MICROBIOLOGIA GENERAL

MICROBIOLOGIA GENERAL

MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE CEPAS MICROBIANAS1. INTRODUCCION

Los microorganismos representan un papel esencial para el mantenimiento y funcionamiento de los ecosistemas globales y como fuente de nuevos recursos para el desarrollo de la medicina, la industria, la agricultura y la biotecnologa. Por eso es necesario conservar toda esta fuente microbiana y esto se garantiza mediante las colecciones de cultivos. En la ltima dcada, se ha visto un marcado aumento en la concientizacin del valor de las colecciones de cultivos. Actualmente, existen en el mundo alrededor de 488 colecciones de 65 pases registradas en el Centro de Datos Mundial de Microorganismos de Japn. Adems, se han establecido organizaciones mundiales, regionales y nacionales. El acelerado desarrollo en Cuba de la industria farmacutica y biotecnolgica, as como el potencial uso de los microorganismos, obligan cada vez ms a promover actividades de aseguramiento de la calidad para su conservacin, de manera que puedan ser utilizados en diversos ensayos analticos en los laboratorios de control microbiolgico. La necesidad de mantener y disponer de cultivos de calidad impuso la introduccin de mtodos de conservacin de microorganismos que reducen al mnimo la posibilidad de contaminacin y garantizan al menos la supervivencia del 70 % de las clulas por un periodo determinado de tiempo. La liofilizacin es el mtodo de eleccin debido a sus numerosas ventajas, entre las que se puede resaltar la posibilidad de minimizar al mximo el riesgo de cambio gentico en las clulas y las mantienen viables por 10 aos o ms. Adems es recomendable por su comodidad en almacenamiento y transporte de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a una temperatura ambiente de 18 a 20 C o bien de 4 a 6 C. El laboratorio de control microbiolgico de Laboratorios Lio rad dispona de una coleccin de cepas procedentes de subcultivos de cepas de referencia de la American Type Culture Coleccin (ATCC). El mtodo de conservacin empleado era la congelacin a 70 C, metodologa que no resulta la ms conveniente para la conservacin por largos periodos de tiempo, por tal motivo surgi la necesidad de evaluar otra estrategia de conservacin para estos microorganismos. La metodologa propuesta fue emplear el Caldo Triptona Soy (CTS) como medio de crecimiento, la leche descremada y el glicerol al 20% (sustancias lioprotectoras), la liofilizacin como mtodo de conservacin y ensayos de calidad: viabilidad, pureza e identidad.2. OBJETIVOS

Para hacer este trabajo hemos tomado en cuenta principalmente tres objetivos para una correcta conservacin: 1. Mantenimiento del cultivo puro (pureza). 2. Que la cepa microbiana este viva (viabilidad). 3. La cepa debe guardarse genticamente estable (estabilidad). Los dos primeros objetivos no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades. Motivo por el cual existen varios mtodos de conservacin para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilizacin general. Vamos a resumir estos mtodos agrupndolos en tres apartados, que son: Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos restringidos.El objetivo tambin es verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres fisiolgicos de cepas bacterianas originalmente preservadas en medio semislido de conservacin desde finales de 1980, se estudiaron 60 cepas bacterianas de las familias Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae y Pseudomonaceae, mantenidas como patrones de referencia en la coleccin de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. El 85,0 % de las cepas se mantuvo viable durante 12 aos con un 45,3 de sus niveles de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL y un 87,0 de pureza, as como un 95,2 de preservacin de las caractersticas fenotpicas. El medio permiti la conservacin con buenos resultados de las cepas, lo que sugiere su empleo como mtodo simple en los laboratorios con limitados recursos.

3. REVISION BIBLIOGRAFICA

En un ensayo se utilizan cepas de Salmonella typhimurium, construidas por ingeniera gentica, capaces de detectar compuestos que causan mutaciones gnicas. La mayor dificultad del trabajo con estas cepas es la disminucin de la calidad en cuanto a la prdida total o parcial de los marcadores fenotpicos, por ser susceptibles a los cambios de temperatura. El objetivo de este trabajo es profundizar sobre el tema de cmo conservar estas cepas eficientemente, siendo evaluadas mediante las pruebas fenotpicas como parmetro de calidad del proceso. Se hace alusin a los mtodos generales de conservacin, utilidad del ensayo de ames, evaluaciones a incluir en las pruebas fenotpicas y su utilidad para definir el mtodo ms eficaz de conservacin. Los mtodos ms eficaces de conservacin lo constituyen la liofilizacin en primer lugar y la congelacin a -80C como mtodo alternativo para un corto periodo de tiempo, las pruebas fenotpicas utilizadas como parmetros de calidad nos permiten definir cul es el mtodo ideal de conservacin. Bajo nuestras condiciones experimentales, para el caso de las cepas TA 98, 100 y 102 evaluadas durante 3 aos, el mejor mtodo de conservacin es la liofilizacin con mantenimiento a 4C, sin modificaciones significativas en el efecto mutacin his y la frecuencia espontnea de reversiones. Palabras clave: Conservar, Salmonella typhimurium, ensayo de ames, pruebas fenotpicas, TA 98, TA 100, TA 102.

4. ANTECEDENTES

4.1. PRIMERAS COLECCIONES DE CULTIVO Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo-La ms antigua Lovaina (Blgica) (Hongos)-La ATCC,en 1925.No vnculos directos con la Universidad, es de carcter comercial (Manassas, USA).-La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960).-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacin internacionaldenominada World Federation for Culture Collection (WFCC).En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture ColletionOrganization (ECCO) que se fund en 1982. 1677 VAN LEEWENHOEK (HOLANDA): Animalculos en agua y cerveza. 1830 CAGNIARD-LATOUR (FRANCIA): Alcohol es producido por bacterias. 1860 PASTEUR (FRANCIA): FERMENTACIN = Microorganismos. Emplea como medios slidos, papa y meln. 1890 HANSEN Desarrolla la tcnica del cultivo puro con levaduras. 1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras se mantienen en medios slidos a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan peridicamente. Se requiere conservacin a largo plazo para preservar las caractersticas de los cultivos. 1909-1911 SHACKEL; HAMMER: Primeros mtodos de liofilizacin para bacterias y virus, empleo de suero y leche como protectores. 1914 LUMIERE Y CHERROTIER Conserva cultivos de gonococcus bajo una capa de parafina lquida, el mtodo es perfeccionado por Morton y Pulski (1938). 1945-1950 La produccin industrial de antibiticos estimula el desarrollo de nuevas tcnicas. Liofilizacin, crio-conservacin, adsorcin en suelo, etc.; permite el mantenimiento de cultivos por 10 o 20 aos. 1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos: glicerol, dimetilsulfxido, sacarosa. 1890 FRANTISEK KRAL Genera la primera coleccin de bacterias y hongos en praga. Cepas de mycobacterium (koch). Cierra en 1911. Se pierden las cepas. 2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material biolgico con una patente de aplicacin (tratado de Budapest 1991). 5. DESARROLLO DEL TEMA

5.1. METODOS DE ELECCION O CONSERVACION A LARGO PLAZOSon los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en si mismo. Los mtodos de conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.

5.1.1. CONSERVACION POR CONGELACION

Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (-196C).

Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas, adems al eliminar el agua lquida por convertirse en hielo existe una concentracin de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles as como utilizar agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO c.a. 10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el proceso de congelacin de una forma rpida o gradualmente no est claro. Algunos recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta -20C para posteriormente enfriar rpidamente, Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservacin de los microorganismos por congelacin son: -30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la formacin de eutcticos (suspensin con distintos puntos de congelacin debido a los solutos que pueden daar a las clulas). -70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo ms utilizado en los laboratorios. -196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estn bien cerrados para evitar la entrada de nitrgeno lquido. Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Tambin resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el envo de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes:A. Edad de las clulasEn la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomrficos e incluso en algunos ms sencillos.

B. Velocidad en la congelacin y descongelacinAunque hay programas de congelacin bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la congelacin como para la descongelacin, por lo que para descongelar conviene poner las clulas a 37C.C. Temperatura de almacenamientoDebe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de 195C, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de 140C.En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los ms aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de 70C. Aquellos que slo alcanzan temperaturas entre 20C y 40C, como ocurre con la mayora, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentracin de solutos que existen en la suspensin celular, su punto de congelacin baja. El dao que se produce en las clulas es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se aade un crioprotector no inico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentracin inica.Para la conservacin en armarios congeladores, las clulas se almacenan en crio tubos (tubos de plstico esterilizables resistentes a la congelacin que cierran hermticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasin. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto tambin se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la solucin celular a congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto. Este mtodo no se debe emplear para la conservacin de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el gnero bacteriano Clostridium, ya que al estar las clulas en una superficie hay un mayor contacto con el oxgeno y puede afectarse la viabilidad.Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su eleccin influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

5.1.2. CONSERVACION POR LIOFILIZACION.

A. DefinicinLa liofilizacin es una forma de desecado en frio que sirve para conservar sin dao los ms diversos materiales biolgicos. EL producto se conserva con muy bajo peso y a temperatura ambiente y mantiene todas sus propiedades al rehidratarse. En el proceso, primero se congela el material, y luego el hielo se elimina por sublimacin. La liofilizacin es un proceso que consiste en desecar un producto previamente congelado, logrndose la sublimacin del hielo bajo vacio. Es por lo tanto el paso directo del hielo (solido) a gas (vapor), sin que en ningn momento aparezca el agua en estado liquido, Se obtiene una masa seca, esponjosa de ms o menos el mismo tamao que la masa congelada original, mejorando su estabilidad y siendo fcilmente redisuelta en agua.

B. Fundamentos de la liofilizacinEl proceso de liofilizacin consta de dos etapas: congelacin y secado. La congelacin debe ser muy rpida con el onjeto de obtener un producto con cristales de hielo pequeos y en un estado amorfo. La etapa de secado se realiza a presiones bajas para permitir la sublimacin del hielo. El proceso de liofilizacin se desarrolla en tres fases: 1. La fase de pre congelacin hasta la temperatura en la que el material est completamente slido, que ser inferior a 0C. 2. La fase de sublimacin propiamente dicha, tambin llamada desecacin primaria en la que se elimina alrededor del 90% del agua. Lo que lleva al producto a una humedad del orden del 90%. Se elimina el hielo libre. 3. La fase del desercin o desecacin secundaria, que elimina el 10% de agua ligada restante. Con lo que se puede llegar hasta productos de una humedad del 2%. Esta fase consiste en un evaporizacin a vacio, a una temperatura positiva de 20 a 60C. En la grafica se representa, sobre el diagrama de fases, la comparacin de los procesos que tienen lugar en el secado evaporativo y en la liofilizacin. En el secado evaporativo el agua en el punto A es calentada hasta alcanzar el equilibrio con su presin de vapor en B. En este punto si se suministra la energa correspondiente al calor latente de vaporizacin, se produce el paso de lquido a vapor. En el secado por liofilizacin el agua en el punto A se enfra hasta un punto inferior al de congelacin D. Cuando el agua esta completamente congelada, se reduce la presin, se hace vaco, hasta el punto E consiguiendo una presin absoluta inferior a la presin de vapor del hielo. Por ultimo, con el suministro del calor latente de cristalizacin y evaporacin, el hielo sublima a vapor de agua a temperatura constante. Como los constituyentes de material estn congelados, permanecen inmovilizados durante la sublimacin. La forma de la sustancia seca es prcticamente la misma que la de la congelada y se reduce o incluso se elimina la migracin de slidos hacia la superficie. Como el secado por liofilizacin tiene lugar a baja temperatura, se minimizan los daos por calor y se retienen los componentes voltiles. El secado por atomizacin requiere exposiciones a temperaturas de ms de 100C durante periodos de segundos, el secado en horno requiere temperaturas tpicas de 60C durante periodos de minutos, y la liofilizacin expone el material a temperaturas por debajo de 0C durante periodos de horas. Por otra parte como los cristales sublimados de hielo dejan cavidades, el material seco contiene miles de intersticios por los que el agua puede penetrar produciendo una rpida y completa rehidratacin cuando sea necesaria.

5.1.3. PROCESO DE LA LIOFILIZACIN

A. Etapas de la liofilizacinSe realiza a temperaturas inferiores a la solidificacin total, o sea, el producto debe estar congelado a temperaturas entre 10 y 15 C por debajo de su temperatura autentica para evitar la formacin de cogulos de H2O. B. Congelacin inicialEs una operacin previa y obligatoria, El tiempo de duracin depende de varios factores como la cantidad, concentracin y naturaleza propia del producto. En lneas generales podemos decir que una congelacin adecuada es la base de que el producto liofilizado presente ptimas condiciones de aspectos, conservacin de sus propiedades originales y rpida rehidratacin. C. Sublimacin o desecacin primariaEs la etapa en la que mayor parte del agua libre pasa a vapor. Los parmetros temperatura, presin y tiempo pueden ser modificados independientemente pero estn ntimamente relacionados, no es posible modificar, sin que se afecten los otros, por lo que en todo momento deben ser considerados conjuntamente y analizados sus efectos. D. Desorcin o desecacin secundariaSu misin es eliminar las ultimas trazas de vapor de agua, evaporando el agua no congelada ligada al producto, Se lleva a cabo a una temperatura inferior a la de desnaturalizacin del producto y se logra una humedad final hasta valores inferiores al 1%.

5.1.4. IMPORTANCIA DE LA LIOFILIZACION

La liofilizacin se ha mostrado como un mtodo efectivo para ampliar la vida media de los alimentos y tiene dos caractersticas importantes: Virtual ausencia de aire durante el procesado. La ausencia de aire y la baja temperatura previene el deterioro debido a la oxidacin o las modificaciones del producto. Secado a una temperatura inferior a la de ambiente: los productos que se descomponen o sufren cambios en su estructura, textura, apariencia, y/o aromas como consecuencia de temperaturas altas, pueden secarse bajo vacio con un dao mnimo. Los productos liofilizados que han sido adecuadamente empaquetados pueden ser almacenados durante tiempos ilimitados, reteniendo la mayora de propiedades fsicas, qumicas, biolgicas y sensoriales de su estado fresco; adems, reduce las prdidas de calidad debidas a las reacciones de pardeamiento enzimtico y no enzimtico. Sin embargo, la oxidacin de lpidos, inducida por los bajos niveles de humedad conseguidos durante el secado, es superior en los productos liofilizados, Esta oxidacin lipdica puede controlarse con envasados en paquetes impermeables al paso del oxigeno. El pardeamiento no enzimtico apenas ocurre durante el secado, ya que la reduccin de la humedad del producto en el proceso es casi instantnea. El uso de bajas temperaturas tambin reduce la desnaturalizacin de protenas en este tipo de secado. Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C), con lo cual su envo es muy cmodo.Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de conservacin sonA. Tipo de microorganismoHay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos.B. Concentracin celularLo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentracin del orden de 108-109 clulas/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.C. Temperatura durante la sublimacinDebe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.Grado de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua remanente que no es perjudicial.D. Atmsfera de oxgeno en el tuboLas clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas.E. Condiciones de almacenamientoLa temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin bajar de los 0C. Los lifilos se deben guardar en la oscuridad.

CRECIMIENTO DE LA CEDA MICROBIANA5.1.5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CONSERVACION POR EL METODO DE LIOFILIZACION

A. VENTAJAS Reduccin de la variabilidad del microorganismo Largo tiempo de conservacin. Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los lotes.

B. DESVENTAJAS El alto coste del equipo. La preparacin de la forma incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en el estancamiento de la viabilidad y/o en perdidas en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos.

5.2. METODOS ALTERNATIVOSSon los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos.

5.2.1. CONSERVACION POR TRANSFERENCIA PERIODICA.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que al estar las clulas creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las clulas que se estn guardando sern descendientes lejanas de las clulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus caractersticas.Si se va a utilizar este mtodo es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inculo; rebajando la proporcin de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxgeno es ms rpido y origina productos generalmente txicos; y almacenando los cultivos a 4C-8C. A veces tambin se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con esto se consigue tambin evitar en la medida de lo posible la desecacin del medio de cultivo, que podra ser txico para las clulas al aumentar su concentracin. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peridica es que la contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de caros en los mismos.

5.2.2. CONSERVACION POR DESTILACION EN AGUA DESTILADO O EN AGUA DE MARFIL

Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en crio tubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no debe ser superior a 104-105 clulas/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida.Los resultados obtenidos por la CECT en la conservacin de microorganismos por este mtodo muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a veces superiores a 5 aos. La estabilidad para caracteres morfolgicos y fisiolgicos es buena, pero no se ha comprobado para caracteres especficos como la virulencia, el poder fermentativo, etc.

5.2.3. METODOS RESTRINGIDOS

En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilizacin o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas.A. DESECACION EN PAPEL FILTROSe utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire (en condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin previa de las clulas. El vaco producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas.

B. DESECACION EN SUELO, ARENA, SILICATOSe aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este mtodo.Es importante esterilizar el soporte por aplicacin de calor seco, No esterilizar en autoclave. La tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios das para inducir esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la esporulacin se manifiesta, la tierra es secada y el cultivo es mantenido de esta forma en una atmosfera seca o en refrigerador. El mtodo ha sido utilizado ampliamente con hongos y actinomicetos, los cuales han sido mantenidos en estas condiciones varios aos. Tambien se puede utilizar tierra para la conservacin directa de suspensiones de esporas.

C. DESECACION EN BOLITAS DE ALGINATOste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C, pudindose guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en agua de las clulas y la proteccin que suministra el soporte de alginato. Este es un mtodo que se est utilizando incluso para la conservacin de algas y clulas vegetales.

D. DESECACION EN SAL GORDA PARA HALOBACTERIASPara su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se dejan desecar espontneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecacin no es total, pero las clulas dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

Por ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el mtodo empleado en la conservacin de las cepas microbianas, cuando stas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque stas vienen de una situacin de estrs ms o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilizacin) y por lo tanto no son adecuadas para ningn tipo de prueba.Primero habra que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo ms posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportar determinados mtodos de conservacin mejor que otros, o ser necesario tomar precauciones especiales en su conservacin. Como ya dijimos al comienzo, no existe un mtodo general de conservacin de los microorganismos, aunque no resulta difcil determinar el ms aconsejable en cada caso. La mayora de microorganismos de inters sanitario pueden conservarse a largo plazo con los mtodos generales de congelacin y/o liofilizacin, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los mtodos alternativos si se hace en las condiciones adecuadas y bien controlados por un microbilogo.Con lo anteriormente expuesto pretendemos contestar a las numerosas preguntas que se plantean a la CECT sobre esta cuestin. Este artculo se ha confeccionado no solamente mediante una consulta bibliogrfica que se puede ampliar con la completa bibliografa que se incluye al final, sino tambin gracias a la experiencia adquirida por el personal de la CECT a lo largo de los aos, y los autores agradecen su informacin y consejos.Por ltimo, la CECT organiza cada ao en el mes de Septiembre un curso terico-prctico de 40 horas de duracin repartidas en cinco das consecutivos sobre el tema Conservacin y control de cepas microbianas. Las plazas disponibles son 15, y en l los alumnos pueden aprender con ms detalle lo que antes hemos resumido.

6. CONCLUSIONESA. Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logartmica, a la temperatura optima, en el medio adecuado. B. Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin optima. C. Repartir la suspensin en la ampolla de congelacin, cerrarla hermticamente y mantenerla 30 minutos a 30C. D. Disminuir la temperatura lo ms rpido posible. E. A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado en un bao a 37 - 40C. En cualquier laboratorio de microbiologa es fundamental el mantenimiento y conservacin de las colecciones de microorganismos con las que trabajamos ya que, obviamente, son nuestro reactivo primordial. Existen una gran variedad de mtodos de mantenimiento y conservacin de los microorganismos cuya utilizacin va a depender en parte del tiempo previsto y en parte de las caractersticas de los diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus, algas, protozoos).

7. RECOMENDACIONESConsideraciones para la preservacin de cepas microbianas: A. Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados. B. Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar si el agente protector es txico. C. Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de secado, agregado de protectores en procesos industriales la viabilidad no es lo nico importante. D. La cepa debe mantener sus propiedades productivas.E. Desarrollar un test de produccin o bioensayo durante la recuperacin de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfologa, formacin de producto, rasgos recombinantes (plsmidos, resistencia a antibiticos, etc.).8. ANEXOSConservacin bacteriana por mtodo simple a temperatura ambiente: una alternativa viable Lic. Zulia Weng Alemn, 1 Dra. Raquel de los ngeles Junco Daz, 2 Tc. Olvido Esther Daz Rosa, 3 Tc. Inalvis lvarez Molina,4 Jos Ramn Beltrn Daz3 y Tc. Mara Caridad Rodrguez Salazar3 RESUMEN Con el objetivo de verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres fisiolgicos de cepas bacterianas originalmente preservadas en medio semislido de conservacin desde finales de 1980, se estudiaron 60 cepas bacterianas de las familias Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae y Pseudomonaceae, mantenidas como patrones de referencia en la coleccin de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. El 85,0 % de las cepas se mantuvo viable durante 12 aos con un 45,3 de sus niveles de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL y un 87,0 de pureza, as como un 95,2 de preservacin de las caractersticas fenotpicas. El medio permiti la conservacin con buenos resultados de las cepas, lo que sugiere su empleo como mtodo simple en los laboratorios con limitados recursos. Palabras clave: Temperatura ambiente, medio semislido de conservacin, viabilidad, cepas bacterianas. Numerosas instituciones mantienen colecciones vivientes de microorganismos, ya sea con fines docentes, investigativos o para disponer de cepas patrones tiles en el aseguramiento de la calidad de mltiples procesos industriales, evaluacin de materias primas, productos y tecnologas. En la actualidad, para la conservacin de estos cultivos por largos perodos de tiempo se emplean la liofilizacin y la criopreservacin,1,2 como mtodos de eleccin que aseguran la viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas. Cuando no existen los recursos necesarios para la utilizacin de estas tcnicas, la bsqueda de alternativas de preservacin menos costosas es una constante. La coleccin de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa (CCINHEM) ha provisto de cepas bacterianas a numerosos laboratorios microbiolgicos en todo el pas, en medio semislido de conservacin (MSC), el cual es de fcil preparacin, manipulacin, costo y buenos resultados en el mantenimiento de los cultivos a mediano plazo, convertido en el mtodo bsico de transporte y preservacin de los cultivos de la coleccin. Despus de transcurrir ms de 10 aos desde su introduccin a la prctica y al constatarse que mantena su apariencia, consistencia e hidratacin, se decidi verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres fisiolgicos de los primeros cultivos inoculados en l, empleados como microorganismos patrones en el control de la calidad de medios de cultivos y reactivos en el Departamento de Microbiologa Sanitaria del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. MTODOS Se preservaron en medio semislido de conservacin a temperatura ambiente 60 cepas bacterianas que integran el banco primario de trabajo de la coleccin de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa (CCINHEM), desde su aislamiento y/o incorporacin entre 1986 y 1990. Despus de su estudio se mantuvieron en este medio hasta mediados del 2000, fecha en que se comenz la verificacin nuevamente de su viabilidad y clasificacin (tabla 1). Tabla 1. Relacin de microorganismos en estudio. INHEM 2000-2002 Cepas microbianasAo conservacinRplicas disponiblesCepas microbianas (INHEM)AoconservacinRplicas disponibles

Bacillus cereusINHA19892Salmonella allenton19871

Bacillus subtilisATCC 663319901Salmonella anatum19882

Budvicia aquatica IHE 2742619892Salmonella binza19881

Citrobacter freundiiINHEM19882Salmonella braenderly19871

Citrobacter spINHEM19861Salmonella bredeney19871

Edwarsiella tardaIHE 2745619891Salmonella B19871

Enterobacter sp19891Salmonella C19871

Enterobacter aerogenes19882Salmonella cerro19871

Enterobacter sakazakiiIHE 2813219893Salmonella edmonton19871

Enterococcus faecalis19882Salmonella havana19871

Enterococcus faecalisATCC 1943319891Salmonella heidelberg19871

Pseudomonas aeruginosa232719883Salmonella infantis19871

Escherichia coliATCC 2592219881Salmonella kentucky19871

ELABORACINPesar las cantidades exactas indicadas y calentar los ingredientes hasta lograr su total disolucin.Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min.Distribuir aspticamente 3 mL del medio en tubos de 90 x 10 mm (bacilo) y tapar con tapn de goma previamente esterilizados (tubos y tapones por separado).Mtodo de siembra del medio de conservacin:Tomar inculos de las cepas cultivadas, previa comprobacin de pureza; sembrar en el medio con aguja de nicrn hasta mitad del tubo; incubar por 18-24 h a 37 C y posteriormente mantener a temperatura ambiente.CHEQUEO DE VIABILIDADLos cultivos conservados en MSC fueron sembrados en caldo cerebro corazn y se incubaron a 37 C por 18-24 h. A los cultivos viables se les realizaron las pruebas de tincin de Gram, evaluacin de la viabilidad en medios slidos mediante los mtodos de cultivo en placa por agotamiento4y la tcnica de Miles y Misra "modificada",5as como el chequeo de las propiedades bioqumicas por el mtodo convencional de los tubos de ensayo, segn lo que reporta la literatura de consulta.6,7,8Adems, se verific el mantenimiento de las caractersticas antignicas para las cepas del gneroSalmonella spmediante la tcnica de aglutinacin en lmina portaobjetos segn el esquema de Kauffman-White,9para lo que se utilizaron antisueros comerciales (Wellcome). La figura ilustra la marcha tcnica seguida para el desarrollo del trabajo.FIG. Procedimiento de comprobacin de los cultivos en la CCINHEM. INHEM, 2000-2002.En la ejecucin de este estudio fueron utilizados medios de cultivo BIOCEN10y reactivos MERCK11de calidad certificada, y los resultados obtenidos referente a la caracterizacin bioqumica fueron comparados con los datos del estudio inicial correspondiente a la fecha de conservacin de las cepas.RESULTADOSLa tabla 2 muestra los valores de porcentaje de viabilidad de los cultivos estudiados en correspondencia con la familia microbiana a que pertenecen las cepas, mientras que las tablas 3 y 4 ilustran los resultados de las pruebas fisiolgicas evaluadas y la nomenclatura y estructura antignica de las cepas deSalmonella spincluidas en el estudio, respectivamente. El 87,04 % de los cultivos viables permaneci puro y conserv su respuesta frente a la tincin de Gram, y se obtuvo una buena recuperacin de los cultivos en medios slidos.

Tabla 2. Resultados de la viabilidad de los cultivos por familia bacteriana

Familia bacterianaCantidad de cepas%

EvaluadasViables

Bacillaceae22100

Enterobacteriaceae554785,45

Enterococaceae2150,0

Pseudomonaceae11100

Total605185,0

Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas

Pruebas bioqumicasRespuestas coincidentes (% de positividad)Respuestas no coincidentes (% de positividad)

Oxidasa100

Catalasa100

Reaccin en medio de Kligler

Glucosa100

Lactosa100

Gas100

H2S100

Descarboxilacin en medio de Moeller

Control100

Lisina919

Arginina7525

Ornitina919

Pruebas miscelneas

Indol100

Urea100

Citrato100

Movilidad100

Fermentacin de carbohidratos

Salicina919

Sorbitol8515

Manitol9010

De los resultados obtenidos en este trabajo se concluye que el medio semislido de conservacin result apropiado para el mantenimiento de las cepas bacterianas en estudio durante ms de 12 aos, al permitir la conservacin de los cultivos con un 85,0 % de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL, la pureza en un 87,0 y la estabilidad de las propiedades fisiolgicas en un 95,2.

9. BIBLIOGRAFIA1. LAB. Microbiologa Ambiental y Biotecnologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, UNMSM LIMA-PERU2 Lab. Microbiologa, Instituto del Mar del Peru IMARPE.2. Beech, F.W.; and Davenport, R.R. "Isolation, purification and maintenance of yeasts". Methods in Microbiology.Vol 4.Academic Press.London, 153-182 (1971).3. Day, J.G and McLellan, M.R. (eds.) "Cryopreservation and freeze-drying protocols". Humana Press. Totowa.New Jersey (1995).4. Hatt, H. (ed.) "American Type Culture Collection Methods: I. Laboratory manual on preservation, freezing and freeze-drying". American Type Culture Collection. Rockville (1980).5. Hunter-Cevera, J.C. and Belt, A. (eds.) "Maintaining cultures for biotechnology and industry". Academic Press. London. (1996).6. Juarros, E., Tortajada, C., Garca, M.D. and Uruburu, F. "Storage of stock cultures of filamentous fungi at 80C.: effects of different freezing-thawing methods". Microbiologa SEM. 9, 28-33 (1993).

INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS UNSAPgina 1