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Universitat Autònoma de Barcelona

Detección de Cloranfenicol en Leche Química BioAnalítica

Miguel Berenguel Alonso

2/21/2011



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DETECCIÓN DE CLORANFENICOL EN LECHE

CONTENIDOS

1. Introducción ...................................................................................................................... 3

2. Método estándar: HPLC – MS/MS ..................................................................................... 4

3. Método propuesto: biosensor SPR .................................................................................... 7

3.1. Elección del método de detección ............................................................................. 7

3.2. Elección del tipo de Inmunoensayo ............................................................................ 8

3.3. Producción de los bioreactivos .................................................................................. 9

3.4. Inmobilización ......................................................................................................... 11

3.5. Obtención de la señal analítica ................................................................................ 12

4. Referencias ..................................................................................................................... 15



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1. INTRODUCCIÓN

En las últimas dos décadas, se ha producido un gran progreso en cuanto al desarrollo de

biosensores de afinidad y sus aplicaciones en áreas como diagnóstico médico, control

medioambiental, biotecnología o seguridad alimentaria, entre otras.1 Los biosensores de

afinidad son dispositivos que usan anticuerpos, secuencias de ADN o proteínas receptoras

conectados a un transductor de señal para medir un evento de enlace.2

Las enfermedades y otros problemas de salud causados por residuos presentes en alimentos

son un serio problema, con graves connotaciones tanto en la salud pública como en su coste

económico. Éstas pueden ser provocadas por pesticidas, herbicidas, micotoxinas y antibióticos.

Por lo tanto, la detección de sustancias relacionadas con la seguridad alimentaria es de gran

importancia para todos los agentes implicados en la manipulación de alimentos, desde el

productor hasta el distribuidor comercial. A tal efecto, se han diseñado varios tipos de

biosensores de afinidad: electroquímicos, piezoeléctricos, de impedancia u ópticos.2

El cloranfenicol, o CAP, (ver Figura 1) es un antibiótico de amplio espectro considerablemente

usado desde los años cincuenta en países desarrollados, tanto en humanos como con fines

veterinarios. No obstante, debido a sus posibles efectos secundarios, tales como daños

irreparables en la médula ósea, leucemia o anemia aplásica, los cuales pueden conducir incluso

a la muerte, tanto Estados Unidos como la Unión Europea prohibieron su uso en 1994.3 En la

actualidad, su uso está autorizado en humanos tan sólo en casos concretos y mediante

aplicación tópica (tratamiento de conjuntivitis bacteriana).

Países menos desarrollados han seguido y siguen utilizando cloranfenicol debido a su bajo

coste y su facilidad de obtención, para combatir la fiebre tifoidea.4 Asimismo, el cloranfenicol

todavía sigue siendo utilizado ilegalmente por granjeros debido varios factores:5

- Actividad óptima a pH entre 7,4 y 8,0

- Elevado tiempo medio de vida en solución

- Bajo coste



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Figura 1 Representación de la molécula de cloranfenicol, a la izquierda en 3D, y a la derecha en 2D.

Debido a su peligrosidad para la salud pública, la legislación actual en los países occidentales

no permite el uso de cloranfenicol ni siquiera con finalidades veterinarias. En productos

alimentarios de origen animal no se especifica ni siquiera un límite máximo de residuo (MRL)

para cloranfenicol. No obstante, el límite mínimo de análisis requerido (MRPL) es de 0,3 µg/kg.6

Esto significa que el método analítico tiene que ser capaz de la detección de 0,3 ppb. Por

tanto, el diseño de biosensores de screening y de métodos de confirmación para cloranfenicol

deben fijar su objetivo en la especificidad y la disminución del límite de detección.

2. MÉTODO ESTÁNDAR: HPLC – MS/MS

El método estándar escogido es la cromatografía líquida de alta resolución con detección por

espectrometría de masas en tándem,7 debido a la alta sensibilidad y eficiente separación. El

procedimiento de análisis ha sido extraído de la compañía Thermo Scientific.

La preparación de la muestra es en este caso más simple que la descrita en otros

procedimientos, que incluyen extracción en fase sólida i/o extracciones líquido-líquido.

En primer lugar, se añade un patrón interno de cloranfenicol deuterado. Seguidamente, la

adición de acetonitrilo provoca la precipitación de las proteínas de la muestra (relación

acetonitrilo-agua 1,5 : 1). A continuación, la muestra es diluida con agua y refrigerada por un

cierto tiempo a 4 ºC. Se observa la precipitación de trazas de proteínas debido a que la el



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proceso con acetonitrilo no elimina la totalidad de éstas. Por tanto, se toma la parte superior

de la solución para la inyección en el cromatógrafo. La Figura 2 muestra esquemáticamente el

proceso de preparación de la muestra:

Figura 2 Esquema del proceso de tratamiento previo de la muestra de leche.

La cromatografía HPLC se realiza a temperatura ambiente con una fase móvil metanol – agua,

mientras que la detección se realiza mediante espectrometría de masas en tándem. El método

de ionización es el electrospray, y los valores de m/z para la cuantificación y confirmación del

cloranfenicol son los mostrados en la Figura 3.8 El patrón interno incorporado en el proceso de

preparación de la muestra se observa a m/z = 157. Este patrón interno es el d5 – CAP.



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Figura 3 Cloranfenicol y sus iones utilizados para su identificación i cuantificación mediante espectroscopía de masas, con sus

respectivas relaciones masa - carga.

Este método es relativamente simple y rápido en comparación con otros procedimientos de

análisis mediante HPLC encontrados en la literatura, debido en gran medida a la simplificación

del pre-tratamiento de la muestra. No obstante, requiere de instrumental de laboratorio muy

sofisticado y de personal de gran cualificación. El límite de detección (CCα) y límite de

cuantificación (CCβ) están por debajo del MRPL (0,3 µg/kg), y son los siguientes:



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3. MÉTODO PROPUESTO: BIOSENSOR SPR

3.1. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE DETECCIÓN

El método elegido como cuantificación bioanalítica de CAP es el de detección mediante

Surface Plasmon Resonance (SPR). En un sistema formado por un metal (normalmente oro) y

un dieléctrico (muestra), los electrones superficiales del metal oscilan a una determinada

frecuencia. La excitación óptica para producir el plasmón superficial tan sólo tiene lugar bajo

condiciones de reflexión total atenuada (ATR) cuando la energía de los fotones es exactamente

igual al nivel de energía quántica de los plasmones.9 El plasmón superficial es una onda

electromagnética que se propaga a lo largo de la interfase (onda azul en la Figura 4) y decaen

con una onda evanescente perpendicular a la interfase. Debido a que la onda plasmónica se

encuentra en la frontera entre el metal y el medio externo, las oscilaciones del plasmón son

muy sensibles a cualquier cambio en la interfase, y por tanto, la resonancia de plasmón

superficial tiene aplicación en sensores.10

Figura 4 Resonancia de plasmón superficial (SPR) en reflexión total atenuada (ATR).

La inmovilización de un ligando en la superficie del metal, que interaccione con el analito,

propicia el cambio en el índice de refracción, y por tanto, permite la monitorización de

interacciones. Para monitorizar los cambios en el índice de refracción se pueden medir

distintos parámetros: variación angular, cambio de la longitud de onda, la intensidad, la



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modulación de fase y la modulación de la polarización. De todos éstos, los parámetros más

sencillos de monitorizar son la variación angular y el cambio de longitud de onda, los cuales

ofrecen alta resolución y no requieren instrumentación demasiado compleja.

3.2. ELECCIÓN DEL TIPO DE INMUNOENSAYO

Los biosensores pueden detectar el analito mediante diferentes formatos de ensayo. La

elección del formato de detección para una aplicación particular depende del tamaño del

analito en cuestión, el rango de concentraciones que se desea medir, etc. En el caso de la

detección por SPR, los formatos de detección más habituales son el directo, el tipo sándwich y

el ensayo indirecto.11 La Figura 5 muestra de manera esquemática el mecanismo de estos tres

tipos de inmunoensayo.

Figura 5 Representación esquemática de los formatos de inmunoensayo más habituales en SPR.



9

La detección directa se prefiere normalmente cuando las concentraciones a determinar

producen señales elevadas. Los límites de detección son mejores en el caso del ensayo

sándwich. En el caso concreto de la detección de cloranfenicol mediante SPR, se decide utilizar

el inmunoensayo por inhibición competitiva, fundamentalmente porqué el analito es una

molécula pequeña. Debido a que el anticuerpo tiene una masa mucho mayor que la del

analito, proporcionará un mayor cambio en el índice de refracción al interaccionar con el CAP

inmovilizado en la superficie del biosensor, y por tanto aumentará la sensibilidad del método.

3.3. PRODUCCIÓN DE LOS BIOREACTIVOS

Para diseñar un biosensor SPR de cloranfenicol se requiere de un elemento de reconocimiento

específico, es decir, un anticuerpo. No obstante, el cloranfenicol es un hapteno, lo cual implica

que no genera respuesta inmune, debido a que es una molécula demasiado pequeña. Por

tanto, el cloranfenicol debe ser enlazado a una molécula portadora, produciendo de esta

manera un conjugado capaz de inducir respuesta inmune (ver Figura 6). Este inmunógeno será

inyectado en el animal, produciendo anticuerpos policlonales.

Figura 6 Representación esquemática de la obtención del conjugado CAP – KLH inmunógeno.

Las proteínas portadores más comunes son KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), OVA

(Ovoalbumin) y BSA (Bovine Serum Albumin). Se decide escoger la proteína portadora KLH

debido a su alto peso molecular y la abundancia de residuos disponibles de lisina, cuya cadena



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lateral contiene un grupo amino que permite una funcionalización sencilla. De entre las tres

proteínas portadoras mencionadas, KLH es la que propicia una mayor respuesta inmune.

Para la producción del inmunógeno se necesita la activación del cloranfenicol. A tal efecto, se

puede modificar el CAP con ácido succínico para obtener el correspondiente éster. Éste

reaccionará con el grupo amino del spacer para formar una amida, mediante la reacción con

DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida). Este mismo tipo de reacción

se puede usar para unir el producto obtenido con la proteína KLH, mediante la formación de

otro enlace amida con los grupos amino de los residuos de lisina. La síntesis está representada

en la Figura 7.

Figura 7 Esquema de la síntesis del inmunógeno.



11

El inmunógeno debe ser administrado al animal en dosis adecuadas al tamaño del mismo. Se

ha encontrado en la literatura anticuerpos producidos por distintos animales, como por

ejemplo, conejos y ovejas (anticuerpos comercializados por distintas empresas), así como

camellos, cabras o burros.12

Dos semanas después de la última inmunización, se procede a la extracción de sangre

mediante punción en la yugular. Esta sangre contiene los anticuerpos generados por el animal,

que deben ser aislados mediante técnicas de separación. Existen gran variedad de técnicas de

purificación de anticuerpos, como por ejemplo, diálisis, precipitación de proteínas, distintos

tipos de cromatografía (incluyendo la de afinidad con el antígeno o con Proteína A/G),

electroforesis, etc.

3.4. INMOBILIZACIÓN

Debido a que el tipo de inmunoensayo escogido es el de

inhibición indirecta, sobre la superficie de oro se debe

inmovilizar el propio cloranfenicol. Para tal efecto, se opta

por crear una monocapa autoensamblada mixta (mSAM)

con tioles funcionalizados,13 y posteriormente se modifica

con el inmunógeno, que contiene el cloranfenicol. Por

tanto, se trata de una inmovilización covalente e indirecta.

La mSAM está compuesta por una mezcla de 11-

mercaptoundecanol y ácido 16-mercaptohexadecanoico en

una relación 9:1 (ver Figura 8). El inmunógeno sintetizado

para la producción de anticuerpos (ver Figura 7) hace las

veces de antígeno inmovilizado, gracias a la reactividad de

la proteína KLH. Los residuos de la proteína que contienen

grupos amino pueden reaccionar con los grupos ácido

carboxílico de la monocapa, formando enlaces amida (igual

que en la síntesis del inmunógeno, con DCC/NHS). Figura 8 Representación gráfica de la inmovilización de CAP en la superficie de oro.



12

Esta estrategia de inmovilización del cloranfenicol tiene varias ventajas. La monocapa mixta

permite que la inmovilización sea selectiva, y se dé tan sólo en los tioles funcionalizados con el

grupo ácido carboxílico. De esta forma, se evita la sobreacumulación del antígeno y se

favorece el entorno de enlace del mismo en la superficie. El spacer también mejora el entorno

de coordinación del cloranfenicol. Por otra parte, al no estar directamente unido a la

superficie, el cloranfenicol raramente pierde su funcionalidad debido el impedimento estérico

provocado por interacciones secundarias con otros elementos de la superficie. Otra gran

ventaja que proporciona este tipo de inmovilización covalente, es que después del ciclo de

análisis, la superficie puede ser regenerada fácilmente, y reusarse hasta 400 veces.13

3.5. OBTENCIÓN DE LA SEÑAL ANALÍTICA

El biosensor SPR de cloranfenicol utilizará la variación en el ángulo de incidencia para obtener

la señal analítica (ver Figura 10), debido a su sensibilidad y relativa facilidad de medición, en

comparación con otros parámetros afectados por el cambio en el índice de refracción.

El análisis se lleva a cabo mediante inhibición competitiva (Figura 9). Por tanto, en primer lugar

se mezcla el anticuerpo con la muestra de leche. Seguidamente, se hace pasar la muestra por

la superficie de oro con el cloranfenicol inmovilizado. En función de la concentración de CAP en

la muestra, más o menos anticuerpo se unirá al CAP inmovilizado. En consecuencia, a mayor

variación de señal, menor concentración de CAP en la muestra.

Figura 9 Representación esquemática del inmunoensayo por inhibición competitiva.



13

Esta técnica de detección tiene ventajas importantes. De entre ellas cabe destacar que no

precisa del marcaje de anticuerpos ni antígenos. Por otra parte, los eventos de

bioreconocimiento también pueden ser monitorizados en tiempo real,9 de manera que se

obtiene una gráfica como la de la Figura 10 (abajo). En principio, esta técnica permite la

cuantificación de cualquier analito para el cuál exista un elemento de bioreconocimiento.

Además, no precisa de que el analito tenga ninguna propiedad especial como fluorescencia o

bandas características de absorción o de scattering.10

Figura 10 Arriba, esquema de la superficie del sensor SPR y variación del mínimo de reflexión en función del ángulo (curva se

mueve hacia la derecha cuanto mayor bioreconocimiento se dé). Abajo, típico sensograma SPR de una interacción molecular en

función del tiempo.

Además de estas ventajas, ya existen prototipos de biosensores SPR portátiles de pequeñas

dimensiones,14, 15 que permiten la integración de todos los componentes. Este hecho haría



14

posible el screening de las muestras in situ, por ejemplo, en las explotaciones ganaderas

productoras de leche y otros productos lácteos. Estos biosensores integran el detector SPR con

microfluídica, y por tanto, el consumo de muestra es reducido. Un ejemplo de dispositivo

portátil se representa en la Figura 11.

Figura 11 a) Fotografía del sensor y b) diagrama de sus componentes.

No obstante, y como todas las técnicas de análisis en superficie, SPR tiene sus limitaciones en

cuanto a sensibilidad y resolución (la menor diferencia de ángulo detectable). Aún y así,

existen diversas maneras de incrementar la señal, como por ejemplo usando por ejemplo un

anticuerpo secundario.



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4. REFERENCIAS

1. Homola, J., Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2003, 377, (3), 528-539.

2. Rogers, K. R.; Mulchandani, A.; (Editors), Affinity Biosensors. Techniques and Protocols. Humana: Totowa, New Jersey, 1998; Vol. 7.

3. European Community Regulations, 2377/90 (1990), Annexure IV and 1430/94. In 1994.

4. Patel, J. C.; Banker, D. D.; Modi, C. J., Chloramphenicol in Typhoid Fever. British Medical Journal 1949, 2, 908-909.

5. Ashwin, H. M.; Stead, S. L.; Taylor, J. C.; Startin, J. R.; Richmond, S. F.; Homer, V.; Bigwood, T.; Sharman, M., Development and validation of screening and confirmatory methods for the detection of chloramphenicol and chloramphenicol glucuronide using SPR biosensor and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta 2005, 529, (1-2), 103-108.

6. European Comission, Official Journal of the European Communities, 13 March, 2003, (2003/181/EC). In.

7. Liu, T.; Wang, P.; Wang, K., Simple and Rapid Analysis of Chloramphenicol in Milk by LC-MS/MS. Thermo Fischer Scientific 2007, (Procedure).

8. Bogusz, M. J.; Hassan, H.; Al-Enazi, E.; Ibrahim, Z.; Al-Tufail, M., Rapid determination of chloramphenicol and its glucuronide in food products by liquid chromatography-electrospray negative ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B 2004, 807, (2), 343-356.

9. Mol, N. J.; Fischer, M. J., Surface Plasmon Resonance: A General Introduction. In Surface Plasmon Resonance, Vol. 627, pp 1-14.

10. Homola, J.; Homola, J.; Piliarik, M., Surface Plasmon Resonance (SPR) Sensors. In Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer Berlin Heidelberg: 2006; Vol. 4, pp 45-67.

11. Janz, S.; Ctyroky, J.; Tanev, S.; Homola, J., SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) BIOSENSORS AND THEIR APPLICATIONS IN FOOD SAFETY AND SECURITY. In Frontiers in Planar Lightwave Circuit Technology, Springer Netherlands: 2006; Vol. 216, pp 101-118.



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12. Fodey, T.; Murilla, G.; Cannavan, A.; Elliott, C., Characterisation of antibodies to chloramphenicol, produced in different species by enzyme-linked immunosorbent assay and biosensor technologies. Analytica Chimica Acta 2007, 592, (1), 51-57.

13. Yuan, J.; Oliver, R.; Li, J.; Lee, J.; Aguilar, M.; Wu, Y., Sensitivity enhancement of SPR assay of progesterone based on mixed self-assembled monolayers using nanogold particles. Biosensors and Bioelectronics 2007, 23, (1), 144-148.

14. Soelberg, S.; Chinowsky, T.; Geiss, G.; Spinelli, C.; Stevens, R.; Near, S.; Kauffman, P.; Yee, S.; Furlong, C., A portable surface plasmon resonance sensor system for real-time monitoring of small to large analytes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2005, 32, (11), 669-674.

15. Naimushin, A. N.; Soelberg, S. D.; Bartholomew, D. U.; Elkind, J. L.; Furlong, C. E., A portable surface plasmon resonance (SPR) sensor system with temperature regulation. Sensors and Actuators B: Chemical 2003, 96, (1-2), 253-260.

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