nghiÊn cỨu Ảnh hƯỞng cỦa chẤt kÍch khÁng lÊn sỰ...

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN

THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID

Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên nganh: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

Ma sô: 9420112

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC

HUẾ - NĂM 2019

LỜI CÁM ƠN

Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình.

Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ giảng viên của Bộ môn Sinh học

Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa

học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên,

Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện

Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian

thực hiện đề tài.

Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban

Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo

Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường

Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa cơ bản,

Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu,

tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án.

Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng

tôi hoàn thành luận án.

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia

đình đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ cả vật chất lẫn tinh thần.

Xin trân trọng cảm ơn!

Huế, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Trương Thị Phương Lan

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng

được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu

hoàn toàn trách nhiệm.

Tác giả luận án

Trương Thị Phương Lan

ii

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

BAP 6-benzylaminopurine

CoA coezyme A

cs cộng sự

CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide

CzDCS Curcuma zedoaria DCS

CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1



ĐC đối chứng

DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

dw dry weight (khối lượng khô)

FRAP ferric reducing antioxidant power

fw fresh weight (khối lượng tươi)

HPLC high-performance liquid chromatography

IBA 3-indolebutyric acid

KIN kinetin

MAPK mitogen-activated protein kinase

MeJA methyl jasmonate

MS Murashige and Skoog (1962)

NAA naphthaleneacetic acid

NO nitric oxide

PAA phenyl acetic acid

ROS reactive oxygen species

SA salicylic acid

SNP sodium nitroprusside

YE yeast extract (dịch chiết nấm men)

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .................................................................... viii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................ 1

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.......................................................................... 2

3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................ 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 5

1.1. CÂY NGHỆ ĐEN ...................................................................................... 5

1.1.1. Đặc điểm thực vật học......................................................................... 5

1.1.2. Phân bố ................................................................................................ 5

1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen ....................................... 6

1.1.3.1. Tinh dầu ........................................................................................... 6

1.1.3.2. Curcuminoid ..................................................................................... 7

1.1.4. Công dụng của nghệ đen ..................................................................... 8

1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau ........................................................................... 8

1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư ................................................................... 9

1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan ........................................................................ 9

1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét ................................................ 9

1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa ................................................................ 10

1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................ 10

1.1.4.7. Các hoạt tính khác .......................................................................... 11

1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG ......................................................... 15

iv

1.3.1. Elicitor ............................................................................................... 15

1.3.1.1. Khái niệm ....................................................................................... 15

1.3.1.2. Phân loại ......................................................................................... 15

1.3.1.3. Cơ chế kích kháng .......................................................................... 16

1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hương đến sự kích kháng ...................................... 18

1.3.2. Ứng dụng của elicitor ........................................................................ 20

1.3.2.1. Elicitor sinh học ............................................................................. 20

1.3.2.2. Elicitor phi sinh học ....................................................................... 26

1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................ 27

1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid ...................................... 27

1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid ......... 31

1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS) ...................... 31

1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) .......................... 31

1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase .................................. 32

1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase ........................................ 33

1.4.2.5. Các gen khác .................................................................................. 34

1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp ........................ 35

1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor .................................. 37

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 39

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 39

2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen ......................................................... 40

2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật ......................................................................... 40

2.2.1.2. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro ....................................................... 41

2.2.1.3. Nuôi cấy callus ............................................................................... 41

2.2.1.4. Nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41

2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid ........................................... 42

2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................. 42

v

2.2.2.2. Khuếch đại PCR ............................................................................. 43

2.2.2.3. Tạo dòng và chú giải gen ............................................................... 43

2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ ...................................................................... 45

2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid ............... 46

2.2.3.1. Xử lý elicitor .................................................................................. 46

2.2.3.2. Phân tích RT-PCR .......................................................................... 46

2.2.3.3. Phân tích HPLC ............................................................................. 48

2.2.4. Xử lý thống kê ................................................................................... 49

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 50

3.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 50

3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 50

3.1.1.1. Tái sinh chồi ................................................................................... 50

3.1.1.2. Tạo rễ in vitro ................................................................................. 52

3.1.2. Nuôi cấy callus .................................................................................. 54

3.1.2.1. Ảnh hương của 2,4-D và KIN ........................................................ 54

3.1.2.2. Ảnh hương của 2,4-D và NAA ...................................................... 55

3.1.2.3. Ảnh hương của 2,4-D và AgNO3 ................................................... 55

3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen .................................................................. 57

3.2. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID .................... 59

3.2.1. Phân lập gen ...................................................................................... 59

3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid.................... 68

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP

CURCUMINOID ............................................................................................ 72

3.3.1. Thăm dò ảnh hương của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng

hợp curcuminoid ......................................................................................... 72

3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid ......................................... 74

3.3.3. Tích lũy curcumin ............................................................................. 76

Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 79

vi

4.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 79

4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 79

4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen ............................................ 81

4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ......................... 83

4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid ................................................. 83

4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid .............................. 85

4.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN

CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................................... 85

4.3.1. Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu ........................ 85

4.3.1.1. Dịch chiết nấm men ....................................................................... 85

4.3.1.2. Salicylic acid .................................................................................. 87

4.3.2. Ảnh hương của elicitor lên sự sinh trương của tế bào ...................... 89

4.3.3. Ảnh hương của elicitor lên mức độ biểu hiện gen ............................ 90

4.3.4. Ảnh hương của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin ........... 92

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 95

KẾT LUẬN ..................................................................................................... 95

KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 95

DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 97

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau ..................................................... 17

Bảng 1.2. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất

thứ cấp trong nuôi cấy in vitro. ....................................................................... 21

Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen

tổng hợp curcuminoid ơ nghệ đen ................................................................... 45

Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các

gen tổng hợp curcuminoid ơ nghệ đen ............................................................ 47

Bảng 3.1. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in

vitro nguyên vẹn. ............................................................................................. 51

Bảng 3.2. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in

vitro đã được chẻ đôi ....................................................................................... 52

Bảng 3.3. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro ........ 53

Bảng 3.4. Ảnh hương của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trương

của callus nghệ đen ......................................................................................... 55

Bảng 3.5 Ảnh hương của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trương

của callus nghệ đen ......................................................................................... 56

Bảng 3.6. Ảnh hương của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh

trương của callus nghệ đen. ............................................................................. 56

Bảng 3.7. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen

CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ

đen ................................................................................................................... 70

Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ơ các gen tổng hợp

curcuminoid ..................................................................................................... 76

Bảng 3.9. Ảnh hương của các elicitor lên sinh trương và tích lũy curcumin trong

tế bào nghệ đen ................................................................................................ 77

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin .................................................. 8

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng .. 30

Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ơ

nghệ vàng. ....................................................................................................... 32

Hình 2.1. Cây nghệ đen. .................................................................................. 39

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm. ............................................................................ 40

Hình 2.3. Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ). ......................................... 44

Hình 2.4. Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1 ...................... 48

Hình 3.1. Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi. ................................................. 53

Hình 3.2. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trương trên môi trường có 2,4-D 1

mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trương trên môi trường

có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B). .............................................. 57

Hình 3.3. Đường cong sinh trương của tế bào nghệ đen. ............................... 58

Hình 3.4. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ

sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L ................................................................ 59

Hình 3.5. Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen. ....................... 59

Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA

tổng số của nghệ đen ....................................................................................... 61

Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp

curcuminoid ơ nghệ đen. ................................................................................. 61

Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS

(MF663785) ơ nghệ đen và DCS ơ nghệ vàng (AB495006.1). ...................... 62

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1

(MF402846) ơ nghệ đen và CURS1 ơ nghệ vàng (AB495007.1). ................. 63


(MF402846) ơ nghệ đen và CURS2 ơ nghệ vàng (AB506762.1). .................. 64

ix


(NCBI: MF987835) ơ nghệ đen và CURS3 ơ nghệ vàng (NCBI: AB506763.1).

......................................................................................................................... 65

Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS

(C0SVZ5.1). .................................................................................................... 66

Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1

(AJF45913.1)................................................................................................... 66


(BAW81545.1). ............................................................................................... 67


(AJF45914.1)................................................................................................... 67

Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid. .................... 68

Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. ................ 70

Hình 3.18. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 71

Hình 3.19. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen. ......................................... 71

Hình 3.20. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen. ................................... 72

Hình 3.21. RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor ....... 73

Hình 3.22. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và

CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor. ...................................................... 74

Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp

curcuminoid ơ nghệ đen. ................................................................................. 75

Hình 3.24. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 78

Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày

nuôi cấy. .......................................................................................................... 78

Hình 3.26. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5

ngày nuôi cấy. ................................................................................................. 79

1

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae)

còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ơ Ấn

Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ơ Trung Quốc, Nhật Bản,

Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7]. Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng

trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các

bệnh về da như các vết thương và các vết lơ loét, cũng như sự bất thường của

chu kỳ kinh nguyệt [157].

Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó

như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính

tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76]. Các nghiên cứu gần

đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý

rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống

tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid)

[14], [58], [116]. Curcuminoid được chiết xuất từ củ (thân rễ) của các loài nghệ

khác nhau, chẳng hạn C. caesia [24], C. amada [50], C. longa [67], C.

aromatica [74] và C. zedoaria [78]. Curcuminoid hiện đang được sử dụng như

dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư

trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35]. Nhiều

nghiên cứu cũng đã cho thấy curcuminoid có độ an toàn cao, dung nạp tốt với

cơ thể, không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [46].

Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid ơ nghệ

vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai

nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase là diketide-CoA

synthase (DCS) và các curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3) [66],

[67]. Trước đó, Brand và cs. (2006) cũng đã mô tả một gen mã hóa enzyme

2

type III polyketide synthase khác là chalcone synthase (CHS) có ơ cây

Wachendorfia thyrsiflora, và gen này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp

curcuminoid [28]. Behar và cs. (2016) khi phân tích biểu hiện của các gen tham

gia tổng hợp curcuminoid ơ C. caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3

và CHS1 đã nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng trong củ cao hơn ơ lá [24].

Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ơ loài nghệ đen đến nay vẫn

chưa được công bố.

Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường

chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược

phẩm trong nuôi cấy tế bào thực vật [62], [111]. Theo Abraham và cs (2011),

dịch chiết nấm men (YE) đã được ứng dụng trong nuôi cấy in vitro thực vật do

khả năng kích thích cơ chế bảo vệ, tăng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp

có hoạt tính sinh học [9]. Salicilic acid (SA) được xem là một trong những tín

hiệu quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây và cũng được sử dụng rộng rãi

trong sản xuất các chất chuyển hóa từ nuôi cấy tế bào thực vật [22]. Methyl

jasmonate (MeJA) cũng đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan

trọng trong việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật và

có thể kích thích sự sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp trong nuôi cấy tế bào

[158], [169].

Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hương

của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình

tổng hợp curcuminoid ơ tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm

xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu

hiện của các gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase trong con đường

phenylpropanoid ơ tế bào nghệ đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung

cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất

điều hòa dương tính của biểu hiện gen ơ loài dược liệu có giá trị này.

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

3

Mục tiêu lý thuyết

Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và

CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng

hợp curcuminoid ơ tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor.

Mục tiêu thực nghiệm

Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm

chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ơ tế bào nghệ đen

nuôi cấy in vitro.

3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

- Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ

sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ơ quy mô phòng thí nghiệm.

- Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia

trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ơ nghệ đen.

- Nghiên cứu ảnh hương của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức

độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin

trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.

4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án có các đóng góp mới như sau:

- Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa

sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung

AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy

callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu

trước đây.

- Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp

curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ơ cây

nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là

4

MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu

hiện ơ trong củ và callus của cây nghệ đen.

- Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp curcumin ơ cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định

trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.

- Đã nghiên cứu được ảnh hương của một số loại elicitor (dịch chiết nấm

men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của

các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1

g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng.

5

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY NGHỆ ĐEN

1.1.1. Đặc điểm thực vật học

Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao khoảng 1-

1,5m; có củ hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; cây mẫm

và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu

xám, bên trong củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều

vòng màu xanh tím. Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi

cay. Chồi lá nghệ đen có thể cao tới 1 m với 5 lá. Lá có bẹ ôm vào thân cây

phía dưới, dài 30-60 cm, rộng 7-8 cm, dọc theo gân chính giữa có những đốm

màu đỏ, cuống lá ngắn hay hầu như không có. Cụm hoa mọc ngang, dài 15-20

cm. Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù, màu xanh lục nhạt, mép đỏ;

lá bắc phía trên màu vàng nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa. Hoa màu vàng,

đài hoa có thùy hình mác tù dài 15 mm, thùy giữa nhọn, cánh môi hẹp ơ phía

dưới nhưng hơi mơ rộng phía trên [59], [105].

Trong hai tháng 3 và 4, các cụm hoa từ chồi nách của thân và chồi đỉnh

của củ bắt đầu vươn lên mặt đất. Trên các điểm gần cụm hoa thường phát triển

các chồi và từ đó bắt đầu hình thành các nhánh mới. Vào mùa thu, lá trên mặt

đất bắt đầu lụi. Từ tháng 11 đến tháng 12, các chất chuyển hóa thứ cấp ơ củ bắt

đầu được tích lũy [7].

1.1.2. Phân bô

Cây nghệ đen được xem như là cây bản địa của vùng Đông Bắc Ấn Độ

nhưng hiện đang được trồng khắp nơi ơ Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản, Trung

Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố ơ các tỉnh miền

núi và trung du phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái… và một số tỉnh ơ

6

miền Trung. Hiện nay, cây nghệ đen cũng đã được trồng tại một số địa phương

khác của miền Bắc và Tây Nguyên [6].

1.1.3. Thanh phần hóa học chính của củ nghệ đen

Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh

dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin,

demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài ra, cây nghệ còn chứa

một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin,

flavonoiod [76].

1.1.3.1. Tinh dầu

Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của tinh

dầu củ nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như α-pinen, borneol, camphen,

camphor và cineol bên cạnh các sesquiterpene, nhưng không phân lập và xác

định được loại sesquiterpene nào. Xingyi (1999) khi nghiên cứu tinh dầu nghệ

đen ơ Trung Quốc nhận thấy chúng chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó

chủ yếu là curzerenone (45,02%), curcumenol (8,31%), β-elemene (5,79%) và

isocurcumenol (4,05%) [164]. Trong tinh dầu nghệ đen sinh trương ơ vùng

Đông Bắc Ấn Độ, Tohda và cs (2006) đã thu được 37 hợp chất, chiếm 87,7%

lượng tinh dầu tổng số, chủ yếu là curzerenone (22,3%), tiếp đến là 1,8-cineole

(15,9%) và germacrone (9%), β-tumerone (19,88%) và zingiberene (7,84%)

[155]. Duke và cs (2003) đã tìm thấy trong củ nghệ đen một số sesquiterpenoid

như ar-turmerone zederone, β-turmerone, curcumadiol, curcumenol, curcumol,

curcolone, curdione, curzerene, curzerenone, dehydrocurdione,

epicurzerenone, furanodiene, isocurcumenol, procurcumenol và zingiberene

[41].

Ở Việt Nam, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đã và đang

được quan tâm nghiên cứu. Thành phần chính trong tinh dầu củ nghệ thu được

tại Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [3], trong khi tinh dầu nghệ

7

đen ơ Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) đều giàu epicurzerenon

và germacrone. Các hợp chất khác trong tinh dầu có hàm lượng thấp hơn đó là

α-cadinol, β-elemen, β-pinen, δ-cadinen, 1,8-cineol, 2,4-diisopropenyl-1-vinyl-

cyclohexan, benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5

isopropyl, camphor, germacrene, isoborneol, T-muurolol và zingiberen [1].

Thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ơ Đà Lạt có chứa các hợp

chất như γ-elemen (14,18-18,79%), curzeren (14,28-16,67%), và germacrone

(22,53-24,28%) [4].

1.1.3.2. Curcuminoid

Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên

cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng được quan tâm.

Syu và cs (1998) nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa các hợp

chất nhóm curcuminoid là curcumin, demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin (Hình 1.1) [149].

Curcumin (C21H20O6) là một hợp chất dạng tinh thể, màu vàng cam, có

trong các loài thực vật thuộc chi Curcuma, tan tốt trong các dung môi hữu cơ

như acetone, methanol, ethanol và isopropanol nhưng không tan trong nước.

Các dung môi hòa tan thích hợp để tách chiết curcumin là acetone,

dichloromethan, ethanol ethyl acetate, methanol, n-butanol và hexane.

Curcumin có thể được thu hồi bằng cách kết tinh từ dịch chiết [2], [60].

8

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin.

1.1.4. Công dụng của nghệ đen

Cây nghệ đen được trồng phổ biến dùng làm rau hoặc đồ gia vị ơ các nước

vùng Đông và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia, Thái

Lan và Việt Nam [59], [135]. Từ lâu, nghệ đen đã được sử dụng như một vị

thuốc trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen cũng được kê

trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều trị hội chứng “Oketsu” gây

ra do tắc nghẽn mạch máu, điều kinh và cải thiện kinh nguyệt với nhiều dạng

pha chế khác nhau [96]. Ở Thái Lan, nghệ đen được dùng để làm dịu cơn đau

dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt hoặc làm se các vết thương ơ

ngoài da [135]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong

gân, ung nhọt và vết thương [41]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa

giun sán ơ trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa

bệnh phù hay phong hủi [64], [109]. Ngày nay, nhiều hoạt chất sinh học của

nghệ đen đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, kháng ung

thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống đột biến…

1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau

Curcumin

H3CO

HO

OCH3

OH

O O

HO

OCH3

OH

O O

Demethoxycurcumin

HO OH

O O

Bisdemethoxycurcumin

9

Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của hai loại sesquiterpene là

cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen trên thỏ và chuột thực nghiệm.

Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối

[144]. De Navarro và cs (2002) khi nghiên cứu hoạt tính giảm đau của nghệ

đen ơ Brazil đã nhận thấy hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao hơn

nhiều lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường như aspirin và dipyrone

[38].

1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư

Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt

tính chống ung thư và kháng viêm. Khả năng ức chế sinh tổng hợp các chất

prostalandin và NO của dịch chiết nghệ được cho là có tiềm năng trong việc

kháng viêm và trong hóa trị liệu chống ung thư [59]. Seo và cs (2005) nhận

thấy dịch chiết nước của củ nghệ có hoạt tính chống di căn phổi của các tế bào

khối u ác tính B16 [140]. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu hoạt tính kháng ung

thư của các curcuminoid thu được từ dịch chiết ethanol của củ nghệ. Kết quả

cho thấy, chúng có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư buồng trứng

OVCAR-3 ơ người [149]. Các nghiên cứu của Jiang và cs (1996), Hanif và cs

(1997) cũng cho thấy curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế

sinh trương khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư

biểu mô gan ơ người [55], [63].

1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan

Matsuda và cs (1998) nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen

có hoạt tính bảo vệ gan, sesquiterpene và curcumin chống lại sự hình thành D-

galactosamine/lipopolysaccharide làm giảm tổn thương gan ơ chuột [95]. Kết

quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen có thể được sử dụng

như một loại thuốc tiềm năng trong điều trị chứng xơ gan mãn tính [70].

1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét

10

Nghệ đen còn được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu để điều trị các

vị trí bị loét trong hệ tiêu hóa. Nghiên cứu của Raghuveer và cs (2003) cho thấy

dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm

loét dạ dày [122]. Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét

của 8 loại dịch chiết từ nghệ đen trồng ơ Yakushima (Nhật Bản) trên chuột gây

viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)-(+)

germacrone 4,5-epoxide phân lập từ tinh dầu nghệ đen có hoạt tính ức chế sự

hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [161]. Jang và cs (2001) nhận thấy

ba hợp chất epiprocurcumenol, procurcumenol và 7-bis (4-hydroxyphenyl)-

1,4,6-heptatrien-3-one từ dịch chiết củ nghệ đen có hoạt tính kháng viêm [61].

1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa

Theo Matsuda và cs (1993), các hợp chất curcumin, demethoxycurcumin

và bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ nghệ đen có hoạt tính chống oxy hóa

và kháng viêm tương đương với các chất này thu được từ củ nghệ vàng [94].

Dịch chiết ethanol của củ nghệ đen ơ Thái Lan có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

với nồng độ ức chế 50% (EC50) từ 18,29-40,33 μg/mL (trung bình 25,71

μg/mL). Khả năng bắt gốc tự do của các curcuminoid phân tách từ dịch chiết

ethanol của nghệ đen lần lượt là: curcumin (EC50 = 7,89 μg/mL),

demethoxycurcumin (EC50 = 9,52 μg/mL) và bisdemethoxycurcumin (EC50 =

149,09 μg/mL) [114]. Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy tinh dầu nghệ

đen trồng ơ Đà Lạt ơ nồng độ 20 mg/mL có khả năng chống oxy hóa tương đối

cao, từ 74,8-77,8% [4]. Nghiên cứu của Loc và cs (2008) cho thấy hoạt tính của

các enzyme chống oxy hóa như peroxidase, superoxide dismutase và catalase

trong tế bào nghệ đen đạt giá trị cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy, lần lượt là

0,63 U/mg, 16,60 U/mg và 19,59 U/mg protein [81].

1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Hoạt tính kháng các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh ơ người và thực vật

của nghệ đen cũng được quan tâm nghiên cứu. Theo Wilson (2005), dịch chiết

từ củ nghệ đen có khả năng kháng năm chủng vi khuẩn khác nhau là Bacillus

11

subtilis NCIM 2603, Escherichia coli NCIM 2574, Klebsiella pneumoniae

NCIM 2957, Micrococcus luteus NCIM 2103 và Proteus mirabilis NCIM

2300, và hai chủng nấm là Aspergillus niger NCIM 596 và Candida albicans

NCIM 3102 [162]. Dịch chiết ethanol của nghệ đen trồng ơ Ấn Độ có khả năng

kháng B. cereus ơ nồng độ 1.000 μg/mL và có hoạt tính ức chế tương đối với

C. albicans và K. pneumoniae [145]. Nghiên cứu của Giang và cs (2000) cho

thấy, dịch chiết củ nghệ đen trồng ơ Việt Nam có phổ kháng khuẩn rộng. Các

chất như a-humulene, humulene-8-hydroperoxide, zerumbone và zerumbone-

2,3-epoxide có hoạt tính kháng lại các loài vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) được

thử nghiệm [49].

1.1.4.7. Các hoạt tính khác

Ansari và Ahmad (1991) nhận thấy dịch chiết alcohol từ củ nghệ đen nồng

độ 1-10 mg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của amoeba (Entamoeba

histolytica) [16]. Champakaew và cs (2007) khi phân tích thành phần hóa học

và thử hoạt tính kháng muỗi Aedes aegypti mang virus gây bệnh sốt Dengue

của tinh dầu nghệ đen đã nhận thấy chúng thật sự có hiệu quả trong việc giết

chết các ấu trùng muỗi, đây được xem là nguồn tinh dầu thay thế triển vọng để

phát triển các loại thuốc diệt ấu trùng muỗi trong tương lai [30]. Daduang và cs

(2005) nghiên cứu khả năng kháng nọc độc rắn của dịch chiết nghệ đen cho

thấy nó có tác dụng ngăn cản nọc độc di chuyển trước khi bổ sung kháng thể

kháng độc [37].

1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG SẢN XUẤT HỢP

CHẤT THỨ CẤP

1.2.1. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bao thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài

trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học.

Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng

sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những

12

thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp

khác nhau [5].

Các nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản

xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết

từ cây ngoài tự nhiên. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một

cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sơ:

- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo

nên không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý, không cần phải vận chuyển và bảo

quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.

- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại

bỏ các trơ ngại trong quá trình sản xuất thực vật.

- Phủ định ảnh hương sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong

tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng).

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch

huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [5].

- Chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau.

- Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trương của tế bào và điều hòa

quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm sẽ tăng lên [108].

Thực vật có khả năng sản xuất số lượng lớn các hợp chất thứ cấp và sự

phân bố các hợp chất thứ cấp ơ mức độ tế bào phụ thuộc vào con đường sinh

tổng hợp và đặc điểm cấu trúc của chúng [112]. Trong đó, các không bào dự

trữ thường chiếm 40-90% thể tích tế bào thực vật, chúng đóng vai trò then chốt

trong sự tích lũy các hợp chất thứ cấp ơ thực vật. Sự tích lũy các hợp chất thứ

cấp trong không bào có ít nhất hai vai trò được xác định đó là lưu trữ tạm thời

các hoạt chất sinh học nội sinh trong tế bào và bảo vệ chúng khỏi quá trình dị

hóa [52]. Các nghiên cứu cũng cho thấy có hai cơ chế vận chuyển các hợp chất

thứ cấp chủ yếu trong không bào đó là vận chuyển theo gradient H+ qua kênh

13

vận chuyển ion H+ và vận chuyển sơ cấp cần năng lượng trực tiếp bơi các chất

mang dạng hình hộp liên kết với phân tử ATP [93]. Một số nghiên cứu khác

cũng nhận thấy, gen không những liên quan đến sinh tổng hợp các hợp chất thứ

cấp mà còn liên quan đến các yếu tố vận chuyển chúng. Kết quả nghiên cứu

này sẽ hữu ích trong công nghệ trao đổi chất nhằm tăng khả năng sản xuất các

hợp chất thứ cấp có giá trị ơ thực vật [165].

1.2.2. Các phương pháp nuôi cấy sử dụng trong sản xuất hợp chất thứ

cấp từ thực vật

1.2.2.1. Nuôi cấy callus

Nuôi cấy callus là quá trình nuôi cấy các tế bào thực vật không biệt hóa

được hình thành bằng cách nuôi cấy các mô trên môi trường chứa nồng độ

auxin cao hoặc kết hợp auxin và cytokinin trong điều kiện in vitro. Nuôi cấy

callus đã được ứng dụng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật đặc biệt

là các hợp chất flavonoid. Quy trình nuôi cấy callus ổn định và tối ưu là bước

quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy huyền phù để sản xuất

hợp chất thứ cấp ơ quy mô lớn hơn [153].

1.2.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào là quá trình nuôi cấy các tế bào hay một khối

tế bào nhỏ không biệt hóa của thực vật trong môi trường lỏng và được duy trì

trong điều kiện sục khí, kích thích, ánh sáng, nhiệt độ và các thông số vật lý

thích hợp. Các tế bào nuôi cấy không chỉ có thể tạo ra các hợp chất hóa sinh

tiêu chuẩn xác định với khối lượng lớn mà còn loại bỏ sự hiện diện của nhiều

hợp chất không mong muốn khác với trong cây tự nhiên. Nuôi cấy huyền phù

tế bào được ứng dụng phổ biến nhất để sản xuất thứ cấp ơ quy mô lớn. Một số

loại bioreactor khác nhau đã được sử dụng cho quá trình nuôi ấy. Ứng dụng

thương mại đầu tiên về nuôi cấy tế bào quy mô lớn được thực hiện trong các

14

bioreactor bể khuấy có công suất 200 lít và 750 lít để sản xuất shikonin từ

Lithospermum erythrorhizon. Tế bào của Catharanthus roseus, Dioscorea

deltoidea, Digitalis lanata, Panax notoginseng, Taxus wallichiana và

Podophyllum hexandrum đã được nuôi cấy trong các bioreactor khác nhau để

sản xuất các sản phẩm thực vật thứ cấp. Những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy

tế bào để sản xuất các hợp chất dược phẩm đã tạo ra nhiều loại dược phẩm như

alkaloids, terpenoids, steroid, saponin, phenolics, flavanoid. Bằng cách cải biến

quy trình nuôi cấy, sản lượng hợp chất thứ cấp thu được có thể tăng cao (dẫn

theo Plunkett và cs. 2004) [119].

1.2.2.3. Nuôi cấy rễ tơ

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) đã trơ nên phổ biến trong hai thập

kỷ qua như một phương pháp để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp được

tổng hợp trong rễ. Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa

được tạo ra bơi sự lây nhiễm của Agrobacterium rhizogenes vào các loài thực

vật bậc cao bị tổn thương. Tác nhân gây bệnh này gây ra sự nhiễm bệnh dẫn

đến sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bơi tốc độ tăng trương cao

trong môi trường không chứa hormone và sự ổn định di truyền khi nuôi cấy

trong một thời gian dài. Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống

với ơ các cơ quan hoang dại nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần. Chính

đặc tính ổn định và năng suất cao cho phép khai thác rễ tơ là công cụ công nghệ

sinh học có giá trị để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật [113],

[119].

1.2.3. Vai trò của AgNO3 trong nuôi cấy mô tế bao thực vật

Nano bạc bao gồm các hạt bạc có kích thược nano, khoảng từ 1-100 nm,

thông thường kích thước đo được khoảng 25 nm. Theo Kumar và cs (2009) và

15

Sandra & Maira (2013), AgNO3 khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô

thực vật có tác dụng ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, vì thế quá trình

sinh trương của tế bào sẽ được thuận lợi hơn [73], [134].

Đến nay, AgNO3 đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật để

tái sinh chồi, tăng hệ số nhân giống, phát sinh cơ quan, cải thiện các thông số

hóa sinh và thậm chí chuyển gen thông qua Agrobacterium… (Kumar và cs.

2009) [73], Sandra và Maira. 2013 [134], Sgamma và cs. 2015 [141],

Sarropoulou và cs. 2016 [137], Mohiuddin và cs. 1997 [104], Tamini và cs.

2015 [151], Harathi và cs. 2016 [56], Da Silva và cs. 2013 [152]). Park và cs

(2016) cho rằng YE và AgNO3 có thể cảm ứng làm tăng mức độ biểu hiện của

gen sinh tổng hợp phenylpropanoid và tăng cường tích lũy rosmarinic acid

trong tế bào cây hoắc hương núi (Agastache rugosa) [115].

1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG

1.3.1. Elicitor

1.3.1.1. Khái niệm

Elicitor (hay chất kích kháng) được định nghĩa như là một chất cơ bản mà

khi đưa một lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì có thể khơi động hoặc cải

thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào [111]. Sự kích kháng

thực vật (elicitation) là quá trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp các chất

chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động của các elicitor, giúp cho cây chống lại các

yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như tác nhân gây bệnh hoặc điều kiện sinh thái

khắc nghiệt [143].

1.3.1.2. Phân loại

Elicitor có thể được phân loại dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là

elicitor phi sinh học (abiotic elicitor) và elicitor sinh học (biotic elicitor), hoặc

dựa vào nguồn gốc của chúng là elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) và

elicitor nội sinh (endogenous elicitor). Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn

16

gốc không thuộc sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý, ví

dụ: các ion Cu2+, Cd2+, Ca2+, độ pH cao... Elicitor sinh học là các chất có nguồn

gốc từ sinh vật, bao gồm các polysacharide của thành tế bào thực vật (cellulose

hoặc pectin) và vi sinh vật (chitin hoặc glucan), hoặc các glycoprotein, G-

protein hay các protein nội bào có chức năng gắn các receptor và tác động bằng

cách hoạt hóa hay bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion. Elicitor ngoại

sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các acid béo, các

polysaccharide và polyamine. Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn

gốc bên trong tế bào như là galacturonide, hepta-β-glucoside... (Bảng 1.1)

[111].

1.3.1.3. Cơ chế kích kháng

Elicitor là các chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây nên các đáp

ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra khi thực

vật chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Chúng có thể là các elicitor phi

sinh học như ion kim loại, hợp chất vô cơ hoặc elicitor sinh học có nguồn gốc

từ nấm, vi khuẩn hoặc động vật ăn cỏ, mảnh vỡ của thành tế bào thực vật cũng

như các chất được giải phóng ra tại vị trí tổn thương của thực vật do mầm bệnh

hoặc động vật tấn công.

Thực vật được xử lý elicitor hoặc bị mầm bệnh tấn công gây ra một loạt

các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các hợp chất thứ cấp bảo vệ ơ cả

trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro. Mặc dù đã có nhiều nghiên

cứu về cơ chế ảnh hương của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp các chất thứ

cấp ơ thực vật nhưng cơ chế của sự kích kháng vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có

nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bơi Ca2+, các yếu tố ảnh

hương đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế/hoạt hóa nội

bào hay sự thay đổi áp suất thẩm thấu [111].

Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau [111]

A. Theo bản chất

17

Elicitor sinh học Elicitor phi sinh học

- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh

vật và được nhận diện bơi tế bào thực

vật (các enzyme, các mảnh vỡ của

thành tế bào).

- Được tạo thành bơi hoạt động của vi

sinh vật trên thành tế bào thực vật

(pectin).

- Được tạo ra từ hoạt động của

enzyme thực vật trên thành tế bào vi

khuẩn (chitosan, glucan).

- Các hợp chất nội sinh được hình

thành hoặc tiết ra bơi tế bào thực vật

khi đáp ứng các kích thích khác nhau.

- Tác dụng của các tác nhân vật lý

hoặc hóa học tự nhiên theo đường nội

sinh tạo thành các elicitor sinh học.

- Tia UV.

- Protein biến tính (RNase).

- Đông và rã đông.

- Các thành phần không thiết yếu của

môi trường (agarose).

- Kim loại nặng.

- Các loại hóa chất có ái lực cao với

DNA, có hoạt tính phá vỡ màng tế

bào, thuốc diệt nấm (benomyl,

butylamin, maneb), và thuốc diệt cỏ

(acifluorofen).

B. Theo nguồn gôc

Elicitor ngoại sinh Elicitor nội sinh

- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao

gồm các phản ứng trực tiếp hoặc qua

các chất nội sinh trung gian.

- Các polysaccharide: chitosan,

glucan, và glucomanose.

- Peptide và chuỗi các ion dương:

glycoprotein, monilicolin, polyamine,

và poly-L-lysine.

- Các enzyme: polygalacturonase,

cellulase, và endo-polygalacturonase

acid lyase.

- Các acid béo: acid arachidonic và

acid eicosapentanoic.

- Hình thành qua các phản ứng thứ

cấp, cảm ứng bằng một tín hiệu sinh

học hoặc phi sinh học trong tế bào.

- Alginate oligomer.

- Dodeca-β-1,4-D-galacturonide.

- Hepta-β-glucoside.

Một số nghiên cứu đã giả thiết có sự liên kết của elicitor vào các thụ thể

18

trên màng sinh chất để kích hoạt quá trình chống chịu [32], [54]. Gelli và cs

(1997) cho rằng khi có kích kháng, Ca2+ di chuyển vào tế bào chất từ bên ngoài

tế bào [48]. Một số tác giả nhấn mạnh đến sự thay đổi nhanh chóng của quá

trình phosphoryl hóa protein và kích hoạt kinase chính là cơ chế của quá trình

kích kháng [47], [129]. Trong khi đó, nhiều tác giả khác nhận thấy có sự tích

lũy mitogen-activated protein kinase (MAPK) và kích hoạt G-protein trong quá

trình kích kháng [10], [40]. Armero và Tena (2001) cho rằng, có sự acid hóa

màng nguyên sinh chất gây ra bơi sự bất hoạt H+-ATPase, trong khi giảm sự

phân cực của màng, tăng pH bên ngoài màng được quan sát thấy khi xử lý

elicitor [19]. Apostol và cs (1989), Bolwell và cs (1995) và Pugin và cs (1997)

giải thích rằng, việc sản xuất các ROS như anion superoxide và H2O2 tạo ra

hiệu ứng kháng khuẩn trực tiếp cũng như góp phần tạo ra các dẫn xuất của acid

béo có hoạt tính sinh học [17]. Tương tự, ROS tham gia vào quá trình liên kết

với protein giàu proline gắn trên thành tế bào sau đó hoạt động như là tín hiệu

thứ cấp và kích hoạt dịch mã các gen bảo vệ [89].

Theo một giả thuyết khác, sự tích lũy của các protein liên quan đến việc

bảo vệ thực vật khỏi các tác nhân gây bệnh như chitinase, glucanase và

endopolygalacturonase góp phần giải phóng các pectic oligomer tín hiệu

(elicitor nội sinh), glycoprotein giàu hydroxyproline và chất ức chế protease

[25]. Ngoài ra, sự kích hoạt phiên mã của các gen bảo vệ trong quá trình kích

kháng cũng đã được công bố [99], [139].

1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hương đến sự kích kháng

Tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ nuôi cấy tế

bào thực vật bằng cách xử lý chúng với các elicitor thích hợp đã mơ ra một

hướng nghiên cứu mới trong công nghiệp dược phẩm. Các thông số như thành

phần và nồng độ elicitor, thời gian xử lý, tuổi của tế bào, dòng tế bào, chất điều

hòa sinh trương, môi trường dinh dưỡng và đặc điểm thành tế bào phù hợp có

19

thể tăng khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp [111].

Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá

trình kích kháng. Namdeo và cs (2002, 2007) nhận thấy sự tích lũy ajmalicine

cao trong tế bào cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được xử lý dịch chiết nấm

Trichoderma viride, Aspergillus niger và Fusarium moniliforme ơ các nồng độ

khác nhau. Lượng ajmalicine trong tế bào được xử lý elicitor nồng độ cao (5%)

lớn hơn so với nồng độ thấp (0,5%). Tuy nhiên, nồng độ elicitor >10% đã ảnh

hương bất lợi lên sự tích lũy ajmalicine do chúng gây ra hiện tượng đáp ứng

quá ngưỡng, dẫn đến chết tế bào [111], [110].

Thời gian xử lý elicitor: Nghiên cứu của Namdeo và cs (2002, 2007) cho

thấy lượng ajmalicine tăng khoảng 3 lần ơ tế bào dừa cạn được xử lý dịch chiết

của T. viride trong 48 giờ, trong khi đó chất này chỉ tăng 2 lần ơ tế bào được

xử lý dịch chiết của A. niger và F. moniliforme trong cùng thời gian. Khi thời

gian xử lý lớn hơn 96 giờ khả năng tích lũy ajmalicine của tế bào đã giảm rõ

rệt [111], [110].

Tuổi của tế bao: Thời điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong

sản xuất các chất chuyển hóa sinh học từ các tế bào được xử lý elicitor. Namdeo

và cs (2002, 2007) nhận thấy lượng ajmalicine đạt cao nhất (166 µg/g khối

lượng khô (dw)) ơ tế bào 20 ngày tuổi được xử lý dịch chiết của T. viride [111],

[110].

Môi trường dinh dưỡng: Thành phần môi trường cũng đóng một vai trò

quan trọng trong quá trình kích kháng. Theo Namdeo và cs (2002, 2007),

ajmalicine được tích lũy ơ tế bào sinh trương trong môi trường Zenk nhiều hơn

so với môi trường MS [111], [110].

Ngoài ra, sự kích kháng cũng phụ thuộc vào đặc tính của các elicitor, dòng

tế bào hoặc chủng vi sinh vật được sử dụng làm elicitor, sự có mặt của các chất

điều hòa sinh trương cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [111].

20

1.3.2. Ứng dụng của elicitor

Đến nay, đã có nhiều công trình ứng dụng elicitor để kích thích sản xuất

các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật. Các nghiên cứu đều cho thấy

sự tích lũy của những chất này đã tăng lên đáng kể so với đối chứng sau khi

được xử lý với loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng (Bảng 1.2).

1.3.2.1. Elicitor sinh học

Thông thường, các elicitor có nguồn gốc phi sinh học hoặc kết hợp elicitor

sinh học và phi sinh học được sử dụng phổ biến hơn. Tuy nhiên, cũng có tác giả

chỉ sử dụng elicitor sinh học trong các nghiên cứu của mình. Chẳng hạn:

Cousins và cs (2010) đã nuôi cấy cây nghệ vàng (C. longa) trong hệ lên

men thể tích 2,5 L có bổ sung nhiều loại elicitor khác nhau để cải thiện khả

năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng. Chẳng hạn: 1)

phenylalanine được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ tuần thứ 12-17; và 2)

proline, dịch chiết cá giàu proline hoặc chitosan được bổ sung vào tuần thứ 20.

Ở trường hợp 1, sinh khối của cây và sự tích lũy các chất chống oxy hóa của

chúng đã giảm sau 5 tuần xử lý. Ở trường hợp 2, hàm lượng các hợp chất phenol

tăng lên 4,7% dw (đối chứng 4,1% dw) khi xử lý nitrogen ơ nồng độ thấp sau

1,5 tuần [36].

Khi nuôi cấy in vitro cây nghệ C. mangga, Abraham và cs (2011) nhận

thấy xử lý YE không ảnh hương lên sinh khối và hình thành chồi ơ cây con.

Ngoài ra, cây con có hình thái bất thường khi được xử lý YE ơ nồng độ cao

(>3,5 mg/L). Tuy nhiên, ơ các môi trường có bổ sung YE, cây con tích lũy

nhiều chất có hoạt tính bắt gốc tự do. Cây con được nuôi trên môi trường có bổ

sung chitosan 150 mg/L và YE 3,5 mg/L có hàm lượng chất bắt gốc tự do nhiều

hơn các môi trường khác [9].

21

Bảng 1.2. Một sô ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro [111]

Loai thực vật Mẫu vật

nuôi cấy

Elicitor Sản phẩm thứ cấp Ham lượng

Không xử lý Xử lý

Capsicum annum Tế bào T. viride (thô) Capdisol 0 1 mg/bình

Carthamus tinctorius Rễ tơ Vi khuẩn lam (thô) Kinobeon A 0,6 mg/L 5,78 mg/L

C. roseus Rễ tơ Penicillium sp. (thô) Alkaloids (indole) 3 mg/g dw 9 mg/g dw

C. roseus Tế bào Alteromonas macleodii, alginate Phosphodiesterase 0,022 U/mL <0,235 U/mL

C. roseus Tế bào Pythium sp. (thô) Ajmalicine 0 400 µg/L

C. roseus Tế bào T. viride Ajmalicine 79 µg/g dw 166 µg/g dw

C. roseus Tế bào Pythium aphanidermatum (thô) Alkaloids (indole) 50 µmol/L 75 µmol/L

Cupressus usitanica Tế bào Nấm β-thujaplicin 0 187 µg/g dw

Datura stramonium Tế bào Phytopthora megasperma (thô) Alkaloids (tropane) 0,85 mg/g dw 4,27 mg/g dw

D. stramonium Rễ tơ CuSO4 Rishitin 0 Vết

D. stramonium Rễ tơ CdCl2 Sesquiterpenes 0 140 nM/g

Dioscorea deltoidea Tế bào Rhizopus arrhizus (thô) Diosgenin 134 mg/L 230 mg/L

Eschscholtzia californica Tế bào Dịch chiết nấm men (thô) Sanguinarine 20 mg/L 60 mg/L

22

Hyoscyamus muticus Rễ tơ Rhizoctonia solani Sesquiterpenes 0 1 mg/10 g fw

Lithospermum

erythrorhizon

Tế bào Các tác nhân nội sinh (thô) Shikonin 0 28 µg/10mL

Lotus corniculatus Rễ tơ Glutathione Isoflavonoids 0 160 µg/g

Morinda citrifolia Tế bào Chitin 50 (tinh khiết) Anthraquinones 3 µg/g dw 7 µg/g dw

Nicotiana tabacum Rễ tơ Dịch chiết nấm men Sesquiterpenes 1 µg/g dw 87 µg/g dw

N. tabacum Tế bào P. cryptogea (thô) Capsidiol 0 25 µg/mL

Panax ginseng Rễ tơ Selenium Ginseng saponin Đối chứng Tăng 1,33 lần

Papaver bracteatum Tế bào Dendryphion (thô) Sanguinarine 50 µg/g dw 450 µg/g fw

Sanguinaria canadensis Tế bào Verticillium dahliae (tế bào) Dopamine 3 mg/g fw 15 mg/g fw

S. canadensis Tế bào V. dahliae (thô) Sanguinarine 3 µg/g fw 12 µg/g fw

Tagetes patula Rễ tơ F. conglutanis (thô) Thiophene 0,2 g/100g dw 0,55 g/100 g

dw

T. patula Rễ tơ A. niger (thô) Thiophene 1,5 µM/g dw 3,5 µM/g dw

Taxus chinensis Tế bào Trifluoroethyl salicylate Taxuyunnanine C 14 mg/g dw 21,9 mg/g dw

Thalictrum rugosum Tế bào S. cerevisiae (thô) Berberine 0,5% dw 2% dw

23

Ảnh hương của các oligosaccharide DP4, DP7 và DP10 tách chiết từ

chủng nấm F. oxysporum Dzf17 lên khả năng tích lũy diosgenin ơ D.

zingiberensis đã được Li và cs (2011) nghiên cứu. Tế bào được xử lý với hỗn

hợp oligosaccharide nói trên ơ nồng độ 20 mg/L sau 26 ngày nuôi và thu sinh

khối vào ngày thứ 32. Hàm lượng diosgenin đạt được cao nhất là 2,187 mg/L,

gấp 5,65 lần đối chứng. Xử lý từng oligosaccharide riêng lẻ từ 2-10 mg/L cho

thấy DP7 ơ 6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L,

gấp 8,27 lần đối chứng. Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào

ngày 30, lượng diosgenin còn tăng lên cao hơn nữa đạt 4,843 mg/L, gấp 12,38

lần đối chứng [77].

Bota và cs (2012) dùng dịch chiết của hai chủng nấm Botrytis và

Sclerotinia để tăng hàm lượng flavonoid ơ Digitalis lanata. Bổ sung 1-2 mL

dịch chiết nấm vào 100 mL dịch tế bào của dòng số 11 và 13 đã cải thiện sự

tích lũy flavonoid theo thời gian và nồng độ xử lý. Hàm lượng flavonoid thu

được sau 96 giờ nuôi dòng số 11 đạt 1.000 mg% (dịch chiết Botrytis) và 999,81

mg% (dịch chiết Sclerotinia), trong khi dòng số 13 đạt 1051,65 mg% (Botrytis)

và 1025,43 mg% (Sclerotinia) [27].

Khi bổ sung dịch chiết của A. niger, F. oxysporum và YE vào môi trường

nuôi cấy Hypericum triquetrifolium ơ nồng độ từ 0,1-0,75 mg/L, Azeez và cs

(2013) nhận thấy các elicitor này có vai trò khác nhau trong việc sản xuất các

hợp chất thứ cấp. Dùng YE 0,5 mg/L đã tăng hàm lượng p-OH-benzoic acid và

chlorgenic acid lên đáng kể so với đối chứng. Sinh tổng hợp caffeic acid và

tannic acid giảm ơ tất cả công thức xử lý nhưng catechin lại tăng khi bổ sung

dịch chiết A. niger. Hypersoid, quercitin và rutin cũng tăng lên nhiều trong các

công thức thử nghiệm [20].

Nuôi cấy rễ tơ cây rau sam (Portulaca oleracea) cũng đã được Pirian và

cs (2013) thực hiện. YE ơ các nồng độ 125, 250, 500 và 1.000 mg/L được sử

dụng để cải thiện khả năng tích lũy noradrenaline với thời gian xử lý 2 ngày.

24

Các tác giả nhận thấy YE ơ nồng độ 250 và 500 mg/L là thích hợp nhất, hàm

lượng noradrenaline đã tăng 3-4 lần so với đối chứng [117].

Admeh và cs (2014) đã dùng dịch chiết của A. niger, P. notatum, YE và

chitosan để kích thích sản xuất psoralen trong nuôi cấy tế bào cây Psoralea

corylifolia. Bổ sung dịch chiết A. niger đã tăng lượng psoralen lên 9 lần so với

đối chứng. Trong khi dùng P. notatum, YE và chitosan lượng psoralen thu được

ít hơn 4-7 lần. Nói chung, dịch chiết A. niger 1% cho hiệu quả cao nhất, hàm

lượng psoralen đạt 9.850 μg/g sinh khối khô [12].

Nghiên cứu của Hasanloo (2014) cho thấy, chitosan có khả năng kích thích

tổng hợp silymarin trong nuôi cấy rễ tơ của loài Silybum marianum. Rễ tơ sau

30 ngày nuôi cấy được xử lý với chitosan có khối lượng phân tử trung bình.

Hàm lượng silymarin tổng số tăng lên 5,26 lần và khối lượng khô của rễ tơ đạt

cao nhất là 0,535 g sau 96 giờ xử lý với 30 mg/50 mL chitosan [57].

Hiệu quả của các elicitor sinh học cũng được Ebrahimi (2015) thử nghiệm

trong nuôi cấy tế bào Peganum harmala để tăng sinh tổng hợp hai loại alkaloid

β-carboline là harmaline và harmine. Nuôi cấy đã được xử lý với dịch chiết của

các loại nấm (Alternaria alternate, A. flavus, Coriolus versicolor, F.

oxysporum, Mucor sp., P. notatum và Rhizopus stonifer), dịch thủy phân casein

và YE ơ các nồng độ khác nhau. Lượng harmine thu được cao nhất khi bổ sung

YE 1.000 mg/L là 91,2 μg/g dw, gấp 1,68 lần đối chứng. Khi bổ sung dịch thủy

phân casein từ 75-100 mg/L vào nuôi cấy, sinh khối tế bào đã tăng mạnh, lượng

harmaline và harmine cũng tăng lần lượt gấp 1,61 và 1,46 lần đối chứng [43].

Silene vulgaris là một loài thực vật được phân bố rộng rãi ơ Bắc Mỹ chứa

các saponin loại oleanane có hoạt tính sinh học. Khả năng sản xuất saponin

bằng nuôi cấy rễ tơ của loài này đã được Kim và cs (2015) nghiên cứu thành

công. Rễ tơ của S. vulgaris được hình thành bằng cách lây nhiễm các mẫu lá

với năm chủng Agrobacterium rhizogenes khác nhau (LBA9402, R1000, A4,

13333 và 15834). Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy, khả năng tích

25

lũy saponin triterpenoid trong rễ tơ có sự thay đổi đáng kể. Lượng segetalic

acid và gypsogenic acid cao gấp 5 và 2 lần tương ứng so với đối chứng [71].

Arican (2016) nghiên cứu ảnh hương của các loại elicitor sinh học đến khả

năng tổng hợp triterpene trong nuôi cấy tế bào Alstonia scholaris. Nuôi cấy

được xử lý dịch chiết các loại nấm Candida albicans, F. oxysporum, P.

avelanium và YE. Các elicitor gây ra sự kích thích nhanh chóng quá trình trao

đổi chất thứ cấp của các tế bào A. scholaris dẫn đến tăng tổng hợp triterpenoid.

Khi tiếp xúc trong thời gian dài, một số dòng tế bào có khả năng tăng gấp đôi

sản lượng của triterpene. YE là elicitor tốt nhất cho tất cả các dòng tế bào được

khảo sát với lượng ursolic acid và oleanolic acid tích được tương ứng là 5 và 7

mg/g dw [18].

Hyoscyamine và scopolamine là hai loại alkaloid tropane rất có giá trị,

thường được sử dụng để làm chất chống đông máu, chống co thắt, chống dị

ứng, giảm đau và làm thuốc an thần. Các chất này được phát hiện có nhiều

trong loài Hyoscyamus reticulatus. Để tìm phương pháp sản xuất hyoscyamine

và scopolamine tốt nhất, Moharrami (2017) đã thử nghiệm nuôi cấy rễ tơ của

cây nảy mầm từ hạt được biến nạp chủng A. rhizogenes A7 có xử lý elicitor

sinh học ơ các nồng độ và thời điểm khác nhau. Kết quả thu được cho thấy, YE

ơ 500 và 250 mg/L sau 48 giờ xử lý là tốt nhất, hàm lượng hyoscyamine và

scopolamine đã tăng gấp 2 và 2,5 lần tương ứng so với đối chứng [103].

Năm 2018, Lee và cs đã nghiên cứu phương thức tăng khả năng tổng hợp

saponin trong nuôi cấy tế bào Kalopanax septemlobus bằng cách sử dụng

elicitor. Khi không bổ sung elicitor, hàm lượng saponin tổng số thu được là

1,56 mg/60 mL sau 15 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung coronatine 1 μM, lượng

saponin được tích lũy tăng lên 160%. Ngoài ra, các tác giả nhận thấy coronatine

còn làm tăng biểu hiện sinh tổng hợp β-amyrin từ đó dẫn đến tích lũy oleanolic

acid (tiền thân của oleanan-một loại saponin triterpene) [75].

26

1.3.2.2. Elicitor phi sinh học

Các elicitor phi sinh học thường được dùng phổ biến hơn elicitor sinh học,

nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành theo hướng này. Rezaei và cs

(2011) đã nghiên cứu sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào của cây thủy tùng

(Taxus baccata) bằng cách bổ sung SA từ 25-50 mg/L kết hợp với sóng siêu

âm có tần số 40 kHz trong 2 phút. Hàm lượng taxol thu được ơ môi trường có

SA 50 mg/L cao gấp 8 lần đối chứng [126].

MeJA đã được Wang và cs (2015) sử dụng để tăng sản xuất flavonoid

trong nuôi cấy tế bào Hypericum perforatum. Khi bổ sung MeJA 100 μmol/L

vào môi trường trong 15 ngày đã thu được lượng flavonoid cao nhất là 280

mg/L, gấp 2,7 lần đối chứng. Nguyên nhân có thể do MeJA ức chế hoạt tính

catalase nhưng lại tăng hoạt tính phenylalanine ammonia lyase (PAL), những

enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp flavonoid, từ đó tăng tổng hợp

chất này trong quá trình nuôi cấy [159].

Năm 2016, Khojasteh và cs đã sản xuất thành công rosmarinic acid bằng

nuôi cấy tế bào Satureja khuzistanica trong nồi phản ứng sinh học (bioreactor).

Hai elicitor là MeJA (100 μM) và cyclodextrin (40 mM) đã được thử nghiệm

riêng rẻ hoặc kết hợp. Kết quả cho thấy chỉ có MeJA khi dùng riêng rẻ đã tăng

tích lũy rosmarinic acid gấp 3 lần đối chứng, đạt 3,9 g/L. Khi chuyển sang nuôi

cấy trong các bioreactor, lượng rosmarinic acid tích lũy tối đa đạt 3,1 g/L [69].

Manivannan và cs (2016) nghiên cứu ảnh hương của MeJA, SA và SNP

lên khả năng sinh tổng hợp các chất chống oxy hóa và các chất chuyển hóa thứ

cấp trong nuôi cấy tế bào Scrophularia kakudensis. Tất cả các elicitor đều có

ảnh hương tích cực đến khả năng tích lũy các chất này trong tế bào. Trong đó,

MeJA từ 150-200 μM cho hiệu quả tổng hợp các chất nhóm phenol và flavonoid

cao nhất [91].

Saeed (2017) khi nuôi cấy tế bào của rễ cây Ajuga bracteosa đã bổ sung

thêm MeJA và PAA. Kết quả cho thấy sinh khối tế bào đã tăng đáng kể, đạt tối

27

đa 8,88 g/L dw ơ ngày thứ 32 khi bổ sung MeJA 0,6 mg/L, và 8,24 g/L dw ơ

ngày thứ 40 khi bổ sung PAA 1,2 mg/L. Ngoài ra, khả năng tích lũy các hợp

chất phenol, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa cũng tăng lên nhiều lần khi

sử dụng hai loại elicitor nói trên [131].

Estrada-Soto và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hương của MeJA và SA

trong nuôi cấy callus lá của Leptochinia caulescens để sản xuất ursolic và

oleanolic acid. Nhìn chung, cả hai loại elicitor nói trên đều có ảnh hương tích

cực lên quá trình sản xuất ursolic và oleanolic acid. Bổ sung MeJA trong 8 giờ

đã cho kết quả tốt nhất, hàm lượng các triterpen tăng gấp 5 lần đối chứng [45].

Bên cạnh việc sử dụng riêng lẻ các loại elicitor sinh học và phi sinh học,

rất nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng kết hợp các elicitor để mang lại hiệu

quả cao hơn. Artemisinin là chất thường được sử dụng để sản xuất thuốc chống

sốt rét ơ các nước châu Á và châu Phi. Ahlawat và cs (2014) đã thiết lập nuôi

cấy rễ tơ cây Artemisia annua để sản xuất bằng cách bổ sung MeJA, dịch chiết

nấm (A. alternate, Curvularia limata, F. solani và Piriformospora indica),

farnesyl pyrophosphate và miconazole vào môi trường nuôi cấy. Kết quả xử lý

riêng rẽ các elicitor cho thấy hiệu quả cao nhất thu được khi sử dụng dịch chiết

P. indica, hàm lượng artemisinin cao gấp 1,97 lần đối chứng. Tuy nhiên, khi

kết hợp xử lý MeJA và P. indica, hàm lượng artemisinin đã tăng lên cao hơn,

đạt 2,44 lần [11].

1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID

1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid

Năm 1973, Roughly và Whiting đưa ra hai con đường sinh tổng hợp

curcumin ơ thực vật dựa trên các dữ liệu phân tích 14C. Ở con đường thứ nhất,

cinnamic acid kết hợp với malonyl-CoA (có nguồn gốc từ malonic acid) trong

một chuỗi phản ứng mà cuối cùng được aryl hóa thành một curcuminoid. Trong

con đường thứ hai, hai đơn vị muối cinnamate được kết hợp với nhau bằng

28

malonyl-CoA. Cả hai cơ chế cùng sử dụng cinnamic acid có nguồn gốc từ

phenylalanine như điểm khơi đầu của chúng [72], [130].

Bằng cách sử dụng những chất đánh dấu đồng vị phóng xạ, một số nghiên

cứu cho thấy các hợp chất nhóm curcuminoid có nguồn gốc từ các chất trung

gian trong con đường phenylpropanoid kết hợp với các phân tử khác từ con

đường tổng hợp acetate hay chuỗi ngắn và vừa của acid béo. Dựa trên kết quả

này, Schröder (1997) cho rằng các enzyme tương tự như polyketide synthase

đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các cấu trúc khung của curcuminoid

và sử dụng các CoA có nguồn gốc từ các hợp chất trung gian. Từ đó, hai con

đường sinh tổng hợp curcuminoid đã được đưa ra. Curcuminoid có thể được

hình thành từ sự kết hợp của hai phân tử p-coumaroyl-CoA với một phân tử

malonyl-CoA nhờ hoạt động của polyketide synthase (hoặc tương tự), có thể

do bổ sung diketide trung gian (Berbd và Schneider 2006). Kết quả,

bisdemethoxycurcumin được chuyển thành demethoxycurcumin, rồi thành

curcumin theo hai vòng liên tục của sự hydro hóa và methyl hóa. Mặt khác, có

khả năng enzyme tổng hợp curcuminoid sử dụng các dạng ester CoA của 2

phân tử p-coumaric acid và ferulic acid làm cơ chất. Trong tường hợp này, sự

hydro hóa và methyl hóa dẫn tới sự hình thành các nhóm chức methoxyl trong

phân tử curcumin tương tự như các phản ứng phát hiện trong con đường

phenylpropanoid (Hình 1.2) [124].

Để tìm hiểu quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ơ cây nghệ vàng (C.

longa), Kita và cs (2008) đã thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro cho loài dược

liệu này với các tiền chất bổ sung vào môi trường chứa 13C. Kết quả phân tích

hàm lượng demethoxycurcumin và các dạng curcuminoid khác bằng phân tích

cộng hương từ hạt nhân 13C cho thấy một phân tử acetic acid hoặc malonic acid

và hai phân tử phenylalanine hoặc phenylpropanoid (không phải tyrosine) kết

hợp tạo thành demethoxycurcumin. Sự kết hợp với các cơ chất giống nhau để

tạo thành demethoxycurcumin hay curcumin là tương tự nhau, theo thứ tự

29

malonic acid > acetic acid, và cinnamic acid > p-coumaric acid > ferulic acid.

Kết quả này cho thấy có thể hai phân tử cinnamoyl-CoA và một phân tử

malonyl-CoA đã tạo nên curcuminoid, các gốc hydroxy và methoxy trên vòng

thơm được gắn vào sau khi hình thành cấu trúc khung của curcuminoid [72].

Xie và cs (2009) đã nghiên cứu các cơ chế điều hòa biểu hiện gen tổng

hợp các hợp chất thứ cấp ơ cây nghệ vàng và nhận thấy có một cơ chế điều hòa

sinh tổng hợp ba dạng curcuminoid. Sự tồn tại của cơ chế điều hòa này đã chứng

minh cho giả thuyết rằng nhóm 3-methoxyl trên vòng thơm của phân tử

curcuminoid được hình thành trước sự hình thành của khung heptanoid trong

quá trình sinh tổng hợp curcumin cũng như sự tồn tại của nhiều gen mã hóa

enzyme thuộc nhóm polyketide synthases với nhiều cơ chất khác nhau, hình

thành nhiều diarylheptanoid trong cây nghệ vàng [163].

30

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng. PAL: phenylalanine ammonia lyase. C4H: cinnamate 4-

hydroxylase. 4CL: 4-coumarate-CoA ligase. CST: p-coumaroyl shikimate transferase. CS3’H: p-coumaroyl 5-O-shikimate 3’-

hydroxylase. CCOMT: caffeoyl-CoA O-methyltransferase [124].

31

1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid

Tham gia vào chu trình sinh tổng hợp curcuminoid ơ nghệ vàng có rất

nhiều enzyme khác nhau xúc tác cho nhiều phản ứng trung gian khác nhau,

phần lớn các gen/enzyme này đều đã được nghiên cứu cả về đặc điểm, chức

năng cũng như biểu hiện tái tổ hợp. Trong số đó, các enzyme thuộc nhóm

polyketide synthase type III đóng vai trò hết sức quan trọng. Đây là họ enzyme

thiết yếu trong quá trình sinh tổng hợp flavonoid và các hợp chất polyphenol ơ

thực vật bằng cách gắn các nhóm acetyl từ malonyl-CoA lên vị trí liên kết

thioester trên trung tâm hoạt động của polyketide synthase (Hình 1.3) [125].

1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS)

Gen DCS mã hóa diketide-CoA synthase là một enzyme thuộc nhóm

polyketide synthase type III xúc tác tạo thành feruloyldiketide-CoA từ feruloyl-

CoA và malonyl-CoA (Hình 1.3) [66], [67].

1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS)

Gen CURS mã hóa curcumin synthase là enzyme xúc tác tạo thành

curcuminoid từ cinnamoyldiketide-N-acetylcysteamine và feruloyl-CoA. Hoạt

động đồng thời của DCS và CURS khi có sự hiện diện của feruloyl-CoA và

malonyl-CoA sẽ tạo ra nhiều curcumin, trong khi một mình CURS cho hiệu quả

tổng hợp curcumin thấp cùng với sự hiện diện của feruloyl-CoA và malonyl-

CoA. Như vậy, DCS tổng hợp feruloyldiketide-CoA trong khi CURS xúc tác

chuyển hóa diketide-CoA thành curcuminoid [66].

Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được có ba gen CURS mã hóa ba

enzyme CURS với các vai trò khác nhau. CURS1 xúc tác hình thành curcumin

từ feruloyl-CoA và feruloyldiketide-CoA (được tạo ra bơi hoạt động của gen

DCS). Hai enzyme DCS và CURS1 cùng tham gia xúc tác tạo thành curcumin,

cả hai gen đều sử dụng p-coumaroyl-CoA nhưng hiệu quả thấp, chúng cũng có

32

khả năng sinh tổng hợp demethoxycurcumin từ feruloyl-CoA và malonyl-CoA

theo con đường tạo thành p-coumaroyldiketide-CoA. CURS2 tương tự CURS1

về tính đặc hiệu cơ chất với feruloyl-CoA là cơ chất khơi đầu. CURS3 cũng có

tính đặc hiệu cơ chất như CURS1 và CURS2, sử dụng cả p-coumaroyl-CoA và

feruloyl-CoA làm cơ chất khơi đầu. Giống như CURS1, CURS2 chủ yếu xúc

tác quá trình tạo thành curcumin và demethoxycurcumin bằng cách gắn

feruloyl-CoA với p-coumaroyldiketide-CoA hoặc feruloyldiketide-CoA. Trong

khi đó, CURS3 có khả năng tổng hợp cả 3 loại curcuminoid bằng cách gắn

feruloyl-CoA hoặc p-coumaroyl-CoA với p-coumaroyldiketide-CoA hoặc

feruloyldiketide-CoA. Sự tồn tại của ba gen CURS cho thấy các dạng

curcuminoid được tổng hợp trong củ nghệ không chỉ phụ thuộc vào cơ chất như

p-coumaroyl-CoA và feruloyl-CoA mà còn phụ thuộc vào mức độ biểu hiện

của các gen này (Hình 1.3) [67].

Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ơ nghệ

vàng [67].

1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase

33

Bên cạnh hệ thống enzyme sinh tổng hợp curcuminoid là DCS/CURS

trong củ nghệ vàng, hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện thêm một enzyme

khác thuộc nhóm polyketide synthase type III là curcuminoid synthase (CUS)

ơ cây lúa (Oryza sativa) cũng có chức năng tương tự. Enzyme này xúc tác quá

trình tổng hợp curcuminoid như sau: đầu tiên, p-coumaroyl-CoA và malonyl-

CoA kết hợp tạo thành sản phẩm trung gian diketide-CoA. Sau đó, sự kết hợp

giữa diketide-CoA và phân tử p-coumaroyl-CoA khác tạo nên

bisdemethoxycurcumin. Bản thân enzyme CUS xúc tác cho cả 2 bước được

thực hiện riêng rẽ bơi DCS và CURS, vì sử dụng enzyme CUS sẽ đơn giản hơn

sử dụng hệ thống DCS/CURS nên có nhiều ưu thế hơn khi xây dựng hệ thống

tổng hợp curcuminoid trong vi sinh vật [68].

Mặc dù đều có khả năng tổng hợp curcuminoid nhưng hoạt động của hai

hệ enzyme CUS và DCS/CURS có một số điểm khác nhau. CUS tổng hợp

curcuminoid kèm theo sự hình thành của triketide pyrone. Trong khi đó, hệ

enzyme DCS/CURS chỉ tạo thành một lượng rất ít dehydrozingerone là sản

phẩm phụ (dạng vết), có nguồn gốc từ sự thủy phân không có sự tham gia của

enzyme (nonenzymatic hydrolysis) và sự decarboxyl hóa feruloyldiketide-

CoA. Do đó, hệ enzyme DCS/CURS chỉ tổng hợp curcumin và các chất trung

gian là feruloyldiketide-CoA. Hệ thống tổng hợp curcumin trong nghệ vàng

loại bỏ sản phẩm phụ triketide pyrone bằng cách chia quá trình tổng hợp thành

hai phần: phần sử dụng DCS và phần sử dụng CURS. Cơ chất để bắt đầu quá

trình tổng hợp của hai hệ enzyme cũng khác nhau, CUS sử dụng p-coumaroyl-

CoA trong khi cả DCS và CURS sử dụng feruloyl-CoA làm cơ chất khơi đầu

[66].

1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase

Chalcone synthase (CHS) là một enzyme thuộc nhóm polyketide synthase

type III, xúc tác cho sự hình thành các hợp chất thứ cấp chính của thực vật như

34

acridone, bibenzyl, biphenyl, benzophenone, chalcone, chromone,

curcuminoid, phloroglucinol, pyrone, resorcinol và stilbene. Các phản ứng

được xúc tác bơi CHS được bắt đầu bằng cách chuyển nhóm acyl từ p-

coumaroyl-CoA lên trung tâm xúc tác cysteine của CHS. Sau đó, kết hợp với 3

phân tử malonyl-CoA đã bị decarboxyl để tạo nên chất trung gian tetraketide.

Phản ứng này được xúc tác bơi trung tâm hoạt động gồm Cys-Asn-His.

Tetraketide sau đó được đóng vòng thơm để tạo thành chalcone [66]. Gần đây,

các nhà khoa học đã tìm thấy gen CHSI (chalcone synthase like gene) và gen

CHSII ơ cây nghệ C. caesia, các gen này đã được tạo dòng, phân tích chức năng

và đăng ký ơ ngân hàng gen [23]. Trong quá trình sinh tổng hợp curcuminoid,

hoạt động mạnh của gen CHS sẽ làm giảm lượng curcuminoid tạo thành do sử

dụng các hợp chất trung gian là diketide-CoA và malonyl-CoA để tổng hợp nên

chalcone hay triketide pyrone [66].

Resmi và Soniya (2012) đã tìm ra hai gen mới mã hóa các enzyme thuộc

nhóm polyketide synthase type III là ClPKS9 và ClPKS10 từ nghệ vàng. Gen

ClPKS9 có trình tự tương đồng với gen CHS trong khi gen ClPKS10 tương

đồng với gen CUS. Hai gen này có sự biểu hiện khác nhau ơ các mô khác nhau,

ClPKS9 biểu hiện mạnh ơ chồi và củ hơn ơ lá, trong khi đó gen ClPKS10 biểu

hiện mạnh trong lá nhưng rất ít trong rễ và củ [125].

1.4.2.5. Các gen khác

Bên cạnh các gen đã kể trên, con đường phenylpropanoid tổng hợp nhóm

chất curcuminoid còn có sự tham gia của một số gen khác (Hình 1.2).

Gen PAL mã hóa phenylalanine ammonia lyase, enzyme tham gia phản

ứng chuyển hóa đầu tiên trong chu trình phenylpropanoid, khơi đầu của quá

trình sinh tổng hợp curcuminoid. Enzyme này xúc tác phản ứng loại gốc amine

không oxy hóa của L-Phe tạo thành trans-cinnamic acid và NH4+ [124].

Gen C4H mã hóa cinnamate 4-hydroxylase là monooxygenase phụ thuộc

35

Cyt P450 đầu tiên, tham gia ơ bước thứ 2 trong con đường phenylpropanoid.

Enzyme này xúc tác chuyển cinnamic acid thành p-coumaric acid. Hiện nay,

có hơn 20 gen C4H đã được phân lập [138].

Gen 4CL mã hóa 4-coumarate-CoA ligase, enzyme xúc tác phản ứng

chuyển hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid, caffeic acid và ferulic acid)

sang dạng CoA esters (p-coumaroyl-CoA, caffeoyl-CoA và feruloyl-CoA)

[128].

Gen CST mã hóa p-coumaroyl shikimate transferase, enzyme tham gia

vào quá trình sản xuất methoxylate phenylpropanoid trong thực vật. Trong các

mô sản xuất curcuminoid, nếu thiếu enzyme này hoặc enzyme này ít hoạt động

thì curcumin sẽ được tổng hợp thông qua bisdemethoxycurcumin, trong đó tất

cả các chất trung gian trong con đường phenylpropanoid đều có nguồn gốc từ

p-coumaroyl-CoA chứ không phải từ feruloyl-CoA. Tuy nhiên, một số nghiên

cứu khác cho rằng enzyme này tham gia vào quá trình tạo ra khung cấu trúc

của curcuminoid và sử dụng cả p-coumaroyl-CoA và feruloyl-CoA làm cơ chất

[124].

1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp

Với sự hiểu biết về các gen cũng như vai trò của chúng trong con đường

sinh tổng hợp curcuminoid ơ thực vật nói chung và nghệ vàng nói riêng,

Katsuyama và cs (2008) đã tạo ra hệ thống tổng hợp curcuminoid trong tế bào

E. coli. Trong hệ thống này, gen PAL có nguồn gốc từ nấm men Rhodotorula

rubra, gen 4CL từ cây L. erythrorhizon, gen ACC (acetyl-CoA carboxylase)

từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum và gen CUS từ lúa. Tế bào E. coli

tái tổ hợp được nuôi trong môi trường có tyrosine hoặc phenylalanine, hoặc

cả hai để tổng hợp nên bisdemethoxycurcumin, dicinnamoylmethane và

cinnamoyl-p-coumaroylmethane. Một hệ thống khác chứa hai gen 4CL và

CUS đã tổng hợp được lượng lớn curcuminoid từ các thành phần

36

phenylpropanoid acid bổ sung từ bên ngoài như p-coumaric acid, cinnamic

acid và ferulic acid. Hàm lượng curcuminoid thu được khoảng 100 mg/L

[68], [65].

Rogrigues và cs (2015) đã xây dựng hệ thống tổng hợp curcuminoid nhân

tạo trong E. coli thông qua caffeic acid. Các tác giả đã sử dụng gen tổng hợp

4CL từ Arabidopsis thaliana, gen DCS và CURS1 từ nghệ vàng và đã thu được

70 mg/L curcumin với cơ chất là ferulic acid. Bisdemethoxycurcumin và

demethoxycurcumin cũng được tạo ra nhưng với hàm lượng thấp khi sử dụng

p-coumaric acid hoặc hỗn hợp p-coumaric acid và ferulic acid. Curcuminoid

cũng được tổng hợp từ tyrosine thông qua con đường caffeic acid. Để tạo ra

caffeic acid, gen TAL mã hóa hóa tyrosine ammonia lyase từ Rhodotorula

glutinis, gen C3H mã hóa 4-coumarate 3-hydroxylase từ Saccharothrix

espanaensis đã được sử dụng. Gen COMT mã hóa catechol-O-

methyltransferase từ cỏ linh lăng (Medicago sativa) được sử dụng để chuyển

caffeoyl-CoA thành feruloyl-CoA. Sử dụng caffeic acid, p-coumaric acid hoặc

tyrosine làm cơ chất, các tác giả đã thu được hàm lượng curcumin tương ứng

lần lượt là 3,9, 0,3, và 0,2 mg/L. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng gen DCS

và CURS1 để tổng hợp curcuminoid trong điều kiện in vitro và curcumin được

sản xuất từ tyrosine [128].

Wang và cs (2015) đã sử dụng 7 enzyme khác nhau từ thực vật và vi khuẩn

để tổng hợp nên các hợp chất có giá trị trong E. coli như 4 loại phenylpropanoid

acid (cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid và ferulic acid), 3 chất thuộc

nhóm stilbenoid (resveratrol, piceatannol và pinosylvin), và 3 chất thuộc nhóm

curcuminoid (curcumin, bisdemethoxycurcumin và dicinnamoylmethane).

Trong đó, các gen PAL có nguồn gốc từ Trifolium pretense, 4CL từ A. thaliana,

CUS từ lúa, TAL và C3H từ Saccharothrix espanaensis, COMT từ cỏ linh lăng

và STS mã hóa stilbene synthase từ cây lạc (Arachis hypogaea). Ban đầu, các

tác giả đã biểu hiện các gen PAL, 4CL và CUS trong E. coli để tổng hợp

37

dicinnamoylmethane. Sau đó, họ sử dụng TAL thay cho PAL, biểu hiện đồng

thời TAL, 4CL và CUS trong E. coli đã tạo ra sản phẩm là

bisdemethoxycurcumin (28,9 mg/L). Các tác giả này cũng nhận thấy có thể

tổng hợp curcumin từ L-tyrosine khi biểu hiện đồng thời 4CL và CUS trong E.

coli [160].

1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor

Những nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều. Park và cs (2016) đã

xử lý YE và AgNO3 để tăng cường mức độ biểu hiện của các gen trong chu

trình phenylpropanoid và sự tích lũy của rosmarinic acid khi nuôi cấy tế bào

cây Agastache rugosa. Kết quả cho thấy bổ sung YE 0,5 g/L và AgNO3 30

mg/L ơ các thời điểm khác nhau đều kích hoạt sự biểu hiện của các các gen và

sự tích lũy của rosmarinic acid. Mức độ biểu hiện của các gen RAS mã hóa

rosmarinic acid synthase và HPPR mã hóa hydroxyl phenylpyruvate

reductase tăng lên cao nhất là 1,84, 1,97 và 2,86 lần khi được xử lý YE trong

các thời gian khác nhau 3, 6 và 12 giờ. Đối với gen PAL, mức độ phiên mã tăng

lên tới 52,31 lần khi xử lý bằng AgNO3 sau 24 giờ. Xử lý YE cũng làm tăng

mức độ tích lũy rosmarinic acid lên 4,98 mg/g, trong khi xử lý AgNO3

rosmarinic acid chỉ đạt 0,65 mg/g. Như vậy, có sự tương đồng cao trong việc

tăng mức độ biểu hiện của các gen trong chu trình phenylpropanoid và sự tích

lũy của rosmarinic acid khi được xử lý bằng YE [115].

Loc và cs (2016) đã nghiên cứu tăng cường mức độ biểu hiện của các gen

CaSQS, CabAS và CaCYS trong con đường chuyển hóa phytosterol và

triterpene ơ cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban) được xử lý bơi salicilic

acid (50-200 µM). Phân tích PR phiên mã ngược (RT-PCR) và Northern blot

cho thấy các gen CaSQS, CabAS và CaCYS biểu hiện ơ cả trong cây tự nhiên

và trong tế bào nuôi cấy (có và không có xử lý elicitor). Trong tế bào được xử

lý elicitor, mức độ biểu hiện của các gen CaSQS, CabAS và CaCYS phụ thuộc

rất lớn vào nồng độ và thời gian xử lý salicilic acid. Mức độ biểu hiện cao nhất

38

được quan sát thấy khi xử lý salicilic acid 100 µM vào ngày thứ 10 của quá

trình nuôi cấy. Salicilic acid nồng độ từ 50-200 µM làm giảm mức độ biểu hiện

của các gen CaCYS và CaSQS trong tế bào được xử lý elicitor so với đối chứng

không xử lý elicitor [88].

Sarkate và cs (2007) đã sử dụng YE để tăng cường sản xuất các hợp chất

thứ cấp nhóm phenol và chất chống oxy hóa từ tế bào cây táo (Malus domestica

‘florina’). Ở các công thức xử lý YE, hàm lượng các hợp chất nhóm phenol và

chất chống oxy hóa đều tăng lên đáng kể, thông qua sự tăng cường hoạt động

của enzyme PAL. Dịch chiết methanol được phân tích HPLC cho thấy các hợp

chất phenol là chlorogenic acid (112 µg/g), 4-coumaric acid (122 µg/g), ferulic

acid (212 µg/g), benzoic acid (244 µg/g) và rutin (348 µg/g) đều tăng lên sau

khi tế bào được xử lý YE. Bên cạnh đó, hoạt tính của các chất chống oxy hóa

như DPPH và FRAP cũng đều tăng lên khi được xử lý YE, tương ứng với sự

tăng tích lũy các hợp chất phenol [136]./.

39

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là sự biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp curcuminoid trong tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria

Roscoe). Cây nghệ đen có nguồn gốc từ tỉnh Đắk Lắk, được trồng tại thành phố

Huế trước khi được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu (Hình 2.1).

Hình 2.1. Cây nghệ đen.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ thí nghiệm ơ hình 2.2 và

sử dụng các phương pháp sau:

40

2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen

2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật

Chồi mầm tách từ củ nghệ được rửa sạch bằng nước xà phòng loãng và

nước máy nhiều lần trước khi khử trùng. Chồi được ngâm 30 giây trong cồn

70% và sau đó 20 phút trong dung dịch AgNO3 1% [101]. Sau cùng rửa lại

bằng nước cất vô trùng 5 lần trước khi cấy lên môi trường dinh dưỡng thích

hợp.

Cây nghệ đen

Chồi mầm của củ nghệ Phân lập các gen tổng hợp

curcuminoid

Tái sinh chồi in vitro

Nhân cụm chồi

Tạo rễ

Nhân giống cây in vitro

Củ nghệ

Nuôi cấy callus Phân tích biểu hiện

(RT-PCR và HPLC)

Nuôi cấy tế bào Xử lý elicitor Phân tích biểu hiện

(RT-PCR và HPLC)

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm.

41

2.2.1.2. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro

Chồi mầm sau khi khử trùng (1-1,5 cm) được cấy lên môi trường cơ bản

MS có sucrose 20 g/L, agar 8 g/L, bổ sung BAP 3 mg/L, IBA 0,5 mg/L và nước

dừa 20% (v/v) để tái sinh cụm chồi [79]. Chồi in vitro tái sinh (khoảng 2 cm)

nguyên vẹn hoặc chẻ đôi được chuyển lên môi trường tương tự như trên nhưng

thêm AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng nhân cụm chồi. Chồi chẻ

đôi là các chồi mang đỉnh sinh trương được chẻ đôi theo chiều dọc bằng giao

cấy, trong đó đỉnh sinh trương cũng được chẻ đôi. Các chồi in vitro (3-4 cm)

tách từ cụm chồi trên môi trường nhân được nuôi trên môi trường MS có

sucrose 20 g/L, agar 8 g/L, nước dừa 20% (v/v) bổ sung NAA 2 mg/L [79] và

AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng tạo rễ. Thí nghiệm được đánh giá

sau 4 tuần nuôi cấy.

2.2.1.3. Nuôi cấy callus

Cây nghệ đen in vitro 4 tuần tuổi sinh trương trên môi trường tạo rễ trong

lần cấy chuyển đầu tiên được sử dụng làm nguyên liệu tạo callus. Gốc lá (leaf-

base) (0,2×1 cm) được nuôi trên môi trường MS có sucrose 20 g/L, agar 8 g/L,

bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L để tạo callus. Callus sơ cấp sau đó được

cắt thành các khối nhỏ (đường kính ~2 mm) rồi cấy chuyển lên môi trường mới

có 2,4-D 1 mg/L và KIN hoặc NAA từ 0,5-2 mg/L hoặc AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L

để tăng sinh khối mô. Thí nghiệm được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy. Các callus

sinh trương trên môi trường thích hợp sẽ được cấy chuyển định kỳ 2 tuần/lần

để duy trì nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào.

2.2.1.4. Nuôi cấy tế bào

Callus vàng rời, 2 tuần tuổi sinh trương trên môi trường tốt nhất được sử

dụng làm nguyên liệu trong nuôi cấy tế bào huyền phù. Chuyển 3 g callus vào

bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường MS lỏng có sucrose 20 g/L, bổ

sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L, khuấy trộn cho đến khi xuất hiện các tế

42

bào tự do (môi trường bị đục và quan sát thấy tế bào dưới kính hiển vi). Sau đó,

các tế bào này được chuyển sang môi trường mới có thành phần tương tự và

nuôi lắc 150 vòng/phút trong 18 ngày để thu sinh khối [82].

Tế bào được thu hoạch 2 ngày/lần (thu nguyên bình), dịch môi trường

được lọc bằng giấy lọc và cân để xác định sinh khối tươi. Sinh khối tươi sau đó

được sấy ơ 50oC cho đến khi khối lượng không đổi để xác định khối lượng khô.

Các môi trường nuôi cấy đều được điều chỉnh pH đến 5,8 và khử trùng ơ

121oC trong 20 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy được duy trì ơ 25±2ºC, cường

độ chiếu sáng 2.000-3.000 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, ngoại trừ

nuôi cấy tế bào là 500 lux.

2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid

2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ lá nghệ đen được tách chiết bằng phương pháp CTAB

theo Babu và cs. (2014) có cải tiến [21]. Nghiền 1 g lá trong nitrogen lỏng cho

đến khi thu được bột mịn sau đó chuyển vào tube Eppendorf, bổ sung 1 mL

đệm CTAB (Tris.HCl 100 mM pH 8, EDTA 20 mM pH 8, CTAB 2%, NaCl

1,4 M và β-mercaptoethanol 0,2%) đã được làm ấm từ trước ơ 65ºC và vortex

mạnh trong 5 phút. Ủ mẫu ơ 65ºC trong 1 giờ, vortex 15 phút/lần trong 10 giây,

sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ơ 4ºC để thu dịch nổi. Bổ sung

một thể tích tương đương dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (tỷ lệ:

25/24/1), vortex và ủ ơ nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút

trong 15 phút ơ 4ºC để thu dịch nổi. Tiếp tục bổ sung một thể tích tương đương

isopropanol, vortex và ủ ơ -20ºC trong 1 giờ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong

20 phút ơ 4ºC để thu kết tủa DNA. Rửa kết tủa bằng 500 µL ethanol 70% lạnh,

ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ơ 4ºC, loại bỏ dịch nổi. Để mẫu DNA

khô tự nhiên, sau đó hòa tan trong 20 µL 1×TE (Tris.HCl 10 mM pH 8 và

EDTA 1 mM). DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và

43

nhuộm bằng RedSafeTM (Intron Biotechnology, Hàn Quốc). Hình ảnh điện di

được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec). DNA

tổng số được bảo quản ơ -20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2.2. Khuếch đại PCR

DNA tổng số của nghệ đen được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại

gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (CzDCS) và các gen mã hóa

enzyme curcumin synthase (CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3) dựa vào các

cặp primer đặc hiệu của chúng (Bảng 2.1). Các primer được thiết kế dựa trên

các vùng 5’ và 3’ không dịch mã ơ các gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3

của nghệ vàng (Mã số GenBank: AB495006.1, AB495007.1, AB506762.1 và

AB506763.1) để đảm bảo tính đặc hiệu của các sản phẩm PCR do trình tự

nucleotide của các gen này có độ tương đồng rất cao [66].

Để có được vùng bên cạnh (flanking region) trình tự CDS của các gen

tham gia tổng hợp curcuminoid của nghệ vàng, trình tự mRNA của các gen đã

được BLAST với cơ sơ dữ liệu EST của loài này, các đoạn có giá trị E-value

cao sẽ được lựa chọn để sử dụng với trình tự CDS tương ứng tạo ra các mRNA

liên tục hoàn chỉnh. Chuỗi mRNA hoàn chỉnh giả định của các gen DCS,

CURS1, CURS2 và CURS3 ơ nghệ vàng được dùng làm khuôn mẫu để thiết kế

primer khuếch đại các gen tương ứng ơ nghệ đen.

Thành phần PCR bao gồm: 50 ng DNA tổng số, 10 pmol primer mỗi loại,

6 µL 2×Go Taq® Green Master Mix (Promega, Mỹ), bổ sung nước cất vô trùng

vừa đủ 12 µL. Khuếch đại PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt Veriti 96

Well Thermal Cycler (ABI, Mỹ) theo chu trình: 95ºC/15 phút; 30 chu kỳ:

95ºC/30 giây, 53ºC/30 giây, và 72ºC/1 phút; cuối cùng 72ºC/10 phút.

2.2.2.3. Tạo dòng và chú giải gen

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo

44

Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi tinh sạch chúng được

gắn vào vector pGEM®T-Easy (Hình 2.3) bằng T4 DNA ligase (Promega, Mỹ)

với thành phần phản ứng (trong 10 µL) gồm có: 3 unit T4 DNA ligase, 1 µL

10× T4 DNA ligase buffer, 50 ng pGEM®-T Easy, 70 ng sản phẩm PCR của

mỗi gen. Hỗn hợp được trộn đều và ủ ơ 4ºC qua đêm. Vector pGEM®-T Easy

mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 bằng phương pháp

sốc nhiệt theo Sambrook và Russell (2001) [133]. Thể biến nạp được chọn lọc

trên môi trường LB rắn (trypton 1%, YE 0,5%, NaCl 1% và agar 1,5%) có bổ

sung 50 μg/mL ampicillin. Kiểm tra sự có mặt của đoạn chèn trong vector

pGEM®T-Easy tái tổ hợp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với các cặp primer

đặc hiệu. DNA plasmid sau đó được tách chiết theo phương pháp alkaline lysis

[133] và trình tự nucleotide của sản phẩm PCR được xác định bằng phương

pháp dideoxy terminator của Sanger trên máy ABI PRSIM 3100 (Mỹ). Các gen

(sản phẩm PCR) sau khi giải trình tự được so sánh với mRNA của nghệ vàng

bằng công cụ blastn, blastx và dự đoán cấu trúc của nó bằng phần mềm

FGENES.

Hình 2.3. Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ).

Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen tổng

45

hợp curcuminoid ơ nghệ đen.

Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) Chiều dài ước

tính của sản

phẩm PCR

(bp)

CzDCS DCS-F GTCGTTTCTGTGACCTTCTC

~ 1400 DCS-R CTTTTGGATGCAGACTGGAACA

CzCURS1 CURS1-F CTGCGACTGCGAGAAGAAGC

~ 1250 CURS1-R CAGATAGACAGCCATACAAACC

CzCURS2 CURS2-F GCACGCGTTTTCTTGCTAATC

~ 1300 CURS2-R GATCGTGTTCATAATTCACTGG

CzCURS3 CURS3-F CTAGCTAGCTGCAATTCGTT

~ 1250 CURS3-R GTGCTAGCTTAGCTTGACGTA

2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ

Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên các trình tự nucleotide thu được

sẽ giúp đánh giá chính xác hơn các gen mới tìm thấy ơ nghệ đen. Vùng CDS

của các gen DCS, CURS1, CURS2, CURS3 của cây nghệ đen, DCS1 và DCS2

(Mã số GenBank: KM880191.1 và AB535216.1) của nghệ vàng, gen type III

PKS (polyketide synthase) của cây chuối (Musa accuminata) (Mã số GenBank:

GU724611.1), và 4 gen mới thu được từ nghệ đen được sử dụng để xây dựng

cây phả hệ thông qua phần mềm MEGA7. Gen PKS từ nấm A. alternate (Mã

số GenBank: JX103640.1) được sử dụng làm nhóm ngoại. Cây phả hệ được

xây dựng dựa trên phương pháp Maximum Likelihood có độ lặp lại (bootstrap)

là 2.000 lần.

46

2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid

2.2.3.1. Xử lý elicitor

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hương của elicitor lên khả năng sinh

trương và tích lũy curcumin được thiết kế dựa trên kết quả nghiên cứu quá trình

nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen và các kết quả đạt được trước đây của

nhóm nghiêm cứu trên các đối tượng khác. Các loại elicitor được sử dụng là

MeJA, SA và YE, đây là các loại elicitor đã được chứng minh là có hiệu quả

trên tế bào cây rau má, cà gai leo,… Khoảng nồng độ elicitor, thời gian xử lý

elicitor sử dụng trong nghiên cứu này cũng được kế thừa từ các nghiên cứu

trước đây của nhóm nghiên cứu [87], [88].

Chuyển 3 g sinh khối tế bào nghệ đen 10 ngày tuổi vào môi trường lỏng

(môi trường MS cơ bản có sucrose 20 g/L, bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3

mg/L) để tiến hành xử lý với 3 loại elicitor khác nhau. Elicitor được bổ sung

vào môi trường nuôi cấy ơ các nồng độ khác nhau (MeJA 25-150 µM, SA 50-

150 µM và YE 0,1-1,5 g/L) và tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu

hoặc ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy huyền phù). Sau 14 ngày nuôi cấy trong

bình tam giác, thu sinh khối tế bào để xác định khối lượng tươi và khối lượng

khô, mức độ biểu hiện của các gen và mức độ tích lũy curcumin [80], [82].

2.2.3.2. Phân tích RT-PCR

Mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid trong các mẫu khác

nhau được phân tích bằng kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR) với các

primer được thiết kế cho các đoạn chỉ thị của các gen này (Bảng 2.2). Primer

được thiết kế dựa trên trình tự mRNA dự đoán của các gen CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 bằng công cụ Primer BLAST. Trong quá trình thiết kế,

các vùng có sự khác nhau lớn giữa các gen được lựa chọn để đảm bảo tính đặc

hiệu của đoạn chỉ thị cho toàn bộ gen (Hình 2.4).

Mẫu vật (200 mg callus/tế bào hoặc 100 mg củ nghệ đen 1 năm tuổi) được

47

nghiền thành bột mịn trong nitrogen lỏng. RNA tổng số được tách chiết bằng

Invitrap® Spin Plant RNA Mini Kit (Stratec Molecular GmbH, Đức) theo

hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sợi cDNA thứ nhất được tổng hợp bằng First Strand cDNA Synthesis Kit

(Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tổng thể tích phản

ứng (20 µL) chứa 5 µL RNA tổng số, 0,5 µg oligo(dT)18 primer, 4 µL 5× buffer,

20 unit RiboLockTM ribonuclease inhibitor, 2 µL dNTP 10 mM và 40 unit M-

MuLV reverse transcriptase. Hỗn hợp phản ứng được ủ ơ 37oC trong 60 phút,

sau đó dừng phản ứng ơ 70oC trong 5 phút và làm lạnh trên đá, bảo quản mẫu

DNA ơ -40oC.

Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các gen tổng

hợp curcuminoid ơ nghệ đen.

Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) Chiều

dài

(bp)

Nhiệt độ

gắn primer

(oC)

CzDCS ID-F TGCTCCGAGGTCACCGTGC

272 55 ID-R GGTCAGCCCAATTTCGCGG

CzCURS1 IC1-F CCGCTGGAAGGAATTGAAAAA

286 55 IC1-R GAGCTTGTCCGGGCTCAGCTG

CzCURS2 IC2-F CCACCTCCGCGAGGTGGGGCT

211 55 IC2-R GCGGTGGCCAGCTTGCTCTGT

CzCURS3 IC3-F CACCTGAGGGAAATCGGCTGG

202 50 IC3-R GCGAGCTTCCCCTGTTCCAGC

48

Hình 2.4. Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1. Mô hình này cũng

được sử dụng để thiết kế primer cho các gen CzDCS, CzCURS2 và CzCURS3 của

nghệ đen.

Thành phần PCR bao gồm 50 ng cDNA, 6 µL 2× GoTaq® Green Master

Mix (Promega, Mỹ), 10 pmol primer mỗi loại, nước cất khử trùng được bổ sung

đến thể tích cuối cùng là 12 µL. Khuếch đại PCR được thực hiện trong máy

luân nhiệt Veriti 96 Well Thermal Cycler (ABI, Mỹ) theo chu trình: 95ºC/2

phút; 20-30 chu kỳ: 95ºC/30 giây, 50-55ºC/30 giây và 72ºC/30 giây; cuối cùng

là 72ºC/10 phút. 3 µL sản phẩm PCR được sử dụng để điện di trên gel agarose

1% (w/v) và xác định cường độ của các băng DNA bằng chương trình ImageJ

thông qua đo mật độ các điểm ảnh (ver. k1.45).

2.2.3.3. Phân tích HPLC

Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của Paramapojn và

Gritsanapan (2009) [114]. Tế bào hoặc củ nghệ đen 10 tháng tuổi được sấy khô

ơ 50°C đến khối lượng không đổi sau đó nghiền thành bột mịn. Hòa 2 g bột

mịn trong 20 mL ethanol 70%. Hỗn hợp được xử lý bằng sóng siêu âm trên

máy T 700/H (Elma, Đức) trong 30 phút ơ 30oC. Dịch chiết được lọc bằng giấy

Whatman (No. 1), bã được chiết lại với cùng dung môi cho tới khi hết hoàn

toàn (dịch chiết cuối cùng là không màu). Dịch chiết nhiều lần được trộn lại và

cô ơ 70oC bằng máy cô quay chân không (Heidolph, Đức). Mẫu sau khi cô được

hòa tan trơ lại với ethanol 70% đến 10 mL, lọc bằng màng Millipore 0,25 μm

(Sartorius, Đức) và pha loãng dịch chiết 2 lần, 10 μL dịch chiết được sử dụng

để chạy HPLC.

Điều kiện HPLC: cột Hypersil™ MOS C8 LC Column (5 µm, 4,6×150

mm), tốc độ chạy 1 mL/phút, thời gian chạy 15-30 phút, pha tĩnh là silica gel

(pha ngược) và pha động là acetonitrile/acetic acid 2% (35/65, v/v). Dữ liệu

phân tích được thu nhận bằng đầu dò PDA (photodiode array) ơ bước sóng 420

49

nm trên hệ thống Shimazu 20AD (Nhật Bản).

Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích được mua từ các Hãng Sigma

(Mỹ) và Merck (Đức). Curcumin của hãng Sigma được dùng làm chất chuẩn

để xác định hàm lượng curcumin. Hàm lượng curcumin được xác định dựa theo

đường chuẩn được xây dựng từ diện tích peak của các nồng độ curcumin chuẩn

khác nhau trong phân tích HPLC, phương trình đường chuẩn là y = 0,213x,

trong đó y là hàm lượng curcumin, x là diện ticvhs peak, R2 = 0,983.

2.2.4. Xử lý thông kê

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Đối với các thí nghiệm nuôi cấy in vitro mỗi lần lặp ít nhất 10 mẫu.

Đối với các thí nghiệm phân tích (RT-PCR và HPLC) mỗi lần lặp lại 3

mẫu.

Kết quả thí nghiệm được tính trung bình và phân tích ANOVA bằng

Duncan’s test với p<0,05 sử dụng phần mềm SPSS ver 19.0./.

50

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO

Chồi mầm của củ nghệ đen được nuôi cấy để nhân giống cây in vitro. Sau

đó, dùng gốc lá của cây in vitro để tạo callus và thiết lập nuôi cấy tế bào.

3.1.1. Nhân giông cây nghệ đen in vitro

Trước tiên, cây in vitro được nhân giống để tạo nguồn nguyên liệu dùng

cho nuôi cấy callus. Trong các nghiên cứu được công bố trước đây, Loc và cs.

(2005) [79], Stanly và Keng (2007) [146], Shahinozzaman và cs. (2013) [142]

đã nhân giống được cây nghệ đen in vitro. Sau đó, Loc và cs. (2006, 2008 và

2009) cũng đã nuôi cấy thành công tế bào nghệ đen [81], [80], [82]. Theo một

số nghiên cứu, AgNO3 được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng đã có tác dụng

ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, nhờ đó kích thích được quá trình sinh

trương của tế bào [73], [134]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử cải thiện

hiệu suất nuôi cấy bằng cách thăm dò ảnh hương của AgNO3 ơ các nồng độ

khác nhau lên các quá trình sinh trương in vitro của nghệ đen.

3.1.1.1. Tái sinh chồi

Sử dụng chồi in vitro nguyên vẹn. Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả

môi trường được thăm dò đều có khả năng tái sinh chồi (Bảng 3.1). Ở môi

trường đối chứng (ĐC), chồi đỉnh bắt đầu kéo dài từ ngày thứ 3 và sau đó xuất

hiện các chồi mới từ ngày thứ 5. Trên các môi trường có bổ sung AgNO3, chồi

đỉnh bắt đầu kéo dài và hình thành các chồi mới muộn hơn 1 ngày. Tuy nhiên,

các môi trường có bổ sung AgNO3 đều cho tỷ lệ tạo chồi mới cao hơn hoặc

tương đương ĐC. Số lượng chồi tăng dần (4,8-6,4 chồi/mẫu) và chiều cao chồi

khá đồng đều (6,6-7,1 cm, p> 0,05) ơ các nồng độ AgNO3 từ 0,5-1,5 mg/L. Khi

51

tăng AgNO3 lên 2 mg/L, số lượng và chiều cao chồi có xu hướng giảm (5,1

chồi/ 6,2 cm). Trên tất cả môi trường, các chồi mới hình thành có hiện tượng

tạo rễ nhưng không mạnh. Chồi hình thành trên môi trường bổ sung AgNO3 1,5

mg/L có màu xanh đậm hơn ĐC; ơ các môi trường khác chồi có màu xanh

tương đương hoặc nhạt hơn.

Bảng 3.1. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro

nguyên vẹn.

AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi

(%) Sô chồi/mẫu

Chiều cao chồi

(cm)

ĐC 100 5,4ab 6,3ab

0,5 100 5,6ab 7,1a

1,0 100 6,1ab 6,9ab

1,5 100 6,4a 6,6ab

2,0 100 5,1b 6,2b

ĐC: đối chứng không bổ sung AgNO3, chú thích này dùng chung cho các bảng 3.2 và

3.3. Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<

0,05 (Duncan’s test), chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng (ngoại trừ bảng 3.7).

Sử dụng chồi in vitro chẻ đôi. Số liệu ơ bảng 3.2 cho thấy tất cả môi

trường được thăm dò đều có khả năng tái sinh chồi tương tự như thí nghiệm

chồi in vitro nguyên vẹn. Ở môi trường ĐC, chồi mới xuất hiện từ ngày thứ 5,

còn trên các môi trường có AgNO3 chồi mới hình thành sớm hơn 2 ngày. Các

môi trường có bổ sung AgNO3 đều cho tỷ lệ tạo chồi mới cao hơn ĐC. Số lượng

chồi tăng dần (5,9-7,5 chồi/mẫu), nhưng chiều cao của chúng thì sai khác không

nhiều (3,6-3,9 cm) khi AgNO3 được bổ sung từ 0,5-1,5 mg/L. Nếu tăng AgNO3

lên 2 mg/L thì số lượng và chiều cao chồi bắt đầu giảm (6,1 chồi/ 3,4 cm). Hiện

tượng tạo rễ của các chồi mới tái sinh cũng xảy ra ơ tất cả môi trường nhưng

không đáng kể. Các chồi ơ môi trường có 1,5 mg/L AgNO3 có màu xanh đậm

52

hơn ĐC, còn ơ các môi trường khác chồi có màu xanh nhạt hơn. Nhìn chung,

so với chồi nguyên vẹn thì chồi chẻ đôi có hiệu quả tái sinh chồi mới cao

(7,5/6,4 chồi).

Bảng 3.2. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro đã

được chẻ đôi.

AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Sô chồi/mẫu Chiều cao chồi

(cm)

ĐC 100 5,6c 3,4c

0,5 100 5,9bc 3,6bc

1,0 100 6,6b 3,9a

1,5 100 7,5a 3,7b

2,0 100 6,1bc 3,6bc

3.1.1.2. Tạo rễ in vitro

Trong quy trình nhân giống cây in vitro, tạo rễ là giai đoạn quan trọng để

tạo ra cây hoàn chỉnh, việc cải thiện khả năng tạo rễ của cây nghệ đen dựa trên

việc bổ sung AgNO3 vào môi trường sẽ góp phần hoàn chỉnh quy trình nhân

giống cây này. Để nghiên cứu ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của

chồi nghệ đen in vitro, môi trường có bổ sung NAA 2 mg/L kết hợp với AgNO3

từ 0,5-2,5 mg/L đã được sử dụng và kết quả được trình bày ơ bảng 3.3.

Khi kết hợp NAA với AgNO3, tất cả môi trường thăm dò đều có khả năng

tạo rễ. Trên môi trường ĐC rễ xuất hiện muộn ơ ngày thứ 5, còn ơ các môi

trường có AgNO3 rễ hình thành sớm hơn, chỉ sau 3 ngày nuôi cấy và số lượng

cũng nhiều hơn.

53

Bảng 3.3. Ảnh hương của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro.

AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo rễ (%) Sô rễ/chồi Chiều dai rễ

(cm)

ĐC 100 18,3c 0,6c

0,5 100 20,0bc 0,7ab

1,0 100 22,5b 0,7ab

1,5 100 27,0a 0,8a

2,0 100 20,8bc 0,8a

Hình 3.1. Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi trên môi trường chứa NAA 2 mg/L và

AgNO3 1,5 mg/L.

Số lượng rễ tăng từ 20-27 rễ và chiều dài của chúng trong khoảng 0,7-0,8

cm (p> 0,05) ơ môi trường có AgNO3 từ 0,5-1,5 mg/L, khi tăng AgNO3 lên 2-

54

2,5 mg/L rễ giảm số lượng rõ rệt (18,8-20,8 rễ) và tương đương với ĐC (18,3

rễ) nhưng chiều dài không thay đổi đáng kể (0,6-0,8 cm và ĐC là 0,6 cm). Nhìn

chung, môi trường có bổ sung AgNO3, ngoài tác dụng tạo rễ còn có thể hình

thành một vài chồi con.

3.1.2. Nuôi cấy callus

Một số nghiên cứu trước đây cho thấy callus tế bào nghệ đen sinh trương

tốt trên môi trường có bổ sung 2,4-D và BAP, trong đó 2,4-D đóng vai trò chính

(Loc và cs. 2006, 2008 và 2009) [81], [80], [82]. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi thay BAP bằng một chất kích thích sinh trương khác cùng nhóm cytokinine

(KIN), auxin (NAA) hoặc AgNO3 để tiếp tục cải thiện khả năng sinh trương

của callus nghệ đen, đây là các chất đã được nhiều tác giả sử dụng trên nhiều

loài nghệ khác nhau [102], [120], [168].

3.1.2.1. Ảnh hương của 2,4-D và KIN

Kết quả trình bày ơ bảng 3.4 cho thấy 2,4-D và KIN ảnh hương khá rõ rệt

lên sinh trương của callus. Nhìn chung, ơ môi trường có 2,4-D 1 mg/L và KIN

từ 1-1,5 mg/L callus sinh trương mạnh hơn ĐC; đường kính trung bình của

chúng khoảng 1,53-1,56 cm, khối lượng tươi và khối lượng khô tương ứng từ

0,84-0,9 g và 83,15-84,11 mg. Ở các công thức khác, đường kính callus tương

đương ĐC (p<0,05) nhưng khối lượng tươi và khô vẫn cao hơn. Callus ơ môi

trường có 2,4-D 1 mg/L và KIN 1,5 mg/L có màu vàng hơn ĐC, ơ các môi

trường khác callus có màu vàng tương đương hoặc nhạt hơn (Hình 3.2).

55

Bảng 3.4. Ảnh hương của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trương của

callus nghệ đen.

KIN (mg/L) Đường kính (cm) Khôi lượng

Tươi (g) Khô (mg)

ĐC 1,35c 0,68c 61,24c

0,5 1,48abc 0,79b 79,03b

1,0 1,53ab 0,84ab 83,15a

1,5 1,56a 0,90a 84,11a

2,0 1,38bc 0,85ab 80,37b

ĐC: đối chứng là môi trường có 2,4-D 3 mg/L và BA 3 mg/L. Chú thích này dùng

chung cho các bảng 3.5 và 3.6.

3.1.2.2. Ảnh hương của 2,4-D và NAA

Kết quả trình bày ơ bảng 3.5 cho thấy hiệu quả kích thích sinh trương

callus của NAA dường như không bằng KIN. Ở môi trường thích hợp nhất (2,4-

D 1 mg/L và NAA từ 1-1,5 mg/L), đường kính callus khoảng 1,5-1,56 cm ((p>

0,05), khối lượng tươi và khô tương ứng là 0,76-0,79 g và 73,91-80,16 mg. Ở

các môi trường khác sinh trương của callus tương đương ĐC (p> 0,05). Callus

trên môi trường chứa 2,4-D 1 mg/L và NAA 1 mg/L có màu vàng hơi xanh hơn

ĐC, ơ các môi trường khác callus có màu vàng nhạt hơn.

3.1.2.3. Ảnh hương của 2,4-D và AgNO3

Tương tự 2 thí nghiệm trên, kết quả nghiên cứu cho thấy ơ tất cả môi

trường được thăm dò, sinh trương của callus đều tăng so với ĐC. Mặc dù ảnh

hương của các nồng độ AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên đường kính và khối lượng

tươi của mô không khác nhau đáng kể (p> 0,05) nhưng ơ môi trường có AgNO3

1,5 mg/L callus có khối lượng khô cao nhất (62,43 mg) (Bảng 3.6).

Callus trên môi trường được bổ sung AgNO3 1,5 mg/L có màu vàng đậm

56

hơn ĐC, ơ các môi trường khác callus có màu vàng tương đương hoặc nhạt

hơn. Tuy nhiên, dường như AgNO3 không thích hợp bằng KIN hoặc NAA khi

kết hợp với 2,4-D trong nuôi cấy tăng sinh khối callus nghệ đen. Vì thế, chúng

tôi chọn callus sinh trương trên môi trường có 2,4-D 1 mg/L và KIN 1,5 mg/L

để thiết lập nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng.

Bảng 3.5. Ảnh hương của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trương của

callus nghệ đen.

NAA (mg/L) Đường kính (cm) Khôi lượng


ĐC 1,35c 0,65c 60,89c

0,5 1,45abc 0,70abc 64,39c

1,0 1,56a 0,79a 80,16a

1,5 1,50ab 0,76ab 73,91b

2,0 1,44bc 0,69bc 63,23c

Bảng 3.6. Ảnh hương của AgNO3 từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trương của

callus nghệ đen.

AgNO3 (mg/L) Đường kính (cm) Khôi lượng


ĐC 1,28b 0,53c 48,21c

0,5 1,38ab 0,59bc 49,78c

1,0 1,41a 0,65ab 56,87b

1,5 1,45a 0,71a 62,43a

2,0 1,35ab 0,67ab 58,18b

57

Hình 3.2. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trương trên môi trường có 2,4-D 1 mg/L

kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trương trên môi trường có 2,4-D 3

mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B).

3.1.3. Nuôi cấy tế bao nghệ đen

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài

trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học.

Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng

sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những

thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp

khác nhau [5]. Các nghiên cứu cho thấy rằng, nuôi cấy tế bào thực vật có khả

năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó

được chiết từ cây ngoài tự nhiên [83]. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp

sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy. Trong sản xuất curcumin, nuôi cấy

tế bào các loài nghệ là một giải pháp được nhiều tác giả thực hiện.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nuôi cấy tế bào cây nghệ đen trong

A

B

58

môi trường lỏng nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu sản xuất

curcumin sau này. Để xác định thời điểm sinh trương cực đại của tế bào nghệ

đen khi nuôi cấy huyền phù, chúng tôi đã nuôi 3 g callus 2 tuần tuổi trong bình

tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, sinh khối tế bào được thu hoạch

2 ngày/lần để xây dựng đường cong sinh trương, thời gian theo dõi là 18 ngày.

Kết quả trình bày ơ hình 3.3 cho thấy pha thích nghi của tế bào khá ngắn,

tế bào sớm chuyển qua pha tăng trương và tăng sinh liên tục từ 2 đến 14 ngày

nuôi cấy sau đó giảm dần. Sinh khối tươi đạt cực đại là gần 170 g/L, tương

đương với khối lượng khô khoảng 15 g/L (Hình 3.4 và 3.5). Các nghiên cứu

trước đây khối lượng khô chỉ đạt cao nhất khoảng 13,2 g/L trong một điều kiện

tương đương (Tuan và cs. 2011) [156]. Đây là cơ sơ để chúng tôi thiết kế các

thí nghiệm nghiên cứu ảnh hương của elicitor sau này.

Hình 3.3. Đường cong sinh trương của tế bào nghệ đen.

Khối lượng tương

Khối lượng khô

0.00

0.15

0.30

0.45

0.60

0.75

0.90

0.00

1.50

3.00

4.50

6.00

7.50

9.00

2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khối l

ượ

ng

khô (

g/b

ình)

Khối l

ượ

ng

tươ

i (g/b

ình)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Sinh khối tươi

Sinh khối khô

59

Hình 3.4. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung

2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L.

Hình 3.5. Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen.

3.2. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID

3.2.1. Phân lập gen

Kết quả khuếch đại PCR từ DNA tổng số của nghệ đen với các cặp primer

như đã trình bày ơ bảng 2.1 cho thấy sự hiện diện của các băng DNA đặc hiệu

có kích thước phù hợp với tính toán trên điện di đồ. Kích thước đầy đủ của các

A B

60

gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3 được giả định tương ứng khoảng 1,4 kb;

1,25 kb; 1,3 kb và 1,25 kb (Hình 3.6). Có thể nhận thấy 4 gen trên đều có mặt

trong cây nghệ đen và các primer được thiết kế là đặc hiệu cho các gen này.

Các sản phẩm PCR được tinh sạch và tạo dòng trong vector pGEM T-Easy

để giải trình tự nucleotide của chúng. Kết quả chỉ ra các gen DCS, CURS1,

CURS2 và CURS3 của nghệ đen có chiều dài lần lượt là 1382 bp, 1240 bp, 1288

bp và 1265 bp. Các gen này được đặt tên tương ứng là CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 và đã đăng ký trên GenBank với các mã số sau:

MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835.

Để xác định các vùng intron/exon trên các gen CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 có nguồn gốc từ DNA tổng số, chúng tôi đã sử dụng

các phương pháp khác nhau. Trước tiên, so sánh trình tự của các gen này với

vùng mã hóa của các gen tương ứng ơ nghệ vàng đã được công bố trên

GenBank, các vùng không bắt cặp sẽ là vùng 5’ và 3’ không dịch mã cùng với

các intron. Thứ hai, chúng tôi sử dụng công cụ blastx và FGENES để xác định

lại kết quả của phương pháp trên. Bên cạnh đó, các lỗi gặp phải trong khi giải

trình tự các gen có thể ảnh hương đến việc dự đoán intron/exon sẽ được xử lý

để có trình tự chính xác. Kết quả cuối cùng cho thấy các gen CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 chỉ có 1 vùng intron trong khi gen CzDCS có 2 vùng

intron. Vùng intron/exon giả định của 4 gen được minh họa ơ hình 3.7.

Sau khi loại bỏ các intron, 2 gen CzDCS và CzCURS1 có chiều dài đoạn

cDNA là 1170 bp, gen CzCURS2 là 1176 bp và gen CzCURS3 là 1173 bp. Cả

4 gen này đều tương đồng 99% với các gen tương ứng ơ nghệ vàng (Hình 3.8-

3.11). So sánh trình tự amino acid suy diễn của các gen ơ nghệ đen và nghệ

vàng cho thấy CzDCS/DCS có tỷ lệ tương đồng là 387/389, CzCURS1/CURS1

là 387/389, CzCURS2/CURS2 là 387/391 và CzCURS3/CURS3 là 387/390

(Hình 3.12-3.15).

61

Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng

số của nghệ đen. M1 và M2: DNA size marker (100 bp BioRad và 1 kb DNA Ladder

Geneaid), 1: CzDCS, 2: CzCURS1, 3: CzCURS2, 4: CzCURS3.

Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen tổng hợp curcuminoid ơ nghệ

đen. Trong đó, intron (đường thẳng), exon (hình hộp) và vị trí của nó. Số 1 là

nucleotide đầu tiên trong mã mơ đầu. Cấu trúc chung của chuỗi protein mã hóa được

thể hiện bên dưới (màu cam). Vị trí các vùng được xác định bằng công cụ

InterProScan.

http://www.geneaid.com/products/dna-ladders/1-kb-dna-ladder

62

CzDCS 1 ATGGAAGCGAACGGCTACCGCATAACTCACAGCGCCGACGGGCCGGCGACGATCTTGGCC 60

DCS 1 ATGGAAGCGAACGGCTACCGCATAACTCACAGCGCCGACGGGCCGGCGACGATCTTGGCC 60

CzDCS 61 ATCGGCACCGCCAACCCCACCAACGTCGTCGACCAGAACGCTTATCCCGACTTCTATTTC 120

DCS 61 ATCGGCACCGCCAACCCCACCAACGTCGTCGATCAGAACGCTTATCCCGACTTCTATTTC 120

CzDCS 121 CGGGTCACCAACTCCGAGCATCTGCAGGAACTCAAAGCCAAGTTTAGGCGCATCTGTGAG 180

DCS 121 CGGGTCACCAACTCCGAGTATCTGCAGGAACTCAAAGCCAAGTTTAGGCGCATCTGTGAG 180

CzDCS 181 AAAGCGGCGATCAGGAAGAGGCACTTGTACTTGACTGAGGAGATTTTGCGGGAGAATCCT 240

DCS 181 AAAGCGGCCATCAGGAAGAGGCACTTGTACTTGACTGAGGAGATTTTGCGGGAGAATCCT 240

CzDCS 241 AGCTTGCTGGCTCCCATGGCGCCGTCGTTCGACGCGCGGCAGGCGATCGTGGTGGAGGCG 300

DCS 241 AGCTTGCTGGCTCCCATGGCGCCGTCGTTCGACGCGCGGCAGGCGATCGTGGTGGAGGCG 300

CzDCS 301 GTGCCGAAGCTAGCGAAGGAGGCGGCGGAGAAGGCGATCAAGGAGTGGGGTCGCCCCAAA 360

DCS 301 GTGCCGAAGCTGGCGAAGGAGGCGGCGGAGAAGGCGATCAAGGAGTGGGGCCGCCCCAAA 360

CzDCS 361 TCGGACATCACGCACCTCGTCTTCTGCTCCGCGAGCGGAATCGACATGCCCGGCTCCGAC 420

DCS 361 TCGGACATCACGCACCTCGTCTTCTGCTCCGCGAGCGGAATCGACATGCCCGGCTCCGAC 420

CzDCS 421 CTGCAGCTTCTCAAGCTGCTCGGGCTCCCGCCGAGCGTCAATCGCGTCATGCTCTACAAC 480

DCS 421 CTGCAGCTTCTCAAGCTGCTCGGGCTCCCGCCGAGCGTCAATCGCGTCATGCTCTACAAC 480

CzDCS 481 GTCGGGTGCCACGCCGGTGGCACCGCCCTCCGCGTCGCCAAGGACCTCGCGGAGAACAAC 540

DCS 481 GTCGGGTGCCACGCCGGTGGCACCGCCCTCCGCGTCGCCAAGGACCTCGCGGAGAACAAC 540

CzDCS 541 CGCGGCGCGCGGGTGCTCGCCGTCTGCTCCGAGGTCACCGTGCTCTCCTACCGCGGCCCC 600

DCS 541 CGCGGCGCGCGGGTGCTCGCCGTCTGCTCCGAGGTCACCGTGCTCTCCTACCGCGGCCCC 600

CzDCS 601 CACCCCGCCCACATCGAGAGCCTCTTCGTCCAAGCTCTGTTTGGCGACGGCGCTGCCGCG 660

DCS 601 CACCCCGCCCACATCGAGAGCCTCTTCGTCCAAGCTCTGTTTGGCGACGGCGCCGCCGCG 660

CzDCS 661 CTCGTGGTCGGGTCCGACCCCGTCGATGGCGTCGAGCGCCCCATCTTCGAAATCGCCTCG 720

DCS 661 CTCGTGGTCGGGTCCGACCCCGTCGATGGCGTCGAGCGCCCCATCTTCGAAATCGCCTCG 720

CzDCS 721 GCATCCCAAGTGATGCTTCCGGAGAGCGAAGAGGCGGTAGGCGGCCACCTCCGCGAAATT 780

DCS 721 GCATCCCAAGTGATGCTTCCGGAGAGCGCAGAGGCGGTGGGCGGCCACCTCCGCGAAATT 780

CzDCS 781 GGGCTGACCTTCCACCTCAAGAGCCAGCTTCCGTCGATCATCGCGAGCAACATCGAGCAG 840

DCS 781 GGGCTGACCTTCCACCTCAAGAGCCAGCTTCCGTCGATCATCGCGAGCAACATCGAGCAG 840

CzDCS 841 AGCCTGACGACTGCGTGCTCGCCGCTGGGGCTGTCGGACTGGAACCAGCTGTTCTGGGCG 900

DCS 841 AGCCTGACGACTGCGTGCTCGCCGCTGGGGCTGTCGGACTGGAACCAGCTGTTCTGGGCG 900

CzDCS 901 GTTCACCCCGGCGGCCGAGCGATCCTGGACCAGGTGGAGGCGCGGCTCGGACTGGAGAAG 960

DCS 901 GTTCACCCCGGCGGCCGAGCGATCCTGGACCAGGTGGAGGCGCGGCTCGGACTGGAGAAG 960

CzDCS 961 GACCGGCTCGCCGCGACGCGGCACGTACTCAGCGAGTACGGCAACATGCAGAGCGCCACG 1020

DCS 961 GACCGGCTCGCCGCGACGCGGCACGTACTCAGCGAGTACGGCAACATGCAGAGCGCCACG 1020

CzDCS 1021 GTGCTGTTCATCCTGGACGAGATGCGGAACCGCTCGGCTGCGGAGGGCCACGCCACCACC 1080

DCS 1021 GTGCTGTTCATCCTGGACGAGATGCGGAACCGCTCGGCTGCGGAGGGCCACGCCACCACC 1080

CzDCS 1081 GGCGAGGGGCTCGACTGGGGCGTGCTTTTGGGCTTCGGCCCGGGACTCTCCATCGAGACC 1140

DCS 1081 GGCGAGGGGCTCGACTGGGGCGTGCTGTTGGGCTTCGGCCCGGGACTCTCCATCGAGACC 1140

CzDCS 1141 GTCGTCCTCCATAGTTGCAGACTGAACTAG 1170

DCS 1141 GTCGTCCTCCATAGTTGCAGACTGAACTAG 1170

Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS (MF663785) ơ

nghệ đen và DCS ơ nghệ vàng (AB495006.1). Số nu tương đồng: 1161/1170 (99%).

Hộp màu đen chỉ các nu khác nhau và đoạn chỉ thị của gen được đóng khung, chú

thích này dùng chung cho các hình 3.9-3.11.

63

CzCURS1 1 ATGGCCAACCTCCACGCGTTGCGCAGGGAGCAGAGGGCTCAAGGTCCCGCCACCATCATG 60

CURS1 1 ATGGCCAACCTCCACGCGTTGCGCAGGGAGCAGAGGGCTCAAGGTCCTGCCACCATCATG 60

CzCURS1 61 GCCATCGGGACGGCCACCCCCCCCAACCTCTACGAGCAGAGCACCTTCCCGGACTTCTAC 120

CURS1 61 GCCATCGGGACCGCCACCCCTCCCAACCTCTACGAGCAGAGCACCTTCCCGGACTTCTAC 120

CzCURS1 121 TTCCGCGTCACCAACTCCGACGACAAGCAGGAGCTCAAGAAAAAGTTCCGCCGCATTTGC 180

CURS1 121 TTCCGCGTCACCAACTCCGACGACAAGCAGGAGCTCAAGAAAAAGTTCCGCCGCATGTGC 180

CzCURS1 181 GATAAGACGATGGTGAAGAAGCGGTACCTGCACTTGACCGAGGAGATCCTGAAGGAGAGG 240

CURS1 181 GAGAAGACGATGGTGAAGAAGCGGTACCTGCACTTGACCGAGGAGATCCTGAAGGAGAGG 240

CzCURS1 241 CCCAAGCTCTGCTCCTACAAGGAGGCGTCGTTCGACGACCGGCAGGACATCGTGGTGGAG 300

CURS1 241 CCCAAGCTCTGCTCCTACAAGGAGGCGTCGTTCGACGACCGGCAGGACATCGTGGTGGAG 300

CzCURS1 301 GAGATACCGAGATTGGCTAAAGAAGCGGCGGAGAAGGCCATCAAGGAGTGGGGGCGGCCC 360

CURS1 301 GAGATACCGAGATTGGCTAAGGAAGCGGCGGAGAAGGCCATCAAGGAGTGGGGGCGGCCC 360

CzCURS1 361 AAATCGGAGATCACCCACCTGGTCTTCTGTTCCATCAGCGGGATCGACATGCCCGGCGCC 420

CURS1 361 AAATCGGAGATCACCCACCTGGTCTTCTGCTCCATCAGCGGGATCGACATGCCCGGCGCC 420

CzCURS1 421 GACTACCGCCTCGCCACGCTCCTCGGCCTCCCTCTCACCGTCAACCGCCTCATGATCTAC 480

CURS1 421 GACTACCGCCTCGCCACGCTCCTCGGGCTCCCTCTCACCGTCAACCGCCTCATGATCTAC 480

CzCURS1 481 AGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCCGCCATGCTCCGCATCGCCAAGGACCTCGCCGAGAAC 540

CURS1 481 AGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCCGCCATGCTCCGCATCGCCAAGGACCTCGCCGAGAAC 540

CzCURS1 541 AACAGGGGCGCGCGCGTGCTGGTGGTCGCCTGCGAGATCACCGTGCTCAGCTTCCGCGGC 600

CURS1 541 AACAGGGGCGCGCGCGTGCTGGTGGTCGCCTGCGAGATCACCGTGCTCAGCTTCCGCGGC 600

CzCURS1 601 CCGAACGAGGGCGACTTCGAGGCGCTCGCGGGGCAGGCCGGCTTCGGCGACGGCGCGGGG 660

CURS1 601 CCGAACGAGGGCGACTTCGAGGCGCTCGCGGGGCAGGCCGGCTTCGGCGACGGCGCGGGG 660

CzCURS1 661 GCCGTCGTCGTCGGGGCCGACCCGCTGGAAGGAATTGAAAAACCCATCTACGAGATCGCG 720

CURS1 661 GCCGTCGTCGTCGGGGCCGACCCGCTGGAAGGAATTGAAAAACCCATCTACGAGATCGCG 720

CzCURS1 721 GCGGCGATGCAGGAGACGGTGGCGGAGAGCCAGGGGGCGGTGGGCGGCCACCTGCGGGCG 780

CURS1 721 GCGGCGATGCAGGAGACGGTGGCGGAGAGCCAGGGGGCGGTGGGCGGCCACCTGCGGGCC 780

CzCURS1 781 TTCGGCTGGACGTTCTACTTCCTGAACCAGCTGCCGGCGATCATCGCCGACAACCTCGGG 840

CURS1 781 TTCGGCTGGACGTTCTACTTCCTGAACCAGCTGCCGGCGATCATCGCCGACAACCTCGGG 840

CzCURS1 841 AGGAGCCTGGAGCGGGCGTTGGCGCCGCTGGGGGTGACGGAGTGGAACGACGTCTTCTGG 900

CURS1 841 AGGAGCCTGGAGCGGGCGTTGGCGCCGCTGGGGGTGAGGGAGTGGAACGACGTCTTCTGG 900

CzCURS1 901 GTGGCGCACCCGGGCAACTGGGCCATCATGGACGCCATCGAAGCCAAGCTGCAGCTGAGC 960

CURS1 901 GTGGCGCACCCGGGCAACTGGGCCATCATTGACGCCATCGAAGCCAAGCTGCAGCTGAGC 960

CzCURS1 961 CCGGACAAGCTCAGCACCGCCCGCCACGTCTTCACAGAGTACGGCAACATGCAGAGCGCC 1020

CURS1 961 CCGGACAAGCTCAGCACCGCCCGCCACGTCTTCACAGAGTACGGCAACATGCAGAGCGCC 1020

CzCURS1 1021 ACCGTGTACTTCGTGATGGATGAGCTGAGGAAGCGGTCGGCGGTGGAGGGGCGGAGCACC 1080

CURS1 1021 ACCGTGTACTTCGTGATGGATGAGCTGAGGAAGCGGTCGGCGGTGGAGGGGCGGAGCACC 1080

CzCURS1 1081 ACCGGAGACGGCTTGCAGTGGGGAGTTCTCCTCGGTTTTGGGCCGGGCCTCAGCATCGAG 1140

CURS1 1081 ACCGGCGACGGCTTGCAGTGGGGAGTTCTCCTCGGTTTTGGGCCGGGCCTCAGCATCGAG 1140

CzCURS1 1141 ACCGTTGTACTGCGCAGTATGCCACTGTAG 1170

CURS1 1141 ACCGTTGTACTGCGCAGTATGCCACTGTAG 1170

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1 (MF402846)

ơ nghệ đen và CURS1 ơ nghệ vàng (AB495007.1). Số nu tương đồng: 1158/1170

(99%).

64

CzCURS2 1 ATGGCGATGATCAGCTTGCAGGCGATGCGCAAGGCGCAGAGAGCTCAAGGTCCGGCCACC 60

CURS2 1 ATGGCGATGATCAGCTTGCAGGCGATGCGCAAGGCGCAGAGAGCTCAAGGTCCGGCCACC 60

CzCURS2 61 ATCTTGGCCGTCGGCACCGCCAACCCGCCCAATCTCTACGAGCAGGACACGTATCCCGAC 120

CURS2 61 ATCTTGGCCGTCGGCACCGCCAACCCGCCCAATCTCTACGAGCAGGACACGTATCCCGAC 120

CzCURS2 121 TACTACTTCCGCGTCACCAACTCCGAGCACAGGCAGGAGCTCAAGAACAAGTTCCGCCGC 180

CURS2 121 TACTACTTCCGCGTCACCAACTCCGAGCACAAGCAGGAGCTCAAGAACAAGTTCCGCCTC 180

CzCURS2 181 ATGTGCGAGAAGACGATGGTGAAGAGGCGGTATCTTTACCTGACGCCGGAGATCCTGAAG 240

CURS2 181 ATGTGCGAGAAGACGATGGTGAAGAGGCGGTATCTTTACCTGACGCCGGAGATCCTGAAG 240

CzCURS2 241 GAGCGGCCGAAGCTGTGCTCGTACATGGAGCCGTCGTTCGACGACCGGCAGGACATCGTG 300

CURS2 241 GAGCGGCCGAAGCTGTGCTCGTACATGGAGCCGTCGTTCGACGACCGGCAGGACATCGTG 300

CzCURS2 301 GTGGAGGAGGTGCCGAAGCTGGCCGCGGAGGCAGCGGAGAAGGCCATCAAGGAGTGGGGC 360

CURS2 301 GTGGAGGAGGTGCCGAAGCTGGCCGCGGAGGCAGCGGAGAACGCCATCAAGGAGTGGGGC 360

CzCURS2 361 GGCGAGAAGTCGGCCATCACCCACCTGGTCTTCTGCTCCATCAGCGGCATCGACATGCCC 420

CURS2 361 GGCGACAAGTCCGCCATCACCCACCTGGTCTTCTGCTCCATCAGCGGCATCGACATGCCC 420

CzCURS2 421 GGAGCTGACTACCGCCTCGCCAAGCTCCTCGGGCTCCCGCTCGCCGTCAACCGCCTGATG 480

CURS2 421 GGAGCTGACTACCGCCTCGCCCAGCTCCTCGGACTCCCGCTCGCCGTCAACCGCCTGATG 480

CzCURS2 481 CTCTACAGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCCGCCATGCTGCGCATAGCCAAGGACATCGCC 540

CURS2 481 CTCTACAGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCCGCCATGCTGCGCATAGCCAAGGACATCGCC 540

CzCURS2 541 GAGAACAACCGCTCCGCTCGCGTCCTCGTCGTCGCCTGCGAGATCACCGTGCTCAGCTTC 600

CURS2 541 GAGAACAACCGCTCCGCGCGCGTCCTCGTCGTCGCCTGCGAGATCACCGTGCTCAGCTTC 600

CzCURS2 601 CGCGGCCCGGACGAGCGCGACTTCCAGGCGCTGGCCGGCCAGGCCGGCTTCGGGGACGGC 660

CURS2 601 CGCGGCCCGGACGAGCGCGACTTCCAGGCGCTGGCCGGCCAGGCCGGCTTCGGGGACGGC 660

CzCURS2 661 GCCGGCGCGATGATCGTCGGGGCCGACCCCGTCCTCGGCGTCGAGCGGCCGCTCTACCAC 720

CURS2 661 GCCGGCGCGATGATCGTCGGGGCCGACCCCGTCCTCGGCGTCGAGCGGCCGCTCTACCAC 720

CzCURS2 721 ATCATGTCGGCGACTCAGACGACGGTGCCGGAGAGCGAGAAGGCGGTGGGGGGCCACCTC 780

CURS2 721 ATCATGTCGGCGACTCAGACGACGGTACCGGAGAGCGAGAAGGCGGTGGGGGGCCACCTC 780

CzCURS2 781 CGCGAGGTGGGGCTGACCTTCCACTTCTTCAACCAGCTGCCGGCGATCATCGCCGACAAC 840

CURS2 781 CGCGAGGTGGGGCTGACCTTCCACTTCTTCAACCAGCTGCCGGCGATCATCGCCGACAAC 840

CzCURS2 841 GTGGGGAACAGCCTGGCGGAGGCGTTCGAACCGATCGGGATCAAGGACTGGAACAACATC 900

CURS2 841 GTGGGGAACAGCCTGGCGGAGGCGTTCGAACCGATCGGGATCAAGGACTGGAACAACATC 900

CzCURS2 901 TTCTGGGTGGCGCACCCGGGCAACTGGGCCATCATGGACGCCATCGAGACCAAGCTGGGC 960

CURS2 901 TTCTGGGTGGCGCACCCGGGCAACTGGGCCATCATGGACGCCATCGAGACCAAGCTGGGC 960

CzCURS2 961 CTGGAACAGAGCAAGCTGGCCACCGCACGCCACGTCTTCTCCGAGTTCGGCAACATGCAG 1020

CURS2 961 CTGGAACAGAGCAAGCTGGCCACCGCACGCCACGTCTTCTCCGAGTTCGGCAACATGCAG 1020

CzCURS2 1021 AGCGCCACCGTCTACTTCGTGATGGACGAGCTCAGGAAACGGTCGGCGGCGGAGAACCGG 1080

CURS2 1021 AGCGCCACCGTCTACTTCGTGATGGACGAGCTCAGGAAACGGTCGGCGGCGGAGAACCGG 1080

CzCURS2 1081 GCGACCACCGGCGACGGGCTCCGGTGGGGCGTGCTCTTCGGCTTCGGCCCCGGCATCAGC 1140

CURS2 1081 GCGACCACCGGCGACGGGCTCCGGTGGGGCGTGCTCTTCGGCTTCGGCCCGGGCATCAGC 1140

CzCURS2 1141 ATCGAAACCGTCGTGCTCCAAAGCGTGCCGCTTTAG 1176

CURS2 1141 ATCGAAACCGTCGTGCTCCAAAGCGTGCCGCTTTAG 1176


(MF402846) ơ nghệ đen và CURS2 ơ nghệ vàng (AB506762.1). Số nu tương đồng:

1166/1176 (99%).

65

CzCURS3 1 ATGGGCAGCCTGCAGGCGATTCGCAGAGCACAGCGGGCTCAAGGCCCGGCCACCATCATG 60

CURS3 1 ATGGGCAGCCTGCAGGCGATGCGCAGGGCACAGCGGGCTCAAGGCCCGGCCACCATCATG 60

CzCURS3 61 GCTGTCGGCACCTCCAACCCGCCTAACCTCTACGAGCAGACCTCCTACCCCGACTTCTAT 120

CURS3 61 GCTGTCGGCACCTCCAACCCGCCTAACCTCTACGAGCAGACCTCCTACCCCGACTTCTAT 120

CzCURS3 121 TTCCGCGTCACCAACTCCGACCACAAGCACGAGCTCAAGAACAAATTCCGTGTTATCTGT 180

CURS3 121 TTCCGCGTCACCAACTCCGACCACAAGCACGCGCTCAAGAACAAATTCCGTGTTATCTGT 180

CzCURS3 181 GAGAAGACGAAGGTGAAAAGACGGTACTTGCACTTGACGGAGGAGATCCTGAAGCAGAGG 240

CURS3 181 GAGAAGACGAAGGTGAAAAGACGGTACTTGCACTTGACGGAGGAGATCCTGAAGCAGAGG 240

CzCURS3 241 CCCAAGCTCTGCTCCTACATGGAGCCCTCCTTCGACGACCGGCAGGACATCGTGGTGGAG 300

CURS3 241 CCCAAGCTCTGCTCCTACATGGAGCCCTCCTTCGACGATCGGCAGGACATCGTGGTGGAG 300

CzCURS3 301 GAGATACCGAAGCTGGCGAAGGAGGCGGCGGAAAAGGCGATCAAGGAATGGGGCCGCCCC 360

CURS3 301 GAGATACCAAAGCTGGCGAAGGAGGCGGCGGAGAAGGCGATCAAGGAGTGGGGCCGCCCC 360

CzCURS3 361 AAGTCGGAGATCACCCACTTGGTGTTCTGCTCCATCAGCGGYATCGACATGCCCGGCGCC 420

CURS3 361 AAGTCGGAGATCACCCACTTGGTGTTCTGCTCCATCAGCGGTATCGACATGCCCGGCGCC 420

CzCURS3 421 GATTACCGCCTCGCCACGCTCCTCGGCCTCCCCCTGTCCGTCAACCGCCTCATGCTCTAC 480

CURS3 421 GATTACCGCCTCGCCACCCTCCTCGGCCTCCCCCTGTCCGTCAACCGCCTCATGCTCTAC 480

CzCURS3 481 AGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCGCAGATGCTGCGCATAGCCAAGGACCTCGCGGAGAAC 540

CURS3 481 AGCCAGGCCTGCCACATGGGCGCGCAGATGCTGCGCATAGCCAAGGACCTCGCGGAGAAC 540

CzCURS3 541 AACCGGGGCGCGCGCGTCCTGGCCGTCTCCTGCGAAATCACCGTGTTCAGCTTCCGCGGT 600

CURS3 541 AACCGGGGCGCGCGCGTCCTGGCCGTCTCCTGCGAAATCACCGTGCTCAGCTTCCGCGGT 600

CzCURS3 601 CCCGACGCGGGCGACTTCGAGGCCCTCGCGTGTCAGGCCGGCTTCGGCGACGGTGCCGCT 660

CURS3 601 CCGGACGCGGGCGACTTCGAGGCCCTCGCGTGTCAGGCCGGCTTCGGCGACGGTGCCGCT 660

CzCURS3 661 GCCGTCGTCGTCGGGGCCGACCCCCTCCCGGGCGTCGAGAGGCCCATCTACGAGATCGCG 720

CURS3 661 GCCGTCGTCGTCGGGGCCGACCCCCTCCCGGGCGTCGAGAGGCCCATCTACGAGATCGCG 720

CzCURS3 721 GCGGCGATGCAGGAAACGGTGCCGGAGAGCGAGAGGGCGGTGGGGGGCCACCTGAGGGAA 780

CURS3 721 GCGGCGATGCAGGAAACGGTGCCGGAGAGCGAGAGGGCGGTGGGGGGCCACCTGAGGGAA 780

CzCURS3 781 ATCGGCTGGACCTTCCACTTCTTCAACCAGCTGCCGAAGCTGATCGCGGAAAACATCGAG 840

CURS3 781 ATCGGCTGGACCTTCCACTTCTTCAACCAGCTTCCGAAGCTGATCGCGGAAAACATCGAG 840

CzCURS3 841 GGCAGCCTGGCGCGGGCGTTCAAGCCGCTGGGGATCAGCGAGTGGAACGACGTGTTCTGG 900

CURS3 841 GGCAGCCTGGCGCGGGCGTTCAAGCCGCTGGGGATCAGCGAGTGGAACGACGTGTTCTGG 900

CzCURS3 901 GTGGCGCACCCGGGGAATTGGGGCATCATGGACGCCATCGAGACCAAGCTGGGGCTGGAA 960

CURS3 901 GTGGCGCACCCGGGGAACTGGGGCATCATGGACGCCATCGAGACCAAGCTGGGGCTGGAA 960

CzCURS3 961 CAGGGGAAGCTCGCCACGGCGCGCCACGTCTTCAGCGAGTACGGAAACATGCAGAGCGCC 1020

CURS3 961 CAGGGGAAGCTCGCCACGGCGCGCCACGTCTTCAGCGAGTACGGAAACATGCAGAGCGCC 1020

CzCURS3 1021 ACCGTGTACTTCGTGATGGACGAGGTGAGGAAGCGGTCGGCGGCGGAGGGGCGGGCCACC 1080

CURS3 1021 ACCGTGTACTTCGTGATGGACGAGGTGAGGAAGCGGTCGGCGGCGGAGGGGCGGGCCACC 1080

CzCURS3 1081 ACCGGCGAAGGCCTGGAGTGGGGAGTGCTGTTTGGGTTTGGCCCAGGCCTCACCATAGAA 1140

CURS3 1081 ACCGGCGAAGGCCTGGAGTGGGGAGTGCTGTTTGGGTTTGGCCCAGGCCTCACCATAGAA 1140

CzCURS3 1141 ACTGTCGTGCTACGCAGTGTACCATTACCGTAG 1173

CURS3 1141 ACTGTCGTGCTACGCAGTGTACCATTACCGTAG 1173

Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3 (NCBI:

MF987835) ơ nghệ đen và CURS3 ơ nghệ vàng (NCBI: AB506763.1). Số nu tương

đồng: 1160/1173 (99%).

66

CzDCS 1 MEANGYRITHSADGPATILAIGTANPTNVVDQNAYPDFYFRVTNSEHLQELKAKFRRICE 60

DCS 1 MEANGYRITHSADGPATILAIGTANPTNVVDQNAYPDFYFRVTNSEYLQELKAKFRRICE 60

CzDCS 61 KAAIRKRHLYLTEEILRENPSLLAPMAPSFDARQAIVVEAVPKLAKEAAEKAIKEWGRPK 120

DCS 61 KAAIRKRHLYLTEEILRENPSLLAPMAPSFDARQAIVVEAVPKLAKEAAEKAIKEWGRPK 120

CzDCS 121 SDITHLVFCSASGIDMPGSDLQLLKLLGLPPSVNRVMLYNVGCHAGGTALRVAKDLAENN 180

DCS 121 SDITHLVFCSASGIDMPGSDLQLLKLLGLPPSVNRVMLYNVGCHAGGTALRVAKDLAENN 180

CzDCS 181 RGARVLAVCSEVTVLSYRGPHPAHIESLFVQALFGDGAAALVVGSDPVDGVERPIFEIAS 240

DCS 181 RGARVLAVCSEVTVLSYRGPHPAHIESLFVQALFGDGAAALVVGSDPVDGVERPIFEIAS 240

CzDCS 241 ASQVMLPESEEAVGGHLREIGLTFHLKSQLPSIIASNIEQSLTTACSPLGLSDWNQLFWA 300

DCS 241 ASQVMLPESAEAVGGHLREIGLTFHLKSQLPSIIASNIEQSLTTACSPLGLSDWNQLFWA 300

CzDCS 301 VHPGGRAILDQVEARLGLEKDRLAATRHVLSEYGNMQSATVLFILDEMRNRSAAEGHATT 360

DCS 301 VHPGGRAILDQVEARLGLEKDRLAATRHVLSEYGNMQSATVLFILDEMRNRSAAEGHATT 360

CzDCS 361 GEGLDWGVLLGFGPGLSIETVVLHSCRLN 389

DCS 361 GEGLDWGVLLGFGPGLSIETVVLHSCRLN 389

Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS

(C0SVZ5.1). Hộp màu đen chỉ các amino acid khác nhau, chú thích này dùng chung

cho các hình 3.13-3.15.

CzCURS1 1 MANLHALRREQRAQGPATIMAIGTATPPNLYEQSTFPDFYFRVTNSDDKQELKKKFRRMC 60

CURS1 1 MANLHALRREQRAQGPATIMAIGTATPPNLYEQSTFPDFYFRVTNSDDKQELKKKFRRMC 60

CzCURS1 61 DKTMVKKRYLHLTEEILKERPKLCSYKEASFDDRQDIVVEEIPRLAKEAAEKAIKEWGRP 120

CURS1 61 EKTMVKKRYLHLTEEILKERPKLCSYKEASFDDRQDIVVEEIPRLAKEAAEKAIKEWGRP 120

CzCURS1 121 KSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLTVNRLMIYSQACHMGAAMLRIAKDLAEN 180

CURS1 121 KSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLTVNRLMIYSQACHMGAAMLRIAKDLAEN 180

CzCURS1 181 NRGARVLVVACEITVLSFRGPNEGDFEALAGQAGFGDGAGAVVVGADPLEGIEKPIYEIA 240

CURS1 181 NRGARVLVVACEITVLSFRGPNEGDFEALAGQAGFGDGAGAVVVGADPLEGIEKPIYEIA 240

CzCURS1 241 AAMQETVAESQGAVGGHLRAFGWTFYFLNQLPAIIADNLGRSLERALAPLGVTEWNDVFW 300

CURS1 241 AAMQETVAESQGAVGGHLRAFGWTFYFLNQLPAIIADNLGRSLERALAPLGVREWNDVFW 300

CzCURS1 301 VAHPGNWAIMDAIEAKLQLSPDKLSTARHVFTEYGNMQSATVYFVMDELRKRSAVEGRST 360

CURS1 301 VAHPGNWAIMDAIEAKLQLSPDKLSTARHVFTEYGNMQSATVYFVMDELRKRSAVEGRST 360

CzCURS1 361 TGDGLQWGVLLGFGPGLSIETVVLRSMPL 389

CURS1 361 TGDGLQWGVLLGFGPGLSIETVVLRSMPL 389


(AJF45913.1).

67

CzCURS2 1 MAMISLQAMRKAQRAQGPATILAVGTANPPNLYEQDTYPDYYFRVTNSEHRQELKNKFRR 60

CURS2 1 MAMISLQAMRKAQRAQGPATILAVGTANPPNLYEQDTYPDYYFRVTNSEHKQELKNKFRR 60

CzCURS2 61 MCEKTMVKRRYLYLTPEILKERPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEVPKLAAEAAEKAIKEWG 120

CURS2 61 MCEKTMVKRRYLYLTPEILKERPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEVPKLAAEAAEKAIKEWG 120

CzCURS2 121 GEKSAITHLVFCSISGIDMPGADYRLAKLLGLPLAVNRLMLYSQACHMGAAMLRIAKDIA 180

CURS2 121 GDKSAITHLVFCSISGIDMPGADYRLAKLLGLPLAVNHLMLYSQACHMGAAMLRIAKDIA 180

CzCURS2 181 ENNRSARVLVVACEITVLSFRGPDERDFQALAGQAGFGDGAGAMIVGADPVLGVERPLYH 240

CURS2 181 ENNRSARVLVVACEITVLSFRGPDERDFQALAGQAGFGDGAGAMIAGADPVLGVERPLYH 240

CzCURS2 241 IMSATQTTVPESEKAVGGHLREVGLTFHFFNQLPAIIADNVGNSLAEAFEPIGIKDWNNI 300

CURS2 241 IMSATQTTVPESEKAVGGHLREVGLTFHFFNQLPAIIADNVGNSLAEAFEPIGIKDWNNI 300

CzCURS2 301 FWVAHPGNWAIMDAIETKLGLEQSKLATARHVFSEFGNMQSATVYFVMDELRKRSAAENR 360

CURS2 301 FWVAHPGNWAIMDAIETKLGLEQSKLATARHVFSEFGNMQSATVYFVMDELRKRSAAENR 360

CzCURS2 361 ATTGDGLRWGVLFGFGPGISIETVVLQSVPL 391

CURS2 361 ATTGDGLRWGVLFGFGPGISIETVVLQSVPL 391


(BAW81545.1).

CzCURS3 1 MGSLQAIRRAQRAQGPATIMAVGTSNPPNLYEQTSYPDFYFRVTNSDHKHELKNKFRVIC 60

CURS3 1 MGSLQAMRRAQRAQGPATIMAVGTSNPPNLYEQTSYPDFYFRVTNSDHKHELKNKFRVIC 60

CzCURS3 61 EKTKVKRRYLHLTEEILKQRPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEIPKLAKEAAEKAIKEWGRP 120

CURS3 61 EKTKVKRRYLHLTEEILKQRPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEIPKLAKEAAEKAIKEWGRP 120

CzCURS3 121 KSEITHLVFCSISXIDMPGADYRLATLLGLPLSVNRLMLYSQACHMGAQMLRIAKDLAEN 180

CURS3 121 KSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLSVNRLMLYSQACHMGAQMLRIAKDLAEN 180

CzCURS3 181 NRGARVLAVSCEITVFSFRGPDAGDFEALACQAGFGDGAAAVVVGADPLPGVERPIYEIA 240

CURS3 181 NRGARVLAVSCEITVLSFRGPDAGDFEALACQAGFGDGAAAVVVGADPLPGVERPIYEIA 240

CzCURS3 241 AAMQETVPESERAVGGHLREIGWTFHFFNQLPKLIAENIEGSLARAFKPLGISEWNDVFW 300

CURS3 241 AAMQETVPESERAVGGHLREIGWTFHFFNQLPKLIAENIEGSLARAFKPLGISEWNDVFW 300

CzCURS3 301 VAHPGNWGIMDAIETKLGLEQGKLATARHVFSEYGNMQSATVYFVMDEVRKRSAAEGRAT 360

CURS3 301 VAHPGNWGIMDAIETKLGLEQGKLATARHVFSEYGNMQSATVYFVMDEVRKRSAAEGRAT 360

CzCURS3 361 TGEGLEWGVLFGFGPGLTIETVVLRSVPLP 390

CURS3 361 TGEGLEWGVLFGFGPGLTIETVVLRSVPLP 390


(AJF45914.1).

Do có sự tương đồng cao giữa các gen tổng hợp curcuminoid của nghệ

đen và nghệ vàng, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ cho các gen này. Vùng

CDS của các gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3 từ nghệ đen và nghệ vàng,

gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase từ M. accuminata và gen mã

68

hóa enzyme polyketide synthase từ nấm A. alternate (nhóm ngoại) cũng được

sử dụng. Việc xây dựng cây phả hệ được thực hiện bằng phần mềm MEGA7

theo phương pháp Maximum Likelihood, độ lặp lại (bootstrap) là 2.000 lần.

Kết quả trình bày ơ hình 3.16 cho thấy nhóm gen nghiên cứu có giá trị bootstrap

rất cao, thể hiện đặc tính cùng nguồn gốc và chức năng (orthologs and paralogs)

của các gen này giữa 2 loài nghệ. Trên cây phả hệ, nhóm các gen CURS tạo

thành 1 nhóm với độ tương đồng rất cao, mức độ sai khác giữa các gen chỉ từ

0,1-0,2. Các gen DCS cũng có độ tương đồng khá cao và tạo thành một nhóm

trên cây phả hệ. Kết quả so sánh với gen PKS type III từ cây chuối (nhóm nội)

cũng cho thấy có sự tương đồng cao với 2 nhóm gen trên, sự khác biệt giữa các

gen này chưa tới 0,5. Trong khi đó, so sánh với gen PKS của nấm A. alternate

(nhóm ngoại) cho thấy chúng có sự khác biệt lớn hơn, mức độ sai khác là

khoảng 1,5, thể hiện nguồn gốc khác nhau của chúng. Kết quả so sánh này cho

thấy dù là các gen có cùng tính năng, nhưng sự sai khác thể hiện rất rõ ơ các

loài có họ hàng xa nhau, trong khi các loài gần nhau thì sự tương đồng rất cao.

Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen tổng hợp curcuminoid.

3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid

69

Để nghiên cứu sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid trong 2 cấu

trúc khác nhau của nghệ đen (củ và callus), chúng tôi sử dụng phương pháp

RT-PCR sau đó xác định độ sáng của băng DNA trên hình ảnh điện di (PCR

định tính: non-quantitative RT-PCR). Do các primer được thiết kế để khuếch

đại các gen hoàn chỉnh (full-length) từ genome không cho kết quả tốt nhất trong

trường hợp này, chúng tôi đã thiết kế primer để khuếch đại các đoạn DNA ngắn

hơn (vùng đặc hiệu cho gen) (Hình 3.8-3.11). Các primer được thiết kế dựa trên

trình tự nucleotide của vùng có sự tương đồng thấp giữa các gen để đảm bảo

tính đặc hiệu và dễ dàng phân tích kết quả.

Phân tích dữ liệu RT-PCR của 4 gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và

CzCURS3 ơ củ và callus cho thấy tất cả chúng đều có sản phẩm khuếch đại,

chứng tỏ các gen này đều biểu hiện ơ cả 2 loại mô nói trên (Hình 3.17). Kết quả

này còn minh chứng cho nhận định cơ chế sinh tổng hợp curcuminoid của nghệ

đen cũng xuất hiện trong quá trình nuôi cấy in vitro, và callus là nguyên liệu

thích hợp để phát triển hệ thống nuôi cấy tế bào nhằm mục đích sản xuất

curcumin. Hình ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR tương ứng với các gen

CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 có kích thước lần lượt khoảng 272

bp, 286 bp, 211 bp và 202 bp phù hợp với tính toán (Bảng 2.2 và Hình 3.8-

3.11). Xem xét mức độ biểu hiện của các gen này trong 2 loại mô khác nhau,

chúng tôi nhận thấy mức độ biểu hiện của các gen trong củ đều cao hơn trong

callus, ngoại trừ gen CURS1.

Để củng cố nhận định trên, chúng tôi đã phân tích hàm lượng curcumin,

một thành phần chính của nhóm curcuminoid, ơ các mẫu trên bằng HPLC. Kết

quả cho thấy cả hai dịch chiết từ củ và callus đều có chứa peak curcumin với

thời gian lưu tương tự như curcumin chuẩn (Hình 3.18-3.20). Tuy nhiên, diện

tích và số lượng peak xuất hiện trong các hình 3.19 và 3.20 cho thấy đã có sự

chuyển hóa sinh học diễn ra trong quá trình nuôi cấy callus phù hợp với nhận

định ơ những nghiên cứu đã công bố trước đây [82], [132]. Curcumin được tìm

70

thấy trong callus có thể liên quan đến sự biểu hiện của các gen tổng hợp

curcuminoid ơ nghệ đen như trong phân tích RT-PCR (Hình 3.17). Nhận định

này sẽ được củng cố thêm ơ phần sau (mục 3.3).

Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. M: DNA size

marker (1 kb), 1-3-5-7: củ, 2-4-6-8: callus, A: CzDCS, B: CzCURS1, C: CzCURS2,

và D: CzCURS3.

Bảng 3.7. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS,

CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen

Gen Mẫu Đường

chạy

Mật độ Tỷ lệ giữa củ/callus

CzDCS Củ 1 4061,3 1,8

Callus 2 2231,9

CzCURS1 Củ 3 2288,1 0,6

Callus 4 3946,7

CzCURS2 Củ 5 5018,3 1,9

Callus 6 2641,9

CzCURS3 Củ 7 4684,5 1,4

Callus 8 3281,8

71

Hình 3.18. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. Điều kiện HPLC: cột Hypersil™ MOS

C8 LC Column (5 µm, 4,6×150 mm), tốc độ chạy 1 mL/phút, thời gian chạy 30 phút,

pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là acetonitrile/acetic acid 2% (35/65,

v/v). Điều kiện HPLC ơ hình 3.19 và 3.20 là tương tự.

Hình 3.19. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen.

72

Hình 3.20. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen.

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH

TỔNG HỢP CURCUMINOID

3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng

hợp curcuminoid

Trong các gen CURS tham gia vào con đường sinh tổng hợp curcuminoid,

gen CURS1 đóng vai trò chính trong quá trình sinh tổng hợp curcumin trong

khi gen CURS3 có vai trò lớn hơn trong quá trình tổng hợp

bisdemethoxycurcumin (Hình 1.3). Vì vậy, để giảm bớt số mẫu cần phân tích,

chúng tôi đã phân tích sơ bộ mức độ biểu hiện của 2 gen này khi được xử lý

các loại elicitor khác nhau với các nồng độ khác nhau. Tế bào nghệ đen 10 ngày

tuổi ơ vào thời điểm gần kết thúc pha sinh trương (pha logarithm) (Hình 3.3)

được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường mới có thành phần tương tự nhưng

có bổ sung các elicitor khác nhau (SA, MeJA và YE) với các nồng độ khác

nhau, sau đó thu hoạch sinh khối vào ngày thứ 14 (kết thúc pha sinh trương) để

đánh giá mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và hàm lượng

curcumin đã được tích lũy.

Kết quả phân tích RT-PCR cho thấy phần lớn các công thức xử lý elicitor

mức độ biểu hiện của 2 gen CURS1 và CURS3 đều có thay đổi so với đối chứng

không xử lý. Khi xử lý MeJA (25-150 mM), mức độ biểu hiện của gen CURS1

73

gần như không thay đổi so với đối chứng (Hình 3.22A) trong khi CURS3 có

chiều hướng tăng lên, tuy nhiên mức độ tăng lên không nhiều (Hình 3.22B).

Khi xử lý salicilic acid (50-150 mM), mức độ biểu hiện của 2 gen này đều tăng

so với đối chứng, trong đó gen CURS1 tăng mạnh nhất khi xử lý ơ nồng độ 100

mM trong khi gen CURS3 mạnh nhất ơ nồng độ 150 mM. Trong khi đó, khi xử

lý bằng dịch chiết nấm men, mức độ biểu hiện của các gen chỉ tăng ơ nồng độ

0,7-1,0 g/L, các công thức xử lý còn lại các gen đều có mức độ biểu hiện thấp

hơn so với đối chứng.

Từ các kết quả sơ bộ, chúng tôi nhận thấy MeJA ít có ảnh hương lên sự

biểu hiện của các gen CURS, trong khi đó salicilic acid và dịch chiết nấm men

có ảnh hương lớn đến mức độ biểu hiện của các gen này. Xét trên vai trò của

các gen, chúng tôi nhận thấy CURS1 có vai trò lớn hơn các gen khác trong quá

trình sinh tổng hợp curcuminoid, vì vậy chúng tôi lựa chọn các công thức xử lý

cho mức độ biểu hiện của gen CURS1 cao nhất. Các nồng độ xử lý elicitor được

lựa chọn là salicilic acid 100 mM và dịch chiết nấm men 1 g/L, các công thức

xử lý này sẽ được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của tất cả các gen ơ

các thời điểm xử lý khác nhau về sau.

Hình 3.21. RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor. M: DNA

size marker (1 kb), MeJA. Methyl jasmonate, SA. Salicilic acid, YE. Dịch chiết nấm

men. ĐC. Tế bào không xử lý elicitor.

-------MeJA-------- ------------SA------------- ----------YE---------------

M ĐC 25 50 100 150 50 70 100 150 0,1 0,5 0,7 1,0 M

74

Hình 3.22. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và CzCURS3

(B) sau khi được xử lý elicitor. M: DNA size marker (1 kb), MeJA. Methyl jasmonate,

SA. Salicilic acid, YE. Dịch chiết nấm men. ĐC. Tế bào không xử lý elicitor. PC. Đối

chứng dương tính (gen CzCURS1 và CzCURS3)

3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid

Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trương cho thấy tế bào nghệ đen đạt

sinh trương cực đại sau 14 ngày nuôi cấy, vì vậy, các thời điểm được chúng tôi

lựa chọn để bổ sung elicitor vào môi trường là lúc bắt đầu nuôi cấy và thời điểm

5 ngày, là thời điểm tế bào bào đầu sinh trương mạnh ơ đầu pha sinh trương

(pha log). Trong nghiên cứu này, YE 1 g/L và SA 100 µM và MeJA được bổ

sung vào môi trường tại 2 thời điểm trên. Kết quả phân tích hình ảnh điện di

các sản phẩm RT-PCR cho thấy sự biểu hiện của các gen ơ tế bào nghệ đen đã

được xử lý elicitor mạnh hơn đối chứng là tế bào không xử lý (Hình 3.23). Mức

độ biểu hiện của các gen này được đánh giá thông qua độ sáng của các băng

DNA đã cho thấy các tế bào có xử lý cao hơn khoảng 1,14-3,64 lần so với

không xử lý (Bảng 3.8).

-------MeJA-------- ------------SA------------- ----------YE---------------

M ĐC 25 50 100 150 50 70 100 150 0,1 0,5 0,7 1,0 1,5 PC

A

B

75

Nhìn chung, YE có tác dụng kích thích tốt hơn so với SA, mật độ tổng số

của các băng DNA đạt 71.528 so với 31.625 (hơn khoảng 2,3 lần). Số liệu ơ

bảng 3.8 còn cho thấy SA được bổ sung vào ngày thứ 5 đã tăng khả năng biểu

hiện của tất cả các gen so với việc bổ sung vào thời điểm ban đầu. Trong khi

đó, xử lý YE cho kết quả khác, các gen CzCURS1 và CzCURS3 biểu hiện mạnh

khi xử lý ơ thời điểm ban đầu, trong khi các gen CzDCS và CzCURS2 thì ngược

lại, biểu hiện mạnh khi xử lý ơ thời điểm 5 ngày. Xử lý YE ơ thời điểm ban đầu

của nuôi cấy thu được mật độ tổng số của cả 4 gen cao hơn khoảng 1,3 lần so

với khi bổ sung vào ngày thứ 5.

Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen tổng hợp curcuminoid ơ

nghệ đen. A: CzDCS, B-D: CzCURS1-3, E: RNA tổng số. 1: đối chứng (tế bào không

xử lý elicitor), 2 và 4: tế bào được xử lý SA và YE tại thời điểm ban đầu. 3 và 5: tế

bào được xử lý SA và YE vào ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy. M: DNA size marker

(1 kb DNA Ladder).

76

Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ơ các gen tổng hợp curcuminoid.

Gen Đôi

chứng

SA (100 µM) YE (1 g/L)

0 5 0 5

CzDCS 4706 5312 6146 5113 13425

CzCURS1 6881 7810 10766 32576 13524

CzCURS2 4646 6186 8510 12139 17783

CzCURS3 4414 4146 6203 21700 12664

Tổng số 20647 23455 31625 71528 57397

Tăng so với ĐC 1,00 1,14 1,53 3,46 2,78

0 và 5 là ký hiệu elicitor được bổ sung vào môi trường ơ thời điểm ban đầu hoặc ngày

thứ 5 của quá trình nuôi cấy.

3.3.3. Tích lũy curcumin

Kết quả trình bày ơ bảng 3.9 cho thấy sinh trương của tế bào nghệ đen ơ

tất cả các công thức được xử lý elicitor đều bị ức chế đáng kể, sinh khối tươi

thu được cao nhất chỉ đạt 105,20 g khối lượng tươi/L (9,80 g khối lượng khô)

so với 154,20 g khối lượng tươi/L (12,80 g khối lượng khô) ơ đối chứng. Tuy

nhiên, có sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen khi phân tích RT-

PCR với sự tích lũy curcumin khi phân tích bằng HPLC. Ảnh hương của YE

lên khả năng sản xuất curcumin cao hơn so với khi xử lý bằng SA và đối chứng.

Hàm lượng curcumin thu được khi xử lý SA và YE vào thời điểm 5 ngày nuôi

cấy cao hơn khoảng 1,2 đến 1,6 lần so với khi bổ sung vào thời điểm ban đầu,

tương ứng đạt 1,32 với 1,14 mg/g khối lượng khô khi xử lý SA và 1,44 với 0,92

mg/g khối lượng khô khi xử lý YE. Ở trường hợp xử lý bằng YE, hàm lượng

curcumin thu được có sự sai khác so với mức độ biểu hiện của các gen. Cường

độ tổng số của các băng DNA trong phân tích RT-PCR tại thời điểm bổ sung

ban đầu cao hơn khi bổ sung vào ngày thứ 5 (Bảng 3.8), trong khi đó hàm lượng

curcumin khi bổ sung YE vào ngày thứ 5 lại cao hơn (Bảng 3.9). Nguyên nhân

có thể do các gen này ngoài việc tham gia quá trình sinh tổng hợp curcumin

77

còn tham gia tổng hợp demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin.

Bảng 3.9. Ảnh hương của các elicitor lên sinh trương và tích lũy curcumin trong tế

bào nghệ đen

Elicitor

Sinh trưởng tế bao Curcumin (mg/g

khô) Khôi lượng tươi

(g/L)

Khôi lượng khô

(g/L)

YE(1) 105,20b 9,80b 0,92d

YE(2) 97,6c 8,40c 1,44a

SA(1) 69,00d 6,20d 1,14c

SA(2) 63,20d 6,00d 1,32b

Đối chứng (I) 154,2a 12,80a 0,57f

Đối chứng (II) - - 0,78e

Elicitor được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ơ thời điểm ban đầu (1) hoặc sau 5

ngày (2). Đối chứng (I): tế bào không xử lý elicitor. Đối chứng (II): củ nghệ đen 10

tháng tuổi.

78

Hình 3.24. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. Điều kiện HPLC: cột Hypersil™ MOS

C8 LC Column (5 µm, 4,6×150 mm), tốc độ chạy 1 mL/phút, thời gian chạy 15 phút,

pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là acetonitrile/acetic acid 2% (35/65,

v/v). Điều kiện HPLC ơ hình 3.25 và 3.26 là tương tự.

Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày

nuôi cấy.

Hình 3.26. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5 ngày

nuôi cấy.

79

Chương 4

BÀN LUẬN

4.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO

Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng củ (thân rễ, rhizome),

do phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu

hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu

và mùa vụ nên khó có đủ nguồn nguyên liệu để sản xuất một lượng lớn các hoạt

chất sinh học quý dùng trong bào chế dược phẩm [100]. Nuôi cấy tế bào huyền

phù thực vật từ lâu đã được xem là một phương thức thay thế có nhiều tiềm

năng trong sản xuất các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị cao nhờ tính

đồng nhất của quần thể tế bào in vitro, sự sẵn có một lượng lớn nguyên liệu, và

tốc độ sinh trương nhanh của chúng [106]. Nghiên cứu cải thiện hiệu suất nhân

giống cũng như sự sinh trương của callus, tế bào có sử dụng AgNO3 sẽ làm

tăng hiệu quả của quá trình sản xuất curcumin từ tế bào huyền phù cây nghệ

đen.

4.1.1. Nhân giông cây nghệ đen in vitro

Nghệ đen là loài nhân giống bằng củ, nhưng phải mất thời gian dài để

tạo củ, nên hệ số nhân thấp. Mặt khác, các cây thuộc họ Gừng thường bị bị xâm

nhiễm bơi các mầm bệnh, chẳng hạn như bệnh thối củ gây ra bơi các loài

Pithium và bệnh đốm lá do các loài Coleotrichum [31]. Do đó, sử dụng kỹ thuật

in vitro trong nhân giống nghệ đen, tạo nguồn dược liệu bền vững là hướng

nghiên cứu đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Marcia và cs.

(2000) đã nghiên cứu nhân giống cây nghệ đen ơ Malaysia và xây dựng công

thức nhằm đánh giá số lượng cây giống in vitro [92]. Bharalee và cs. (2005)

cũng đã nghiên cứu nhân giống bằng chồi củ của cây nghệ đen. Khả năng hình

thành chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L NAA,

đạt 4,5 chồi/mẫu. Số rễ cao nhất 8,9 rễ/mẫu khi nuôi cấy chồi trên môi trường

80

MS bổ sung 0,5 mg/L IAA. Các cây tạo rễ có thể đưa ra ngoài đất [26].

Anisuzzaman và cs (2008) đã nghiên cứu tạo củ in vitro cây nghệ đen ơ

Bangladesh. Chồi in vitro khoảng 10-12 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi

trường MS với nồng độ khác nhau của BA và NAA và các nguồn carbon khác

nhau. Củ hình thành tốt nhất trên môi trường có 4,0 mg/L BA và 6% sucrose

sau 7-9 tuần nuôi cấy. Củ được nảy chồi trên môi trường MS không có bổ sung

chất kích thích sinh trương [15]. Stanly và cs (2010) nghiên cứu nhân giống in

vitro cây nghệ đen ơ Malaysia thông qua nhân nhanh chồi in vitro trên môi

trường rắn, nuôi cấy lắc trong bình tam giác và nuôi cấy ngập chìm tạm thời.

Tất cả các cây con in vitro sản xuất từ 3 hệ thống này đều sống và sinh trương

bình thường, không có sự thay đổi hình thái. Nghiên cứu cũng cho thấy hệ

thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là sự lựa chọn tốt nhất trong kỹ thuật nhân

giống in vitro để sản xuất cây con [147]. Tuy nhiên, các tác giả đã chưa sử dụng

AgNO3 trong quá trình nuôi cấy. Theo Kumar và cs (2009) và Sandra và Maira

(2013), AgNO3 khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật có tác

dụng ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, vì thế quá trình sinh trương của

tế bào sẽ được thuận lợi hơn [73], [134].

Đối với quá trình tái sinh chồi, nghiên cứu của Loc và cs (2005) cho thấy

môi trường có bổ sung 3 mg/L BAP cho hiệu quả tốt nhất, số chồi/mẫu đạt 2,3

và chiều cao chồi đạt 3,42 cm [79]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng

công thức môi trường này để tiến hành nghiên cứu ảnh hương của AgNO3. Kết

quả nghiên cứu cho thấy số chồi tạo thành cao hơn (3,3 so với 2,3 chồi) và

chiều dài chồi cũng cao hơn (4,1 cm so với 3,42 cm). Như vậy, AgNO3 đã có

tác dụng trong việc nâng cao hiệu quả của quá trình tái sinh chồi. AgNO3 khi

được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật có tác dụng ức chế hoạt

động của ethylene nội sinh; do đó quá trình sinh trương của tế bào vì thế sẽ

được thuận lợi hơn [73], [134]. Các kết quả thu được của chúng tôi cũng phù

hợp với nhận định trên.

81

Môi trường tốt nhất để tạo rễ theo Loc và cs (2005) là 2 mg/L NAA, khi

bổ sung AgNO3 vào môi trường này, chúng tôi nhận thấy 1,5 mg/L AgNO3 cho

hiệu quả tốt nhất. So với nghiên cứu trước đây của Loc và cs (2005) thì kết quả

thu được của chúng tôi tốt hơn, số rễ/chồi nhiều hơn (27,0 so với 18,5), rễ tạo

thành cũng dài hơn (0,80 cm so với 0,51 cm) [79].

Qua các kết quả nghiên cứu về nhân giống, chúng tôi nhận thấy bổ sung

AgNO3 vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng cao hiệu suất nhân giống, các chỉ tiêu

nghiên cứu đều tăng lên từ 25-50%.

4.1.2. Nuôi cấy callus va tế bao cây nghệ đen

Qua một số nghiên cứu trước đây cho thấy, đa số trường hợp nuôi cấy

callus hoặc tế bào thực vật đều cho hàm lượng các chất thứ cấp cao hơn nhiều

lần so với trong điều kiện tự nhiên. Chẳng hạn, hàm lượng anthocyanin ơ callus

của cây hoa cúc (Rudbeckia hirta) chiếm đến 4,97% trong khi hoa của cây này

trong tự nhiên, nơi tích lũy chủ yếu anthocyanin, chỉ có 0,28% [90]. Nguyễn

Hoàng Lộc và cs (2010, 2011) đã nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus cây

cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine tích lũy

trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm

tuổi [84]. Tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy tế bào cà gai leo trong chai tam giác,

các tác giả nhận thấy solasodine tích lũy trong tế bào huyền phù cao hơn trong

callus [85].

Sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị từ callus hoặc tế bào huyền phù

là hướng nghiên cứu đã được triển khai trong vài thập kỷ qua và mang lại nhiều

thành quả đáng khích lệ. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ

đen, các nghiên cứu nuôi cấy callus và tế bào huyền phù cây nghệ đen cũng đã

được công bố. Mello và cs. (2001a,b) đã tạo callus từ đoạn rễ của cây nghệ đen

in vitro trên môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP

trong điều kiện tối. Các tác giả cũng đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù

82

cây nghệ đen. Kết quả cho thấy với 0,5 g tế bào trong bình tam giác 125 ml

chứa 10 ml môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP, tốc

độ lắc 60 vòng/phút đã thu được khoảng 6 g sinh khối tươi của tế bào sau 35

ngày nuôi cấy. Nhóm tác giả này cũng đã tiến hành khảo sát ảnh hương của các

nguồn carbon khác nhau lên sinh trương của tế bào huyền phù nghệ đen. Kết

quả cho thấy sucrose là nguồn carbon thích hợp cho sinh trương của tế bào nghệ

đen, các nguồn carbon khác như galactose, glycerol và sorbitol không có vai

trò đáng kể trong kích thích sinh trương của tế bào [97], [98].

Theo Miachir và cs. (2004), callus không hình thành từ mô lá và rễ của

cây nghệ đen in vitro trên môi trường có 2,4-D. Callus hình thành tốt nhất từ

đoạn rễ trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA và nuôi cấy trong tối. Tác

giả cũng đã thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây nghệ trong bình tam giác

250 ml trên máy lắc. Nuôi cấy 1 g tế bào trong 75 ml môi trường MS có bổ

sung 1 mg/L NAA đã thu được sinh khối tế bào cao nhất là 8 g sau hơn 20 ngày

nuôi cấy ơ tốc độ lắc 100 vòng/phút [100].

Loc và cs. (2006, 2008) đã nghiên cứu sản xuất sinh khối tế bào cây nghệ

đen thông qua nuôi cấy callus, callus đã được tạo thành khi nuôi cấy mảnh lá

trên môi trường có chứa 3 mg/L BAP và 3 mg/L 2,4-D. Nuôi cấy tế bào huyền

phù được thiết lập bằng cách nuôi 3 g callus tươi trong bình tam giác 250 ml

chứa 50 ml cùng loại môi trường. Tế bào huyền phù sau đó được nuôi trên hệ

lên men 5 L, sinh khối tế bào đạt cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy (sinh khối tươi

đạt 338,15 g, sinh khối khô đạt 38,85 g) với tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc

độ sục khí 2,5 L/phút, tỷ lệ tiếp mẫu ban đầu là 50 g. Trong điều kiện này, hàm

lượng tinh dầu thu được là 1,78% trong khi hàm lượng curcumin là 9,69% [81],

[80].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc bổ sung AgNO3 vào môi trường

nuôi cấy đã làm tăng khả năng sinh trương của tế bào. Sau 14 ngày nuôi cấy,

sinh khối tươi đạt cực đại là gần 8,5 g/bình, tương đương với khối lượng khô

83

khoảng 0,75 g/bình, cao hơn kết quả nghiên cứu trước đây của Tuan và cs.

(2011) (khoảng 0,66 g khô/bình) [156] hay Miachir và cs. (2004) (quy đổi

tương đương 5,33 g tươi/bình) [100]. Bên cạnh đó, thời gian đạt sinh trương

cực đại của chúng tôi (14 ngày) cũng ngắn hơn rất nhiều so với các nghiên cứu

đã công bố như trong nghiên cứu của Mello và cs. (2001) là 35 ngày [97] hay

Miachir và cs. (2004) là 20 ngày [100]. Thời gian nuôi cấy ngắn sẽ góp phần

làm tăng hiệu quả của quá trình sản xuất curcumin. So với các đối tượng khác,

thời gian sinh trương của tế bào huyền phù cây nghệ đen ngắn hơn, ví dụ sinh

khối tế bào huyền phù rau má đạt cực đại sau 24 ngày [86], cà gai leo đạt cực

đại sau 28 ngày [87].

Khi nuôi cấy callus nghệ đen trên môi trường được bổ sung AgNO3 1,5

mg/L, các khối callus có màu vàng đậm hơn đối chứng, ơ các môi trường khác

callus có màu vàng tương đương hoặc nhạt hơn. Tuy nhiên, kết quả cũng cho

thấy AgNO3 không thích hợp bằng KIN hoặc NAA khi kết hợp với 2,4-D trong

nuôi cấy tăng sinh khối callus nghệ đen. Trong các nồng độ AgNO3 được sử

dụng, sinh trương cao nhất của callus chỉ đạt 0,71 g tươi, tương ứng với 62,43

mg khô, thấp hơn rất nhiều so với công thức kết hợp 2,4-D 1 mg/L và KIN từ

1,5 mg/L, sinh khối tươi thu được 0,90 g với sinh khối khô là 84,11 mg.

4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID

4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid

Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy có sự tương đồng lớn giữa

các gen của nghệ đen với nghệ vàng (xấp xỉ 99%). Các phân tích trình tự cũng

cho thấy các gen thuộc tất cả loài của trong chi Curcuma có sự tương đồng rất

lớn, thậm chí ngay ơ các vùng không mã hóa. Ví dụ, gen mã hóa 5S RNAs

ribosome của nghệ vàng (LT853920.1) và nghệ đen (KU936068.1) có sự tương

đồng 92%. Chính sự tương đồng cao trong trình tự của các gen này dẫn đến sẽ

có sự tương đồng cao trong các trình tự amino acid của các protein được mã

84

hóa. Đây là cơ sơ để chúng tôi thiết kế các mồi để phân lập các gen sinh tổng

hợp curcuminoid từ nghệ đen.

Trong quá trình thiết kế mồi, chúng tôi gặp nhiều khó khăn khi các gen

trong mỗi loài thuộc chi Curcuma đều có sự đặc hiệu cao, đặc biệt là ơ vị trí

mơ đầu và kết thúc của vùng mã hóa (CDS). Do không có bất kỳ trình tự mRNA

đầy đủ nào của các gen này từ chi Curcuma được công bố trên GenBank, chúng

tôi phải dựa vào các trình tự sẵn có của các gen này trên cây nghệ vàng để

nghiên cứu, tuy nhiên, tất cả các gen đã được công bố đều chỉ có vùng mã hóa.

Để xác định các vùng 5’ và 3’ không dịch mã (UTR), chúng tôi sử dụng các

gen của nghệ vàng, tìm kiếm cơ sơ dữ liệu EST (expressed sequence tag) của

cây nghệ vàng nhận thấy các EST có sự ổn định cao ơ các gen này. Các EST

này được sử dụng cùng với các vùng CDS để tạo ra các chuỗi các đoạn DNA

được nhân bản nằm liền kề nhau (contig) dài hơn. Vì vùng không dịch mã của

các gen này có sự khác biệt lớn, các mồi cho vùng CDS được thiết kế dựa trên

các vùng này để đảm bảo tính đặc hiệu cho phản ứng PCR. Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi cho thấy các sản phẩm PCR đặc hiệu cho tất cả các gen, điều này

chứng tỏ cây nghệ đen chứa tất cả các gen này.

Mặc dù các gen DCS và CURS trên cây nghệ đen chưa được nghiên cứu

nhiều, tuy nhiên các gen này trên cây nghệ vàng đã được nhiều tác giả nghiên

cứu và công bố. So sánh kết quả phân lập của chúng tôi với các kết quả đã công

bố trên cây nghệ vàng có thể thấy các gen giữa hai loài này có độ tương đồng

rất cao, lên đến 99%. Ngoài ra, nghiên cứu trên loài họ hàng cho thấy, M.

accuminata chứa 3 bản sao của gen tương tự CURS3 (LOC103968790,

LOC103968789 và LOC103968788), tất cả đều nằm trên nhiễm sắc thể số 10,

và 5 bản sao của gen tương tự CURS2 (LOC103976634, LOC103976805,

LOC103986053, LOC103987346, và LOC103968787) trên các nhiễm sắc thể

số 2, 5, 6 và 10 (https://banana-genome-hub.southgreen.fr/).

85

4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid

Curcumin là thành phần chính của nhóm curcuminoid, được tìm thấy

trong callus và liên quan đến sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid

như trong phân tích RT-PCR (Hình 3.17). Tuy nhiên, diện tích peak thể hiện

trong các hình 3.18-3.20 cho thấy đã có sự chuyển hóa sinh học diễn ra trong

quá trình nuôi cấy callus. Các nghiên cứu trước đây của Sakui và cs (1992)

[132] và Loc và cs (2009) [82] cũng cho thấy có sự chuyển hóa sinh học của

các sesquiterpenoid trong quá trình nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen có

nguồn gốc từ callus. Theo Muffler và cs (2011), quá trình chuyển hóa sinh học

là bắt buộc để thu các hoạt chất sinh học từ các tiền chất trong quá trình sản

xuất triterpene từ nuôi cấy mô thực vật [107]. Nghiên cứu của Dvořáková và cs

(2007) cũng cho thấy quá trình chuyển hóa sinh học của hỗn hợp monoterpene

trong nuôi cấy huyền phù tế bào 2 loài Picea abies và Taxus baccata [42].

Trên các đối tượng nghệ, mức độ biểu hiện của các gen DCS và CURS

cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Katsuyama và cs (2009 a, b) đã xác

định sự biểu hiện của các gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3 trong củ và lá

của cây nghệ vàng bằng kỹ thuật qPCR (quantitative PCR) [66], [67]. Behar và

cs (2016) cũng nhận thấy sự phiên mã của các gen DCS, CURS1, CURS2 và

CURS3 trong củ và lá cây C. caesia, trong đó mức độ phiên mã của gen CURS

trong củ 5 tháng tuổi cao hơn 4 lần so với củ 10 tháng tuổi [24].

4.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU

HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID

4.3.1. Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu

4.3.1.1. Dịch chiết nấm men

86

Dịch chiết nấm men (YE) là một elicitor sinh học, được sử dụng trong

nuôi cấy mô và tế bào thực vật để tăng khả năng kích thích bộ máy bảo vệ, từ

đó gia tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp [53]. Pitta-Alvarez và cs (2000)

nghiên cứu sử dụng YE 0,8 mg/mL trên rễ tơ cây Brugmansia candida, sau 48

giờ nuôi cấy các tác giả nhận thấy hàm lượng scopolamine và hyoscyamine

tăng khoảng 200% so với đối chứng (không có YE). Ngoài ra, kết quả cũng cho

thấy scopolamine cao hơn khoảng 600% so với đối chứng sau 24 giờ nuôi cấy.

Điều này có thể được lý giải bơi trong thành phần của YE được cho là có chứa

một số cation như Zn2+, Ca2+ và Co2+ có vai trò như là các elicitor phi sinh học.

Bên cạnh đó YE cũng là một hợp chất bao gồm nhiều thành phần khác nhau,

ngoài các amino acid, vitamin và khoáng chất, nó còn có thể chứa các thành

phần elicitor khác chưa được xác nhận [118].

Cơ chế tác động chính xác của YE lên tế bào thực vật hiện nay vẫn chưa

được làm rõ. Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu cảm ứng được xem là một hệ thống

nhiều thành phần có chức năng phức tạp trong các phản ứng bảo vệ khác nhau

của tế bào thực vật, giống như: các kênh ion, sự hoạt hóa tác nhân phân bào

khơi động protein kinase hoặc con đường jasmonic acid hoặc SA [127], [143].

Các nghiên cứu sử dụng YE để tăng mức độ tích lũy các hợp chất thứ

cấp đã được một số tác giả công bố. Chẳng hạn, nuôi cấy rễ tơ cây rau sam đã

được Pirian và cs (2013) thực hiện để sản xuất noradrenaline. Các tác giả đã sử

dụng YE ơ các nồng độ 0,125-1 g/L để cảm ứng làm tăng quá trình sản xuất

noradrenaline, thời gian cảm ứng 2 ngày. Các tác giả nhận thấy liều lượng 0,25

và 0,5 g/L YE là thích hợp nhất, hàm lượng noradrenaline tăng 3-4 lần so với

đối chứng [117]. Khi bổ sung dịch chiết nấm men, Aspergillus niger, Fusarium

oxysporum vào môi trường nuôi cấy Hypericum triquetrifolium Turra ơ các

nồng độ từ 0,1-0,75 mg/L, Azeez và cs (2013) nhận thấy các elicitor này có vai

trò khác nhau trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Đối với nấm men (0,5

mg/L), hàm lượng p-OH-benzoic acid và chlorgenic acid tăng lên đáng kể so

87

với đối chứng. Rutin, hypersoid và quercitin tăng lên đáng kể so với đối chứng

khi được xử lý kích kháng ơ tất cả các công thức [20]. Pitta-Alvarez và cs

(2000) nghiên cứu sử dụng YE 0,8 g/L cảm ứng rễ tơ Brugmansia candida sau

48 giờ nuôi cấy nhận thấy, hàm lượng scopolamine và hyoscyamine trong rễ

tăng khoảng 200% so với đối chứng. Ngoài ra, kết quả cho thấy scopolamine

cao hơn khoảng 600% so với đối chứng (không có YE) sau 24 giờ nuôi cấy

[118].

4.3.1.2. Salicylic acid

Salicylic acid là một hợp chất tín hiệu thực vật quan trọng trong việc kích

hoạt các gen liên quan đến cơ chế bảo vệ. Khi sử dụng làm elicitor, SA ảnh

hương đến khả năng tích lũy các hợp chất liên quan đến cơ chế bảo vệ. SA được

biết như là tác nhân chống chịu tương tác thực vật gây bệnh, nhưng không phải

là chất cảm ứng vạn năng trong sản xuất các chất chuyển hóa bảo vệ thực vật

[29]. Theo Taguchi và cs (2001), SA tích lũy ơ các vị trí mầm bệnh để tấn công

và kích thích hệ thống bảo vệ thực vật và việc sản xuất các hợp chất thứ cấp

[150].

Việc sử dụng SA làm elicitor để tăng cường tổng hợp các hợp chất thứ

cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật rất phổ biến. Yu và cs (2005) đã nghiên cứu sự

tích lũy jaceosidin và siringin trong nuôi cấy tế bào của sen tuyết với elicitor là

SA, kết quả thu được jaceosidin (95 mg/L) cao gấp 2,5 lần và siringin (631

mg/L) cao gấp 2,7 lần so với mẫu không bổ sung SA [167]. Dong và cs (2010)

nghiên cứu vai trò của SA đến sự tích lũy của phenolic acid và tăng hoạt động

các enzyme chống oxy hóa trong nuôi cấy tế bào của cây đan sâm. Phenolic

acid gồm có hai thành phần salvianolic acid B và caffeic acid. Khi bổ sung 6,25

mg/L SA vào môi trường nuôi cấy sau 8 giờ, hàm lượng salvianolic acid B và

caffeic acid thu được cao nhất, gấp 2 lần so với mẫu không bổ sung SA [39].

Pitta-Alvarez và cs (2000) nghiên cứu ảnh hương của SA đến khả năng tích lũy

88

scopolamine và hyoscyamine trong nuôi cấy rễ tơ Brugmansia candida nhận

thấy cả hai loại alkaloid này đều tăng sau 24 giờ cảm ứng. Ở tất cả các nồng độ

SA khảo sát (0,01-1,00 mM), hyoscyamine và scopolamine tích lũy cực đại lần

lượt sau 48 và 72 giờ nuôi cấy (gấp khoảng 6 và 10 lần so với đối chứng) [118].

4.3.1.3. Methyl jasmonate

MeJA là một hợp chất tạo hương dễ bay hơi lần đầu tiên được tìm thấy

trong hoa của cây Jasminum grandiflorum, sau đó được chứng minh là phân bố

rộng rãi trong giới thực vật. MeJA được ghi nhận như một chất điều hòa cần

thiết cho sự sống tế bào, có vai trò trung gian trong quá trình phát triển khác

nhau (nảy mầm, tạo rễ, sinh sản, chín quả, già yếu) và các phản ứng bảo vệ tế

bào chống lại các stress sinh học và phi sinh học (tổn thương do côn trùng gây

ra, điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, nhiệt độ thấp, độ mặn) [33].

MeJA và jasmonic acid là những hợp chất điều hoà sinh trương thực vật

có vai trò trong sự lão suy của thực vật, tham gia vào con đường truyền tín hiệu

ngoại sinh (stress, vết thương, sinh vật gây bệnh) và cảm ứng hoạt động của hệ

thống bảo vệ ơ thực vật. MeJA khơi động sự phiên mã mRNA de novo của các

gen PAL dẫn tới sự tạo phenylalanine ammonia-lyase, enzyme đầu tiên của con

đường phenylpropanoid liên quan chặt chẽ đến sự sản xuất các HCTC ơ thực

vật (Brincat và cs, 2002) (dẫn theo Lê Thị Thủy Tiên và cs, 2010) [8]. MeJA

đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi làm elicitor trong sản xuất các hợp chất

thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật [154].

Jasmonate ngoại sinh khi ứng dụng vào thực vật đã cho thấy có ảnh hương

đến sự biểu hiện về hình thái và sinh lý. Jasmonate kết hợp với sự tích lũy của

các hợp chất thứ cấp đã thể hiện sự đáp ứng bảo vệ ơ thực vật. MeJA làm tăng

hàm lượng shikonin và dẫn xuất của nó trong nuôi cấy tế bào cây Onosma

paniculatum, MeJA còn tăng cường sinh tổng hợp IAA nội sinh ơ thực vật.

Ứng dụng jasmonate ngoại sinh đã kích thích mạnh sự sinh tổng hợp nhiều hợp

89

chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào và nuôi cấy cây in vitro. MeJA

cảm ứng tích lũy anthocynin đã được báo cáo ơ cây Arabidopsis thaliana,

Vaccinium pahalae và Vitis vinifera. Hơn nữa, MeJA và salicylic acid cảm ứng

sản xuất anthocyanine trong nuôi cấy callus cây D. carota [148].

MeJA ức chế sinh trương tế bào và tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp

trong nuôi cấy rễ cây Bupleurum falcatum L., Taxus spp. và lúa. Ảnh hương

của MeJ ngoại sinh lên hàm lượng của các amine sinh học bao gồm putrescine,

spermidine, tyramine, cadaverine và 2-phenylethylamine trong cây kiều mạch

(Fagopyrum esculentum) cũng đã được nghiên cứu [13].

4.3.2. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bao

Trong hầu hết các công trình nghiên cứu được công bố, việc xử lý elicitor

sẽ ức chế sự sinh trương của tế bào giống như trong nghiên cứu của chúng tôi.

Đối với tế bào cây nghệ đen, xử lý SA sinh khối tươi của tế bào giảm còn 27,24-

44,75% trong khi xử lý YE sinh khối tươi giảm còn 63,29- 68,22% (Bảng 3.9).

Như vậy, tác dụng ức chế của SA lên sinh trương của tế bào nghệ đen gần gấp

đôi của YE.

Các nghiên cứu trước đây cũng cho kết quả tương tự. Yu và cs (2001) đã

nghiên cứu ảnh hương của SA và chất tách chiết từ nấm (F5) ơ các nồng độ

riêng rẽ và phối hợp lên khả năng sản xuất taxol trong nuôi cấy huyền phù tế

bào cây thông đỏ lá ngắn. Các tác giả nhận thấy khi bổ sung vào môi trường

nuôi cấy 50 mg/L F5 hoặc 50 mg/L SA hoặc phối hợp 50 mg/L F5 và 50 mg/L

SA đều ức chế sinh trương của tế bào, sinh khối thấp nhất khi sử dụng phối hợp

50 mg/L F5 và 50 mg/L SA [166]. Nuôi cấy rễ tơ cây Brugmansia candida bổ

sung SA (0,01-1,00 mM) ơ thời điểm sau 18 ngày, Pitta-Alvarez và cs (2000)

nhận thấy sinh trương tế bào bị ảnh hương, sinh khối tươi chỉ đạt 40% (480 mg)

so với đối chứng sau 72 giờ cảm ứng [118]. Nghiên cứu của Loc và cs (2012)

cũng có kết quả tương tự, sinh khối tế bào rau má sau 24 ngày nuôi cấy giảm

90

so với đối chứng ơ tất cả các nồng độ SA (50-200 µM) bổ sung tại các thời

điểm khác nhau (5-15 ngày) [86].

4.3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen

Curcumin là một trong 3 thành phần của nhóm curcuminoid được tìm

thấy trong các loài thuộc chi Curcuma, bao gồm thêm demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin. Trong con đường sinh tổng hợp curcuminoid ơ cây

nghệ vàng, sự khơi đầu bắt nguồn từ phenylalanine, gen DCS xúc tác phản ứng

kết hợp feruloyl-CoA và p-coumaroyl-CoA tạo thành feruloyldiketide-CoA,

sau đó các gen CURS1-3 chuyển feruloyldiketide-CoA thành curcumin. Bên

cạnh đó, CURS 3 có thể tạo thành demethoxylcurcumin từ feruloyldiketide-

CoA. Đồng thời, gen DCS cũng tham gia chuyển hóa p-coumaroyl-CoA thành

p-coumaroyldiketide-CoA, sau đó các gen CURS1-3 hoặc chỉ gen CURS3

chuyển hóa chất này thành demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin

[67].

Sự tích lũy của các sản phẩm thứ cấp chính trong nuôi cấy tế bào thực

vật tăng lên có liên quan đến mức độ biểu hiện của các gen cũng như tăng lên

dưới tác dụng của các elicitor. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi xử lý elicitor

ơ các nồng độ và thời điểm khác nhau sẽ tăng lên ơ các mức độ khác nhau. Đối

với gen CzDCS, mức độ biểu hiện tăng cao nhất khi xử lý YE vào thời điểm 5

ngày sau khi nuôi cấy, mức biểu hiện gấp 2,85 lần so với đối chứng (cường độ

băng DNA đạt 13.425 so với 4.706 của đối chứng). Đối với các gen CURS, gen

CzCURS1 mức biểu hiện cao nhất ghi nhận được tại công thức xử lý YE vào

thời điểm ban đầu (nồng độ 32.576), gen CzCURS2 là khi xử lý YE ơ thời điểm

5 ngày (cường độ 17.778) còn gen CzCURS3 cao nhất khi xử lý YE ơ thời điểm

ban đầu (cường độ 21.700) (Bảng 3.8). Như vậy, trong tất cả các công thức xử

lý, mức độ biểu hiện của các gen khi xử lý bằng YE đều cao hơn khi xử lý bằng

SA, điều này chứng tỏ YE phù hợp hơn SA trong việc tăng cường mức độ biểu

91

hiện của các gen trong chu trình phenylpropanoid ơ cây nghệ đen.

Xét về thời điểm bổ sung elicitor, bổ sung vào thời điểm ban đầu cho

hiệu quả tốt hơn vào thời điểm 5 ngày sau nuôi cấy, mức độ biểu hiện của tất

cả các gen khi bổ sung YE vào thời điểm ban đầu là 71.528 (gấp 3,46 lần đối

chứng) trong khi tại thời điểm 5 ngày là 57.397 (gấp 2,78 lần so với đối chứng).

Thông qua quá trình xử lý elicitor, vai trò của các gen cũng đã được thể

hiện. Khi xử lý YE ơ thời điểm ban đầu, mật độ băng DNA của gen CzDCS là

5.133 trong khi tổng mật độ của 3 gen CzCURS là 66.415 (Bảng 3.8) cho hàm

lượng curcumin là 0,92 mg/g khô (Bảng 3.9). Trong khi đó bổ sung elicitor tại

thời điểm 5 ngày, mật độ của gen CzDCS là 13.425 (tăng hơn 2 lần) và tổng

mật độ của các gen CzCURS là 43.971 (giảm hơn 30% so với bổ sung thời điểm

ban đầu) nhưng hàm lượng curcumin đã tăng lên là 1,44 mg/g khô (gấp 1,5

lần).

Xử lý SA cũng cho kết quả tương tự nhưng không rõ bằng YE. Khi xử

lý SA ơ thời điểm ban đầu, mật độ băng DNA của gen CzDCS là 5.312 trong

khi tổng mật độ của 3 gen CzCURS là 18.142 (Bảng 3.8) cho hàm lượng

curcumin là 1,14 mg/g khô (Bảng 3.9). Trong khi đó bổ sung elicitor tại thời

điểm 5 ngày, mật độ của gen CzDCS là 6.146 (tăng khoảng 1,2 lần) và tổng mật

độ của các gen CzCURS là 25.479 (tăng 1,4 lần) thu được hàm lượng curcumin

là 1,32 mg/g khô (gấp 1,15 lần). Như vậy, việc tăng mức độ biểu hiện của gen

CzDCS đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp curcumin trong tế bào, mức độ biểu

hiện của các gen CzCURS ít tác động đến khả năng sinh tổng hợp curcumin. So

sánh khả năng sinh tổng hợp curcumin khi xử lý SA và YE cho thấy, mức độ

biểu hiện của gen CzDCS cao hơn sẽ thu được hàm lượng curcumin cao hơn.

Đối với các hợp chất được sinh tổng hợp theo chu trình phenylpropanoid,

các nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của các gen tham gia chu trình cũng

đã được nghiên cứu. Chẳng hạn, các gen trong con đường phenylpropanoid

được kích hoạt biểu hiện và mức độ tích lũy furanocoumarin trong nuôi cấy tế

92

bào cây rau mùi tây (Petroselinum crispum) [44].

Nghiên cứu tăng cường biểu hiện của các gen trong chu trình

phenylpropanoid bằng elicitor cũng đã được nhiều tác giả thực hiện. Park và cs

(2016) đã nghiên cứu sử dụng YE và AgNO3 để tăng cường mức độ biểu hiện

của các gen trong chu trình phenylpropanoid trong nuôi cấy tế bào cây hoắc

hương núi (Agastache rugosa). Kết quả cho thấy xử lý YE 0,5 g/L và AgNO3

30 mg/L ơ các thời điểm khác nhau đều làm tăng biểu hiện của các các gen

trong chu trình phenylpropanoid và sự tích lũy của rosmarinic acid. Mức độ

biểu hiện của các gen RAS và HPPR tăng lên cao nhất là 1,84, 1,97 và 2,86 lần

khi được xử lý YE ơ các mốc thời gian 3, 6 và 12 giờ. Đối với gen PAL, mức

độ phiên mã tăng lên tới 52,31 lần khi xử lý bằng AgNO3 sau 24 giờ [115].

Một số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy sự tăng biểu hiện của các

gen khi được xử lý elicitor, ví dụ gen OsWRKY53 trong tế bào cây lúa khi xử

lý cerebroside từ nấm (Chujo và cs. 2007) [34], gen bảo vệ ơ tế bào rau mùi tây

khi xử lý bằng MeJA (Ellard-Ivey và Douglas. 1996) [44], hay gen bảo vệ ơ tế

bào 2 loài nho (Vitis rupestris và V. vinifera) được xử lý bằng Harpin (Qiao và

cs 2010) [121]. Trong một nghiên cứu khác, SA có tác dụng làm tăng biểu hiện

các gen tham gia vào con đường tổng hợp phytosterol và triterpene trong tế bào

cây rau má (Centella asiatica) [88].

4.3.4. Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin

Trong nghiên cứu của chúng tôi trên cây nghệ đen, xử lý YE vào thời

điểm 5 ngày sau quá trình nuôi cấy cho kết quả tốt nhất, hàm lượng curcumin

đạt 1,44 mg/g, gấp 1,53 lần so với đối chứng không xử lý elicitor (Bảng 3.9).

Các công thức xử lý khác cũng đều thu được hàm lượng curcumin cao hơn

đối chứng, xử lý bằng SA vào thời điểm 5 ngày cũng cho kết quả rất tốt, hàm

lượng curcumin cao gấp 2,32 lần so với đối chứng. Đối chiếu với kết quả

phân tích mức độ biểu hiện của các gen trong chu trình, sự tích lũy curcumin

93

trong tế bào có sự khác biệt. Đối với YE, mức độ biểu hiện của các gen

CURS tại thời điểm ban đầu cao hơn thời điểm 5 ngày, trong khi hàm lượng

curcumin tại thời điểm 5 ngày lại cao hơn, điều này có thể thấy vai trò quan

trọng của gen DCS trong quá trình sinh tổng hợp curcumin, việc tăng mức

độ biểu hiện của gen DCS tại thời điểm 5 ngày có ảnh hương quyết định đến

việc tăng khả năng tổng hợp curcumin trong tế bào. Trong chu trình này, gen

DCS xúc tác phản ứng kết hợp feruloyl-CoA và p-coumaroyl-CoA tạo thành

feruloyldiketide-CoA, đây là nguyên liệu để tổng hợp nên các chất thuộc

nhóm curcuminoid, các gen CURS1-3 sẽ tham gia xúc tác tổng hợp curcumin

và các dẫn xuất của nó, việc biểu hiện các gen này ơ các mức độ khác nhau

có thể dẫn đến việc tổng hợp curcumin và các dẫn xuất với mức độ khác

nhau. Việc xử lý SA sẽ làm tăng đều mức độ biểu hiện của các gen nhưng ơ

mức độ thấp hơn khi xử lý bằng YE.

Các nghiên cứu đã công bố trước đây cho thấy mỗi elicitor cho hiệu quả

cải thiện hiệu suất của các hợp chất thứ cấp khác nhau đối với từng loài thực

vật. Vì vậy, việc lựa chọn elicitor phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu là rất

quan trọng. Chẳng hạn MeJA tăng cường tích lũy azadirachtin trong nuôi cấy

tế bào Azadirachta indica tốt hơn các elicitor khác như SA, pectinase,

pectolyase, AgNO3, CuSO4 và dịch chiết nấm [123].

Tương tự nghiên cứu của chúng tôi, một số công trình nghiên cứu cho

rằng kích kháng bằng các tác nhân sinh học tốt hơn các tác nhân phi sinh học.

Goyal và cs (2008) tăng cường tích lũy isoflavonoid trong nuôi cấy tế bào của

cây Pueraria tuberose có bổ sung các elicitor như YE, MeJA và SA. Hàm

lượng isoflavonoid thu được ơ mẫu có bổ sung 200 µg/L YE đạt cao nhất gấp

12,4 lần so với mẫu không bổ sung YE. Trong khi các mẫu có bổ sung SA hoặc

MeJA, hàm lượng isoflavonoid thấp hơn mẫu bổ sung YE nhưng vẫn cao hơn

mẫu đối chứng từ 9,53-10,1 lần [51].

95

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã xây dựng thành công hệ thống nuôi cấy cây nghệ đen có sử dụng

AgNO3, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào các môi trường nuôi cấy tạo cây in vitro

và nuôi cấy callus đều cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất.

2. Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp

curcuminoid, các gen này được đặt tên tương ứng là CzDCS, CzCURS1,

CzCURS2 và CzCURS3; có chiều dài lần lượt là 1382 bp, 1240 bp, 1288 bp và

1265 bp; tương đồng 99% so với các gen tương ứng ơ cây nghệ vàng và đã

được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là MF663785,

MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu hiện ơ trong

củ và callus của cây nghệ đen.

3. Các elicitor (dịch chiết nấm men và salicilic acid) đều có tác dụng tăng

cường mức độ biểu hiện của các gen cũng như sự tổng hợp curcumin. Giá trị

tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau 5 ngày nuôi cấy,

mức độ biểu hiện của các gen cao hơn 2,78 lần và hàm lượng curmin tích lũy

cao hơn 2,5 lần so với đối chứng không xử lý.

4. Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp curcumin ơ cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định

trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.

KIẾN NGHỊ

Đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu theo hướng ứng dụng, mơ rộng ơ

quy mô pilot, thăm dò thêm các elicitor khác, từ đó hoàn thiện quy trình sản

xuất để có thể áp dụng vào sản xuất ơ quy mô công nghiệp.

96

DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Trương Thị Phương Lan, Lê Thị Anh Thư, Ngô Thị Sen (2017) Ảnh hương

của AgNO3 đến quá trình tái sinh in vitro cây nghệ đen (Curcuma zedoaria

Roscoe). Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn 126(3D): 5-15.

2. Trương Thị Phương Lan, Lê Thị Anh Thư, Nguyễn Thị Hà Ngân (2017)

Thăm dò ảnh hương của môi trường nuôi cấy đến sinh trương của callus

nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe). Tạp chí Khoa học và Công nghệ,

Trường đại học Khoa học, Đại học Huế: Chuyên san Hóa-Sinh-Khoa học

Trái đất 12(2): 63-74.

3. Truong Thi Phuong Lan, Nguyen Duc Huy, Nguyen Ngoc Luong, Nguyen

Van Nghi, Trinh Huu Tan, Le Viet Quan, Nguyen Hoang Loc (2018)

Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway of

Curcuma zedoaria Roscoe. Current Pharmaceutical Biotechnology. DOI:

10.2174/1389201019666181008112244.

4. Truong Thi Phuong Lan, Nguyen Duc Huy, Nguyen Ngoc Luong, Hoang

Tan Quang, Trinh Huu Tan, Le Thi Anh Thu, Nguyen Xuan Huy, Nguyen

Hoang Loc (2019) Expression of elicitor-induced curcuminoid genes in cells

of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe). Journal of Plant Biotechnology

(accepted).

97

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Lê Quý Bảo (2004), "Các cấu tử dễ bay hơi của thân rễ Nga truật (Curcuma

zedoaria Rosc.) trồng ơ tỉnh Nghệ An và Hà Tĩnh", Tạp chí Dược học, 343, tr.

9-11.

2. Đào Hùng Cường (2003), "Tách chiết curcumin từ củ nghệ bằng dung môi

thực phẩm", Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, 11, tr. 36-40.

3. Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hưng, Phan Tống Sơn (1997), "Đóng góp vào

việc nghiên cứu các sesquiterpenoid trong thân rễ nghệ đen (Curcuma

zedoaria)", Tạp chí Hóa học và Công nghiệp Hóa chất, 4, tr. 9-11.

4. Trần Thị Việt Hoa, Trần Thị Phương Thảo, Vũ Thị Thanh Tâm (2007),

"Thành phần hóa học và tính kháng oxy hóa của nghệ đen Curcuma zedoaria

Berg trồng ơ Việt Nam", Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 10(4), tr.

37-47.

5. Nguyễn Hoàng Lộc (2011), Nuôi cấy mô và tế bào thực vật-Các khái niệm

và ứng dụng, Nxb Đại học Huế.

6. Đỗ Tất Lợi (1995), Tinh dầu Việt Nam, Nxb Y học, TP. Hồ Chí Minh.

7. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà

Nội.

8. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng (2010), Khảo sát vài

yếu tố ảnh hương đến sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào Taxus

wallichiana Zucc. in vitro, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 13(T3),

tr. 67-77.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

9. Abraham F., Bhatt A., Keng C.L., Indrayanto G., Sulaiman S.F. (2011),

Effect of yeast extract and chitosan on shoot proliferation, morphology and

98

antioxidant activity of Curcuma mangga in vitro plantlets, African Journal of

Biotechnology, 10(40), pp. 7787-7795.

10. Agrawal G.K., Rakwal R., Iwahashi H. (2002), Isolation of novel rice

(Oryza sativa L.) multiple stress responsive MAP kinase gene, OsMSRMK2,

whose mRNA accumulates rapidly in response to environmental cues,

Biochemical and Biophysical Research Communications, 294(5), pp. 1009-

1016.

11. Ahlawat S., Saxena P., Alam P., Wajid S., Abdin M.Z. (2014), Modulation

of artemisinin biosynthesis by elicitors, inhibitor, and precursor in hairy root

cultures of Artemisia annua L., Journal of Plant Interactions, 9(1), pp. 811-

824.

12. Ahmed S.A., Baig M.M.V. (2014), Biotic elicitor enhanced production of

psoralen in suspension cultures of Psoralea corylifolia L., Saudi Journal of

Biological Sciences, 21(5), pp. 499-504.

13. Akula R., Ravishankar G.A. (2011), Influence of abiotic stress signals on

secondary metabolites in plants, Plant Signaling & Behavior, 6(11), pp. 1720-

1731.

14. Amalraj A., Pius A., Gopi S., Gopi S. (2017), Biological activities of

curcuminoids, other biomolecules from turmeric and their derivatives – A

review, Journal of Traditional and Complementary Medicine, 7(2), pp. 205-

233.

15. Anisuzzaman M., Sharmin A., Mondal S.C., Sultana R., Khalekuzzaman

M., Alam I., Alam M.F. (2008), In vitro microrhizome in Curcuma zedoaria

(Christm.) Roscoe-a conservation prioritized medicinal plant, Journal of

Biological Sciences, 8(7), pp. 1216-1220.

16. Ansari M.H., Ahmad S. (1991), Screening of some medicinal plants for

antiamoebic action, Fitoterapia, 62, pp. 171-175.

99

17. Apostol I., Heinstein P.F., Low P.S. (1989), Rapid Stimulation of an

Oxidative Burst during Elicitation of Cultured Plant Cells : Role in Defense

and Signal Transduction, Plant Physiology, 90(1), pp. 109-116.

18. Arıcan E. (2016), Elicitation triterpene yield in Alstonia scholaris cell

cultures via synergetic organisms, Biotechnology & Biotechnological

Equipment, 30(5), pp. 915-920.

19. Armero J., Tena M. (2001), Possible role of plasma membrane H+-ATPase

in the elicitation of phytoalexin and related isoflavone root secretion in

chickpea (Cicer arietinum L.) seedlings, Plant Science, 161(4), pp. 791-798.

20. Azeez T.H.A., Ibrahim K.M. (2013), Effect of biotic elicitors on secondary

metabolite production in cell suspensions of Hypericum triquetrifolium,

Bulletin UASVM Horticulture, 70(1), pp. 26-33.

21. Babu K.N., Rajesh M.K., Samsudeen K., Minoo D., Suraby E.J., Anupama

K., Ritto P. (2014), Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and

Derived Techniques. In Besse P, ed. Molecular Plant Taxonomy: Methods and

Protocols. Totowa, NJ, Humana Press: 191-209

22. Badrhadad A., Piri K., Ghiasvand T. (2013), Increasing of alpha-tocopherol

in cell suspension cultures Elaeagnus angustifolia L., International Journal of

Agriculture and Crop Sciences, 5, pp. 1328-1331.

23. Behar N., Tiwari K.L., Jadhav S.K. (2013), In silico survey of genes

involved in curcuminoid synthesis for expression studies in Curcuma caesia

Roxb. IJCA Proceedings on National Seminar on Application of Artificial

Intelligence in Life Sciences NSAAILS, pp: 37-39.

24. Behar N., Tiwari K.L., Jadhav S.K. (2016), Semi-quantitative expression

studies of genes involved in biosynthesis of curcuminoid in Curcuma caesia

Roxb., Indian Journal of Biotechnology, 15, pp. 491-494.

25. Benhamou N. (1996), Elicitor-induced plant defence pathways, Trends in

Plant Science, 1(7), pp. 233-240.

100

26. Bharalee R., Das A., Kalita M.C. (2005), In vitro clonal propagation of

Curcuma caesia Roxb and Curcuma zedoaria Rosc. from rhizome bud

explants, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 14, pp. 61-63.

27. Bota C., Deliu C. (2012), Effect of some biotic elicitors on flavonoids

production in Digitalis lanata cell cultures, Revista medico-chirurgicala a

Societatii de Medici si Naturalisti din Iasi, 116(2), pp. 624-629.

28. Brand S., Hölscher D., Schierhorn A., Svatoš A., Schröder J., Schneider B.

(2006), A type III polyketide synthase from Wachendorfia thyrsiflora and its

role in diarylheptanoid and phenylphenalenone biosynthesis, Planta, 224(2),

pp. 413-428.

29. Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Mischenko N.P., Khodakovskaya M.V.,

Glazunov V.P., Radchenko S.V., Zvereva E.V., Fedoreyev S.A., Zhuravlev

Y.N. (2002), Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and

cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures

transformed with the rolB and rolC genes, Journal of Biotechnology, 97, pp.

213-221.

30. Champakaew D., Choochote W., Pongpaibul Y., Chaithong U., Jitpakdi A.,

Tuetun B., Pitasawat B. (2007), Larvicidal efficacy and biological stability of

a botanical natural product, zedoary oilimpregnated sand granules, against

Aedes aegypti, Parasitology Research, 100, pp. 729-737.

31. Chan L.K., Thong W.H. (2004), In vitro propagation of Zingiberaceae

species with medicinal properties, Journal of Plant Biotechnology, 6, pp. 181-

188.

32. Cheong J.J., Hahn M.G. (1991), A specific, high-affinity binding site for

the hepta-beta-glucoside elicitor exists in soybean membranes, The Plant Cell,

3(2), pp. 137.

33. Cheong J.J., Choi Y.D. (2003), Methyl jasmonate as a vital substance in

plants, TRENDS in Genetic, 19(7), pp. 409-413.

101

34. Chujo T., Takai R., Akimoto-Tomiyama C., Ando S., Minami E.,

Nagamura Y., Kaku H., Shibuya N., Yasuda M., Nakashita H., Umemura K.,

Okada A., Okada K., Nojiri H., Yamane H. (2007), Involvement of the elicitor-

induced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice,

Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression, 1769(7), pp.

497-505.

35. Chunfen Y., Xun S., Anchang L., Lin Z., Aihua Y., Yanwei X., Guangxi Z.

(2013), Advances in clinical study of curcumin, Current Pharmaceutical

Design, 19(11), pp. 1966-1973.

36. Cousins M.M., Adelberg J., Chen F., Rieck J. (2010), Secondary

metabolism-inducing treatments during in vitro development of turmeric

(Curcuma longa L.) rhizomes, Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants,

15(4), pp. 303-317.

37. Daduang S., Sattayasai N., Sattayasai J., Tophrom P., Thammathaworn A.,

Chaveerach A., Konkchaiyaphum M. (2005), Screening of plants containing

Naja naja siamensis cobra venom inhibitory activity using modified ELISA

technique, Analytical Biochemistry, 341, pp. 316-325.

38. De Navarro D.F., De Souza M.M., Neto R.A., Golin V., Niero R., Yunes

R.A., Delle M.F., Cechinel F.V. (2002), Phytochemical analysis and analgesic

properties of Curcuma zedoaria grown in Brazil, Phytomedicine, 9, pp. 427-

432.

39. Dong J., Wan G., Liang Z. (2010), Accumulation of salicylic acid-induced

phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and

antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture, Journal of

Biotechnology, 148(2-3), pp. 99-104.

40. Droillard M.J., Thibivilliers S., Cazalé A.C., Barbier-Brygoo H., Laurière

C. (2000), Protein kinases induced by osmotic stresses and elicitor molecules

102

in tobacco cell suspensions: two crossroad MAP kinases and one

osmoregulation-specific protein kinase, FEBS Letters, 474(2), pp. 217-222.

41. Duke A.J., Bogenschutz G.M.J., Du Cellier J., Duke P.G.K. (2003), CRC

handbook of medicinal spices, CRC Press, Boca Raton, Florida.

42. Dvořáková M., Valterová I., Vaněk T. (2007), Biotransformation of a

monoterpene mixture by in vitro cultures of selected conifer species, Natural

Product Communications, 2, pp. 233-238.

43. Ebrahimi M., Zarinpanjeh N. (2015), Bio-elicitation of β-carboline

alkaloids in cell suspension culture of Peganum harmala L., Journal of

Medicinal Plants, 14, pp. 35-49.

44. Ellard-Ivey M., Douglas C.J. (1996), Role of jasmonates in the elicitor- and

wound-Inducible expression of defense genes in parsley and transgenic

tobacco, Plant Physiology, 112(1), pp. 183-192.

45. Estrada-Soto S., Vergara-Martínez V., Arellano J., C. Rivera-Leyva J.,

Castillo-España P., Flores Flores A., T. Cardoso-Taketa A., Perea-arango I.

(2018), Methyl jasmonate and salicylic acid enhanced the production of ursolic

and oleanolic acid in callus cultures of Lepechinia caulescens, Pharmacognosy

Magazine, 13, pp. 886-889.

46. Fan X., Zhang C., Liu D.B., Yan J., Liang H.P. (2013), The clinical

applications of curcumin: Current state and the future, Current Pharmaceutical

Design, 19(11), pp. 2011-2031.

47. Felix G., Grosskopf D.G., Regenass M., Boller T. (1991), Rapid changes

of protein phosphorylation are involved in transduction of the elicitor signal in

plant cells, Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(19), pp. 8831-

8834.

48. Gelli A., Higgins V.J., Blumwald E. (1997), Activation of Plant Plasma

Membrane Ca2+-Permeable Channels by Race-Specific Fungal Elicitors, Plant

Physiology, 113(1), pp. 269-279.

103

49. Giang P.M., Huong V.N., Son P.T. (2000), Antimicrobial activity of

sesquitrepene contituents from some Curcuma species of Vietnam, Journal of

Chemistry, 38(1), pp. 91-94.

50. Gilani S.A., Kikuchi A., Shimazaki T., Wicaksana N., Wunna, Watanabe

K.N. (2015), Molecular genetic diversity of curcuminoid genes in Curcuma

amada: Curcuminoid variation, consideration on species boundary and

polyploidy, Biochemical Systematics and Ecology, 61, pp. 186-195.

51. Goyal S., Ramawat K.G. (2008), Increased isoflavonoids accumulation in

cell suspension cultures of Pueraria tuberosa by elicitors, Indian Journal of


52. Gunawardena A.H., Greenwood J.S., Dengler N.G. (2004), Programmed

cell death remodels lace plant leaf shape during development, Plant Cell

Report, 16, pp. 60-73.

53. Hamza M.A. (2013), Effect of yeast extract (biotic elicitor) and incubation

periods on selection of Lupinus termis explant in vitro, Journal of Applied

Sciences Research, 9(7), pp. 4186-4192.

54. Hanania U., Avni A. (1997), High-affinity binding site for ethylene-

inducing xylanase elicitor on Nicotiana tabacum membranes, The Plant

Journal, 12(1), pp. 113-120.

55. Hanif R., Qiao L., Shiff S.J., Rigas B. (1997), Curcumin, a natural plant

phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes

in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-independent pathway,

Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 130(6), pp. 576-584.

56. Harathi K., Naidu C.V. (2016), Influence of ethylene inhibitor silver nitrate

on direct shoot regeneration from in vitro raised shoot tip explants of

Sphaeranthus indicus Linn.-An important antijaundice medicinal plant,

American Journal of Plant Sciences, 7, pp. 525-532.

104

57. Hasanloo T., Eskandari S., Najafi F. (2014), Chitosan (middle-viscous) as

an effective elicitor for silymarin production in Silybum marianum hairy root

cultures, Research Journal of Pharmacognosy, 1, pp. 9-13.

58. Hayakawa H., Minaniya Y., Ito K., Yamamoto Y., Fukuda T. (2011),

Difference of curcumin content in Curcuma longa L. (Zingiberaceae) caused

by hybridization with other Curcuma species, American Journal of Plant

Sciences, 2, pp. 111-119.

59. Hong H.C., Noh M.S., Lee W.Y., Lee S.K. (2002), Inhibitory effects of

natural sesquiterpenoids isolated from the rhizome of Curcuma zedoaria on

prostaglandin E2 and nitric oxide production, Planta Medica, 68, pp. 545-547.

60. Huang M.T., Newmark H.L., Frenkel K. (1997), Inhibitory effects of

curcumin on tumorigenesis in mice, Journal of Cellular Biochemistry, 27, pp.

26-34.

61. Jang M.K., Sohn D.H., Ryu J.H. (2001), A curcuminoid and sesquiterpenes

as inhibitors of macrophage TNF-alpha release from Curcuma zedoaria, Planta

Medica, 67(6), pp. 550-552.

62. Jeong G.T., Park D.H. (2005), Enhancement of growth and secondary

metabolite biosynthesis: Effect of elicitors derived from plants and insects,

Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10(1), pp. 73.

63. Jiang M.C., Yang Yen H.F., Yen J.J., Lin J.K. (1996), Curcumin induces

apoptosis in immortalized NIH 3T3 and malignant cancer cell lines, Nutrition

and Cancer, 26(1), pp. 111-120.

64. Joy P.P., Thomas J., Mathew S., Skari B.P. (1998), Medicinal Plants:

Tropical Horticulture, Naya Prakash, Calcutta, India.

65. Katsuyama Y., Matsuzawa M., Funa N., Horinouchi S. (2008), Production

of curcuminoids by Escherichia coli carrying an artificial biosynthesis

pathway, Microbiology, 154(Pt 9), pp. 2620-2628.

105

66. Katsuyama Y., Kita T., Funa N., Horinouchi S. (2009), Curcuminoid

biosynthesis by two type III polyketide synthases in the herb Curcuma longa,

Journal of Biological Chemistry, 284(17), pp. 11160-11170.

67. Katsuyama Y., Kita T., Horinouchi S. (2009), Identification and

characterization of multiple curcumin synthases from the herb Curcuma longa,

FEBS Letters, 583(17), pp. 2799-2803.

68. Katsuyama Y., Hirose Y., Funa N., Ohnishi Y., Horinouchi S. (2010),

Precursor-directed biosynthesis of curcumin analogs in Escherichia coli,

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74(3), pp. 641-645.

69. Khojasteh A., Mirjalili M., Palazon J., Eibl R., Cusido R. (2016), Methyl

jasmonate-enhanced production of rosmarinic acid in cell cultures of Satureja

khuzistanica in a bioreactor, Engineering in Life Sciences, 16(8), pp. 740-749.

70. Kim D.I., Lee T.K., Jang T.H., Kim C.H. (2005), The inhibitory effect of a

Korean herbal medicine, Zedoariae rhizoma, on growth of cultured human

hepatic myofibroblast cells, Life Sciences, 77(8), pp. 890-906.

71. Kim Y.B., Reedb D.W., Covellob P.S. (2015), Production of triterpenoid

sapogenins in hairy root cultures of Silene vulgaris, Natural Product

Communications, 10(11), pp. 1919-1922.

72. Kita T., Imai S., Sawada H., Kumagai H., Seto H. (2008), The biosynthetic

pathway of curcuminoid in turmeric (Curcuma longa) as Revealed by 13C-

labeled precursors, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 72(7), pp.

1789-1798.

73. Kumar V., Parvatam G., Ravishankar G. (2009), AgNO3 - a potential

regulator of ethylene activity and plant growth modulator, Electronic Journal

of Biotechnology, 12(2), pp.

74. Lee J., Jung Y., Shin J.H., Kim H.K., Moon B.C., Ryu D.H., Hwang G.S.

(2014), Secondary metabolite profiling of Curcuma species grown at different

106

locations using GC/TOF and UPLC/Q-TOF MS, Molecules, 19(7), pp. 9535-

9551.

75. Lee J.K., Eom S.H., Hyun T.K. (2018), Enhanced biosynthesis of saponins

by coronatine in cell suspension culture of Kalopanax septemlobus, 3 Biotech,

8(1), pp. 59.

76. Leonel M., Sarmento S.B.S., Cereda M.P. (2003), New starches for the food

industry: Curcuma longa and Curcuma zedoaria, Carbohydrate Polymers, 54,

pp. 385-388.

77. Li P., Mao Z., Lou J., Li Y., Mou Y., Lu S., Peng Y., Zhou L. (2011),

Enhancement of diosgenin production in Dioscorea zingiberensis cell cultures

by oligosaccharides from its endophytic fungus Fusarium oxysporum Dzf17,

Molecules, 16(12), pp. 10631-10644.

78. Lobo R., Prabhu K.S., Shirwaikar A., Shirwaikar A. (2009), Curcuma

zedoaria Rosc. (white turmeric): a review of its chemical, pharmacological and

ethnomedicinal properties, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 61(1), pp.

13-21.

79. Loc N.H., Duc D.T., Kwon T.H., Yang M.S. (2005), Micropropagation of

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)-a valuable medicinal plant, Plant Cell,

Tissue and Organ Culture, 81, pp. 119-122.

80. Loc N.H., Ha T.T.T., Hirata Y. (2006), Effect of several factors on cell

biomass production of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe) in bioreactor,

Vietnamese Journal of Biotechnol, 4(2), pp. 213-220.

81. Loc N.H., Diem D.T.H., Binh D.H.N., Huong D.T., Kim T.G., Yang M.S.

(2008), Isolation and characterization of antioxidation enzymes from cells of

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe) cultured in a 5-l bioreactor, Molecular


82. Loc N.H., Tuan V.C., Binh D.H.N., Phuong T.T.B., Kim T.G., Yang M.S.

(2009), Accumulation of secquiterpenes and polysaccharides in cells of

107

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe) cultured in a 10 L bioreactor,

Biotechnology and Bioprocess Engineering, 14, pp. 619-624.

83. Loc N.H., An N.T.T. (2010), Asiaticoside production from cell culture of

centella (Centella asiatica L. Urban), Biotechnology and Bioprocess

Engineering, 15, pp. 1065-1070.

84. Loc N.H., Anh N.H.T., Binh D.H.N., Yang M.S., Kim T.G. (2010),

Production of glycoalkaloids from callus cultures of Solanum hainanense

Hance, Journal of Plant Biotechnology, 37, pp. 96-101.

85. Loc N.H., Thanh L.T.H. (2011), Solasodine production from cell culture of

Solanum hainanense Hance, Biotechnology and Bioprocess Engineering,

16(3), pp. 581-586.

86. Loc N.H., Giang N.T. (2012), Effects of elicitors on the enhancement of

asiaticoside biosynthesis in cell cultures of centella (Centella asiatica L.

Urban), Chemical Papers, 66(7), pp. 642-648.

87. Loc N.H., Anh N.H.T., Khuyen L.T.M., An T.N.T. (2014), Effects of yeast

extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis

in cell cultures of Solanum hainanense Hance, Journal of Plant Biochemistry

and Biotechnology, 3(1), pp. 1-6.

88. Loc N.H., Giang N.T., Huy N.D. (2016), Effect of salicylic acid on

expression level of genes related with isoprenoid pathway in centella (Centella

asiatica (L.) Urban) cells, 3 Biotech, 6(1), pp. 86-93.

89. Low P.S., Merida J.R. (1996), The oxidative burst in plant defense:

Function and signal transduction, Physiologia Plantarum, 96(3), pp. 533-542.

90. Luczkiewcz M., Cisowski W. (2001), Optimisation of the second phase of

a two phase growth system for anthocyanin accumulation in callus cultures of

Rudbeckia hirta, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65(1), pp. 57-68.

91. Manivannan A., Soundararajan P., Park Y.G., Jeong B.R. (2016), Chemical

elicitor-induced modulation of antioxidant metabolism and enhancement of

108

secondary metabolite accumulation in cell suspension cultures of Scrophularia

kakudensis Franch, International Journal of Molecular Sciences, 17(3), pp.

399.

92. Marcia O.M., Antônio F.C.A., Murilo M. (2000), Quantifying the micro

propagation of Curcuma zedoaria Roscoe, Scientia Agricola, 57, pp. 703-707.

93. Martinoia E., Klein M., Geisler M., Bovet L., Forestier C., Kolukisaoglu

U., Muller-Rober B., Schulz B. (2002), Multifunctionality of plant ABC

transporters-more than just detoxifiers, Planta Med, 214, pp. 345-355.

94. Masuda T., Jitoe A., Isobe J., Nakatani N., Yonemori S. (1993),

Antioxidative and anti-inflammatory curcumin-related phenolics from

rhizomes of Curcuma domestica, Phytochemistry, 32, pp. 1557-1560.

95. Matsuda H., Ninomiya K., Morikawa T., Yoshikawa M. (1998), Inhibitory

effect and action mechanism of sesquiterpenes from zedoariae rhizoma on D-

galactosamine/lipopolysaccharide -induced liver injury, Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters, 8, pp. 339-344.

96. Matsuda H., Morikawa T., Toguchida I., Ninomiya K., Yoshikawa M.

(2001), Inhibitors of nitric oxide production and new sesquiterpenes,

zedoarofuran, 4-epicurcumenol, neocurcumenol, gajutsulactones A, and B,

zedoarolodes A and B, from zedoariae rhizoma, Chem Pharma Bull, 49, pp.

1558-1566.

97. Mello M.O., Dias C.T.S., Amaral A.F.C., Melo M. (2001), Growth of

Bauhinia forficata Link, Curcuma zedoaria Roscoe and Phaseolus vulgaris L.

cell suspension cultures with carbon sources, Scientia Agricola, 58, pp. 481-

485.

98. Mello M.O., M. M., Appezzato-da-Glória B. (2001), Histological analysis

of the callogenesis and organogenesis from root segments of Curcuma zedoaria

Roscoe, Brazilian Archives of Biology and Technology, 44(2), pp. 197-203.

109

99. Memelink J., Verpoorte R., Kijne J.W. (2001), ORCAnization of

jasmonate-responsive gene expression in alkaloid metabolism, Trends in Plant

Science, 6(5), pp. 212-219.

100. Miachir J.I., Romani V.L.M., De Campos A.A.F., Mello M.O., Crocomo

O.J., Melo M. (2004), Micropropagation and callogenesis of Curcuma zedoaria

Roscoe, Scientia Agricola, 61(4), pp. 427-432.

101. Mihaljević I., Dugalić K., Tomaš V., Viljevac M., Pranjić A., Čmelik Z.,

Puškar B., Jurković Z. (2013), In vitro sterilization procedures for

micropropagation of ‘Oblačinska’ sour cherry, Journal of Agricultural

Sciences, 58(2), pp. 117-126.

102. Mohanty S., Panda M.K., Subudhi E., Nayak S. (2008), Plant regeneration

from callus culture of Curcuma aromatica and in vitro detection of somaclonal

variation through cytophotometric analysis, Biologia Plantarum, 52(4), pp.

783-786.

103. Moharrami F., Hosseini B., Farjaminezhad M., Sharafi A. (2017), Effects

of yeast extract on antioxidant activity and tropane alkaloids production in

hairy roots cultures of Hyoscyamus reticulatus L., Scientific Journal

Management System, 33(3), pp. 466-480.

104. Mohiuddin A.K.M., Chowdhury M.K.U., Abdullah Z.C., Napis S. (1997),

Influence of silver nitrate (ethylene inhibitor) on cucumber in vitro shoot

regeneration, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 51(1), pp. 75-78.

105. Morikawa T., Matsuda H., Ninomiya K., Yoshikawa M. (2002), Medicinal

foodstuffs. XXIX, Potent protective effects of sesquiterpenes and curcumin

from zedoariae rhizoma on liver injury induced by Dgalactosamine/

lipopolysaccharide or tumour necrosis factor-α, Biological & Pharmaceutical

Bulletin, 25, pp. 627-631.

110

106. Moscatiello R., Baldan B., Navazio L. (2013), Plant Cell Suspension

Cultures. In Maathuis FJM, ed. Plant Mineral Nutrients: Methods and

Protocols. Totowa, NJ, Humana Press: 77-93

107. Muffler K., Leipold D., Scheller M.-C., Haas C., Steingroewer J., Bley T.,

Neuhaus H.E., Mirata M.A., Schrader J., Ulber R. (2011), Biotransformation

of triterpenes, Process Biochemistry, 46(1), pp. 1-15.

108. Mulabagal V. T.H.S. (2004), Plant cell cultures- an alternative and

efficient source for the production of biologically important secondary

metabolites, Int J Appl Sci Engin, 2, pp. 29-48.

109. Nadkarni K.M. (1999), Indian Materia Medica, Popular Prakashan Private

Ltd., Mumbai, India.

110. Namdeo A.G., Patil S., Fulzele D.P. (2002), Influence of fungal elicitors

on production of ajmalicine by cell cultures of Catharanthus roseus,

Biotechnology Progress, 18(1), pp. 159-162.

111. Namdeo A.G. (2007), Plant cell elicitation for production of secondary

metabolites: A review, Pharmacognosy Reviews, 1(1), pp. 69-79.

112. Neumann K.H., Kumar A., Imani J. (2009), Plant cell and tissue culture-

A Tool in biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg.

113. Paek K., Chakrabarty D., Hahn E.J. (2005), Application of bioreactor

systems for large scale production of horticultural and medicinal plants, Plant

Cell, Tissue and Organ Culture, 81, pp. 287-300.

114. Paramapojn S., Gritsanapan W. (2009), Free radical scavenging activity

determination and quantitative analysis of curcuminoids in Curcuma zedoaria,

Current Science, 97(7), pp. 1069-1073.

115. Park T.W., Arasu V.M., Al-Dhabi A.N., Yeo K.S., Jeon J., Park S.J., Lee

Y.S., Park U.S. (2016), Yeast extract and silver nitrate induce the expression

111

of phenylpropanoid biosynthetic genes and induce the accumulation of

rosmarinic acid in Agastache rugosa cell culture, Molecules, 21(4), pp. 426.

116. Pawar H., Karde M., Mundle N., Jadhav P., Mehra K. (2014),

Phytochemical evaluation and curcumin content determination of turmeric

rhizomes collected from Bhandara district of Maharashtra (India), Journal of

Medical Chemistry, 4, pp. 588-591.

117. Pirian K., Piri K. (2013), Influence of yeast extract as a biotic elicitor on

noradrenaline production in hairy root culture of Portulaca oleracea L.,

International Journal of Plant Production, 4(11), pp. 2960-2964.

118. Pitta-Alvarez S.I., Spollansky T.C., Guilietti A.M. (2000), The influence

of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane

alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida, Enzyme and Microbial

Technology, 26, pp. 252-258.

119. Plunkett G.M., Lowry P.P., Vu N.V. (2004), Phylogenetic relationships

among Polyscias (Araliaceae) and close relatives from the Western Indian

ocean sasin, International Journal of Plant Sciences, 165(5), pp. 861-873.

120. Prakash S., Elangomathavan R., Seshadri S., Kathiravan K., Ignacimuthu

S. (2004), Efficient Regeneration of Curcuma amada Roxb. Plantlets from

Rhizome and Leaf Sheath Explants, Plant Cell, Tissue and Organ Culture,

78(2), pp. 159-165.

121. Qiao F., Chang X.-L., Nick P. (2010), The cytoskeleton enhances gene

expression in the response to the Harpin elicitor in grapevine, Journal of

Experimental Botany, 61(14), pp. 4021-4031.

122. Raghuveer G.P.S., Ali M.M., Eranna D., Ramachandra S.S. (2003),

Evaluation of anti-ulcer effect of root of Curcuma zedoaria in rats, Indian

Journal of Traditional Knowledge, 2(4), pp. 375-377.

123. Ramawat K.G., Merillon J.M. (2008), Bioactive Molecules and Medicinal

Plants, Springer-Verlag, Berlin, Germany.

112

124. Ramirez-Ahumada M.d.C., Timmermann B.N., Gang D.R. (2006),

Biosynthesis of curcuminoids and gingerols in turmeric (Curcuma longa) and

ginger (Zingiber officinale): Identification of curcuminoid synthase and

hydroxycinnamoyl-CoA thioesterases, Phytochemistry, 67(18), pp. 2017-2029.

125. Resmi M.S., Soniya E.V. (2012), Molecular cloning and differential

expressions of two cDNA encoding Type III polyketide synthase in different

tissues of Curcuma longa L., Gene, 491(2), pp. 278-283.

126. Rezaei A., Ghanati F., Dehaghi M.A. (2011), Stimulation of taxol

production by combined salicylic acid elicitation and sonication in Taxus

baccata cell culture. International Conference on Life Science and Technology,

Singapore, pp: 193-197.

127. Rhee H.S., Cho H.-Y., Son S.Y., Yoon H.S.-Y., J.M. J.M.P. (2010),

Enhanced accumulation of decursin and decursinol angelate in root cultures and

intact roots of Angelica gigas Nakai following elicitation, Plant Cell, Tissue

and Organ Culture, 101, pp. 295-302.

128. Rodrigues J.L., Araújo R.G., Prather K.L.J., Kluskens L.D., Rodrigues

L.R. (2015), Production of curcuminoids from tyrosine by a metabolically

engineered Escherichia coli using caffeic acid as an intermediate,

Biotechnology Journal, 10(4), pp. 599-609.

129. Romeis T. (2001), Protein kinases in the plant defence response, Current

Opinion in Plant Biology, 4(5), pp. 407-414.

130. Roughley P.J., Whiting D.A. (1973), Experiments in the biosynthesis of

curcumin, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, (0), pp.

2379-2388.

131. Saeed S., Ali H., Khan T., Kayani W., Khan M.A. (2017), Impacts of

methyl jasmonate and phenyl acetic acid on biomass accumulation and

antioxidant potential in adventitious roots of Ajuga bracteosa Wall ex Benth.,

113

a high valued endangered medicinal plant, Physiology and Molecular Biology

of Plants, 23(1), pp. 229-237.

132. Sakui N., Kuroyanagi M., Ishitobi Y., Sato M., Ueno A. (1992),

Biotransformation of sesquiterpenes by cultured cells of Curcuma zedoaria,

Phytochemistry, 31(1), pp. 143-147.

133. Sambrook J., Russell W.D. (2001), Molecular cloning: a laboratory

manual, 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

134. Sandra A.T., Maira O. (2013), Effect of culture medium consistence and

silver nitrate on micropropagation of two potato (Solanum tuberosum)

cultivars, Revista Colombiana de Biotecnología, 15, pp. 55-62.

135. Saralamp P., Chuakual W., Temsirikul R., Clayton T. (2000), Medicinal

plants in Thailand, Amerin Printing and Publishing Public Co., Ltd., Bangkok,

Thailand.

136. Sarkate A. (2017), Antioxidant and cytotoxic activity of bioactive

phenolic metabolites isolated from the yeast-extract treated cell culture of

apple, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 130(3), pp. 641-649.

137. Sarropoulou V., Dimassi-Theriou K., Therios I. (2016), Effect of the

ethylene inhibitors silver nitrate, silver sulfate, and cobalt chloride on

micropropagation and biochemical parameters in the cherry rootstocks CAB-

6P and Gisela 6, Turkish Journal of Biology, 40, pp. 670-683.

138. Schoch G.A., Nikov G.N., Alworth W.L., Werck-Reichhart D. (2002),

Chemical inactivation of the cinnamate 4-hydroxylase allows for the

accumulation of salicylic acid in elicited cells, Plant Physiology, 130(2), pp.

1022-1031.

139. Schopfer C.R., Kochs G., Lottspeich F., Ebel J. (1998), Molecular

characterization and functional expression of dihydroxypterocarpan 6a-

hydroxylase, an enzyme specific for pterocarpanoid phytoalexin biosynthesis

in soybean (Glycine max L.), FEBS Letters, 432(3), pp. 182-186.

114

140. Seo W.G., Hwang J.C., Kang S.K., Jin U.H., Suh S.J., Moon S.K. (2005),

Suppressive effect of Zedoariae rhizome on pulmonary metastasis of B16

melanoma cells, Journal of Ethnopharmacology, 101, pp. 249-257.

141. Sgamma T., Thomas B., Muleo R. (2015), Ethylene inhibitor silver nitrate

enhances regeneration and genetic transformation of Prunus avium (L.) cv

Stella, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 120(1), pp. 79-88.

142. Shahinozzaman M., Faruq M.O., Kalam Azad M.A., Amin M.N. (2013),

Studies on in vitro propagation of an important medicinal plant-Curcuma

zedoaria Roscoe using rhizome explants, Persian Gulf Crop Protection, 2(2),

pp. 1-6.

143. Sharma M., Sharma A., Ashwani K., Kumar B.S. (2011), Enhancement of

secandary metabolites in cultured plant cells thoungh stress stimulus, American

Journal of Plant Physiology, 6(2), pp. 50-71.

144. Shin K.H., Yoon K.Y., Cho T.S. (1994), Pharmacologycal activities of

sesquiterpenes from the rizhome of Curcuma zedoaria, Saengyak Hakhoechi,

25, pp. 221-225.

145. Srvidya A.R., Yadev A.K., Dhanbal S.P. (2009), Antioxidant and

antimicrobial activity of rhizome of Curcuma aromatica and Curcuma

zeodaria, leaves of Abutilon indicum, Archives of Pharmaceutical Science and

Research, 1(1), pp. 14-19.

146. Stanly C., Keng C.L. (2007), Micropropagation of Curcuma zedoaria

Roscoe and Zingiber zerumbet Smith, Biotechnology & Biotechnological

Equipment, 6(4), pp. 555-560.

147. Stanly C., Bhatt A., Keng C.L. (2010), A comparative study of Curcuma

zedoaria and Zingiber zerumbet plantlet production using different

micropropagation systems, African Journal of Biotechnology, 9(28), pp. 4326-

4333.

115

148. Sudha G., Ravishankar G.A. (2003), Influence of methyl jasmonate and

salicylic acid in the enhancement of capsaicin production in cell suspension

cultures of Capsicum frutescens Mill, Current Science, 85(8), pp. 1212-1217.

149. Syu W.J., Shen C.C., Don M.J., Ou J.C., Lee G.H., Sun C.M. (1998),

Cytotoxicity of curcuminoids and some novel compounds from Curcuma

zedoaria, Journal of Natural Products, 61, pp. 1531-1534.

150. Taguchi G., Yazawa T., Hayashida N., Okazaki M. (2001), Molecular

cloning and heterologous expression of novel glucosyltransferases from

tobacco cultured cells that have broad substrate specificity and are induced by

salicylic acid and auxin, Journal of Biochemistry, 268, pp. 4086-4094.

151. Tamimi S.M. (2015), Effects of ethylene inhibitors, silver nitrate

(AgNO3), cobalt chloride (CoCl2) and aminooxyacetic acid (AOA), on in vitro

shoot induction and rooting of banana (Musa acuminata L.), African Journal

of Biotechnology, 14(32), pp. 2510-2516.

152. Teixeira Da Silva J.A. (2013), The effect of ethylene inhibitors (AgNO3,

AVG), an ethylene-liberating compound (CEPA) and aeration on the formation

of protocorm-like bodies of hybrid Cymbidium (Orchidaceae), Frontiers in

Biology, 8(6), pp. 606-610.

153. Thach B.D., Le N.T.L., Diep T.C., Trinh T.B., Tran T.L.G., Nguyen

P.A.U., Ngo K.S. (2016), Protocol establishment for multiplication and

renegeration of Polycias fruticosa (L.) Harms. An inportant medicinal plant in

Viet Nam, European Journal of Biotechnology and Genetic Engineering, 3(1),

pp. 31-37.

154. Thanh N.T., Murthy H.N., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2005), Methyl

jasmonate elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension

culture of Panax ginseng in 5L balloon type bubble bioreactor, Apply

Microbiology Biotechnology, 67, pp. 197-201.

116

155. Tohda C., Nakayama N., Hatanaka F., Komatsu K. (2006), Comparison

of antiinflammatory activities of six curcuma rhizomes: a possible curcuminoid

indepent pathway mediated by curcuma phaeocaulis extract, Evid Based

Complement Alternat Med, 3, pp. 255-260.

156. Tuan V.C., Hoang V.D., Loc N.H. (2011), Cell suspension culture of

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe), VNU Journal of Science, Natural

Sciences and Technology, 27, pp. 64-70.

157. Ullah H.M.A., Zaman S., Juhara F., Akter L., Tareq S.M., Masum E.H.,

Bhattacharjee R. (2014), Evaluation of antinociceptive, in-vivo & in-vitro anti-

inflammatory activity of ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizome, BMC

Complementary and Alternative Medicine, 14(1), pp. 346.

158. Walker T.S., Pal Bais H., Vivanco J.M. (2002), Jasmonic acid-induced

hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L.

(St. John's wort), Phytochemistry, 60(3), pp. 289-293.

159. Wang J., Qian J., Yao L., Lu Y. (2015), Enhanced production of

flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of

Hypericum perforatum, Bioresources and Bioprocessing, 2(1), pp. 5.

160. Wang S., Zhang S., Xiao A., Rasmussen M., Skidmore C., Zhan J. (2015),

Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of various

phenylpropanoid derivatives, Metabolic Engineering, 29, pp. 153-159.

161. Watanabe K., Shibata M., Yano S., Cai Y., Shibuya H., Kitagawa I.

(1986), Antiulcer activity of extracts and isolated compound from zedoary

(Gajustsu) cultivated in Yakushima (Japan), Yakugaku Zasshi, 106(12), pp.

1137-1142.

162. Wilson B., Abraham G., Manju V.S., Mathew M., Vimala B., Sundaresan

S., Nambisan B. (2005), Antibacterial activity of Curcuma zedoaria and

Curcuma malabarica tubers, Journal of Ethnopharmacology, 99, pp. 147-151.

117

163. Xie Z., Ma X., Gang D.R. (2009), Modules of co-regulated metabolites in

turmeric (Curcuma longa) rhizome suggest the existence of biosynthetic

modules in plant specialized metabolism, Journal of Experimental Botany,

60(1), pp. 87-97.

164. Xing Y. (1999), The chemical constituents of the essential oil from

Curcuma zedoaria (Christm) Rosc., Journal of essential oil-bearing plants

JEOP, 19(1), pp. 95-96.

165. Yeoman M.M., Meidzybrodzka M.B., Lindsey K., McLauchlan W.R.

(1980), The synthetic potential of cultured plant cells. Plant cell cultures:

results and perspectives. Amsterdam, Elsevier: 327-343

166. Yu L.J., Lan W.Z., Qin W.M., Xu H.B. (2001), Effects of salicylic acid

on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and taxol production

in cell suspension cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 37(5), pp.

477-482.

167. Yu Z.Z., Fu C.X., Han Y.S., Li Y.X., Zhao D.X. (2005), Salicylic acid

enhances jaceosidin and siringin production in cell cultures of Saussurea

medusa, Biotechnology Letters, 28(13), pp. 1027-1031.

168. Zhang S., Liu N., Sheng A., Ma G., Wu G. (2011), In vitro plant

regeneration from organogenic callus of Curcuma kwangsiensis Lindl.

(Zingiberaceae), Plant Growth Regulation, 64(2), pp. 141-145.

169. Zhao J.L., Zhou L.G., Wu J.Y. (2010), Effects of biotic and abiotic

elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell

cultures, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1), pp. 137-144.

a

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 : Trình tự các gen trên ngân hang gen

LOCUS MF663785 1382 bp DNA linear PLN 22-JUL-2018

DEFINITION Curcuma zedoaria diketide-CoA synthase (DCS) gene, complete cds.

ACCESSION MF663785

VERSION MF663785.1

KEYWORDS .

SOURCE Curcuma zedoaria

ORGANISM Curcuma zedoaria

Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;

Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Zingiberales;

Zingiberaceae; Curcuma.

REFERENCE 1 (bases 1 to 1382)

AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Lan,T.T.P., Quan,L.V. and Nghi,N.V.

TITLE Identification and characterization of genes in curcuminoid pathway

of Curcuma zedoaria

JOURNAL Unpublished



TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (12-AUG-2017) Institute of Bioactive Compounds and

Department of Biotechnology, College of Sciences, Hue University,

77 Nguyen Hue street, Hue, Thua Thien Hue 530000, Vietnam

COMMENT ##Assembly-Data-START##

Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing

##Assembly-Data-END##

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1382

/organism="Curcuma zedoaria"

/mol_type="genomic DNA"

/db_xref="taxon:136224"

gene <1..>1382

/gene="DCS"

/note="CzDCS"

mRNA join(<1..175,303..856,942..>1382)

/gene="DCS"

/product="diketide-CoA synthase"

CDS join(1..175,303..856,942..1382)

/gene="DCS"

/codon_start=1

/product="diketide-CoA synthase"

/protein_id="AXC59785.1"

/translation="MEANGYRITHSADGPATILAIGTANPTNVVDQNAYPDFYFRVTN

SEHLQELKAKFRRICEKAAIRKRHLYLTEEILRENPSLLAPMAPSFDARQAIVVEAVP

KLAKEAAEKAIKEWGRPKSDITHLVFCSASGIDMPGSDLQLLKLLGLPPSVNRVMLYN

VGCHAGGTALRVAKDLAENNRGARVLAVCSEVTVLSYRGPHPAHIESLFVQALFGDGA

AALVVGSDPVDGVERPIFEIASASQVMLPESEEAVGGHLREIGLTFHLKSQLPSIIAS

NIEQSLTTACSPLGLSDWNQLFWAVHPGGRAILDQVEARLGLEKDRLAATRHVLSEYG

NMQSATVLFILDEMRNRSAAEGHATTGEGLDWGVLLGFGPGLSIETVVLHSCRLN"

ORIGIN

1 atggaagcga acggctaccg cataactcac agcgccgacg ggccggcgac gatcttggcc

61 atcggcaccg ccaaccccac caacgtcgtc gaccagaacg cttatcccga cttctatttc

121 cgggtcacca actccgagca tctgcaggaa ctcaaagcca agtttaggcg catctgtaag

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=136224


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF663785.1?from=1&to=1382

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF663785.1?location=1:175,303:856,942:1382

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF663785.1?location=1:175,303:856,942:1382

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1430152226

b

181 atttatgtag tttgattgaa tgatgggtcg taattcaaac agaatgatcg atgatcatgt

241 taggaattgg tggtttggtg gatttatgtg ggtgcgtgtg acctgttcga ttacatgtgt

301 aggtgagaaa gcggcgatca ggaagaggca cttgtacttg actgaggaga ttttgcggga

361 gaatcctagc ttgctggctc ccatggcgcc gtcgttcgac gcgcggcagg cgatcgtggt

421 ggaggcggtg ccgaagctag cgaaggaggc ggcggagaag gcgatcaagg agtggggtcg

481 ccccaaatcg gacatcacgc acctcgtctt ctgctccgcg agcggaatcg acatgcccgg

541 ctccgacctg cagcttctca agctgctcgg gctcccgccg agcgtcaatc gcgtcatgct

601 ctacaacgtc gggtgccacg ccggtggcac cgccctccgc gtcgccaagg acctcgcgga

661 gaacaaccgc ggcgcgcggg tgctcgccgt ctgctccgag gtcaccgtgc tctcctaccg

721 cggcccccac cccgcccaca tcgagagcct cttcgtccaa gctctgtttg gcgacggcgc

781 tgccgcgctc gtggtcgggt ccgaccccgt cgatggcgtc gagcgcccca tcttcgaaat

841 cgcctcggca tcccaagtaa tcgctgctcc agtcgaaatt aaccaaaatt cgatcttttg

901 atatcgaacg aactttaaaa atcaaatctt tggcaccgca ggtgatgctt ccggagagcg

961 aagaggcggt aggcggccac ctccgcgaaa ttgggctgac cttccacctc aagagccagc

1021 ttccgtcgat catcgcgagc aacatcgagc agagcctgac gactgcgtgc tcgccgctgg

1081 ggctgtcgga ctggaaccag ctgttctggg cggttcaccc cggcggccga gcgatcctgg

1141 accaggtgga ggcgcggctc ggactggaga aggaccggct cgccgcgacg cggcacgtac

1201 tcagcgagta cggcaacatg cagagcgcca cggtgctgtt catcctggac gagatgcgga

1261 accgctcggc tgcggagggc cacgccacca ccggcgaggg gctcgactgg ggcgtgcttt

1321 tgggcttcgg cccgggactc tccatcgaga ccgtcgtcct ccatagttgc agactgaact

1381 ag

//

c

LOCUS MF402846 1240 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018

DEFINITION Curcuma zedoaria curcuminoid synthase 1 (CURS1) gene, complete cds.

ACCESSION MF402846

VERSION MF402846.1

KEYWORDS .









of Curcuma zedoaria Roscoe

JOURNAL Unpublished




JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and




source 1..1240




gene <1..>1240

/gene="CURS1"

mRNA join(<1..178,249..>1240)

/gene="CURS1"

/product="curcuminoid synthase 1"

CDS join(1..178,249..1240)

/gene="CURS1"

/EC_number="2.3.1.217"

/codon_start=1


/protein_id="AWK77185.1"

/translation="MANLHALRREQRAQGPATIMAIGTATPPNLYEQSTFPDFYFRVT

NSDDKQELKKKFRRMCDKTMVKKRYLHLTEEILKERPKLCSYKEASFDDRQDIVVEEI

PRLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLTVNRLMIY

SQACHMGAAMLRIAKDLAENNRGARVLVVACEITVLSFRGPNEGDFEALAGQAGFGDG

AGAVVVGADPLEGIEKPIYEIAAAMQETVAESQGAVGGHLRAFGWTFYFLNQLPAIIA

DNLGRSLERALAPLGVTEWNDVFWVAHPGNWAIMDAIEAKLQLSPDKLSTARHVFTEY

GNMQSATVYFVMDELRKRSAVEGRSTTGDGLQWGVLLGFGPGLSIETVVLRSMPL"

ORIGIN

1 atggccaacc tccacgcgtt gcgcagggag cagagggctc aaggtcccgc caccatcatg

61 gccatcggga cggccacccc ccccaacctc tacgagcaga gcaccttccc ggacttctac

121 ttccgcgtca ccaactccga cgacaagcag gagctcaaga aaaagttccg ccgcatgtgt

181 aagtaatcga tcgatgatcc gttcagttga tgtaattcga tcggtgattg atttggagaa

241 gtaaataggc gataagacga tggtgaagaa gcggtacctg cacttgaccg aggagatcct

301 gaaggagagg cccaagctct gctcctacaa ggaggcgtcg ttcgacgacc ggcaggacat

361 cgtggtggag gagataccga gattggctaa agaagcggcg gagaaggcca tcaaggagtg

421 ggggcggccc aaatcggaga tcacccacct ggtcttctgt tccatcagcg ggatcgacat

481 gcccggcgcc gactaccgcc tcgccacgct cctcggcctc cctctcaccg tcaaccgcct

541 catgatctac agccaggcct gccacatggg cgccgccatg ctccgcatcg ccaaggacct

601 cgccgagaac aacaggggcg cgcgcgtgct ggtggtcgcc tgcgagatca ccgtgctcag

661 cttccgcggc ccgaacgagg gcgacttcga ggcgctcgcg gggcaggccg gcttcggcga



https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF402846.1?location=1:178,249:1240


d

721 cggcgcgggg gccgtcgtcg tcggggccga cccgctggaa ggaattgaaa aacccatcta

781 cgagatcgcg gcggcgatgc aggagacggt ggcggagagc cagggggcgg tgggcggcca

841 cctgcgggcg ttcggctgga cgttctactt cctgaaccag ctgccggcga tcatcgccga

901 caacctcggg aggagcctgg agcgggcgtt ggcgccgctg ggggtgacgg agtggaacga

961 cgtcttctgg gtggcgcacc cgggcaactg ggccatcatg gacgccatcg aagccaagct

1021 gcagctgagc ccggacaagc tcagcaccgc ccgccacgtc ttcacagagt acggcaacat

1081 gcagagcgcc accgtgtact tcgtgatgga tgagctgagg aagcggtcgg cggtggaggg

1141 gcggagcacc accggagacg gcttgcagtg gggagttctc ctcggttttg ggccgggcct

1201 cagcatcgag accgttgtac tgcgcagtat gccactgtag

//

e

LOCUS MF402847 1288 bp DNA linear PLN 23-MAY-2018

DEFINITION Curcuma zedoaria curcuminoid synthase 2 (CURS2) gene, complete cds.

ACCESSION MF402847

VERSION MF402847.1

KEYWORDS .









of Curcuma zedoaria Roscoe

JOURNAL Unpublished




JOURNAL Submitted (26-JUN-2017) Institute of Bioactive Compounds and







source 1..1288




gene <1..>1288

/gene="CURS2"

mRNA join(<1..184,297..>1288)

/gene="CURS2"


CDS join(1..184,297..1288)

/gene="CURS2"

/EC_number="2.3.1.217"

/codon_start=1


/protein_id="AWK77186.1"

/translation="MAMISLQAMRKAQRAQGPATILAVGTANPPNLYEQDTYPDYYFR

VTNSEHRQELKNKFRRMCEKTMVKRRYLYLTPEILKERPKLCSYMEPSFDDRQDIVVE

EVPKLAAEAAEKAIKEWGGEKSAITHLVFCSISGIDMPGADYRLAKLLGLPLAVNRLM

LYSQACHMGAAMLRIAKDIAENNRSARVLVVACEITVLSFRGPDERDFQALAGQAGFG

DGAGAMIVGADPVLGVERPLYHIMSATQTTVPESEKAVGGHLREVGLTFHFFNQLPAI

IADNVGNSLAEAFEPIGIKDWNNIFWVAHPGNWAIMDAIETKLGLEQSKLATARHVFS

EFGNMQSATVYFVMDELRKRSAAENRATTGDGLRWGVLFGFGPGISIETVVLQSVPL"

ORIGIN

1 atggcgatga tcagcttgca ggcgatgcgc aaggcgcaga gagctcaagg tccggccacc

61 atcttggccg tcggcaccgc caacccgccc aatctctacg agcaggacac gtatcccgac

121 tactacttcc gcgtcaccaa ctccgagcac aggcaggagc tcaagaacaa gttccgccgc

181 atgtgtaagt tcttcgatcg atcctttttt ggttttcgaa aaaagtgagt ttttaatggg

241 aaaagcagag gatcgaggtg gaacgggagg attgatttgg tttaatttga ttgcaggcga

301 gaagacgatg gtgaagaggc ggtatcttta cctgacgccg gagatcctga aggagcggcc

361 gaagctgtgc tcgtacatgg agccgtcgtt cgacgaccgg caggacatcg tggtggagga

421 ggtgccgaag ctggccgcgg aggcagcgga gaaggccatc aaggagtggg gcggcgagaa

481 gtcggccatc acccacctgg tcttctgctc catcagcggc atcgacatgc ccggagctga






https://enzyme.expasy.org/EC/2.3.1.217


f

541 ctaccgcctc gccaagctcc tcgggctccc gctcgccgtc aaccgcctga tgctctacag

601 ccaggcctgc cacatgggcg ccgccatgct gcgcatagcc aaggacatcg ccgagaacaa

661 ccgctccgct cgcgtcctcg tcgtcgcctg cgagatcacc gtgctcagct tccgcggccc

721 ggacgagcgc gacttccagg cgctggccgg ccaggccggc ttcggggacg gcgccggcgc

781 gatgatcgtc ggggccgacc ccgtcctcgg cgtcgagcgg ccgctctacc acatcatgtc

841 ggcgactcag acgacggtgc cggagagcga gaaggcggtg gggggccacc tccgcgaggt

901 ggggctgacc ttccacttct tcaaccagct gccggcgatc atcgccgaca acgtggggaa

961 cagcctggcg gaggcgttcg aaccgatcgg gatcaaggac tggaacaaca tcttctgggt

1021 ggcgcacccg ggcaactggg ccatcatgga cgccatcgag accaagctgg gcctggaaca

1081 gagcaagctg gccaccgcac gccacgtctt ctccgagttc ggcaacatgc agagcgccac

1141 cgtctacttc gtgatggacg agctcaggaa acggtcggcg gcggagaacc gggcgaccac

1201 cggcgacggg ctccggtggg gcgtgctctt cggcttcggc cccggcatca gcatcgaaac

1261 cgtcgtgctc caaagcgtgc cgctttag

//

g

LOCUS MF987835 1265 bp DNA linear PLN 01-SEP-2018

DEFINITION Curcuma zedoaria curcumin synthase 3 (CURS3) gene, complete cds.

ACCESSION MF987835

VERSION MF987835.1

KEYWORDS .







AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V.

and Nghi,N.V.

TITLE Identification and characterization of several genes in curcuminoid

pathway of Curcuma zedoaria

JOURNAL Unpublished


AUTHORS Loc,N.H., Huy,N.D., Truong,L.T.P., Luong,N.N., Tan,T.H., Quan,L.V.

and Nghi,N.V.


JOURNAL Submitted (19-SEP-2017) Institute of Bioactive Compounds and







source 1..1265




gene <1..>1265

/gene="CURS3"

/note="CzCURS3"

mRNA join(<1..178,271..>1265)

/gene="CURS3"

/product="curcumin synthase 3"

CDS join(1..178,271..1265)

/gene="CURS3"

/EC_number="2.3.1.217"

/codon_start=1

/product="curcumin synthase 3"

/protein_id="AXQ39866.1"

/translation="MGSLQAIRRAQRAQGPATIMAVGTSNPPNLYEQTSYPDFYFRVT

NSDHKHELKNKFRVICEKTKVKRRYLHLTEEILKQRPKLCSYMEPSFDDRQDIVVEEI

PKLAKEAAEKAIKEWGRPKSEITHLVFCSISGIDMPGADYRLATLLGLPLSVNRLMLY

SQACHMGAQMLRIAKDLAENNRGARVLAVSCEITVFSFRGPDAGDFEALACQAGFGDG

AAAVVVGADPLPGVERPIYEIAAAMQETVPESERAVGGHLREIGWTFHFFNQLPKLIA

ENIEGSLARAFKPLGISEWNDVFWVAHPGNWGIMDAIETKLGLEQGKLATARHVFSEY

GNMQSATVYFVMDEVRKRSAAEGRATTGEGLEWGVLFGFGPGLTIETVVLRSVPLP"

ORIGIN

1 atgggcagcc tgcaggcgat tcgcagagca cagcgggctc aaggcccggc caccatcatg

61 gctgtcggca cctccaaccc gcctaacctc tacgagcaga cctcctaccc cgacttctat

121 ttccgcgtca ccaactccga ccacaagcac gagctcaaga acaaattccg tgttatctgg

181 aattaattcg cacccatctt ttggttattg atcagttcga tttaaattag ggagttagtt

241 aattaataat attattatta ttctaaatag gtgagaagac gaaggtgaaa agacggtact

301 tgcacttgac ggaggagatc ctgaagcaga ggcccaagct ctgctcctac atggagccct






https://enzyme.expasy.org/EC/2.3.1.217


h

361 ccttcgacga ccggcaggac atcgtggtgg aggagatacc gaagctggcg aaggaggcgg

421 cggaaaaggc gatcaaggaa tggggccgcc ccaagtcgga gatcacccac ttggtgttct

481 gctccatcag cggyatcgac atgcccggcg ccgattaccg cctcgccacg ctcctcggcc

541 tccccctgtc cgtcaaccgc ctcatgctct acagccaggc ctgccacatg ggcgcgcaga

601 tgctgcgcat agccaaggac ctcgcggaga acaaccgggg cgcgcgcgtc ctggccgtct

661 cctgcgaaat caccgtgttc agcttccgcg gtcccgacgc gggcgacttc gaggccctcg

721 cgtgtcaggc cggcttcggc gacggtgccg ctgccgtcgt cgtcggggcc gaccccctcc

781 cgggcgtcga gaggcccatc tacgagatcg cggcggcgat gcaggaaacg gtgccggaga

841 gcgagagggc ggtggggggc cacctgaggg aaatcggctg gaccttccac ttcttcaacc

901 agctgccgaa gctgatcgcg gaaaacatcg agggcagcct ggcgcgggcg ttcaagccgc

961 tggggatcag cgagtggaac gacgtgttct gggtggcgca cccggggaat tggggcatca

1021 tggacgccat cgagaccaag ctggggctgg aacaggggaa gctcgccacg gcgcgccacg

1081 tcttcagcga gtacggaaac atgcagagcg ccaccgtgta cttcgtgatg gacgaggtga

1141 ggaagcggtc ggcggcggag gggcgggcca ccaccggcga aggcctggag tggggagtgc

1201 tgtttgggtt tggcccaggc ctcaccatag aaactgtcgt gctacgcagt gtaccattac

1261 cgtag

//

Phụ lục 2. Đường chuẩn curcumin

Hình 1. Đường chuẩn curcumin dựa trên kết quả HPLC

Phụ lục 3. Hình ảnh thí nghiệm

Hình 2: Tế bao nghệ đen để lắng trong bình tam giác 250 ml

Hình 3: Cây nghệ đen in vitro

Hình 4: Tế bao Callus nghệ đen

Hình 5: Nuôi cấy tế bao nghệ đen trong bình tam giác 250ml đặt trên máy

lắc

Hình 6: Sinh khôi tươi tế bao nghệ đen sau 14 ngay nuôi cấy

Hình 7: Cây nghệ đen tự nhiên

nghiÊn cỨu Ảnh hƯỞng cỦa chẤt kÍch khÁng lÊn sỰ...

Documents