METODE MOLEKULSKE SPEKTROHEMIJE U FORENZICI

-određivanje jedinjenja (molekula) prisutnih u uzorku-

Dr Nada Bošnjaković-Pavlović

nadab@ffh.bg.ac.rs

Energetski nivoi u molekulima su mnogosloženiji od onih u atomima

Svaki elektronski nivo ima mnogovibracionih,a svaki vibracioni mnogorotacionih nivoa

Čisti elektronskienergetski nivoi

Vibracioni nivoi

Elektronski nivoi

Rotacioninivoi

Energetski nivoi molekula

Elektronskinivoi

Vibracioni nivoi

Vibracioninivoi

Rotacioni nivoi

Figure 2.The ground state consists of one electronic energy level, one or more vibrational energy levels, and a very large number of ro tational energy states.The excited state has the same features. The result of transitions between all

Wavelength

these levels is a broad spectrum, rather than a series of narrow lines.

ABSORBANCE

L i n e E m i s s i o n S p e c t r a f o r A t o m s

B r o a d A b s o r p t i o n S p e c t r u m f o r M o l e c u l e s

Linijski emisioni spektar atoma

Širok apsorpcioni spektar molekula

Osnovno stanje se sastoji od jednog elektronskog energetskog nivoa, jednog ili više vibracionih i velikog broja rotacionih stanja. Slično je sa pobuđenim stanjima. Pri prelazu

između svih ovih nivoa nastaje širok spektar a ne niz oštrih linija

- energetski nivoi molekula imaju slozeniju strukturu u odnosu na atomske.

- pored potencijalne energije elektrona, što imamo i kod atoma, molekuli imaju i vrbracionu i rotacionu energiju, koja je takođe kvantovana.

Sve energije, sem KE su kvantirane

Euk = Erot+ Evib+ Eele

Rotacioni Energetski nivoi

Vibracioni Energetski nivoi

Osnovno Elektronsko Stanje

Pobudjeno Elektronsko Stanje

Energetski nivoi molekula

Molekulski spektri nastaju kao posledica prelaza između energetskih nivoa

Rotacioni Energetski Nivoi

VibracioniEnergetski Nivoi

Osnovno Elektronsko Stanje

PobudjenoElektronskoStanje

Rotacioni prelaz

Vibracioniprelaz

Elektronski prelaz

7

Energija prelaza

RotacioniEnergetskiNivoi

VibracioniEnergetski Nivoi

Osnovno Elektronsko Stanje

PobudenoElektStanje

Rotacioni prelazi

1-20 cm-1

Mikrotalasi

Vibracioniprelazi

2000-4000 cm-1

IC

Elektronski prelazi

10000-50000 cm-1

UV-Vis 8

ΔEel

ΔEvibΔErot

Rastojanja izmedju susednih nivoa zavise od vrednosti odgovarajucih energija. Rotaciona energija molekula je najmanja a elektronska najveca, pa rotacioni nivoi su najblizi jedni drugim a elektronski najdalje.

Rotacioni prelazi

1-20 cm-1

VibracioniPrelazi

2000-4000 cm-1

ElektronskiPrelazi

10000-50000 cm-1

<< <<

Kvanti potencijalne energije elektrona su puno veći od kvanata vibracione energije a ovi od kvanata rotacione energije

9

- umesto jedne spektralne linije, koje imamo kod jednog elektronskog prelaza, kod molekula pri promeni elektronskog stanja imamo čitav sistem traka pri čemu jedna traka odgovara prelazu između dva vibraciona stanja a čine je pojedinačne linije koje potiču od rotacionih pralaza

- molekulski spektri mogu nastati.

emisijom, apsorpcijom i rasejanjem svetlosti

- za pobuđivanje emisionih spektara potrebna velika energija što najčešće dovodi do disocijacije molekula. Emisioni molekuli se mogu dobiti samo za mali broj uglavnom dvoatomskih molekula.

- od interesa su molekulski apsorpcioni spektri, tada nema disocijacije molekula

Saglasno trima vrstama energija (energetskih nivoa) razlikujemo više vrsta molekulskih spektara

- ekscitacija elektrona (molekulska UV-VIS spektrofotometrija: elektronska spektrofotometrija)

- vibracioni prelazi (infracrvena spektrometrija, Ramanska spektrometrija – vibraciona spektroskopija)

- rotacioni prelazi (mikrotalasna oblast, delom daleka infracrvena, malo se koristi u analitici)

- prelazi u vezi spina (radiotalasna oblast - nuklearna i mikrotalasna oblast - elektronska magnetna rezonancija NMR i EPR)

UV-VIS spektrofotometrija

- za razliku od atomskih spektara, molekulski elektronski spektri nisu dovoljno karakteristični, trake su široke i nespecifične.

- primena UV-VIS spektrofotometrije za kvantitativnu hemijsku analizu jedinjenja vrlo široko zastupljena.

- uobičajena osetljivost je reda 10-4 do

10-5M ili čak niže za 1-2 reda veličine.

UV: 180 – 380nm

Vid: 380 – 780nm

nanometri nm

1nm = 1 x 10-9m

HROMOFORE - KVALITATIVNA ANLIZA

Položaj i oblik apsorpcionih traka različitih supstancija u VIS i UV delu spektra u vezi je sa strukturom tih supstancija

Atomi ili atomske grupe čija ekscitacija elektrona dovodi do apsorpcije fotona nazivaju se hromoforama i njihovo prisustvo u molekulu odgovorno je za boju supstancije

Najčešće hromofore u organskim molekulima su atomske grupe sa dvostrukim i trostrukim vezama u kojima su elektroni labavije vezani

Joni prelaznih metala kao i usamljeni parovi elektrona u radikalima predstavljaju hromofore

Hromofrne grupe su: C=C, N=N, C=O, -N=O-

Grotus-Draperov zakon:

I0 = IA + IT + IR

RTAI

I

I

I

I

I RTA 000

1

apsorpcija transparencija

refleksija

Zračenje intenziteta Io koje pada na medijum debljine b,biće delom reflektovano, apsorbovano i delom propušteno.

Apsorpcioni Spektar

Io It

Uzorak

b- Dužina ćelije

T, je transparencija. Ona je deo upadne svetlosti

propušten kroz uzorakT = I/Io

A, apsorbancija je definisana kao A = log10(Io/I)

= -log10(T)

max

talasna dužina na kojoj je A

maksimalno

KMnO4

Kvalitativna analiza:

Mnoge organske funkcionalne grupe imaju dobro definisane apsorpcione

karakteristike: max & ili a (obično u UV)

- napraviti rastvor poznate koncentracije(c)

- snimiti spektar između 180 i 350nm

-identifikovati max, izračunati ili a

Ne-obojeni analiti mogu reagovati dajući obojena

jedinjenja npr. PO43-

kofeinkofein

aspirin

acetonmax

Intenzitet elektromagnetskog zracenja I0 smanjuje se prolazom kroz rastvor (ispitivanu supstancu) koja može apsorbovati zracenje. Smanjenje intenziteta zavisi od koncentracije supstance (c) koja apsorbuje elektromagnetno zračenje, debljine sloja, b, (svetlosnom putu kroz uzorak), molarnom apsorpcionom koeficijentu, a, specificnom za svaku supstancu (menja se sa talasnom dužinom).

Za kvantitativna određivanja optičkim apsorpcionim tehnikama služi Lambert – Beer-ov zakon

Smanjenje intenziteta upadnog zračenja pre i posle prolaza kroz uzorak definisali su Lambert i Beer zakonom apsorpcije.

log I0/I = A = a• b • c

Ograničenja Beer-ovog zakona

• Realna– Pri velikim koncentracijama dešavaju se efekti

interakcije između apsorbujućih vrsta

• Hemijska– Analit disosuje/asosuje ili reaguje sa rastvaračem

• Instrumentalna

– rasejana svetlost nastala refleksijom na monohromatoru

• Apsorpcioni spektar

• Kalibraciona prava

C 1

C 2

3 50 40 0 4 50 m ax

A 1

A 2

A 3

A

A X

3 403 50

3 70

3 90

4 10

C C C C1 X 3 C

a) b )

A

Kvantitativna analiza

i) Koristi se Beer-Lambert-ova jednačina

A =ab c

- pipremiti rastvore analita i dodati reagense (ako su neobojeni)

- meriti apsorbanciju na poznatim max

ii) Koristiti kalibracione krive – uobičajen metod

Metoda unutrasnjeg standardaUnutrašnji standard je supstanca potpuno različita od analita.

• Odredjuje se odnos intenziteta linije ispitivanog elemanta prema intenzitetu linije nekog drugog elementa koji sluzi za uporedjivanje (unutrasnji standard pa se na osnovu toga konstruishe kalibracioni dijagram

• Unutrašnji standard je supstanca dodata uzorku i svim standardima a koncentracija unutrašnjeg standarda je konstantna i poznata je vrednost signala koji odgovara unutrašnjem standardu za određenu koncentraciju.

• Ova metoda se koristi kada je osetljivost instrumentalne metode promenjiva s vremenom, kod znatnog uticaja matrice na signal analita, kada je moguć gubitak uzorka za vreme određivanja

• Često se upotrebljava u hromatografskim određivanjima, emisijskim spektrometrijama (spektrografiji, plamenoj spektrometriji), rendgenskoj difrakciji.

• Signal unutrašnjeg standarda se meri istovremeno sa signalom analita. Priprema se poznata smesa unutrašnjeg standarda i analita za merenje relativnog signala detektora.

•

Metoda unutrasnjeg standarda

Hromatogram uz dodatak unutranjeg standarda; A analit, B unutr ašnji standard

Metoda standardnog dodataka

• Tri koraka• 1. merenje signala analita iz uzorka,• 2. dodavanje poznate koncentracije analita u uzorak i

merenje tog signala,• 3. tako izmerimo intenzitete za nekoliko smesa sa

poznatom kolicinom dodataka.• Metoda standardnog dodatka je posebno korisna kada je

uticaj matrice na određivanje analita znatan ili kada su koncentracije analita u uzorku vrlo blizu granice određivanja. Metodom standardnog dodatka uticaj matrice postoji ali jekonstantan za sva merenja

Metoda standardnog dodataka

Da bi se postigla maksimalna moguća tačnost i osetljivost, bitan je izbor talasne dužine merenja

Spektrofotometrija mora da ispuni sledeće uslove:

-da se merenjem postiže maksimalna osetljivost

-da male promene talasne dužine ne utiču na reproduktivnost (najčešće se meri na talasnoj dužini

maksimuma apsorpcije)

-da važi Lambert – Beer-ov zakon

UV/VIS spektrofotometar

• instrument koji se koristi u UV/VIS spektroskopiji zove se UV/VIS spektrofotometar. Spektrofotometar meri intenzitet svetla koje je prošlo kroz analizirani uzorak (I) te ga upoređuje s intenzitetom upadnog svjetla (I0)

• osnovni djelovi spektrofotometra su izvor svetlosti, držač uzorka, monohromator i detektor.

• spektrofotometri mogu imati jedan ili dva snopa svetlosti. Kod instrumenata s jednim snopom I0 se meri nakon što se uzorak izvadi iz držača. Kod instrumenta s dva snopa upadni snop se dijeli na dva pre prolaska kroz uzorak. Jedan služi kao referentni snop (I0), a drugi prolazi kroz uzorak (I).

• najčešće se mere tecni uzorci.• Uzorak je smješten u prozirnoj posudi (kiveti) koja ja najčešće

širine 1 cm i načinjena je od kvarca.

Spektrofotometri se dele na jednozračne i dvozračne.

Jednozračni spektrofotometri jedan put svetlosti jedan uzorak. Referentni uzorak (slepa proba) se mora analizirati posebno.

1 2

3

4 5 6

1 svetlobni izvor2 izbira valovne dolžine3 zaklop

4 kiveta5 detektor6 zapis signala

ENOŽARKOVNI SPEKTROFOTOMETER

0 0 3 2

vzorec

topilo

Filter Detektor

žarnica

Jednozračni spektrofotometar

1. izvor svetlosti 4. kiveta sa uzorkom

2. selekcioni sistem -filter 5. detektor3. zaklon 6. zapis signala

Izvor svetlostiUzorak

Slepa proba

Dvozračni spektrofotometri imaju dva puta svetlosti i istovremeno mogu primiti dva uzorka: mereni uzorak i referentni uzorak (slepu probu). Spektri se automatski oduzimaju jedan od drugoga, pa naknadna obrada spektra nije potrebna.

izvor

čoper

zrcalo

detektor

r

v

monokromator

0 0 3 2

vzorec

topilo

FilterDetektor

žarnica

B

Dvozračni spektrofotometar

Izvor svetlosti Uzorak

Slepa proba

Monohromator

Ogledalo

VIS

Wolframove sijalice (stabilan izvor napajanja

halogene sijalice

UV

Deuterijumove sijalice

Izvori elektromagnetnog zračenja:

UV-VIS spektrofotometrija eksplozivnih materija

• Uzorci se rastvaraju u organskim ratsvaračima

EKSPLOZIV

• DNT 230nm

• TNT 224nm

- molekulska fluorescencija, molekul apsorbuje fotone veće energije a zatim deo energije osobodi u obliku toplote a zatim emituje foton niže energije u odnosu na apsorbovani foton.

- broj jedinjenja koja pokazuju luminiscenciju znatno manji od broja jedinjenja koja pokazuju UV-VIS apsorpciju.

- osetljivost i linearnost bolji za nekoliko redova velicine od UV-VIS apsorbancije.

- Manja preciznost.

FLUORESCENCIJA

• Fluorescencija je sekundarana emisija svetlosti nastala pod desjtvom UV zračenja

Primena

- za otkrivanja latentnih tragova papilarnih linija

-Za izazivanje tragova sa nepodesnih površina (kartonske kutije, koža, metali, plastika, koje ne pokazuju fluorescenciju pod UV zarcima) koriste se hemikalije denzil-hlorid i 9-metil antracen.

Raspršivačima se nanesu na površinu i oni reaguju sa amino kiselinama, dajući obojene komplekse. Vizuelizacija se vrši uz pomoć dugih UV zraka (360nm). Fluorescencija se javlja u u VIS oblasti oko 475nm.

Za porozne površine, papir, koristi se ninhidrin i cink hlorid.

Identifikacija novčanica, papira

- primena UV lampe za kontrolu novčanicanovcanice i zasticeni dokumenti imaju ugradjenie molekulie (vidljivi ili nevidljivi) koji apsorbuju u UV oblasti a zatim fluoresciraju u VIS oblasti

• Sporni dokument se stavi ispod izvora UV zraćenja• otkrivanje i za restitucija uništenog teksta. Kod obrisanih

tekstova, obezbojeni tekst fluorescira drugom bojom u odnosu na ostalu podlogu što omogućava čitanje uništenog teksta

• Koriste se UV lampe kod kojih je moguće menjati talasne dužine UV zračenja

HVALA NA PAŽNJI!