این داربست بیشتر بوده و سلول چنین در این پژوهش تمایز یافته بودند. همin vivoمحیط نزدیکتری به محیط

های دیگر مدت زمان و نوع استفاده از فاکتورهای تم??ایزی، ک??ههمانند پژوهش شده را ب??ا مطالع??ه قبلیدر مطالعه ما استفاده نشده بود، این پژوهش انجام

ه??اینماید. اما در مطالعه دیگری، منگ و همکاران مارکره??ای س??لولمتمایز می نظ??یرها ب??ه عن??وان ی??ک منب??ع بیبنیادی خون قاعدگی را سنجیده و از این سلول

های مختلف سلولی عنوان کرده، ب??دین ص??ورت ک?هجهت تمایز به سمت گونه های مزانشیمیها به علت دارا بودن مارکرهای خاص که هم به سلولاین سلول

های اپیتلیالی نزدیک بوده، دارای توانایی منحص??ر ب??ه ف??ردی درو هم به سلول ، ساس??اکی و2008. در س??ال [70]باش??نده??ا میتمایز به سمت این سلول های بنیادی مغز استخوان دست ب??ه مطالع?ه زده و ب??ههمکاران در مورد سلول

در محی??ط تم??ایزیK14ها قادر به بی??ان م??ارک این نتیجه رسیدند که این سلول های م??ورد مطالع??ه م??اهای مورد مطالعه با سلول. اگرچه سلول[108]باشندمی

های متفاوت ک??ه در ب??االباشد، اما چون طبق نظریهدر این پژوهش متفاوت می ه??ای بنی??ادی مغ??زه??ای بنی??ادی خ??ون قاع??دگی از س??لولبه آن اشاره شد سلول اند، بنابراین قابلیت تمایز مارکره??ای خ??ون قاع??دگی ب??هاستخوان منشا گرفته

بسیار واض??ح ب??وده وK14های کراتینوسیتی نظیر سمت مارکرهای ویژه سلول

119

ای ک?ه م??ا در این مطالع?ه بدس?ت آوردیم مثبت باش??د. اگرچ?ه درطبق نتیج??ه ه??ای کراتینوس??یتیهای بنیادی خون قاعدگی به س??مت س??لولزمینه تمایز سلول

ایای انجام نگرفته است، اما پانسکو و همکاران طی مطالع??هتاکنون مطالعه ه??ای اپیتلی??الی راهای بنیادی مغز استخوان به س??مت س??لولتوان تمایزی سلول

روزه و در حضور10-28بررسی نمودند. بدین صورت که در یک دوره زمانی های بنیادی مغز استخوانفاکتورهای تمایزی اپیتلیالی در محیط دوبعدی، سلول

K19 و K18را به سمت رده اپیتلیالی تمایز داده و در نهایت مارکرهایی نظ??یر

های بنیادی مغ??ز اس??تخوان پس از. در مطالعه مذکور سلول[109]را سنجیدند تمایز مارکرهای اپیتلیالی را بیان نموده اما طبق نتایج مندرج شده این م??یزان بیان چشمگیر نبوده و در مقایسه با پژوهش ما بسیار کمتر بوده اس??ت و این موضوع با توجه به مطالع??ات دیگ??ری ک??ه در ب??اال آورده ش??د و توان??ایی تم??ایز

های بنیادی مغز استخوان سنجیده ش??د،های بنیادی خون قاعدگی و سلولسلول های بنیادی خون قاعدگی نس??بتباشد که توان تمایزی سلولدهنده این مینشان

باش??ند. درهای بنیادی مغز اس??تخوان دارای ت??وان تم??ایزی بیش??تری میبه سلول ه??ایمطالع??ه انج??ام ش??ده، م??یزان بی??ان مارکره??ای کراتینوس??یتی در س??لول

های تمایزنیافته به صورت چشمگیری نمایان بود. درتمایزیافته نسبت به سلول K14مطالعه مشابهی، هاس و همکاران به بررسی مارکرهای اپیتلیالی نظ??یر

های بنی??ادی جنی??نی پرداختند. این مطالعه اینگونه عنوان میکند که سلولIVLو ت??اثیر فاکتوره??ای القاکنن??ده تم??ایزی و در روزه تحت46م??وش در ب??ازه زم??انی

های کراتینوسیتی قرار گرفتند. نت??ایج ب??دین ص??ورت ب??ود ک??هکشتی با سلولهم ادام??ه داش??ته ام??ا46 تم??ایز آغ??از ش??ده و ت??ا روز 16 از روز K14بیان مارکر

چنین بیان مارکردرصد بیان آن در روزهای مختلف، متفاوت بوده است. همIVL ادام??ه داش??ته و نت??ایج آن همانن??د46 تمایز اغاز شده و تا روز 38 از روز

ه??ای بنی??ادیده??د ک??ه س??لول. این مطالعه نشان می[47]مارکر دیگر بوده است های کراتینوسیت را دارند اما چند نکت??ه درجنینی توانایی تمایز به سمت سلول

ه?ای تمایزیافت??ه از ن??وع حی?وانی ب?وده واین مورد وجود دارد. اول اینکه س??لول

120

ه??ای م??ورد مطالع??ه م??ا از ن??وع انس??انی وباشند، در ص??ورتیکه س??لولجنینی می های بنیادی جنینی دارای ق??درت تم??ایزی ب??االییباشند. سلولمزانشیمی بالغ می

ه??ایباشد، ام??ا س??لولها بسیار تهاجمی مییابی به این سلولبوده اما روش دست بنیادی خون قاعدگی ب??ه دلی??ل ی??ک منب??ع دردس??ترس و ع??دم ته??اجم در روش

ه??ای بنی??ادی جنی??نی باش??د.تواند جایگزین خ??وبی ب??رای س??لولآوری آن، میجمع روز بوده، در حالیکه جیانو و46چنین، دوره زمانی تمایزی در این مطالعه هم

بن??دیهمکاران طی یک مطالعه مارکرهای اپیتلی??الی در س??ه ف??از بی??انی طبق??ه- از ابتدا آغاز ش??ده و ت??ا پای??ان ش??اخیk14نمودند، بدین صورت که بیان مارکر

شدن اپیتلیوم ادامه دارد با این تفاوت که این میزان بیان از ابت??دا کم ب??وده و P63 و IVLچنین میزان بیان م??ارکر تا پایان میزان این بیان افزایش میابد. هم

از میانه بیان مارکرها شروع گشته و تا پایان این م??یزان بی??ان اف??زایش میاب??د . این مسئله باعث شد تا بازه[50]باشد روز می21که حداکثر این بازه زمانی

روز کاهش یابد که با توجه ب??ه م??یزان ب??االی بی??ان14زمانی در مطالعه ما به های بنی??ادی خ??ون قاع??دگی، توانایی تمایزی باالی سلولIVL و K14مارکرهای

ش??ود. البت??ه محقق??انهای بنیادی جنینی به خوبی نشان داده مینسبت به سلول های مزانش??یمی راهای بعد، مطالعات تحقیقاتی در راستای تمایز سلولدر سال

[48]ها انج??ام دادن??د، ب??ه این ش??کل ک??ه م??ون و همک??ارانبه سمت کراتینوسی ه??ای پوس??تی تم??ایز داده وهای بنیادی مزانشیمی چربی را به سمت ردهسلول

ه??ایها به سمت اپیتلیال بود. ب??ا این ح??ال س??لولنتایج حاکی از تمایز این سلول های بنیادی خون قاعدگی دارای قابلیت تکثیر درساز برخالف سلولبنیادی چربی

. ام??ا[100]پاساژهای باال نبوده و خیلی زود به مرحله گرانول سازی میرس??ند جدا از تمام این م??وارد، حض??ور داربس??ت زیس??تی ب??ه عن??وان ی??ک م??اتریس و

ه?ا در مراح?ل تم??ایزی ب?ه ص?ورتیکه ب??اعث ایج??اد ی??ک محی?طنگهدارنده سلولinهمانند محیط vivoها را در طی زمان تم??ایز تس??هیل شده و نگهداری سلول

، هاش??می و2011باش??د. ب??ه ص??ورتی ک??ه در س??ال کن، غیرقاب??ل انک??ار میمی های زیستی تحقیق نموده و مطالع??اتی در اینهمکاران در زمینه انواع داربست

121

-، س??لول2007نژاد و همکاران در س??ال چنین کاظم. هم[89]زمینه ارائه دادند های بنیادی مغز استخوان را در محیط سه بع??دی ب??ا داربس??ت ن??انوفیبر تم??ایز داده و نت??ایج آن را نس??بت ب??ه محی??ط دوبع??دی ارزی??ابی ک??رده، ب??ه این نتیج??ه

بع??دی نس??بت ب??ه دوبع?دی بی??انهای تمایزیافته در محیط س??هرسیدند که سلول که ب?ا مطالع?ه ب?ا نت?ایج مش?ترکی داش??ت.[110]بیشتری از خود نشان دادند

عالوه ب??ر این ه??ویت و همک??اران ن??یز س??لولهای بنی??ادی جنی??نی انس??انی را در ها تمایزمحیط سه بعدی به واسطه القاگرهای مخصوص به سمت کراتینوسیت

روز در داربس??ت3ه??ا را ابت??دا ب??ه م??دت دادن??د، ب??دین ش??کل ک??ه این س??لول ه?ایابریشمی کش??ت داده و س??پس ب??ه واس??طه القاگره??ای مخص??وص س??لول

ه??ا تم??ایز دادن??د. نت??ایج ب??ه وس??یله آزمایش??اتاپیتلی??الی ب??ه س??مت کراتینوس??یت مورد بررسیK18 سنجیده شده و مارکر Real Time-PCRایمنوسیتوشیمی و

های بنیادی مغز. سلولjin et alجنین در مطالعه دیگری . هم[111]قرار گرفت ه??ای اپیتلی??الیاستخوان را در حضور داربست پلی الکتیک اسید به س??مت رده

دهن??ده این ب??ود ک??ه روزه تم??ایز دادن??د ک??ه نتیج??ه آن نش??ان10در ی??ک دوره مارکرهای اپیتلیالی در این محیط نسبت به محیط دوبعدی میزان بیان به??تری داشته که البته این میزان بیان نسبت به میزان همان مارکرها در مطالع??ه م??ا

ت??وان ب??ه ن??وع س??لول انتخ??ابی و تف?اوت درکم??تر ب?وده ک?ه این موض?وع را می . در نهایت مطالعه ای که بسیار نزدیک ب??ه مطالع??ه[112]داربست نسبت داد

. در سالKanji et alما در مورد نوع استفاده از داربست بوده است، مطالعه های بنیادی بند ن??اف در حض??ور داربس??تباشد. در این مطالعه سلول می2014

های اپیتلیالی تمایز داده شده و نتایج آن ب??ه این ص??ورتنانوفیبر به سمت رده ه?ا ب?ه دلی??ل اف??زایش س??نتز کالژن و اف?زایش مه?اجرت س??لولیبوده که زخم

فیبروبالست درون زخم میزان بیان م??ارکر و ت??رمیم خ??وبی را از خ??ود نش??ان دادند که این نتایج مهر تاییدی بر عملکرد مناسب داربست مورد اس??تفاده م??ا

. نتایج این بررسی با نتایج مطالعات م??ا از نظ??ر[113]باشددر این مطالعه می

122

س??و ب??ود، هرچن??د ک??هباالتر بودن میزان بیان مارکرها در محیط سه بعدی، هممارکر مورد بررسی در این مطالعه با پژوهش ما متفاوت بود.

گیری( نتیجه2-4 فرد با توان??ایی تکث??یر ب??اال وهای بنیادی خون قاعدگی جمعیت منحصر بهسلول

دهن??د ک??هچ??نین نت??ایج نش??ان میباشند. همتوانایی تمایز به رده کراتینوسیت می های بنیادی خون قاعدگی که تحتسطح بیان مارکرهای کراتینوسیتی در سلول

باشد. عالوه ب??رآن، وج??ود داربس??ت فی??بروئین ک??هپروتکل قرار گرفتند، باال می همانند ماتریس سلولی، محیط بهتر و م??وثرتری جهت انج??ام پروس??ه تم??ایزی

نماید، خود به باالتر ب??ودن س??طحهای بنیادی خون قاعدگی ایجاد میبرای سلول ه??ایبیان مارکرهای مورد نظر کمک موثری نموده است. لذا با توجه ب??ه م??زیت

ها نظیر دسترسی آسان، فراوانی و ع??دم نی??از ب??ه روشاستفاده از این سلول ه??ا منب??ع مناس??بی جهترسد که این سلولتهاجمی جهت دسترسی، به نظر می

های پوستی باشد.درمانی بیماریبررسی در حوزه سلول

( پیشنهادات3-4 های بنی??ادیهایی که سبب افزایش پتانسیل تمایزی سلول- راه اندازی پروتکل1

های پوستی شوند.خون قاعدگی به سلول هایی که ب??ه عن??وان م??اتریس س??لولی س??بب- استفاده از سایر انواع داربست2

بیان بهتر مارکرهای تمایزی شده و سبب تسریع بهبودی شوند. های تمایز یافته در محیط سه بع??دی پس از- بررسی میزان اثربخشی سلول3

ها به مدل حیوانی با نقص پوستی . پیوند آن

123

فصل پنجمضمائم

DMEM-F12( محیط کشت 1شماره

مواد الزم: گرمDMEM-F12 6/15پودر

گرم125/1 بیکربنات سدیم میلی لیترx100، 10 پنی سیلین/ استرپتومایسین

124

میلی لیتر1000 آب مقطر میلی لیترx100،10 اسید های آمینه غیرضروری

میلی لیترx100، 10 ال گلوتامین میکرون22/0 فیلتر

طرز تهیه: را توسط ترازوي حساس وزن شده، به يك ارلن DMEM گرم پودر 6/15ابتدا

گ??رم پ??ودر125/1 ميلي ليتر آب مقطر دو بار تقطير اضافه كرده و 50حاوي س??ی س??ی10بي كربن??ات س??ديم ب??ه آن اض??افه ش??د. ب??ه مخل??وط ف??وق

استرپتومايسين و پني سيلين اضافه ش??د و بع??د از ح??ل ش??دن كام??ل ب??ه حجم 2/7 محلول روي pH موالر HCl 1 با استفاده از میلی لیتر رسانده شد.1000

سی سی اسید آمینه غیر ضروری و ال گلوتامین اض??افه و محی??ط10تنظيم و ميك??رون اس??تريل22/0کشت در فضای استریل زیر هود با استفاده از فیلتر

درجه سانتی گراد نگهداری شد.4و در ظروف شیشه ای درپیچ دار در

PBS( بافر 2شماره

مواد الزم:KCL 2/0گرم

KH2PO4 2/0گرم Na2HPO4 5/1گرم

NaCL 8گرم

طرز تهیه: PH سی سی رسانده و 1000مواد فوق را وزن کرده و با آب مقطر به حجم

تنظیم گردید.2/7 روی HCL 1Nآن توسط

125

Trypsine 0.25% /EDTA 1mM( محلول 3شماره

HBSS میلی لی??تر 100 را در EDTAگ??رم از 0416/0 و Trypsin گ??رم از 25/0

ک??نیم و ه??ر- نگه??داری میoc20 حل کرده و بعد آن را فیل??تر نم??وده و دردم??ای ک??نیم ک??ه در چه??ار درج??ه ی??ک هفت??ه قاب??لدفعه به میزان الزم آن را دفریز می

نگهداری است .

x 100آنتی بیوتیک پنی سیلین/ استرپتومایسین ( 4 شماره

مواد الزم: گرمG 45/0 پنی سیلین

گرم75/0استرپتومایسین میلی لیتر75 آب مقطر

طرز تهیه: رسانیم. س??پس آن را می75مقادیر فوق را وزن کرده و با آب مقطر به حجم

- نگهداری می کنیم.C20الیکه کرده و در

DMEM-HIGH GLUCOSE( محیط کشت سلولی 5شماره DMEM-HIGH GLUCOSE Powder: 1/34 gr

37 gr /0:NaHco3

شود. س??پس آب دیونیزه یا آب دوبار تقطیرحل میml70پودر محیط کشت در تنظیم2/7 ت??ا 7 این محل??ول روی PHکربنات سدیم به آن اضافه می گردد. بی

U/mlشده و پنی سیلین ب??ه غلظت μg/ml و استرپتومایس??ین ب??ه غلظت 100

ش??ود. این رس??انده میml100گ??ردد و در پای??ان ب??ه حجم ب??ه آن اض??افه می100شود. نگهداری میoC4محلول پس از فیلتر کردن تا زمان استفاده در دمای

%(4/0 )( رنگ تریپان بلو6شماره

126

ه?ای زن?ده از این رن?گ اس??تفاده گردی?د. این رن?گ ب?هبرای تعیین نسبت سلول کند. برای تهیهدیده دارند نفوذ میهای مرده که غشا آسیبآسانی به داخل سلول

mg810 آب ح??اوی ml90 از پ??ودر تریپ??ان بل??و ب??ه mg400رن??گ NaCl، mg60

KH2PO4، mg50متیل هیدروکس??ی ب??نزوات اض??افه گردی??د و ت??ا ح??د جوش??یدن تنظیم ش??ده3/7 تا 2/7 آن بین pHحرارت داده می شود. پس از سرد شدن

رسانده شد. ml100و به حجم

HBSS ( محلول 7شماره

gr KCl 4/0

gr KH2PO406/gr NaCl 8/0

gr NaH2PO4 04/0

gr D-glucos 1

Phenol- red gr 01/0 PHرسانیم و میml 100مواد فوق را در یک بشر ریخته با آب دیونیزه به حجم

تنظیم نموده و سپس آن را اتوکالو میک??نیم و در چه??ار درج??ه2/7آن را روی کنیم.نگهداری می

127

فصل ششممنابع

128

1. Bagutti, C., et al., Differentiation of Embryonal Stem Cells into Keratinocytes: Comparison of Wild-Type and β< sub> 1</sub> Integrin-Deficient Cells. Developmental biology, 1996. 179(1): p. 184-196.

2. Coraux, C., et al., Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. Current biology, 2003. 13(10): p. 849-853.

3. Green, H., K. Easley, and S. Iuchi, Marker succession during the development of keratinocytes from cultured human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(26): p. 15625-15630.

4. Tuch, B.E., Stem cells: A clinical update. Australian family physician, 2006. 35(9): p. 719-721.

5. Totey, S. and R. Pal, Adult stem cells: a clinical update. Journal of stem cells, 2008. 4(2): p. 105-121.

6. Dawn, B. and R. Bolli, Adult bone marrow–derived cells: regenerative potential, plasticity, and tissue commitment. Basic research in cardiology, 2005. 100(6): p. 494-503.

7. Kaur, S. and C. Kartha, Stem cells: Concepts and prospects. Current trends in science. Platinum Jubilee Special, Indian Academy of Sciences, Bangalore, 2009: p. 438-452.

8. Friedenstein, A., et al., Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental hematology, 1973. 2(2): p. 83-92.

9. Becker, A.J., E.A. McCulloch, and J.E. Till, Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. 1963.

10. Lodi, D., T. Iannitti, and B. Palmieri, Stem cells in clinical practice: applications and warnings. J Exp Clin Cancer Res, 2011. 30(9): p. 1-20.

11. Wagers, A.J. and I.L. Weissman, Plasticity of adult stem cells. Cell, 2004. 116(5): p. 639-648.

12. Scholer, H.R., The potential of stem cells. An inventory. BUNDESGESUNDHEITSBLATT GESUNDHEITSFORSCHUNG GESUNDHEITSSCHUTZ, 2004. 47(6): p. 565-577.

13. Mitalipov, S. and D. Wolf, Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming, in Engineering of Stem Cells. 2009, Springer. p. 185-199.

14. Ulloa-Montoya, F., C.M. Verfaillie, and W.-S. Hu, Culture systems for pluripotent stem cells. Journal of bioscience and bioengineering, 2005. 100(1): p. 12-27.

15. Friedenstein, A.J., J. Gorskaja, and N. Kulagina, Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental hematology, 1976. 4(5): p. 267-274.

16. Jadon, G., et al., A review on embryonic stem cell information. IJARPB, 2012. 1: p. 165-178.

17. Chambers, I., et al., Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell, 2003. 113(5): p. 643-655.

18. Yamanaka, S., Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell stem cell, 2007. 1(1): p. 39-49.

19. O'Donoghue, K. and N.M. Fisk, Fetal stem cells. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology, 2004. 18(6): p. 853-875.

20. Gallacher, L., et al., Identification of novel circulating human embryonic blood stem cells. Blood, 2000. 96(5): p. 1740-1747.

129

21. Jiang, Y., et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 2002. 418(6893): p. 41-49.

22. Ratajczak, M., et al., A hypothesis for an embryonic origin of pluripotent Oct-4&plus; stem cells in adult bone marrow and other tissues. Leukemia, 2007. 21(5): p. 860-867.

23. Gardner, R., Stem cells: potency, plasticity and public perception*. Journal of Anatomy, 2002. 200(3): p. 277-282.

24. Barrilleaux, B., et al., Review: ex vivo engineering of living tissues with adult stem cells. Tissue engineering, 2006. 12(11): p. 3007-3019.

25. Gimble, J.M., A.J. Katz, and B.A. Bunnell, Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation research, 2007. 100(9): p. 1249-1260.

26. Wong, M.H. Regulation of intestinal stem cells. in Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 2004: Nature Publishing Group.

27. Miura, M., et al., SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(10): p. 5807-5812.

28. McKay, R., Stem cell biology and neurodegenerative disease. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 2004. 359(1445): p. 851-856.

29. Smart, N. and P.R. Riley, The stem cell movement. Circulation Research, 2008. 102(10): p. 1155-1168.

30. Wognum, A.W., A.C. Eaves, and T.E. Thomas, Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of medical research, 2003. 34(6): p. 461-475.

31. Pittenger, M.F., et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999. 284(5411): p. 143-147.

32. Fortier, L., et al., Isolation and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. American journal of veterinary research, 1998. 59(9): p. 1182-1187.

33. Baksh, D., L. Song, and R. Tuan, Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Journal of cellular and molecular medicine, 2004. 8(3): p. 301-316.

34. Tan, S.C., et al., Viscoelastic behaviour of human mesenchymal stem cells. BMC cell biology, 2008. 9(1): p. 40.

35. Schäffler, A. and C. Büchler, Concise Review: Adipose Tissue Derived Stromal Cells—Basic‐ and Clinical Implications for Novel Cell Based Therapies.‐ Stem Cells, 2007. 25(4): p. 818-827.

36. Ruhil, S., V. Kumar, and P. Rathee, Umbilical cord stem cell: an overview. Current pharmaceutical biotechnology, 2009. 10(3): p. 327-334.

37. Mizoguchi, M., et al., Expression of cytokeratins and cornified cell envelope-associated proteins in umbilical cord epithelium: a comparative study of the umbilical cord, amniotic epithelia and fetal skin. Journal of Investigative Dermatology, 2000. 115(1): p. 133-134.

38. Hoyes, A., Ultrastructure of the epithelium of the human umbilical cord. Journal of anatomy, 1969. 105(Pt 1): p. 149.

39. Mihu, C.M., et al., Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord. Rom J Morphol Embryol, 2008. 49(4): p. 441-446.

40. Gupta, P.B., C.L. Chaffer, and R.A. Weinberg, Cancer stem cells: mirage or reality? Nature medicine, 2009. 15(9): p. 1010-1012.

41. De Coppi, P., et al., Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nature biotechnology, 2007. 25(1): p. 100-106.

130

42. Brand, M., J. Palca, and A. Cohen, Skin Cells Can Become Embryonic Stem Cells. National Public Radio. Http://www. npr. org/templates/story/story. php, 2007.

43. Igarashi, T., K. Nishino, and S.K. Nayar, The appearance of human skin. 2005.44. Blanpain, C. and E. Fuchs, Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the

skin. Nature reviews Molecular cell biology, 2009. 10(3): p. 207-217.45. Shokrgozar, M.A., et al., Healing Potential of Mesenchymal Stem Cells Cultured on a

Collagen-Based Scaffold for Skin Regeneration. Iranian Biomedical Journal, 2012. 16(2): p. 68-76.

46. Honma, M., et al., Identification of novel keratinocyte differentiation modulating compounds by high-throughput screening. Journal of biomolecular screening, 2006. 11(8): p. 977-984.

47. Haase, I., et al., In vitro differentiation of murine embryonic stem cells into keratinocyte-like cells. European journal of cell biology, 2007. 86(11): p. 801-805.

48. Moon, K.M., et al., The Effect of Secretory Factors of Adipose-Derived Stem Cells on Human Keratinocytes. International journal of molecular sciences, 2012. 13(1): p. 1239-1257.

49. Aberdam, E., et al., A pure population of ectodermal cells derived from human embryonic stem cells. Stem Cells, 2008. 26(2): p. 440-444.

50. Guenou, H., et al., Human embryonic stem-cell derivatives for full reconstruction of the pluristratified epidermis: a preclinical study. The Lancet, 2009. 374(9703): p. 1745-1753.

51. Coulombe, P.A., R. Kopan, and E. Fuchs, Expression of keratin K14 in the epidermis and hair follicle: insights into complex programs of differentiation. The Journal of cell biology, 1989. 109(5): p. 2295-2312.

52. Walts, A.E., et al., Involucrin, a marker of squamous and urothelial differentiation. An immunohistochemical study on its distribution in normal and neoplastic tissues. The Journal of pathology, 1985. 145(4): p. 329-340.

53. Kubo, E., et al., Transactivation of involucrin, a marker of differentiation in keratinocytes, by lens epithelium-derived growth factor (LEDGF). Journal of molecular biology, 2002. 320(5): p. 1053-1063.

54. Watt, F.M., Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. Journal of Investigative Dermatology, 1983. 81: p. 100s-103s.

55. Metallo, C.M., et al., Retinoic acid and bone morphogenetic protein signaling synergize to efficiently direct epithelial differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells, 2007. 26(2): p. 372-380.

56. Colter, D.C., et al., Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000. 97(7): p. 3213-3218.

57. Datta, N.S. and A.B. Abou-Samra, PTH and PTHrP signaling in osteoblasts. Cellular signalling, 2009. 21(8): p. 1245-1254.

58. Gargett, C.E., R.W. Chan, and K.E. Schwab, Hormone and growth factor signaling in endometrial renewal: role of stem/progenitor cells. Molecular and cellular endocrinology, 2008. 288(1): p. 22-29.

59. Faber, M., et al., Laminin production by human endometrial stromal cells relates to the cyclic and pathologic state of the endometrium. The American journal of pathology, 1986. 124(3): p. 384.

60. Schwab, K.E., R.W.S. Chan, and C.E. Gargett, Putative stem cell activity of human endometrial epithelial and stromal cells during the menstrual cycle. Fertility and sterility, 2005. 84: p. 1124-1130.

131

61. Gargett, C.E., Identification and characterisation of human endometrial stem/progenitor cells. Australian and New Zealand journal of obstetrics and gynaecology, 2006. 46(3): p. 250-253.

62. Holinka, C. and E. Gurpide, Proliferative potential and polymorphism of human endometrial stromal cells. Gynecological Endocrinology, 1987. 1(1): p. 71-81.

63. Matthai, C., et al., Oct-4 expression in human endometrium. Molecular human reproduction, 2006. 12(1): p. 7-10.

64. Dimitrov, R., et al., Characterization of clonogenic stromal cells isolated from human endometrium. Reproduction, 2008. 135(4): p. 551-558.

65. Jensen, U.B., S. Lowell, and F.M. Watt, The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development, 1999. 126(11): p. 2409-2418.

66. Lowell, S., et al., Stimulation of human epidermal differentiation by Delta–Notch signalling at the boundaries of stem-cell clusters. Current biology, 2000. 10(9): p. 491-500.

67. Quesenberry, P.J. and P.S. Becker, Stem cell homing: rolling, crawling, and nesting. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998. 95(26): p. 15155-15157.

68. Hosseinkhani, H., et al., Ectopic bone formation in collagen sponge self-assembled peptide–amphiphile nanofibers hybrid scaffold in a perfusion culture bioreactor. Biomaterials, 2006. 27(29): p. 5089-5098.

69. Hosseinkhani, H., et al., Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in self-assembled peptide-amphiphile nanofibers. Biomaterials, 2006. 27(22): p. 4079-4086.

70. Meng, X., et al., Endometrial regenerative cells: a novel stem cell population. Journal of Translational Medicine, 2007. 5(1): p. 57.

71. Patel, A.N., et al., Multipotent menstrual blood stromal stem cells: isolation, characterization, and differentiation. Cell transplantation, 2008. 17(3): p. 303-311.

72. Zhang, M.J., et al., Could cells from menstrual blood be a new source for cell-based therapies? Medical hypotheses, 2009. 72(3): p. 252-254.

73. Cui, C.H., et al., Menstrual blood-derived cells confer human dystrophin expression in the murine model of Duchenne muscular dystrophy via cell fusion and myogenic transdifferentiation. Molecular biology of the cell, 2007. 18(5): p. 1586-1594.

74. Allickson, J.G., et al., Recent studies assessing the proliferative capability of a novel adult stem cell identified in menstrual blood. The open stem cell journal, 2011. 3(2011): p. 4.

75. Cho, N.H., et al., Lifetime expression of stem cell markers in the uterine endometrium. Fertility and sterility, 2004. 81(2): p. 403-407.

76. Kearns, M. and P. Lala, Bone marrow origin of decidual cell precursors in the pseudopregnant mouse uterus. The Journal of experimental medicine, 1982. 155(5): p. 1537-1554.

77. Schwab, K. and C. Gargett, Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium. Human Reproduction, 2007. 22(11): p. 2903-2911.

78. Taylor, H.S., Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients. JAMA: the journal of the American Medical Association, 2004. 292(1): p. 81-85.

79. Zhong, Z., et al., Feasibility investigation of allogeneic endometrial regenerative cells. J Transl Med, 2009. 7(15): p. 29-37.

80. Hida, N., et al., Novel Cardiac Precursor Like Cells from Human Menstrual Blood Derived‐ ‐ Mesenchymal Cells. Stem Cells, 2008. 26(7): p. 1695-1704.

132

81. McLENNAN, C.E. and A.H. RYDELL, Extent of endometrial shedding during normal menstruation. Obstetrics & Gynecology, 1965. 26(5): p. 605-621.

82. Rodrigues, M.C.O., et al., Menstrual blood transplantation for ischemic stroke: Therapeutic mechanisms and practical issues. Interventional Medicine and Applied Science, 2012. 4(2): p. 59-68.

83. Sato, Y., et al., Characterization of the activation of latent TGF-beta by co-cultures of endothelial cells and pericytes or smooth muscle cells: a self-regulating system. The Journal of cell biology, 1990. 111(2): p. 757-763.

84. Aronow, M.A., et al., Factors that promote progressive development of the osteoblast phenotype in cultured fetal rat calvaria cells. Journal of cellular physiology, 1990. 143(2): p. 213-221.

85. Discher, D.E., P. Janmey, and Y.-l. Wang, Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science, 2005. 310(5751): p. 1139-1143.

86. Greenberg, S., A. Margulis, and J.A. Garlick, In vivo transplantation of engineered human skin. METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN TOTOWA-, 2005. 289: p. 425-430.

87. Cheung, H.-Y., et al., A critical review on polymer-based bio-engineered materials for scaffold development. Composites Part B: Engineering, 2007. 38(3): p. 291-300.

88. Koch, T.G., L.C. Berg, and D.H. Betts, Current and future regenerative medicine—Principles, concepts, and therapeutic use of stem cell therapy and tissue engineering in equine medicine. The Canadian Veterinary Journal, 2009. 50(2): p. 155.

89. Hashemi, Z. and M. Soleimani, Tissue Engineering Scaffolds: History, Types and Construction Methods. Journal of Iranian Anatomical Sciences, 2011.

90. Ravishanker, R., A.S. Bath, and R. Roy, "Amnion Bank"--the use of long term glycerol preserved amniotic membranes in the management of superficial and superficial partial thickness burns. Burns, 2003. 29(4): p. 369-74.

91. Bujang-Safawi, E., et al., Dried irradiated human amniotic membrane as a biological dressing for facial burns--a 7-year case series. Burns, 2010. 36(6): p. 876-82.

92. Aasen, T. and J.C.I. Belmonte, Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature protocols, 2010. 5(2): p. 371-382.

93. Bustin, S., Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of molecular endocrinology, 2002. 29(1): p. 23-39.

94. Lazic, S.E. and R.A. Barker, The future of cell-based transplantation therapies for neurodegenerative disorders. Journal of hematotherapy & stem cell research, 2003. 12(6): p. 635-642.

95. Bongso, A. and E.H. Lee, Stem Cells: Their Definition, Classification and Sources. Stem Cells: From Benchtop To Bedside, 2005: p. 1.

96. Sen, C.K., et al., Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration, 2009. 17(6): p. 763-771.

97. Aarabi, S., M.T. Longaker, and G.C. Gurtner, Hypertrophic scar formation following burns and trauma: new approaches to treatment. PLoS medicine, 2007. 4(9): p. e234.

98. Wong, V.W., et al., Stem cell niches for skin regeneration. International journal of biomaterials, 2012. 2012.

99. Gurudutta, G., et al., Stem cell therapy: A novel & futuristic treatment modality for disaster injuries. The Indian journal of medical research, 2012. 135(1): p. 15.

100. Baraniak, P.R. and T.C. McDevitt, Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regenerative medicine, 2010. 5(1): p. 121-143.

133

101. Ji, L., et al., Generation and differentiation of human embryonic stem cell-derived keratinocyte precursors. Tissue engineering, 2006. 12(4): p. 665-679.

102. Taylor, H.S., Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients. Jama, 2004. 292(1): p. 81-85.

103. Darzi, S., et al., Osteogenic Differentiation of Stem Cells Derived from Menstrual Blood Versus Bone Marrow in the Presence of Human Platelet Releasate. Tissue Engineering Part A, 2012.

104. Nikoo, S., et al., Effect of menstrual blood derived stromal stem cells on proliferative‐ capacity of peripheral blood mononuclear cells in allogeneic mixed lymphocyte reaction. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 2012. 38(5): p. 804-809.

105. Khanmohammadi, M., et al., Proliferation and chondrogenic differentiation potential of menstrual blood-and bone marrow-derived stem cells in two-dimensional culture. International journal of hematology, 2012: p. 1-10.

106. Rahimi, M., et al., Evaluation of menstrual blood stem cells seeded in biocompatible Bombyx mori silk fibroin scaffold for cardiac tissue engineering. Journal of biomaterials applications, 2014: p. 0885328213519835.

107. Rahimi, M., et al., Comparative Evaluation of Cardiac Markers in Differentiated Cells from Menstrual Blood and Bone Marrow-Derived Stem Cells In Vitro. Molecular biotechnology, 2014. 56(12): p. 1151-1162.

108. Sasaki, M., et al., Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. the Journal of immunology, 2008. 180(4): p. 2581-2587.

109. Păunescu, V., et al., In vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to epithelial lineage. Journal of cellular and molecular medicine, 2007. 11(3): p. 502-508.

110. Kazemnejad, S., et al., Development of a novel three-dimensional biocompatible nanofibrous scaffold for the expansion and hepatogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Iran J Biotechnol, 2007. 5(4): p. 201-211.

111. Hewitt, K.J., et al., Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering Part A, 2009. 15(11): p. 3417-3426.

112. Jin, G., M.P. Prabhakaran, and S. Ramakrishna, Stem cell differentiation to epidermal lineages on electrospun nanofibrous substrates for skin tissue engineering. Acta biomaterialia, 2011. 7(8): p. 3113-3122.

113. Joseph, M., et al., Retention of stemness and vasculogenic potential of human umbilical cord blood stem cells after repeated expansions on PES-nanofiber matrices. Biomaterials, 2014. 35(30): p. 8566-8575.

134

Abstract:

Background & Aim:

Human menstrual blood is easily accessible, renewable and inexpensive source of adult

stem cells. Altough, there are many reports about MenSCs feasibility for cell therapy of

some diseases, differentiation ability of these cells into epithelial lineage especially

compared to other stem cell type is not determined. In this study, we evaluated the

trandifferentiation capability of MenSCs into keratinocyte-like cells in presence of 3D

Differentiating Conditions.

Matherial & Methods:

Menstural blood samples were collected from 5 healthy female. After isolation and

culture, in presence of fibroin silk scaffold, differentiation in epithelial lineage was done.

The parallel experiments were carried out to characterize keratinocyte markers such as

Cytokeratin 14 )K14(, Involucrin )IVL( and p63 using immunofluorescence staining and

Real Time-PCR.

Results:

Based on given analysis, the isolated MenSCs exhibited typical expression of keratinocyte

markers at mRNA and protein levels. The immunocytochemistry staining showed that the

differentiated MenSCs could express P63, K14 and IVL protein. Moreover, the

expression levels of P63, K14 and IVL mRNA significantly up regulated in differentiated

MenSCs compared to undifferentiated cells.

Conclusion: Our result demonstrated that MenSCs can develop to keratinocytes. The

development of the method for efficient differentiation of MensScs into keratinocyte

lineage will enable us to access the massive source of epithelial cells for treatment and

healing purposes. But the future studies are required to found out applicability of these

cells for clinical trial of skin diseases.

135

Keywords: Menstrual blood stem cell, keratinocyte, differentiation

136