nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.221

Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn ThuNgười thực hiện: Nguyễn Văn HàNơi thực hiện: Bộ môn vi sinh & và sinh học Trường Đại học dược Hà Nội

Alexander Fleming 1928

Kháng thuốc

Tỷ lệ nhiễm khuẩn cao

Khoảng 60% kháng sinh hiện nay là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó chủ yếu là do chi Streptomyces sản xuất

Tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gôc từ VSV. Streptomyces được ứng dụng để sản xuất KS

Xác định sơ bộ đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces 184.221

Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.

Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, lựa chọn dung môi chiết xuất tốt nhất, tinh chế kháng sinh

Bước đầu xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được.

1

2

3

4

www.themegallery.com

I. Tổng quan

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Company Logo

Chủng streptomyces 184.221Máy móc thiết bị

Môi trường ISP2,ISP3

Dung môi

Môi trường nuôi cấy xạ khuẩnMôi trường nuôi cấy vsv kiểm định

Vi sinh vật kiểm địnhNguyên vật liệu, thiết bị

Nguyên vật liệu, thiết bị

Company Logo

1 2 3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xác định sơ bộ đặc điểm hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.221

Chọn lọc và cải tạo giống: Chọn MT, VSV kiểm định, SLNN, ĐB cải tạo giống,

4

Lên men, chiết tách,tinh chế kháng sinh,xác định độ bền pH, nhiệt độ của dịch chiết

Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được: đo nhiệt độ nóng chảy, UV, IR, MS

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Đột biến hóa học

Chiết, tách

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA STREPTOMYCES 184.221

Đặc điểm hình thái Màu sắc

Khuẩn ty khí sinh Vàng xám

Khuẩn ty cơ chất Nâu

Sắc tố hòa tan Nâu

Hình dạng chuỗi bào tử Gãy,đứt

Bề mặt bào tử Nhẵn

www.themegallery.com

VK kiểm

định

MT1 MT2 MT5 MT6 MT7

B.pumilus (mm) 23,73 24,44 22,83 20,96 19,80

s 0,31 0,59 0,85 0,67 1,05

P.mirabilis (mm) 22,42 21,58 20,48 21,90 19,32

s 0,25 0,54 0,75 0,19 0,10

D

D

Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và vi khuẩn kiểm định

MT2 cho kết quả tốt nhất và 2 VK kiểm định được chọn là B.pumilus và P.mirabilis

KẾT QUẢ SÀNG LỌC NGẪU NHIÊN

STT Dạng chủng

Kết quả Dạngchủng

Kết quả

B.pumilus P.mirabilis B.pumilus P.mirabilis

(mm) s

(mm) s (mm) s

(mm) s

1 1 25,36 1,15 21,70 1,25 16 22,41 1,05 23,02 0,302 2 24,37 0,67 24,40 0,90 17 20,91 0,63 21,70 1,443 3 23,41 0,32 21,31 1,93 18 21,67 0,55 22,70 1,474 5 22,57 0,25 23,20 0,39 20 21,00 0,89 22,00 0,385 6 21,91 0,59 20,04 0,66 21 21,19 0,52 23,04 0,766 7 21,00 0,62 19,70 2,85 22 20,88 0,76 21,60 2,467 9 24,02 0,28 22,54 0,70 24 21,83 1,41 21,04 1,568 10 23,62 0,49 23,34 0,75 25 22,24 0,79 22,98 1,259 14 21,12 0,69 23,12 0,73 29 22,36 0,60 21,68 1,4010 15 21,52 0,70 21,44 0,78 30 21,88 0,96 21,40 1,55

Đem ĐB lần 1

KẾT QUẢ UV LẦN 1

HTKS

Biến

chủng

B.pumilus P.mirabilis

(mm) s% biến đổi

hoạt tính (mm) s

% biến đổi

hoạt tính

1 1 24,28 0,91 102,23 21,06 1,05 100

2 3 24,78 0,61 104,33 26,46 0,75 125,64

3 10 24,81 1,25 104,46 23,46 0,98 111,39

4 12 25,67 1,43 108,08 23,48 1,50 111,49

5 13 24,20 0,98 101,89 25,14 1,34 119,37

6 14 24,70 0,80 104,00 25,68 1,03 121,93

7 15 24,22 1,20 101,98 26,20 1,47 124,41

8 16 25,58 0,81 107,71 26,72 0,33 126,88

9 17 26,85 0,57 113,05 26,20 0,49 124,41

10 19 24,01 1,05 101,09 26,20 0,72 124,41

Chứng 23,75 0,62 100,00 21,06 0,96 100,00

D D

Đem ĐB lần 2

Tỷ lệ sống sót là 0,3%

KẾT QUẢ UV LẦN 2

HTKS

Biến

chủng



hoạt tính (mm) s

% biến đổi

hoạt tính

1 7 25,36 0,91 101,52 24,96 0,91 104,65

2 8 25,43 0,22 101,80 25,06 0,40 105,07

3 9 25,65 0,51 102,68 23,81 0,32 99,83

4 15 25,14 0,61 100,64 23,08 0,48 96,77

5 16 26,70 0,35 106,89 24,28 0,55 101,59

6 17 26,03 0,49 104,20 24,93 0,80 104,53

7 27 26,58 0,33 106,41 24,5 0,50 102,73

8 31 25,38 0,72 101,60 24,08 0,48 100,96

9 34 25,03 0,55 100,20 23,23 0,32 97,40

Chứng 24,98 0,51 100,00 23,85 0,62 100,00

D D

Đem ĐB hóa học bằng HNO2


KẾT QUẢ ĐB HÓA HỌC

HTKS

Biến

chủng



hoạt tính (mm) s

% biến đổi

hoạt tính

1 3 27,60 0,30 105,34 26,50 0,96 99,29

2 4 27,06 0,34 103,28 26,48 0,80 99,21

3 7 26,92 0,36 102,75 25,60 0,14 95,92

4 8 26,46 0,28 101,00 26,62 0,29 99,74

5 18 27,00 0,85 103,05 29,55 0,30 110,72

6 19 26,24 0,26 100,15 29,71 0,12 111,32

7 21 27,60 0,77 105,34 27,56 0,62 103,26

8 26 26,30 0,65 100,38 27,40 0,53 102,66

9 31 27,48 0,40 104,88 28,96 0,73 108,51

10 32 26,78 0,83 102,21 27,37 0,93 102,55

Chứng 26,20 0,43 100,00 26,69 0,79 100,00


Company Logo

105,89

107,71%

100,00%

ĐB HH

ĐB UV 2

ĐB UV 1

SLNN

110,72%

121,11%

H1. SƠ ĐỒ BIỂU THỊ HTKS CỦA CẢI TẠO GIỐNG

Company Logo

LÊN MENLÊN MEN

KẾT QUẢ LÊN MÊN

Chọn MT lên

Chọn chủng dạng chủng, biến chủng lên men

Môi trường


(mm) s (mm)S

MT1dt 11,2 0,52 12,1 0,61

MT2dt 15,3 0,33 14,4 0,19

MT5dt 12,6 0,44 10,2 0,31

D

Chọn MT lên men thích hợp

Dchọn MT2dt là môi trường lên men

Dạng –

biến chủng


(mm) s (mm) s

SLNN.2 15,96 0,98 19,05 0,36

SLNN.5 16,32 0,63 12,10 0,45

SLNN.10 12,58 0,28 12,64 0,64

ĐB1.3 22,30 0,72 19,73 0,70

ĐB1.16 15,23 0,90 14,30 1,05

ĐB1.17 20,92 0,56 18,48 1,08

ĐB2.16 24,02 0,36 23,4 0,85

ĐB2.17 22,57 0,84 23,06 0,60

ĐB2.27 21,05 0,74 16,50 0,32

ĐBHH.18 23,95 0,95 25,20 0,26

ĐBHH.19 22,70 0,22 20,80 0,42

D

Chọn MT dạng chủng, biến chủng thích hợp

D

ĐBHH.18 đươc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

H2. Đồ thị kết quả thử HTKS các dạng chủng, biến chủng trong lên men chìm.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc

DD

pHB.pumilus P.mirabilis

1 ngày 5 ngày 1 ngày 5 ngày

(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s

3 20,40 0,62 16,71 0,81 20,61 0,52 17,00 0,26

5 23,68 0,11 22,95 0,22 22,03 0,66 20,60 0,68

7 25,07 0,20 23,85 0,74 26,06 0,42 24,93 0,02

9 23,58 0,53 22,83 0,75 24,27 0,69 22,10 0,47

11 18,65 0,34 17,85 0,76 20,5 0,23 18,35 0,75

DD DD

Hoạt tính kháng sinh bền ở pH trung tính và khoảng gần pH trung tính

Kết quả đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc

Dịch lọc

B.pumilus P.miramilis

(mm) s (mm) s

Nhiệt độ thường 23,45 0,72 25,22 0,41

Đun sôi 10 phút 19,21 0,52 19,75 0,80

Đun cách thủy 30 phút 23,18 0,54 22,55 0,28

DD

Kháng sinh không bền với nhiệt độ cao

DM pH

B.pumilus

Lần 1 Lần 2

Pha DM Pha nước Pha DM Pha nước

(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s

Cloroform

3 23,97 0,41 18,49 0,39 20,44 0,41 0,00 0,00

5 22,98 0,67 19,26 0,81 19,59 0,34 0,00 0,00

7 25,00 0,36 18,93 0,79 21,70 0,91 0,00 0,00

9 23,20 0,68 19,06 0,31 20,12 0,27 0,00 0,00

11 24,10 0,35 18,96 0,74 19,24 0,71 0,00 0,00

D D D D

Kết quả HTKS để chọn DM chiết tách kháng sinh

SKLM

• Hệ 1

Chloroform : Methanol: Amoniac 25% (1:2:1)

• Hệ 2 n-Butanol: Ethanol: Dimethylformamid

(3:1:1)• Hệ 3

Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)

• Hệ 4Ethylacetat: Propanol: Dicloromethan

(2:2:1)

HỆ DUNG MÔI

Kết quả SKLM chọn hệ DM

Hệ Vết 1 Vết 2 Vết 3

Hình dạng Rf Hình dạng Rf Hình dạng Rf

Hệ 1 Tròn 0,89 Bầu dục 0,75 _ _

Hệ 2 Tròn 0,86 Bầu dục 0,73 _ _

Hệ 3 Tròn 0,42 Bầu dục 0,33 _ _

Hệ 4 Tròn 0,71 Tròn 0,56 Bầu dục 0,39

Hệ 4 có khả năng tách tốt nhất. Hệ 4 được chọn làm hệ DM chạy sắc ký cột lần 1

Company Logo

Dịch Lọc (5,2 lít)

Dịch chiết DMHC

KS thô (0,3023g )

KS tinh khiết

Chiết Cất quay Chạy cột

Kết quả Chạy cột sắc ký lần 1

Các

phân đoạn

B.pumilus Rf

(mm)

s Vết 1 Vết 2 Vết 3

2 9,50 0,97 0,71 - -

3 11,58 0,78 0,71 - -

4 14,33 0,33 0,71 0,46 -

5 18,08 0,60 0,71 0,46 -

6 19,80 0,59 0,70 0,47 -

7 21,40 0,36 0,70 0,47 -

8 19,00 0,16 0,70 0,47 -

9 16,60 0,43 0,70 0,47 -

14 9,91 0,59 - - 0,33

15 13,78 0,71 - - 0,31

16 9,98 0,14 - - 0,32

17 9,40 0,11 - - 0,33

D

Kháng sinh tinh khiết 1


Gộp các phân đoạn 4-9 đem chạy cột lần 2 với Hệ DM Ethylacetat : Methanol: n-Hexan(20:1:1)

Kết quả Chạy cột sắc ký lần 2

Các phân

đoạn

B.pumilus Rf

(mm) s Rf1 Rf2

3 7,76 0,61 0,71 -

4 7,44 0,17 0,71 -

5 12,55 1,05 0,70 0,46

6 18,78 0,64 - 0,46

7 20,01 0,76 - 0,46

8 21,6 0,29 - 0,46

9 22,2 0,66 - 0,4610-14 - - - -

D



KẾT QUẢ VÀ HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH CHIẾT, TÁCH,TINH CHẾ

Chất Khối lượng (g) Hiệu suất %)

KS1 0,0203 6,60

KS2 0,0258 8,53

KS3 0,0082 2,71

Tổng 0,0651 17,84

KS2 được chọn để nghiên cứu tiếp theo

KẾT QUẢ ĐO NHIỆT ĐỘ NÓNG CHẢY , PHỔ HỒNG NGOẠI( IR), PHỔ TỬ NGOẠI (UV), PHÔT KHỐI( MS) KS2

KS2 có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 213-219ᵒC

Phổ UV Phổ UV có 2 đỉnh hấp thụ ở các bước sóng 441nm và 290 nm.

Trong cấu trúc kháng sinh có thể có nhân thơm, có các liên kết bội liên hợp hoặc có các dị tố O, N, S,...

290

441

Nhiệt độ nóng chảy

KẾT QUẢ PHỔ HỒNG NGOẠI( IR)

Đỉnh hấp thụ Nhóm chức

3442,94 cm-1 Đặc trưng cho liên kết N-H.

2958,80 cm-1 Đặc trưng cho liên kết C-H1714,72 cm-1 Đặc trưng cho liên kết C=O trong ketone

hoặc carboxylic acid1649,14 cm-1 Đặc trưng cho liên kết alkene hoặc amid1577,77 cm-1 Đặc trưng cho liên kết N-H

1259,52 cm-1 ; 1095,27 cm-1 Đặc trưng cho liên kết C-X( Fluorid) hoặc C-O, C-N.

KẾT QUẢ PHỔ KHỐI( MS)

566,47

Dự đoán khối lượng phân tử dự kiến của KS2 là 565,47 đvC

Xác định sơ bộ đặc điểm hình thái chủng streptomyces 184.221: khuẩn ty khí sinh :vàng xám; khuẩn ty cơ chất: nâu; sắc tô hòa tan: nâu; hình dạng chuỗi bào tử: gãy; bề mặt bào tử: nhẵn.

Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184.221 sau quá trình cải tạo giống tăng lên đáng kể: dạng chủng ĐBHH.18 tăng lên 121,11% so với chủng ban đầu.

MT2dt là môi trường thích hợp nhât cho Streptomyces 184.221 sinh tổng hợp kháng. Chloroform được chọn làm DM chiết ở PH 5, hệ DM 4 và hệ DM ethylaceat : methanol: n-heaxan( 20:1:1) được sử dụng để tinh chế kháng sinh, H=17,84% .

Kháng sinh 2 :Phổ rộng; không bền ở nhiệt độ cao;Bền trong pH trung tính hoặc kiêm nhẹ, bị phá hủy bởi acid mạnh hoặc base mạnh;nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 213-219ᵒC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại các bước sóng 290nm, 442nm; hấp thụ ánh sáng hồng ngoại. Khối lượng phân tử dự đoán là 565,47 đvC. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể có các nhóm chức trong kháng sinh là: -N-H, -C-H, -C=O, -C=C, -C-F, -C-N

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

Tiến hành phân loại chủng streptomyces 184.221 theo ISP và giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces 184.221

Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 184.221(bằng UV, bằng hóa chất,…) để tạo ra chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn

Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn

Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu

Tiến hành phổ khí, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất vật lý, hóa học, … đê xác định chính xác cấu trúc hóa học và tên khoa học của kháng sinh do Streptomyces 184.221 sinh tổng hợp nên

nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184.221

Documents