LOGO

SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRẦN THỊ LAN HƯƠNG

CAO XUÂN BÁCH

http://humanorgans.org/tuberculosis/

Mycobacterium

tuberculosis scanning

electron micrograph.

Mag 15549X. CDC.

Nội dung

Tài liệu tham khảo

Phương pháp mới

Công nghệ sản xuất

Cơ chế tác động

Giới thiệu Rifamycin

Giới thiệu Rifamycin

Rifmapicin

Rifamycin lần đầu tiên được tách chiết vào năm 1957 từ một canh trường lên men của Streptomyces mediterranei

7 kháng sinh họ này đã được phát hiên có tên rifamycin A, B, C, D, E, S, và SV

Cơ chế tác động

Cơ chế tác động

•Rifamycin là kháng sinh dùng tại

chỗ hoặc tiêm

•Điều trị các nhiễm khuẩn gram âm

và gram dương có nhạy cảm với

thuốc các nhiễm khuẩn ngoài da và

các mô mềm, vết thương, bỏng...

•Đặc biệt hiệu quả với

mycobacteria

•Các sản phẩm ks bán tổng hợp sử

dụng để điều trị các bệnh lao,

phong và nhiễm khuẩn

mycobacterium

Công nghệ sản xuất

Nhân giống Lên men Xử lý thu KS

Chọn giống

Chọn môi

trường

Nhân giống

Chuẩn bị

môi trường,

thiết bị

Lên men

Trích ly,

Chưng

cất, Tẩy

màu, Kết

tinh, Sấy

Nhân giống

Chọn giống

Chọn môi

trường

Nhân giống

Streptomyces mediterranei (Amycolatoposis mediterranei)

Lĩnh giới: Bacteria

Giới: Eubacteria

Ngành: Actinobacteria

Bộ: Actinomycetales

Họ: Streptomycetaceae

Chi: Streptomyces

Loài: Streptomyces mediterranei

S. mediterranei thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria)

là vi khuẩn nhân thật-Eubacteria phân bố rất rộng rãi

trong tự nhiên. S. mediterranei là vi khuẩn Gram

dương, khuẩn lạc hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn

thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces).

Môi trường

1l môi trường nhân giống: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất mạch nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất

Thời gian ủ 7-8 ngày-Nhiệt độ: 28oC-Độ ẩm tương đối: 40%-50%

Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5% bột cá, 0,8 % KNO3, 0,05% KH2PO4, 0,0001% CoCl2, 0,5 % CaCO3.

Lên men

Quá trình lên men phải bổ sung

thêm glucose để hàm lượng

glucose tối thiểu còn lại trong dịch

lên men là 1-1,5%.

-Nhiệt độ lên men: 28oC, pH 6,6

-Thời gian lên men: 9 ngày

-Tốc độ khuấy trộn: 130 rpm

Nocardiamed

iterranei

Nhân giống

Lên menMôi

trường

Môi trường

Môi

trường

Xử lý thu kháng sinh

Trích ly Tẩy màu

Trích ly

Chưng cất

Tẩy màu

Kết tinh

Sấy

RifamycinB

-Trích ly: Ethyl acetat

(CH3COOCH2CH3), pH=2, 10oC

Có thể trích ly hai lần dung môi

-Chưng cất: thu hồi dung môi và

cô đặc dịch sau trích ly(nồng độ

trước kết tinh ≥70%)

-Tẩy màu bằng chất hấp phụ

-Kết tinh: bổ sung Natri acetat

0,1%, cô chân không ở nhiệt độ

thấp 28oC, bổ sung mầm kết

tinh(bột sản phẩm)

-Sấy: sấy chân không thùng quay

đuổi hết dung môi và đạt hàm ẩm

chuẩn.

Một số chỉ tiêu sản phẩm của

Rifamycin B:

-Yêu cầu sản phẩm đạt độ tinh khiết

trên 99,5%

- Độ ẩm: 3-5%

-Tinh thể Rifamycin B dạng kim, có

màu vàng, đồng đều.

- Đạt tiêu chuẩn quốc tế cho phép

Phương pháp mới

Nghiên cứu sản xuất kháng sinh Rifamycin

Phương pháp lên men gián đoạn sử dụng chủng cố định

trong gel alginate và các hạt alginate biến đổi

Trong lên men batch và fed- batch truyền thống hơn

50% thời gian lên men là sd cho tế bào phát triển.

Lên men sử dụng các tế bào tự do dễ nhiễm toàn bộ,

thất thoát lớn

kỹ thuật lên men sử dụng các TB cố định được cân nhắc

Phương pháp sản xuất kháng sinh sử dụng các tế bào

cố định đã thành công, ứng dụng sản xuất nhiều loại

kháng sinh khác nhau: Rifamycin, Neomycin,

cephamycin, oxytetracycline...

Ưu điểm

Năng suất cao hơn

Dễ dàng thực hiện và dễ dàng tái sử dụng

Hạn chế khả năng nhiễm

Thời gian lên men giảm không ảnh hưởng

đến năng suất kháng sinh tạo thành

Vật liệu và phương pháp

Chủng VSV

Chủng vi sinh

vật:

Amycolatopsis

mediterranei

ATCC 21789

Nhân giống

Môi trường,

Nuôi trong các

bình tam giác

Nuôi lắc 48h/

30oC/200rpm

Chuẩn bị Gel

Gel alginate

Canh trường

VSV

Tác nhân làm

cứng

Lên men

Lên men gián

đoạn sử dụng

các hạt gel có

cố định chủng

VSV

Nhân giống

Thành phần: (g/l)

Glucose: 10

KH2PO4: 3

K2HPO4 : 1,5

MgSO4 .7H2O: 1

FeSO2.7H2O: 0,016

Zn acetate: 0,001

YE: 5

Điều chỉnh đến pH= 7 bằng

NaOH, phân bố vào các bình

tam giác, 50ml/bình khử

trùng

Nuôi lắc 48h/ 30oC/200rpm.

Thu tế bào sinh dưỡng để

cấy vào các bình lắc trong kỹ

thuật cố định

Chuẩn bị các hạt gel alginate

80ml nước cất+ 4g sodium alginate,

trộn đều thanh trùng 121C/15’

Định trước trọng lượng tế bào lấy

ra từ canh trường nuôi sau 96h/

300C( phần nổi phía trên)+ 20ml

nước cất vô trùng

Trộn 20ml canh trường với 80ml

dung dịch chứa gel ở trên

Nhỏ hỗn hợp vào dung dịch CaCl23%

Làm đông ở nhiệt độ phòng, cất giữ

qua đêm/ 50C

Môi trường cho sản xuất rifamycin

Thành phần: (g/l)

Glucose: 40

KH2PO4: 3

K2HPO4 : 1,5

MgSO4 .7H2O: 1

FeSO2.7H2O: 0,016

Zn acetate: 0,001

YE: 5

Điều chỉnh về pH 7 bằng NaOH 1M, và phân bố vào các bình tam giác mỗi bình 50ml thanh trùng

Gluocose được khử trùng riêng, và đc thêm vào môt trường nuôi cấy trc khi cấy.

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

• Nồng độ alginate

• Đường kính hạt

• Thời gian cố định các tế bào trong gel

• Thời gian lên men

• Khả năng tái sử dụng các tế bào cố định

KQ: Ảnh hưởng nồng độ alginate

• 3-4% hàm lượng rifamycin

B& SV tăng

• 4-5% hàm lượng rifamycin

B & SV giảm: 544-450mg/l;

534-363mg/l

• 3-5% CDW giảm từ 11.05-

8.2g/l

• Kq cho thấy ở nđộ thấp

hơn 4% cho hàm lượng

Rifamycin cao hơn

Ảnh hưởng của đường kính hạt gel

• TN với nồng độ gel 4%

• Đường kính hạt: 3- 3,7- 4,2

mm

• Kq cho thấy tăng đường kính

hạt từ 3-4,2mm- hàm lượng

Rifamycin B & SV tăng:

432,75- 565mg/l; 419,5-

589mg/l

• CDW cũng tăng từ 7,95 -

10,7 g/l

• Kết luận đk 4,2 là thích

hợp nhất

Thời gian cố định tế bào trong gel

• Thời gian nghiên cứu 72h-

168h

• Hàm lượng 2 kháng sinh

tăng khi tăng thời gian lên

96h, CDW tăng

• 96-168h hàm lượng giảm

668-267,5; 542,5-

234.5mg/l, CDW giảm còn

5,7g/l – 168h

• Lượng đường tiêu thụ nhiều

nhất(96h)

Tác nhân làm cứng gel

• ALG: alginate

• AG: Arabic Gum

• GLN: Gelan Gum

• Kết quả cho thấy khi sử dụng GLN thì hàm lượng Rifamycin B & SV đều tăng so với việc sd chỉ alginate

Tái sử dụng các hạt cố định

Kết luận

Công nghệ lên men sản xuất kháng sinh

giữ vai trò quan trọng trong điều trị bệnh

Phương pháp cố định gel có nhiều ưu

điểm

Trên cơ sở đó tiếp tục phát triển các

phương pháp mới sản xuất kháng sinh

Tài liệu tham khảo

[1] El-Tayeb, Salama, Hussein, and El-Sedawy- Optimization of industrial production of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei. I. The role of colony morphology and nitrogen sources in productivity- African Journal of Biotechnology Vol. 3 (5), pp. 266-272, May 2004

[2] JIN Zhi-hua , LIN Jian-ping , CEN Pei-lin - Scale-up of rifamycin B fermentation with Amycolatoposis mediterranei-Journal of Zhejiang University SCIENCE

[3] Xuan-Tien Doan, Rajagopalan Srinivasan,Prashant M. Bapat, Pramod P.angikar- Detection of phase shifts in batch fermentation via statistical analysis of the online measurements: A case study with rifamycin B fermentation-Journal of Biotechnology 132 (2007) 156–166

[4] Hesham A. El- Enshasy , Usama I. Beshay – Rifamycins Production by Amycolatopsis mediterranei in Batch and Repeated Batch Cultures Using Immobilized Cells in Alginate and Modified Alginate Beads, Journal of Applied Sciences 7 (10), 2007.

LOGO