Dr. David campos G.Dr. David campos G.dcampos@lamolina.edu.pe

15 Agosto 201315 Agosto 2013

UNALM

I B T

““Obtención de péptidos bioactivos con Obtención de péptidos bioactivos con actividades antihipertensiva y antioxidante a actividades antihipertensiva y antioxidante a

partir dos variedades de quinua partir dos variedades de quinua Chenopodium quinoaChenopodium quinoa) y evaluación de su ) y evaluación de su

estabilidad al metabolismo gastrointestinal y estabilidad al metabolismo gastrointestinal y biodisponibilidad biodisponibilidad in vitro”in vitro”

RESULTADOS PRIMERA PARTERESULTADOS PRIMERA PARTE

Péptidos bioactivosPéptidos con actividad biológica,

• Naturalmente presentes en los alimentos• Durante el procesamiento, fermentación • Consecuencia de la digestión gastrointestinal• A través de procesos de biotransformación enzimática A través de procesos de biotransformación enzimática

Fuente: proteínas origen animal y vegetal (cereales y leguminosas nativos)

Péptidos bioactivos y sus efectos benéficos en el organismo

Hipertensión Hipertensión péptidos inhibidores de la péptidos inhibidores de la enzima convertidor de angiotensina (ACE)enzima convertidor de angiotensina (ACE)

El mecanismo exacto de la actividad antioxidante de péptidos aun no está

esclarecido, se ha propuesto (Qian et al., 2008; Rajapakse et al., 2005). :

• péptidos son inhibidores de la peroxidación de lípidos,

• atrapadores de radicales libres y

• quelantes de iones metálicos de transición

Además, los péptidos antioxidantes mantienen a las células a salvo de daños

por estrés oxidativo a través de la inducción de genes. En este sentido, el

péptido Met-Tir del músculo de sardina previene el estrés oxidativo

estimulando la expresión de hemo oxigenasa-1 y ferritina en células

endoteliales (Erdmann et al., 2006).

Péptidos antioxidantes Péptidos antioxidantes

Formación de péptidos bioactivos

Péptido antihipertensivosPhe-Phe-Val-Ala-ProVal-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr-Gly-Leu-PheTyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-LeuIle-Pro-Ala-Val-Pke-Lys-Trp-Leu-Ala-His-Lys-Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-ArgGly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-ArgLeu-Leu-Pro-His-HisLow molecular weight peptides

Ile-Val-Tyr

Arg-Pro-Leu-Lys-Pro-Trp

Dos variedades de quinua:

1.Blanca Hualhuas

2.Pasankalla

MATERIALES Y METODOSMATERIALES Y METODOS

Péptidos obtenidos de la proteína de Péptidos obtenidos de la proteína de quinua con actividad antihipertensiva y quinua con actividad antihipertensiva y

antioxidanteantioxidante

Harina de quinua

Extracción de la proteína

Hidrólisis enzimática

Péptidos antioxidantes e inhibidores ACE:

Determinación de la estabilidad Biodisponibilidad

METODOSMETODOS

Determinación de la humedad, materia seca y proteína: método AOAC 925.40 (1995).

Determinación de la capacidad antioxidante: Para ABTS, se utilizó el método reportado por Torruco–Uco et al. (2009) y Re, et al. (1999) adaptado para hidrolizados proteicos. Para ORAC (Cao et al., 1993)Determinación de proteína soluble: Se determinó mediante el método de Lowry et al. (1951).

Determinación del grado de hidrólisis: Se determinó mediante el método reportado por Adler – Nissen (1979)

Determinación de la actividad inhibitoria (I-ACE) : Se determinó por el método de Wu et al. (2002).

Determinación del IC50 : Se determina según lo propuesto por Barbana y Boye (2011). El valor de IC50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir 50% de la enzima convertidora de angiotensina (ACE). Los resultados se expresan en mg/mL.

Evaluación de la estabilidad de los péptidos frenta a condiciones de digestión gástrica in vitro: Las muestras (4mg/mL), se someterán secuencialmente a la acción de la pepsina (0,05 mg/mL) durante 2 horas a 37 ºC en un medio ajustado a pH 2.0 con HCL 1N y pancreatina (0,05mg/mL) por 4h ajustando el pH a 5.3 con Na2CO3 y 7 con NaOH 1N, a 37ºC, finalmente se detiene la reacción colocando las muestras en tubos herméticamente sellados en un baño de 95ºC por 10 minutos.

Evaluación de la biodisponibildad in vitro

Purificación y caracterización : Cromatografía de filtración sobre gelCromatografía en fase reversa (HPLC-DAD)Electroforesis

…….METODOS.METODOS

Determinación del IC50 : Se determina según lo propuesto por Barbana y Boye (2011). El valor de IC50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir 50% de la enzima convertidora de angiotensina (ACE). Los resultados se expresan en mg/mL.

Evaluación de la estabilidad de los péptidos frenta a condiciones de digestión gástrica in vitro: Las muestras (4mg/mL), se someterán secuencialmente a la acción de la pepsina (0,05 mg/mL) durante 2 horas a 37 ºC en un medio ajustado a pH 2.0 con HCL 1N y pancreatina (0,05mg/mL) por 4h ajustando el pH a 5.3 con Na2CO3 y 7 con NaOH 1N, a 37ºC, finalmente se detiene la reacción colocando las muestras en tubos herméticamente sellados en un baño de 95ºC por 10 minutos.

Evaluación de la biodisponibilidad in vitro : Se realizará según las condiciones establecidas por Pacheco-Palencia et al. (2008) y Satake et al. (2002).

…….METODOS.METODOS

Resultados

Optimización de extracción de la proteína

1. Screening2. Optimización estadística ,

metodología de superficie de respuesta

Diagrama de Pareto Estandarizada para Proteina soluble A

0 1 2 3 4 5Efecto estandarizado

F:Tamaño de partícula

E:Solvente

C:Tiempo

D:Temperatura

B:NaCl

A:pH

G:Relación solvente a mp +-

Screening: Grafica de Pareto, efectos estandarizados

10

2do

3ro

4to

FactorNiveles

-2 -1 0 +1 +2

pH 7 8 9 10 11

Tiempo (h) 30 60 90 120 150

Temperatura (ºC) 14 23 32 41 50

Relación solvente / materia prima (v/p)

6 12 18 24 30

Factores y niveles por factor del diseño central compuesto, para la optimización de la extracción de la proteína de quinua.

Superficie de respuesta de la optimización de extracción de proteína temperatura (ºC) y relación de

solvente a materia prima (v/p)

 F i t t e d S u r f a c e ; V a r i a b l e : P r o t e i n a s o l u b l e ( m g / 1 0 0 m g m a t e r i a p r i m a )

4 f a c t o r s , 1 B l o c k s , 2 9 R u n s ; M S R e s i d u a l = , 2 3 5 7 0 4 5

D V : P r o t e i n a s o l u b l e ( m g / 1 0 0 m g m a t e r i a p r i m a )

> 8

< 8

< 6

< 4

< 2

1015

20 25 30 35 40 45 50 55

Temperatura

(ºC)

468101214161820222426283032

Relación solvente a muestra (v

/p)02468

1012

Proteina soluble (mg/100mgmateria prima)

P.S. = -98,1516 - 0,587633*T + 5,2435*SMP + 20,3264*pH- 0,208855*θ - 0,0184275*T^2 + 0,0212269*T*SMP + 0,17875*T*pH- 0,00314352*T* θ- 0,079934*SMP^2 - 0,239792*SMP*pH - 0,00217361*SMP* θ - 1,15263*pH^2 + 0,045875*pH* θ - 0,000180694* θ^2

R2 = 94,7823 %R2(adj) = 85,6513 %Error estándar del est. = 2,82424Error absoluto medio = 1,46833Estadístico Durbin-Watson = 2,49927 (P=0,7355)Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,320727

• Temperatura es 36,2ºC,• Relación de solvente a materia prima (v/p) de 20/1; • pH 11 y • Tiempo 149 minutos,

RENDIMIENTO: • 63.92 miligramos de proteína soluble por cada 100 miligramos de proteína total (Kjeldahl, fc=5,85), • que corresponde al 11,1% de la materia prima.

Condiciones óptimas de extracciónCondiciones óptimas de extracción

Estudio de la hidrolisis enzimática

Selección de enzimas: de uso alimentario , propiedades cinéticas y mecanismos de acción diferentes.• Flavourzyme®• Alcalase®• Neutrase®

Enzima/reacción Concentración de enzima pH inicial y Temperatura

Alcalasa® 0.385 UA(1)/g de proteína 8.3 y 50 °C

Flavourzyme® 50 U LAPU(2)/g de proteína 7.0 y 50 °C

Neutrasa® 0.385 UA(1)/g de proteína 7.0 y 50 °C

Dos etapas:Dos etapas:Primera etapa Alcalasa®Segunda etapa Flavourzyme®

0.385 UA/ g de proteína50 U LAPU/ g de proteína

8.3 y 50 °C7.0 y 50 °C

Dos etapas:Dos etapas:Primera etapa Alcalasa®Segunda etapa Neutrasa®

50 U LAPU/ g de proteína0.385 UA/ g de proteína

7.0 y 50 °C8.3 y 50 °C

Dos etapas:Dos etapas:Primera etapa Neutrasa®Segunda etapa Alcalasa®

0.385 UA(1)/g de proteína0.385 UA(1)/g de proteína

8.3 y 50 °C7.0 y 50 °C

(1) Anson units(2) Leucine aminopeptidase unit

Enzimas empleada durante la hidrólisis de la proteína Enzimas empleada durante la hidrólisis de la proteína de quinua de quinua

Porqué trabajar con reactores en dos etapas??

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200 250

Grado de hidrólisis (%)

Tiempo (min)

Primera etapa Segunda etapa

Reactor dos etapas

Reactor una etapa

AlcalasaNeutrasaFlavourzyme

36.86±0.531.46±0.911.86±2.2

Alcalasa y flavourzyme Flavourzyme y alcalasaAlcalasa y neutrasaNeutrasa y alcalsa

61.81±1.962.62±1.149.75±1.447.85±0.6

Grados de hidrólisis (%) obtenidos a 240 min de reacción:

Evolución de la hidrolisis, a diferentes tiempos, en Evolución de la hidrolisis, a diferentes tiempos, en reactores de una (A) y dos etapas (B)reactores de una (A) y dos etapas (B)

A B

Evolución de la proteína soluble, a diferentes Evolución de la proteína soluble, a diferentes tiempos, en reactores de una (A) y dos etapas (B)tiempos, en reactores de una (A) y dos etapas (B)

Alcalasa

Neutrasa

Flavourzyme

1697.07±50.9 µmol TE/g de prote.

1480.50±21.6 µmol TE/g de prote.

1281.87±35.1 µmol TE/g de prote.

Capacidad antioxidante obtenida a 240 min de reacción:

Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes tiempos, en reactores de una etapatiempos, en reactores de una etapa

Alcalasa y flavourzyme Flavourzyme y alcalasaAlcalasa y neutrasaNeutrasa y alcalasa

2311.36±77.1 µmol TE/g de prote.2146.40±72.2 µmol TE/g de prote.2075.78±46.2 µmol TE/g de prote.2007.88±87.8 µmol TE/g de prote.

Capacidad antioxidante obtenida a 240 min de reacción:

Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes tiempos, en reactores de dos etapas tiempos, en reactores de dos etapas

Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa® Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa® y capacidad antioxidante y capacidad antioxidante

Blanca Hualhuas Pasankalla

Alcalasa

Neutrasa

Flavourzyme

87.34±0.8 %.

89.22±0.7 %.

17.02±0.2 %.

Porcentaje de inhibición de la angiotensina obtenido 120 min de reacción:

Inhibición de la angiotensina a diferentes Inhibición de la angiotensina a diferentes tiempos, en reactores de una etapatiempos, en reactores de una etapa

Alcalasa y flavourzyme Flavourzyme y alcalasaAlcalasa y neutrasaNeutrasa y alcalasa

76.72±0.9 %.73.29± 0.9 %.93.05±0.3 %.88.58±0.4%.

Porcentaje de inhibición de la angiotensina obtenido 120 min de reacción:

Inhibición de la angiotensina a diferentes tiempos, en reactores de dos etapas

Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa® e Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa® e inhibición de la enzima convertidora de angiotensinainhibición de la enzima convertidora de angiotensina

PasankallaBlanca Huallhuas

Alcalasa 60 min

Alcalasa 120 min

Neutrasa 120 min

280 µg/ml.

120 µg/ml.

98 µg/ml.

Valores ACE, IC50

Valores IC50 para diferentes tratamientos enzimáticos

Alcalasa y neutrasa 120 min

Neutrasa y alcalsa 120 min

Falvourzyme y alcalasa 120 min

79.5 µg/ml.

103.9 µg/ml.

470 µg/ml.

Valores ACE, IC50

Valores IC50 para diferentes tratamientos enzimáticos

Valores ICValores IC5050 de los péptidos inhibidores de la enzima de los péptidos inhibidores de la enzima

convetidora de angiotensina. Hidrólisis con alcalasa, 60 min convetidora de angiotensina. Hidrólisis con alcalasa, 60 min

IC50 = 0.28 mg/ml

Efecto de la simulación gastrointestinal in vitro en la actividad inhibitoria ACE-I del hidrolizado de tiempo 60 (min) con grado de hidrólisis 31.4 %.

Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )

Hidrólisis con alcalasaHidrólisis con alcalasa

I-ACE (%)

DO, 214 nm

I- ACE

Separación de los péptidos con actividad inhibidora angiotensina mediante Separación de los péptidos con actividad inhibidora angiotensina mediante cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )

Hidrólisis con alcalasa – neutrasa Hidrólisis con alcalasa – neutrasa

I- ACE

Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )

Hidrólisis con alcalasa – neutrasa Hidrólisis con alcalasa – neutrasa

Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante cromatografía de filtración en gel (Biogel P2® )cromatografía de filtración en gel (Biogel P2® )

Hidrólisis con neutrasa Hidrólisis con neutrasa

Se ha optimizado el procedimiento de extracción de la proteína de quinua. pH = 11. Temperatura =36 °C. Rela. solv/mp = 20/1. Tiempo =150 min.

Con reactores de dos etapas, combinando enzimas con mecanismos de acción diferentes se obtienen Grados de Hidrólisis de la proteína altos , mayores a 60% y Capacidad antioxidante elevada .

La hidrólisis en dos etapas también permite obtener péptidos con alta actividad anti - hipertensiva (IC50 = 80 µg/ml) y estables al sistema gastrointestinal.

La proteína de quinua hidrolizada podrá ser empleada para la elabaoracion de alimentos funcionales y/o nutraceuticos .

Conclusiones