određivanje specifičnih protutijela

Određivanje specifičnih protutijela

na novi koronavirus SARS-CoV-2

(anti-SARS-CoV-2) i vitamina D

Andrea Radeljak, spec. medicinske

biokemije i laboratorijske medicine

Klinički zavod za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu Kliničke bolnice Merkur - HRN EN ISO 15189:2012 akreditiran i EN ISO 9001 certificiran

Referentni centar Ministarstva zdravstva za izradu i primjenu bioloških referentnih intervala medicinskobiokemijskih pretraga

1

Tečaj trajnog usavršavanja HKMB "Laboratorijska dijagnostika u epidemiji bolesti COVID-19 uzrokovanoj virusom SARS-CoV2" - 12.lipnja 2021

Imunološki odgovor nakon infekcije

SARS-CoV-2• nakon kontakta sa novim koronavirusom SARS-CoV-2

aktivira se imunološki odgovor posredovan protutijelima

• B limfociti, potpomognuti T limfocitima, diferenciraju se u plazma stanice koje potom proizvode protutijela specifična za virusni antigen

• nasuprot tome, odgovor staničnog imuniteta odvija se unutar zaraženih stanica, a posredovan je T limfocitima

• cjelokupni adaptivni imunološki odgovor usmjeravaju pomoćnički T limfociti, dok citotoksični T limfociti imaju ključnu ulogu u čišćenju virusom zaraženih stanica

2

Imunološki odgovor nakon infekcije

SARS-CoV-2

• nejasno je koje su komponente imunološkog sustava najvažnije za borbu protiv SARS-CoV-2 i koje su razine protutijela potrebne za održavanje imuniteta

• protutijela su samo jedan od elemenata imunološkog odgovora

• stanični imunološki odgovor ne može se izmjeriti testom na protutijela

• razumijevanje imunološkog odgovora je presudno za razumijevanje patogeneze bolesti i korisnost terapija te za razvoj cjepiva, farmakoloških i imunoloških terapeutika

3

Racionalna upotreba i interpretacija

seroloških testova

• serološki testovi danas široko dostupni od strane raznih proizvođača▫ odgovarajuće kliničke i analitičke karakteristike

izvedbe nužne za primjenu u rutinskom radu?

• nesigurnosti u pogledu vremena, kinetike i trajanja prisutnosti protutijela na SARS-CoV-2 u različitim populacijama - asimptomatski, simptomatski, hospitalizirani…▫ kliničke indikacije za serološka ispitivanja u

zdravstvenim ustanovama i dalje su ograničene

4

Smjernice u odabiru, provjeri i provedbi

seroloških testova

5

Kliničke indikacije

za serološko testiranje

1) testiranje bolesnika kojima je prošlo >14 dana od pojave simptoma, a molekularno testiranje je negativno, neodređeno ili nedostupno

2) dodatak molekularnom testiranju gdje su trajno pozitivni molekularni testovi unatoč poodmakloj infekciji novim koronavirusom SARS-CoV-2

3) dijagnostička obrada multisistemskog upalnog sindroma u djece (engl. Multisystem InflamatorySindrom - Children, MIS-C)

6



4) otkrivanje prethodne infekcije kod ne-hospitaliziranih osoba (asimptomatskih i simptomatskih) i utvrđivanje seroprevalencije u određenoj populaciji

• protutijela se otkrivaju već 6 dana nakon pojave simptoma i postupno rastu tijekom prva 3–4 tjedna nakon pojave simptoma

• vršnu koncentraciju dosežu 14–30 dana nakon pojave simptoma, a zatim polako padaju kroz 2-3 mjeseca

• razine IgA i IgM protutijela padaju nakon 60 dana od pojave simptoma, a dokazano je da IgG protutijela traju i do 90 dana, čak i u blažim slučajevima• bolesnici s ozbiljnom simptomima i s teškim oblikom bolesti COVID-19

imaju višu razinu protutijela

7


za serološko testiranje5) kvantitativna procjena stupnja imunološkog odgovora

stvaranjem protutijela u oboljelih od bolesti COVID-19

6) pomoć u identificiranju potencijalnih darivatelja rekonvalescentne plazme (od engl. convalescent plasma, CP)

• terapija rekonvalescentnom plazmom se koristi od početka 20. st. za liječenje novih zaraznih bolesti; njezina je djelotvornost povezana s dokazima o poliklonskim neutralizirajućimprotutijelima koja mogu smanjiti trajanje viremije; djelotvornost ove terapije funkcija je nekoliko čimbenika:• vremena doniranja plazme, doziranja i vremena primjene u odnosu na

pojavu bolesti kod primatelja

8



7) utvrđivanje imuniteta i procjena imunološkog odgovora stvaranjem protutijela nakon cijepljenja

• zaštita koju izazivaju trenutno dostupna cjepiva primarno se zasniva na protutijelima koja neutraliziraju novi koronavirusSARS-CoV-2• blokiraju interakciju novog koronavirusa SARS-CoV-2 sa staničnim

receptorima ili sprječavaju konformacijske promjene potrebne za stapanje virusa sa staničnom membranom - važna zaštitna uloga u kasnijoj fazi infekcije i sprječavanje ponovne infekcije

8) serološki testovi, zbog kašnjenja u stvaranju protutijela, ne smiju se koristiti u dijagnozi akutne infekcije virusom SARS-CoV-2 (0– <14 dana) gdje i dalje „zlatni standard“ ostaje molekularno testiranje

9

Ciljna populacija


• vrijednost serološkog testiranja ovisi o pravilnoj upotrebi testa

• s obzirom na procijenjenu prevalenciju bolesti COVID-19 na globalnoj razini, davanje prioriteta pacijentima s kliničkim simptomima ili onima s većim rizikom može poboljšati kliničku izvedbu i/ili dijagnostičku točnost seroloških ispitivanja i smanjiti rizik od pogrešne dijagnoze

• prema preporukama IFCC- a prednost pri serološkom testiranju trebale bi imati osobe sa simptomima bolesti COVID-19 negativne pri molekularnom testiranju(odgođeni klinički početak bolesti)

10

Izbor serološkog testa• serološki testovi detektiraju IgM, IgG, IgA ili ukupna protutijela

• specifična dinamika odgovora IgM, IgG i IgA protutijela utječu na izbor serološkog testa kao i na rezultate ispitivanja

11

Prema: Ghaffari A, Meurant R, Ardakani A. COVID-19 Serological Tests: How Well Do They Actually Perform? Diagnostics (Basel). 2020 Jul 4;10(7):453. doi: 10.3390/diagnostics10070453. PMID: 32635444; PMCID: PMC7400479.

SARS-CoV-2 serološki testovi

• kvalitativni kvantitativni

12

NALAZ: pozitivan ili negativan NALAZ: brojčani (titar antitijela)Prema: Ghaffari A, Meurant R, Ardakani A. COVID-19 Serological Tests: How Well Do They Actually Perform? Diagnostics (Basel). 2020 Jul 4;10(7):453. doi: 10.3390/diagnostics10070453. PMID: 32635444; PMCID: PMC7400479.

Prema: https://www.sepmag.eu/blog/different-types-of-immunoassays


• protutijela stvorena na S-protein▫ IgMSP, IgGSP

zaraženi cijepljeni

• protutijela stvorena na nukleokapsid▫ IgMNCP, IgGNCP

zaraženi

13

Prema: https://www.svkatarina.hr/storage/biokemijski%20lab/test%20covid%2019/2%20(1).jpg


• protutijela stvorena na S-protein▫ IgMSP, IgGSP

zaraženi cijepljeni

• protutijela stvorena na nukleokapsid▫ IgMNCP, IgGNCP

zaraženi

IgGSP

-IgGNCP

-

nije bilo kontakta s

virusom

IgGSP

-IgGNCP

+prethodna infekcija

IgGSP

+IgGNCP

+prethodnainfekcija

IgGSP

+IgGNCP

-

prethodnainfekcija ili cijepljenje

14

Tumačenje rezultata seroloških

testiranja• rezultate serološkog testiranja tumačiti u kontekstu vremena od

pojave simptoma bolesti COVID-19

• negativan rezultat ne potvrđuje nedostatak izloženosti

• pozitivan nalaz ne potvrđuje izloženost SARS-CoV-2

• kako bi se izbjegli lažno negativni i lažno pozitivni rezultati serološkog testiranja, presudno je da i osjetljivost i specifičnost metode ispitivanja protutijela na novi koronavirus SARS-CoV-2 budu što veći u kliničkoj populaciji za koju će se test primjenjivati

• VAŽNO!!!▫ pozitivan rezultat serološkog testa na protutijela SARS-CoV-2 ne znači

da osoba više nije zarazna ili da je imuna na ponovne infekcije!!!

15

Nalaz laboratorijske pretrage

NEGATIVANNALAZ

16

Nalaz laboratorijske pretrage

POZITIVANNALAZ

17

Verifikacija analitičkih i kliničkih

karakteristika seroloških testova

• prije upotrebe seroloških testova u rutinskom radu nužno je provjeriti analitičke karakteristike metode na analitičkom sustavu koji će se upotrebljavati

• dijagnostičke studije točnosti i specifikacije kliničkih karakteristika trebaju se zasnivati na stvarnoj svrsi upotrebe serološkog testa

• uzorci koji se koriste za provjeru metode trebaju biti jednaki onima koji se očekuju tijekom ispitivanja

18

Analitička verifikacija testa

- iskustva KZMBLM -

• sukladno zahtjevima norme HR EN ISO 15189 i CLSI smjernicama (engl. Clinical Laboratory Standards Institut) sastoji se od:

▫ I. Period upoznavanja sa sustavom

kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA)

kvantitativni test:

Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA)

19


- iskustva KZMBLM -

• sukladno zahtjevima norme HR EN ISO 15189 i CLSI smjernicama (engl. Clinical Laboratory Standards institut) sastoji se od:

▫ I. Period upoznavanja sa sustavom

▫ II. Procjena preciznosti sustava

prema CLSI EP 17-A2

analiza kontrolnih uzoraka iz dana u dan

ponovljivost

međupreciznost

ukupna laboratorijska preciznost

20


- iskustva KZMBLM -▫ III. Procjena sustavne pogreške

21

Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA)• sudjelovanje u vanjskoj pocjeni kvalitete akreditiranog organizatora „Labquality”


- iskustva KZMBLM -▫ III. Procjena sustavne pogreške

Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA) provedena međulaboratorijska

usporedba sa Kliničkim zavodom za laboratorijsku dijagnostiku Kliničke bolnice Dubrava

analiza rezultata: Passing-Bablok regresijska analiza

22


- iskustva KZMBLM -

▫ IV. Provjera mjernog područja (linearnost)

▫ V. Provjera i ocjena referentnih intervala verifikacija sukladno protokolu CLSI 28-A3 analizom 20

referentnih osoba ispitivane populacije

dobiveni rezultati potvrdili su prihvatljivost definiranihreferentnih intervala na ispitivanu populaciju

Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA)

spolRI

(negativno)N verifikacija

m, ž< 50,0 AU/mL

2020/20 (100%)

23

Iskustvo KZMBLM - kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA)

• svibanj 2020.g. (nakon „prvog vala”)

• elektrokemiluminescentni imunokemijski test (ECLIA) za kvalitativno dokazivanje IgM / IgG antitijela na virus SARS-CoV2 u humanom serumu; analizator: Roche cobas e411

• analizirano 10 uzoraka pacijenata za koje se očekivalo da budu negativni (negativna epidemiološka anamneza i negativan qRT-PCR test za RNA virusa SARS-CoV2) i 12 uzoraka pacijenata za koje se očekivalo da budu pozitivni (pozitivan qRT-PCR test za RNA virusa SARS-CoV2; pacijenti smješteni u PRIC-u KB Dubrava)

24

NEGATIVAN REAKTIVAN

„NEGATIVNI“ 10 0

„POZITIVNI“ 0 12

Iskustvo KZMBLM - kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA)

• analizirano je 110 uzoraka zaposlenika Kliničke bolnice Merkur

▫ ~ 10% ukupnog broja zaposlenih

▫ djelatnici kojima nije potvrđena infekcija COVID-19, a koji su bili najizloženiji infekciji trijažno – observacijski centar, izoloacijski odjel, trijaža ulaza u

bolnicu, djelatnici na šalterima, laboratorijski djelatnici…

25

NEGATIVAN REAKTIVAN

Djelatnici KZMBLM 30 0

Djelatnici ostalih ustrojstvenih jedinica

80 0

Ukupno 110 0

Iskustvo KZMBLM - kvantitativni test: Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA)

• veljača – ožujak 2021.g.

• kemiluminescentni imunokemijski test na mikročesticama(CMIA) za kvantitativno dokazivanje IgG antitijela domenu vezanja receptora (engl. receptor binding domain, RBD) S1 podjedinice S-proteina (engl. spike protein) virusa SARS-CoV2 u humanom serumu; analizator: Abbott Alinity i

• analizirani uzorci:

▫ osobe koje nisu preboljele COVID-19

▫ osobe koje su imale dokazanu infekciju SARS-CoV-2

▫ cijepljeni djelatnici KB Mekur

26

Osobe koje nisu

preboljele COVID-19

• nisu imali simptome bolesti COVID-19

• nisu bili testirani molekularnim testom (RT-PCR) ili su na testiranju bili negativni

27

Osobe koje su preboljele COVID-19

28

Titar SARS-CoV-2 IgGSP nakon cijepljenja

OSOBE KOJE PRETHODNO NISU PREBOLJELE COVID-19 (N=87)

SARS-CoV-2 IgGAU/mL Nakon 1. doze Nakon 2. doze

Medijan porasta titra antitijela nakon druge doze u odnosu na prvu

Medijan 922, 2 8897, 4 11,7 x

Minimalna vrijednost 18,2 1392,8 1,1 x

Maksimalna vrijednost 24 557,6 32 704,8 112,8 x

OSOBE KOJE SU PRETHODNO PREBOLJELE COVID-19 (N=16)

SARS-CoV-2 IgGAU/mL Nakon 1. doze Nakon 2. doze

Medijan porasta titra antitijela nakon druge doze u odnosu na prvu

Medijan 11 936, 2 10 758, 4 1,1 x

Minimalna vrijednost 7 225,1 7 934,0 0,8 x

Maksimalna vrijednost 35 203,9 55 116,3 1,6 x

29

Titar SARS-CoV-2 IgGSP nakon cijepljenja

OSOBE KOJE PRETHODNO NISU PREBOLJELE COVID-19 (N=30)

SARS-CoV-2 IgGAU/mL

1 mj. nakon cijepljenja

3 mj. nakon cijepljenja

Pad titra antitijela

Medijan 8897, 4 2660, 7 - 65, 9 %

Minimalna vrijednost 1392,8 351, 2 - 0,2 %

Maksimalna vrijednost 32 704,8 7478, 5 - 81,7 %

30

• vrijeme, kinetika i trajanja prisutnosti protutijela na SARS-CoV-2 ???• pozitivan rezultat većine komercijalnih seroloških testova ne ukazuje na imunitet na

ponovnu infekciju, jer nijedan nema dokazanu sposobnost otkrivanja neutralizacijskih protutijela bez obzira na ciljni antigen• za određivanje sposobnosti neutralizacije seruma pacijenta trebaju se koristiti

neutralizacijski testovi (metode smanjenja plaka i mikroneutralizacije)• protutijela su samo jedan od elemenata imunološkog odgovora

Racionalna upotreba i interpretacija

seroloških testova• pozitivan nalaz ukazuje na prijašnji kontakt s virusom ili imunološki odgovor nakon

cijepljenja• negativan nalaz ne isključuje akutnu infekciju

• serološki testovi nikako se ne smiju koristiti u dijagnozi SARS-CoV-2 infekcije u akutnoj fazi bolesti (0 – <14 dana)

• rezultate interpretirati u skladu sa kliničkom slikom i u odnosu na pripadajuće granične vrijednosti

• pozitivan rezultat većine komercijalnih seroloških testova ne ukazuje na imunitet na ponovnu infekciju, jer nijedan nema dokazanu sposobnost otkrivanja neutralizacijskih protutijela

• radi potvrde pozitivnih rezultata, preporuka bila ispitati isti uzorak pacijenta i na alternativnoj platformi (po mogućnosti na različiti ciljni antigen)

• rezultati dobiveni upotrebom različitih imunokemijskih metoda ne smiju se međusobno usposređivati

31

Uloga vitamina D u prevenciji bolesti

COVID-19 i težini kliničke slike

32

Uloga vitamina D u prevenciji bolesti

COVID-19 i težini kliničke slike

• vitamin D je steroidni hormon koji se proizvodi od 7-dehidrokolesterola izlaganjem UVB zrakama

• smatra se da populacije s redovitijom i većom izloženošću sunčevim zrakama imaju manji nedostatak vitamina D i stoga nižu stopu smrtnosti od bolesti COVID-19• potvrđeno je da zemlje bliže ekvatoru imaju niže stope smrtnosti

od bolesti COVID-19 od onih udaljenih od ekvatora

• sve je više pokazatelja da je nedostatak vitamina D povezan s drugim nezaraznim bolestima kao i povećanom osjetljivošću na zarazne bolesti, posebno infekcije gornjih dišnih puteva

33

Vitamin D i imunološki sustav

• vitamin D igra važnu imunološku regulatornu ulogu smanjenjem adaptivnih imunoloških odgovora u stanicama respiratornog epitela tijekom virusnih infekcija• prigušivanjem proliferacije T stanica

• pomicanjem sa T pomagačkih stanica tipa 1 (Th1) na T pomagačkestanice tipa 2 (Th2)

• smanjena proliferacija Th1 smanjenje razine proupalnih citokina i smanjeni stečeni

imunološki odgovor što može biti kontraproduktivno u uspostavljanju uspješnog imunološkog odgovora na infekciju

• smanjena ekspresija proupalnih citokina sputava diferencijaciju i aktivaciju različitih tipova imunih stanica i može spriječiti imunološki posredovana oštećenja

34

Deficijencija vitamina D

• niska razina vitamina D povezana je sa povećanim rizikom od upale pluća i virusnih infekcija gornjih dišnih puteva, a nedostatak sa porastom trombotičkih stanja u oboljelih od bolesti COVID-19

• manjak vitamina D češće se javlja u bolesnika s pretilošću i dijabetesom• rizična skupina u obolijevanju od teškog oblika bolesti COVID-19

• suplementacija vitamina D u bolesnika koji pripadaju rizičnim skupinama bi mogla biti ključna• relativno jeftin, siguran i široko dostupan kao dodatak prehrani• malim, redovnim dnevnim dozama vitamina D moguće je jačanje

imunološkog sustava, a za njegov optimalni učinak na kosti potrebna je doza od 1000–2000 IU. Dnevne doze vitamina D do 10 000 IU se smatraju sigurnima, ali i znatno iznad potrebnih

35

Određivanje koncentracije vitamina D

• u osoba sa vrijednošću vitamina D ispod 50 nmol/L se preporuča testirati razinu 25-OH vitamina D ako je moguće referentnom metodom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti spregnute s dvojnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS) kako bi se izbjegao interferirajući učinak drugih steroidnih struktura, a suplementima opskrbili isključivo oni kojima su suplementi neophodni

• Klinički zavod za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu KB Merkur i Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku KB Dubrava proveli su pilot-studiju:▫ određivanje koncentracije vitamina D LC-MS/MS metodom osobama

koje su se javile u hitnu službu KB Merkur i KB Dubrava sa simptomima bolesti COVID-19 (proljeće 2021.g)

▫ 2 skupine ispitanika. pozitivan qRT-PCR test za RNA virusa SARS-CoV2 negativan qRT-PCR test za RNA virusa SARS-CoV2

36

Postoji li statistički značajna razlika u koncentraciji

vitamina D u osoba kojima je potvrđena infekcija SARS-

CoV-2 u odnosu na one sa negativnim qRT-PCR testom?

37




38




39

16% - vitamin D >75 mmol/L 12% - vitamin D >75 mmol/L

75 mmol/L

Zaključci• određivanje specifičnih protutijela na virus SARS-CoV-2 serološkim testovima

predstavlja dodatni alat u borbi i kontroli pandemije bolesti COVID-19

• udio stanovništva koje je preboljelo bolest (epidemiološko praćenje, gospodarski oporavak (smanjenje broja samoizolacija i karantena radno sposobnog stanovništva) i normalizacija raznih segmenata društva, npr. školsko-obrazovni i zdravstveni sustav)

• cijepljenje - trenutno jedini siguran način sprečavanje zaraze

• nužno kontrolirati i planirati kroz praćenje titra specifičnih protutijela (docjepljivanje?)

• rezultati serološkog testiranja korisni su ako se ispravno interpretiraju

• informacije o vrsti testa (kvalitativni ili kvantitativni), izotip i ciljni antigen mjerenog protutijela (IgM, IgA ili IgG stvoren na S protein ili nukleokapsidni protein virusa) i vremenu testiranja u odnosu na vrijeme kontakta sa virusom (infekcija ili cijepljenje)

• u nedostatku specifičnih i ciljnih farmaceutika, nužno raditi na podizanju imunološkog statusa organizma

• vitamin D

jeftin i pristupačan suplement, vrlo dobra suportivna terapija

nisu dokazane nuspojave u slučaju unosa većih količina od preporučene; u određenih rizičnih skupina (dijabetičari, pretile osobe, kardiovaskularni bolesnici) preporuča se praćenje koncentracije vitamina D specifičnim metodama (LC-MS7MS) u svrhu korekcije terapije

40

određivanje specifičnih protutijela

Documents