1. Metode de evaluare a populatiilor microbiene.Clasificare.Tehnici de diluare si concentrare - metode directe, care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei sau metode indirecte, în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenta, impedanţa);- metode nonculturale, care permit evaluarea rapidă a populaţiei microbiene analizate şi metode culturale, care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei; - metode automatizate, "on line", care permit analiza directă a probelor din fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză. Tehnici de diluare - Serii liniare, în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate; - Serii logarítmice (diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie geometrică (ex. 0.1/0.01/0.001/0.0001 etc.). Pentru realizarea diluţiilor decimale, într-un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia coli). Tehnici de concentrare - utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor patogene; Metode de îmbogăţire, care presupun inocularea probei de analiză într-un mediu favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule; Metode de separare fizică sau fizico-chimică a celulelor prin filtrare, centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici directe sau culturale; Metode de separare prin interacţiuni hidrofobe-hidrofile, interacţiuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

2. Numararea microorganismelor prin examen microscopic direct folosind citometrul THOMA Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor. Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare). Diferenţierea dintre tipurile de citometre constă în mărimea variabilă a suprafeţei unui pătrăţel elementar. În cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1 mm2

este divizată în 400 de pătrăţele elementare cu latura de 1/20 mm. Numărul de celule prezente într-un cm de suspensie de analizat se determină cu formula: N = n·4 · 106 ·k în care: N este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar; k - coeficient de diluţie. În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintă mobilitate.

3. Estimarea electronica a numarului de microorganisme.Principiul de functionare al aparatului de tip CoulterAparatul de tip Coulter funcţionează după următorul principiu: De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într-un electrolit, ale căror borne sunt conectate la tensiune continuă. Prin aspiraţia provocată la partea superioară a tubului, celulele aflate în exteriorul tubului trec pe rând prin orificiu şi deplasează o dată cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoacă o creştere tranzitorie a rezistenţei circuitului, ceea ce generează un impuls electric a cărui amplitudine este proporţională cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurtă durată, aparatul permite numărarea unui număr mare de celule, una câte una, într-un timp foarte scurt. Este posibilă şi o clasificare a celulelor în funcţie de de volumul lor. Această tehnică, deşi sofisticată, este considerată extrem de interesantă şi se aplică cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând simultan cu numărarea şi dimensionarea celulelor. Rezultatele sunt reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule; Sarcina electrică a celulelor poate influenţa analiza conducând la obţinerea de rezultate eronate; Această tehnică nu se poate aplica în cazul culturilor ce conţin în suspensie, alături de celulele microorganismului cultivat, şi particule solide.

4. Citometria in flux Permite numărarea şi aprecierea stării fiziologice a celulelor, când detecţia se face prin măsurarea fluorescentei emise de celulele în prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom). După colorare celulele sunt antrenate printr-un orificiu îngust şi trec una câte una prin faţa unei surse luminoase. Fluorescenta emisă de fiecare microorganism este captată printr-un fotomultiplicator şi analizată. Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescentei. Această histogramă traduce deci un profil al populaţiei. Principiul de funcţionare al citometrului în flux: a, b – exemple de sisteme de detecţiec – diagramă de repartiţie a dimensiunilor

Adesea markerii coloranţi utilizaţi pot oferi diferite tipuri de răspunsuri: - Dacă colorantul este un marker de viabilitate, din histogramă se deduce numărul de celule viabile şi starea fiziologică a populaţiei. - Dacă histograma cuprinde net două picuri este posibilă numărarea separată a microorganismelor dintr-o cultură mixtă (de exemplu, streptococi şi lactobacili). - Dacă markerul este un anticorp sau o sondă nucleică se pot număra specific anumite microorganisme dintr-o populaţie eterogenă.

5. Microscopia in fluorescenta si imunofluorescenta Tehnica de microscopie în fluorescenţă utilizează coloranţi specifici pentru diferenţierea celulelor vii de cele moarte. - prin suspensionarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen cu citrat în preparat microscopic se vor putea diferenţia celulele vii (incolore) de cele moarte (colorate în albastru). - în mod similar, pot fi diferenţiate bacteriile vii de cele moarte după colorare cu acridin oranj. Tehnica de microscopie în imunofluorescenţă permite detectarea unei categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.

6. Tehnica clasica de numarare prin cultivare pe medii dense, in placi Petri Metodologia de analiză presupune adoptarea a două modalităţi de inoculare a celulelor în/pe mediul de cultură solidificat, în plăci Petri, şi anume: a.inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm3 din fiecare diluţie se transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare placă se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific, cu agar (10-15 cm3), fluidifîcat şi temperat la 40...45°C. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin mişcări orizontale, circulare ale plăcii. După solidificarea mediului, prin termostatare în condiţii optime, se vor forma colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia. Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar şi microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. În cazul microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în mediu şi solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de mediu steril; b. inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat, când 0,1 cm3 probă diluată se transferă într-o placă Petri sterilă, în care. în prealabil, a fost repartizat mediul de cultură cu agar. Suspensia se răspândeşte uniform pe întreaga suprafaţă a mediu-luide cultură cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatulă Drigalski). Această tehnică prezintă dezavantajul că unele celule pot să rămână ataşate de instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateţei rezultatului analizei. Pentru obţinerea unor rezultate mai concludente se recomandă inocularea a câte două plăci în paralel pentru fiecare diluţie analizată. Numărarea indirectă a microorganismelor prin cultivare pe medii dense

Citirea şi interpretarea rezultatelor După termostatarea în condiţii optime, apariţia vizibilă a coloniilor va depinde de particularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare, de obicei după 48-72 h de cultivare. În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care s-a făcut numărarea se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm3

probă de analiză, cu formula: ufc/cm3 (g) = n • d în care d este coeficientul de diluţie corespunzător plăcii din care s-a realizat numărarea; în cazul în care pentru aceeaşi diluţie s-au inoculat câte două plăci în paralel, n reprezintă media aritmetică a coloniilor numărate în cele două plăci. In cazul numărării coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu sursă de lumină, lupă

pentru mărirea imaginii şi un dispozitiv de marcare şi înregistrare a coloniilor numărate.7. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologica cantitativa si calitativa "Petrifilms" - discuri în care mediul de cultură specific este deshidratat şi acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm3 suspensie de

celule, apa conţinută în suspensie rehidratează mediul şi prin termostatare este posibilă creşterea microorganismelor. Există diferite tipuri de Petrifilm pentru: număr total de microorganisme, drojdii, bacterii coliforme. Avantaje: reducerea timpului de analiză, reducerea preţului de cost/probă, creşterea numărului de probe analizate, creşterea calităţii şi îmbunătăţirea substanţială a productivităţii. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor

Particularităţi ale Petrifilmelor 3M

- TTC — clorură de trifenil tetrazoliu (culoarea virează spre roşu datorită reducerii de către microorganisme cu formare de formazan); - BCIP - brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfatază, produsă in general de drojdii şi mucegaiuri; virajul culorii, precipitat bleu); - BCIG — brom cloro indoxil β glucuronidă este indicator al β glucuronidazei, pe care o posedă Escherichia coli; are loc virajul culorii — precipitat bleu.

8. Evaluarea numarului de microorganisme dupa flitrare prin membrana Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de microoganisme, care nu conţin compuşi ce produc colmatarea filtrului. Pentru analiză, o cantitate controlată de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se transferă aseptic în rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin filtru (cu pori mici, capabili să reţină toate microorganismele), după care membrana se ridică aseptic cu o pensetă sterilă şi se transferă într-o placă Petri sterilă în care în prealabil s-a repartizat mediul de cultură adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultură specific este impregnat în membrană şi astfel, după filtrare, membrana se plasează într-o placă Petri sterilă. Prin termostatare în condiţii optime la suprafaţa membranei se formează colonii caracteristice, care se pot număra şi analiza din punct de vedere morfologic.

9. Evaluarea numarului de microorganisme prin utilizarea mediilor de imersie Tehnici moderne prevăd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu geloză sau benzi de hârtie impregnate cu medii adecvate. Lamele cu medii de cultură gelozate se menţin în tuburi speciale, sterile. In momentul utilizării se extrage aseptic lama din tub, se imersează în proba de analizat, după care se reintroduce în tubul steril şi se termostatează la temperatura optimă de creştere, specifică microorganismelor analizate. După termostatare, 16-24 h pentru bacterii şi 3-4 zile pentru drojdii şi mucegaiuri, se pot număra coloniile caracteristice care s-au dezvoltat la suprafaţa lamei. Lame specializate pentru control microbiologic selectiv - lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) -destinate pentru determinarea numărului total de microorganisme; - lame pentru evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloză tripticază soia + VRBC geloză); - lame pentru evidenţierea selectivă a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu specific cu geloză); - lame pentru determinarea fungilor filamentoşi (geloză tripticază soia; tripticază soia cu TTC + geloză cu roz bengal şi cloranfenicol ş.a.); - lame Biokar - pentru număr total de coliformi; număr total de drojdii şi mucegaiuri; - lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui; - lame Microtest. Benzile de hârtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip) - sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid şi eficient al alimentelor. - se pretează cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui); - constau din benzi sterile de hârtie impregnate cu mediu specific, pentru care se precizează: timpul necesar de menţinere în contact cu proba de analizat; volumul de lichid pe care îl adsorb (0,1-

1 cm3). - Pentru analiză, banda sterilă se imersează în lichidul de analizat, apoi se reintroduce in ambalajul steril şi se termostatează in condiţii optime.

10. Tehnici de evaluare a cresterii prin determinarea globala a biomasei - pot fi aplicate atât pentru evaluarea populaţiilor aparţinând microorganismelor unicelulare, dar mai ales în cazul microorganismelor filamentoase. - biomasa microbiana este recuperată, în general prin centrifugare (2000-4000 rot., 10 min., la 4°C), este spălată de mai multe ori cu soluţie 0,9% NaCl, pentru îndepărtarea impurităţilor din mediul de fermentaţie, reţinute o dată cu celulele, apoi uscată la temperatura de 105°C, până la greutate constantă. Dezavantaje - este puţin sensibilă; - nu se aplică decât în cazul mediilor lichide fermentate în care microorganismele sunt singurele particule în suspensie; - nu se poate face distincţie între biomasa vie şi cea autolizată; - conţinutul de biomasă nu reflectă întotdeauna gradul de multiplicare al celulelor. De exemplu, în cazul mucegaiurilor, celulele cresc acumulând intracelular substanţe de rezervă şi formează pereţi celulari groşi fără să se producă diviziunea celulară.

11. Estimarea cantitatii de biomasa prin dozarea unor constituienti celulari Determinarea cantitativă a unor componenţi aflaţi în concentraţie aproximativ constantă în celulele microbiene oferă indicaţii asupra evoluţiei unei culturi. Principiul acestor metode constă în măsurarea concentraţiei unor componenţi celulari şi, considerând aceasta aproximativ constantă per celulă, este posibilă stabilirea prin echivalenţă a concentraţiei de biomasa. Astfel de componenţi sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, AND), ATP, NADH. Celulele separate de mediul de fermentaţie prin filtrare sau centrifugare sunt spălate pentru îndepărtarea impurităţilor, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau fizice pentru eliberarea componenţilor celulari şi evaluarea acestora prin tehnici standardizate de analiză. Determinarea concentraţiei proteinelor celulare - Creşterea şi multiplicarea celulelor este în dependenţă directă cu biosinteza de proteine. Pentru evaluarea conţinutului total de proteine sunt recomandate metodele clasice: metoda biuretei, metoda Lowry, metoda Bradford, metoda Kjeldahl, sau hidroliza proteinelor şi dozarea aminoacizilor. Metoda biuretului este cea mai recomandată în astfel de studii. Principiul metodei constă în formarea unui complex colorat între ionii de cupru şi grupările proteice încărcate cu sarcini negative. Metoda Lowry se utilizează atunci când concentraţia de celule în suspensia de analizat este mică. Cantitatea de proteine se determină prin comparaţie cu o curbă etalon cu albumina serică bovină. Conţinutul în proteine se poate exprima şi prin dozarea azotului, utilizând metoda Kjeldahl (proteine = Nx 6,25). Determinarea acizilor nucleici - Biomasa microbiana are un conţinut remarcabil, constant, de ADN. Acest constituent este în general absent în ingredientele mediului de cultură, ceea ce exclude eventualele interferenţe, dar, din păcate, determinarea sa este destul de sofisticată, necesitând tehnici de liză a celulelor, extracţie, separare. Pentru dozare se apelează la metode spectrofotometrice (λ= 260 nm) sau colorimetrice. Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare. Determinarea conţinutului de ATP Evaluarea biomasei microbiene prin determinarea conţinutului de ATP tinde să se generalizeze. ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un intermediar important al metabolismului celular cu rol în metabolismului energetic. Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazează pe emisia luminoasă produsă prin oxidarea luciferinei la oxiluciferină, reacţie catalizată de către enzima luciferază în prezenţă de ATP. Această emisie, care poate fi măsurată spectrofotometric, este obţinută în câteva secunde, conform ecuaţiei: ATP + luciferina + O2 → oxiluciferină + AMP+ PPi + CO2 + lumina. Măsurarea bioluminescenţei se realizează la λ = 562 nm cu ajutorul unor aparate speciale (fluorimetre). Variaţia conţinutului de ATP al microorganismelor este în funcţie de specie şi de starea fiziologică, cu factori de variaţie de la 1 la 10. Dezavantaje - Metoda este laborioasă mai ales dacă se au în vedere dificultăţile de extracţie a ATP-ului din celulele microbiene. Tehnica de analiză a ATP-ului nu oferă rezultate corespunzătoare în cazul unor populaţii eterogene ce conţin celule de vârste variabile. Această tehnică se aplică cu succes pentru studiul culturilor pure în sisteme continue de fermentaţie. Pentru rezultate mai concludente se recomandă corelarea conţinutului în ATP cu numărul de celule.

12. Evaluarea populatiilor microbiene prin masurarea fluorescentei Aceasta poate fi emisă de anumiţi componenţi celulari, care au abilitatea de a reemite lumina absorbită prin modificarea lungimii de undă

Compuşii care emit fluorescentă (fluorofluori) cu importanţă pentru evaluarea populaţiilor microbiene Relaţia dintre fluorescentă şi concentraţia compusului care emite fluorescentă - Dacă fiecare celulă conţine o concentraţie intracelulară

aproximativ constantă a unuia din fluorofluorii prezentaţi în tabel concentraţia de celule se poate determina în funcţie de fluorescenta emisă, măsurată spectrofotometric, conform curbei

Principiul măsurării fluorescentei unei culturi - Dintre compuşii fluorofluori, cel mai adesea se recurge la NADH, care emite fluorescentă la 460 nm, când este excitată în lumină la lungimea de undă λ = 340 nm În forma oxidată (NAD) coenzima nu are fluorescenţă. În cursul creşterii celulare cantitatea de NADH creşte în raport direct proporţional cu multiplicarea celulelor, permiţând astfel evaluarea concentraţiei de biomasă.

Factori care influenţează fluorescenta - pH, temperatură, prezenţa unui agent antispumant, modificări ale activităţii metabolice a celulelor determinate, spre exemplu, prin limitarea oxigenului. Pentru măsurare se lucrează întotdeauna cu celule vii, cu o stare fiziologică constantă. Această metoda de analiză permite evaluarea celulelor vii, este relativ specifică, sensibilă şi exactă, dar aplicarea sa este recomandată pentru evaluarea populaţiilor ce conţin celule cu vârste şi stări fiziologice constante (culturi continue, sincrone). În practica industrială fluorescenta se măsoară "on line" direct în bioreactor.

13. Tehnici turbidimetrice si nefelometrice de evaluare a cresterii microorganismelor Metoda comparativă O metodă simplă (tehnica mestrezat) constă în compararea turbidităţii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor etaloane cu albumină. De exemplu, turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109 bacterii/cm3 corespunde unei suspensii cu o concentraţie de 0,5 g/dm3 albumină. Această metodă este mai puţin precisă şi se utilizează de obicei în studii comparative. Metoda turbidimetrică Tehnica permite stabilirea concentraţiei de celule în funcţie de absorbanţa suspensiei de celule, care se determină cu ajutorul unui spectrofotometru sau nefelometru.

Principiul metodei - Similar cu legea Beer-Lambert există o proporţionalitate între absorbanta culturii (densitatea optică) şi concentraţia de celule în suspensie, conform relaţiei: A=ε·I·C în care: A este absorbanta, măsurată la λ = 600 nm; ε - coeficient de extincţie ''celular“; C - concentraţia celulelor în suspensie. În funcţie de substanţa uscată a masei celulare şi de absorbanţa culturii, comparativ cu mediul de cultură steril considerat ca referinţă, poate fi trasată o

curbă etalon A = f (biomasă substanţă uscată). Această corelaţie este valabilă până la o valoare limită a absorbantei, variabilă în funcţie de: aparatul de măsură, lungimea de undă, natura suspensiei ş.a. Corelaţia absorbanţă-biomasă substanţă uscată

Aplicabilitate - Această metodă rapidă este valabilă în cazul microorganismelor unicelulare dezvoltate în medii definite şi limpezi. Prezenţa de particule în suspensie, altele decât celulele microbiene, perturbă evident măsurătorile. Tehnica nu se pretează întotdeauna pentru evaluarea creşterii microorganismelor filamentoase. Se poate aplica pentru măsurări în sistem continuu ("on line"), pe tot parcursul desfăşurării procesului fermentativ, graţie punerii la punct a unor biofotometre sterilizabile cu funcţionare continuă. Metoda nefelometrică - permite măsurarea

luminii difuze şi oferă informaţii asupra dimensiunilor celulelor şi concentraţiei lor în suspensii lichide. - în practica de laborator se prepară etaloane nefelometrice din sulfat de bariu, într-o serie de 10 eprubete egale se repartizează o soluţie de clorură de bariu 1%, în cantităţi progresiv crescânde de la 0,1 cm3 Ia 1 cm3 . - în fiecare eprubetă se completează apoi volumul până la 10 cm3, cu o soluţie de acid sulfuric 1%. - opacitatea formată de sulfatul de bariu rezultat din reacţie corespunde în prima eprubetă unei concentraţii bacteriene de 3·108 celule/cm3; etalonul următor corespunde la o concentraţie de 6·108 celule/cm3; al treilea etalon, la 9·108 celule/cm3. Eprubetele ce conţin etaloanele se obturează cu dopuri de cauciuc, pentru a preveni concentrarea, iar în momentul utilizării se omogenizează conţinutul.

14. Evaluarea proprietatilor microbiene prin studiul potentialului redox Potenţialul de oxido-reducere – rH Numeroase microorganisme modifică potenţialul oxido-reducător al mediilor de cultură prin utilizarea oxigenului şi eliberarea substanţelor reducătoare ca urmare a activităţii lor reductazice. Intensitatea şi viteza de modificare a potenţialului redox depind de numărul şi natura microorganismelor, de activitatea metabolică, de natura mediului de cultură şi de condiţiile de mediu (aerare, agitare, temperatură) etc. Tehnici de evaluare a activităţii reductazice se aplică în prezent pentru aprecierea numărului de microorganisme vii din lapte, carne, sucuri. Principiul metodelor bazate pe studiul potenţialului oxido-reducător Acestea se bazează pe măsurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui indicator redox, timp care este in directă concordanţă cu numărul de microorganisme vii din proba de analizat. De exemplu, un număr de 106 bacterii produc reductaze care determină decolorarea unei soluţii de albastru de metilen după o oră, ca urmare a trecerii albastrului de metilen din forma oxidată, colorată în albastru, la un leucoderivat incolor. Această metodă nu este specifică şi, în general, este utilizată pentru aprecierea numărului total de bacterii vii. Cei mai utilizaţi indicatori redox sunt: resazurina, albastru de metilen, clorura de trifeniltetrazoliu (TTC). Indicatori redox utilizaţi pentru aprecierea numărului total de bacterii

15. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea pH-ului si a vascozitatii Determinarea pH – ului - Ca urmare a activităţilor metabolice, microorganismele determină frecvent modificarea pH-ului mediului de cultură prin formare sau consum de acizi organici, producerea de compuşi alcalini sau ca efect al schimburilor ionice. Atunci când aceste modificări pot fi corelate cu creşterea, este posibilă estimarea concentraţiei de biomasă. Modificarea pH-ului mediilor de cultură este în general sesizată senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. Nivelul de detecţie al acestei metode este foarte scăzut. Se preferă să se realizeze dozarea titrimetrică cu determinarea: acidităţii totale şi volatile, alcalinităţii totale, azotului bazic total, volatil. Evaluarea viscozităţii mediului - Ca urmare a evoluţiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaţiei se produc modificări ale proprietăţilor reologice ale mediului fermentativ. Modificarea viscozităţii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de evaluare a creşterii. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu glicerol), fie acumulării de produşi de fermentaţie (poliglucide: xantan, dextran ş.a.), sau ca urmare a creşterii concentraţiei de

celule. Există în prezent viscozimetre pentru un domeniu larg de măsurare a viscozităţii, care pot face măsurători “on line". Pentru cazul vâscozităţilor foarte mari nu s-a realizat până un prezent un instrument de precizie pentru măsurarea viscozităţii.

16. Evaluarea proprietatilor microbiene prin metoda calorimetrica Evaluarea calorim e trica Majoritatea reacţiilor metabolice care sunt implicate în creşterea şi multiplicarea celulelor microbiene sunt reacţii exergonice, căldura eliberată variind direct proporţional cu numărul de celule vii. Această căldură poate fi măsurată în bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici: calorimetrie dinamică, calorimetrie în flux, calorimetrie continuă. Microcalorimetrele permit măsurarea schimburilor termice între mediul de fermentaţie şi mediul exterior, cu un prag de detecţie de 1-10 µW. Acumularea de căldură în timpul cultivării se calculează cu relaţia: Qa = Qf + Qag - Qo – QE în care: Qa — căldura acumulată în timpul fermentaţiei, [kJxdrrfJ]; Qf- căldura rezultată prin fermentaţie; Qag - căldura produsă prin agitare; Qo - căldura produsă prin aerare; QE — pierderile de căldură în mediu. Mărimea Qa poate fi măsurată cu ajutorul unui termometru sau termistor, prin închiderea sistemului de răcire al bioreactorului şi măsurarea evoluţiei temperaturii pe perioade scurte de timp. Valoarea Of se calculează în funcţie de pierderile de căldură. Prin tehnici de cultivare continuă, prin calorimetrie în flux, s-a stabilit că evoluţia vitezei de formare a căldurii în sistemul fermentativ este direct proporţională cu concentraţia de biomasă

17. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea CO2-ului rezultat si prin masurarea impedantei Determinarea CO2 Sunt cunoscute în prezent mai multe tehnici de evaluare a conţinutului de CO2 rezultat ca urmare a activităţii metabolice a microorganismelor. Una dintre metode se bazează pe măsurarea conductivităţii într-un mediu cu geloză şi KOH în care este captat CO2 rezultat prin fermentaţie. Prin înlocuirea progresivă a ionilor hidroxil cu ioni carbonat, mai slabi conductori, se reduce conductivitatea mediului. Măsurarea impedanţei - Impedanţa electrică Z, sau conductanţa mediului de cultură, se modifică prin dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfăşurării procesului fermentativ ca urmare a transformării moleculelor electric neutre în molecule ionizante, cu atât mai rapid cu cât microorganismele se dezvoltă mai repede. Modificarea impedanţei variază in funcţie de: concentraţia de celule şi tipul microorganismului, mediul de cultură, temperatură, modul de măsurare, frecvenţa semnalului aplicat, proprietăţile suprafeţei şi geometria electrodului şi distanţa dintre electrozi. Se măsoară modificarea impedanţei mediului pe parcursul dezvoltării culturii, Za, comparativ cu un mediu martor de referinţă, Zref. Variaţia impedanţei se calculează cu formula:

Aplicabilitate Metoda este rapidă şi permite analiza unui număr mare de probe, dar nu permite evaluarea numărului de celule vii, iar în cazul culturilor de drojdii şi mucegaiuri nu se produc modificări mari ale conductanţei mediului, deoarece prin metabolismul lor se produc puţine molecule ionizabile. Această metodă este utilizată

pentru analiza cărnii, a laptelui, iar pragul de detecţie este de aproximativ 106 -107 celule·cm3.

18. Evaluarea proprietatilor microbiene prin dezvoltarea chimica a produsilor de metabolism si prin evaluarea activitatii unor enzime Dozarea chimică - Determinarea cantitativă a produşilor de fermentaţie care au legătură directă cu creşterea: CO2, etanol, acid acetic, ergosterol (în cazul mucegaiurilor) ş.a., oferă informaţii asupra evoluţiei culturii şi pot fi corelaţi cu creşterea. Prin cromatografie de înaltă performanţă a fost posibilă analiza fazei gazoase. Metoda permite cuantificarea foarte fină a cineticii formării substanţelor volatile întimpul fermentaţiei şi corelarea acestora cu creşterea celulelor. Evaluarea activităţii unor enzime - Testele se referă la dozarea de compuşi din mediul de fermentaţie (substrat sau produşi de fermentaţie) care pot fi determinaţi prin evaluarea activităţii unor enzime. În prezent, firme specializate (ex. compania Boehringer) comercializează numeroase kituri de dozare, şi anume:teste pentru măsurarea în UV a unui cofactor oxidat - (NAD→ NADH → H+): aldehida acetică — aldehid dehidrogenaza; acid acetic - citrat sintetaza, malat dehidrogenaza, lactic dehidrogenaza; teste colorimetrice: acid ascorbic - ascorbat oxidaza; acid gluconic - gluconat kinaza; acid glutamic - diaforaza, glutamat dehidrogenaza; Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din pectină de către pectinesterazele fungice şi prin aceasta se poate estima indirect cinetica creşterii culturii fungice.

19. Studiul microscopic al microorganismelor - Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma şi dimensiunile celulelor unor elemente de structură, starea fiziologică şi se pot evidenţia tinctorial anumite proprietăţi ale microorganismelor. Examenul microscopic începe întotdeauna prin realizarea unui preparat între lamă şi lamelă

(umed), care se analizează cu obiective uscate, cu grosisment x 10 şi x40. Acest examen permite diferenţierea culturilor de drojdii şi mucegaiuri de cele de bacterii. In cazul microorganismelor eucariote (drojdii, mucegaiuri) examenul microscopic în stare vie, în preparate umede, permite un studiu eficient al caracterelor morfologice, studiul unor particularităţi privind modul de reproducere şi dimensionarea în plan orizontal a celulelor. In cazul bacteriilor, utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nu este eficientă din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. Cu excepţia unor studii de evidenţiere a mobilităţii, bacteriile se studiază numai in preparate uscate şi colorate (colorarea simplă, colorare diferenţială, colorare de structuri celulare: capsule, cili. incluziuni ş.a). Dimensionarea în plan orizontal a celulelor microbiene - Dimensionarea celulelor microbiene se execută în scopul identificării microorganismelor a căror creştere prezintă anumite limite condiţionate ereditar sau pentru a stabili influenţa unor factori asupra vitezei de creştere celulară. Măsurătorile în plan orizontal permit stabilirea, pe cale microscopică, în mod indirect, a două din dimensiunile celulei (lungime - lăţime), prin intermediul unei scări arbitrare — micrometru ocular, etalonată pentru grosismentul de lucru al microscopului prin intermediul micrometrului obiectiv (scara etalon). Pentru măsurare se folosesc de preferinţă preparate umede în care suspendarea celulelor se face în soluţie de 0,1% geloză, pentru a evita deplasarea celulelor. Micrometru l ocular şi Micrometrul obiectiv- Micrometru l ocular este un disc de sticlă în centrul căruia se află o scară gradată cu lungimea de 10 mm, divizată în 100 de diviziuni. Se montează în interiorul ocularului prin deşurubarea lentilei superioare şi se sprijină pe diafragma ocularului. În cazul în care liniile scării nu se văd distinct, se potriveşte distanţa optimă prin deplasarea diafragmei din tub şi se înşurubează din nou lentila frontală a ocularului. Micrometrul obiectiv este o lamă de sticlă dreptunghiulară în centrul căreia se află un cerc cu contur uniform în care este gravată scara de 1 mm împărţită în 100 de diviziuni egale. O diviziune a micrometrului obiectiv este egală cu 10 um. Mod de dimensionare - Se plasează lama micrometrului obiectiv pe măsuţa microscopului şi se caută imaginea scării etalon cu obiectivul cu grosisment x 10 şi apoi cu cel x45; prin manevrarea platinei se face suprapunerea celor două scări. Se notează câte diviziuni ale micrometrului obiectiv se suprapun exact peste un număr de diviziuni ale micrometrului ocular. Cunoscând că o diviziune reală a scării etalon este egală cu 10 µm, se calculează coeficientul micrometric, care stabileşte corespondenţa dintre cele două scări:

unde: - C este coeficientul micrometric; - N numărul de diviziuni pe micrometrul obiectiv; - n numărul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind în N. După stabilirea coeficientului micrometric, în locul scării etalon, pe măsuţa microscopului se aşează preparatul care conţine

celulele de dimensionat. Cu ajutorul scării prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei, se determină numărul de diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lăţime). Pentru obţinerea dimensiunilor reale ale celulelor dimensionate, numărul de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular se multiplică cu coeficientul micrometric stabilit anterior. 20. Studiul caracterelor culturale Caractere culturale ale microorganismelor în diverse tipuri de culturi - a - forma coloniilor: punctiformă (1); circulară (2); ondulată (3); lobată (4); erodată (5); filamentoasă (6); rizoidală (7); plisată cu striaţiuni radiale (8); plisată cu striaţiuni concentrice (9); formă de fus în masa de geloză (10); - b -profilul coloniilor: plat (1): bombat (2); convex (3); în formă de dom (4); umbonat (5): - c -culturi pe geloză înclinată (inoculare lineară): biomasa invadează întreaga suprafaţă (1); creştere filiformă (2); creştere ondulată (3); creştere difuză (4); creştere rizoidală sau arborescentă (5); - d - culturi prin înţepare în medii cu gelatină; filiformă (1); perlată (2); ondulată (3); arborescentă (4): lichefiere cratiformă (5); lichefiere stratiformă (6); lichefiere sub formă de sac (7): lichefiere totală (8); - e –culturi pe mediu lichid: sediment (1): tulburare (2); peliculă sub formă de inel (3), voal (4).

21. Tipuri de metabolism energetic Viaţa celulei microbiene în condiţii compatibile oferite de mediul ambiant este determinată de caracterele genetice care îi imprimă un anumit metabolism, determinat de totalitatea reacţiilor biochimice catalizate secvenţial de enzimele celulei vii, prin care se asigură transferul de masă şi energie între celulă şi mediul ambiant. Importanţa generală a metabolismului energetic în viaţa microorganismelor, a surselor de energie, a donatorilor de electroni sau de hidrogen şi a acceptorului final de electroni, a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare şi nomenclatură a principalelor tipuri de metabolism. In funcţie de natura acceptorului final de electroni, microorganismele pot prezenta trei tipuri de metabolism energetic. Respiraţia aerobă - este procesul în cursul căruia reacţiile chimice producătoare de energie necesită prezenţa oxigenului molecular ca acceptor final de electroni. - Procesul este dependent de oxigenul din aer, având ca produse finale CO 2

si H2O. - Respiraţia aerobă este foarte avantajoasă din punct de vedere energetic pentru celula microbiană, de aceea, atunci când urmărim obţinerea de celule în cantităţi mari (drojdie comprimată) sau obţinerea de substanţe intracelulare, cultivarea se face în condiţii de aerare. - Respiraţia aerobă este dependentă de cantitatea de oxigen din aer, iar carbonul din compusul organic se regăseşte în dioxidul de carbon.- Microorganismele aerobe dispun de o catenă respiratorie diversificată, în componenţa căreia intră dehidrogenaze. citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Respiraţia anaerobă - este procesul prin care substratul este transformat până la C02, iar e- sunt cedaţi prin procesul de oxidare unor compuşi anorganici acceptori. - este întâlnită la bacteriile strict anaerobe, când acceptorul de electroni sau hidrogen este un compus anorganic. Aceste bacterii obţin o cantitate mică de energie şi pot creşte în absenţa oxigenului molecular, Ia un potenţial de oxidoreducere de -0,2; - 0,3 V. - Ţinând cont că mediile ce vin in contact cu 02 au un potenţial redox de + 0,2; + 0,4 atunci când pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, în mediu se adaugă substanţe cu caracter reducător ca tioglicolat de Na, cistein-SH, sulfura de Na. Substanţele reducătoare permit menţinerea unui potenţial de oxido-reducere scăzut. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi şi vase speciale numite anaerostate în care O2 este legat chimic, sau cultura se menţine în atmosferă de gaze inerte (CO2, N2). Fermentaţia - este un proces în care reacţiile chimice producătoare de energie necesită prezenţa unor compuşi organici ca acccptori finali de electroni. - Metabolismul oxidativ anaerob poate fi întâlnit şi la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a creşte aerob utilizând oxigenul din aer (respiraţie aerobă) sau anaerob, utilizând compuşi organici ca acceptori finali ai electronilor. - Microorganismele facultativ anaerobe, în condiţii aerobe, îşi adaptează echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare până la produşii finali, utilizând preferenţial oxigenul când este disponibil datorită cantităţii mai mari.Tipuri de comportamente diferenţiate ale microorganismelor - aerobe - sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa lichidelor, a mediilor solide. Oxigenul serveşte ca acceptor final de electroni transportaţi prin catena respiratorie; - facultativ anaerobe - nu necesită oxigen pentru creştere, dar cresc mai bine în prezenţa sa. Se dezvoltă bine în medii lichide în care solubilitatea oxigenului din aer este mai redusă; - aerotolerante anaerobe - nu necesită O2 pentru creştere şi cresc la fel de bine în prezenţa sau absenţa sa. Microorganismele incluse în aceste tipuri pot produce superoxid dismutază şi catalază ce catalizează reacţiile:

- microaerofile - se dezvoltă la distanţă mică de suprafaţa mediului de cultură când concentraţia în oxigen este de 2-10%; - strict (obligat) anaerobe - nu tolerează oxigenul şi mor în prezenţa acestuia, deoarece nu pot descompune apa oxigenată cu efect distructiv asupra celulei. Nu pot obţine energie prin respiraţie propriu-zisă şi folosesc fermentaţia şi respiraţia în acest scop (ex. bacterii butirice, metanogene).

22. Studiul tipului de metabolism energetic In eprubete (8x180 mm) se repartizează câte 10-15 cm3 mediu de cultură, BCA+glucoză şi se sterilizează. în momentul utilizării, mediul se fluidifică prin încălzire pe baie de apă şi apoi se temperează la 42...45°C. Urmează inocularea în strii în profunzimea masei de gel, cu ajutorul unei pipete Pasteur. Pipeta se introduce până la partea inferioară a eprubetei, apoi se ridică încet pentru inocularea uniformă (cu 3-4 picături suspensie celule) a mediului de cultură. După răcire şi solidificare mediul se termostatează corespunzător. În funcţie de particularităţile de creştere în raport cu necesarul de oxigen, microorganismele sunt încadrate în 4 categorii principale: strict aerobe (a), strict anaerobe (b), aerotolerante anaerobe (c), microaerofile (d).

23. Evidentierea metabolismului oxidativ si fermentativ prin metoda bazata pe determinarea pH-ului Microorganismele metabolizează substanţele nutritive în mod diferenţiat, procurându-şi energia necesară proceselor vitale. Cantitatea şi natura produselor rezultate depind de caracterele ereditare ale microorganismelor, de stadiul de creştere şi de condiţiile de cultivare. Determinarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi, alcooli, enzime ş.a.) prezintă interes practic în scopul stabilirii condiţiilor optime de mediu pentru creşterea randamentului în produsul cu importanţă economică, la selectarea unor microorganisme înalt productive.In funcţie de particularităţile metabolice şi de condiţiile de cultivare, microorganismele au capacitatea de a metaboliza în mod diferit substratul cu formare de acizi, CO2 şi apă (metabolism oxidativ), sau acizi, alcooli şi gaze (CO2, H2) (metabolism fermentativ anaerob). Evidenţierea tipului de metabolism se va face prin punerea în evidenţă a produşilor finali de metabolism, în special formarea de gaze, care în cazul metabolismului fermentativ se concretizează în: acumulare de gaz în tub Durham (mediu lichid), formarea de alveole de gaz (în mediu cu geloză). În cazul respiraţiei aerobe, prin dezvoltarea microorganismelor la suprafaţa mediului de cultură, CO 2 format este eliberat în mediul înconjurător. Pentru evidenţierea tipului de metabolism se utilizează două metode principale. A. Metoda bazată pe studiul pH-ului - se aplică în general pentru studiul bacteriilor, care prin fermentaţie produc acizi şi uneori gaze. - pentru cultivare se utilizează un mediu semisolid ce conţine un indicator de pH. - înainte de utilizare, mediul se fiuidifică pe baie de apă, apoi se adaugă soluţie de glucoza astfel încât concentraţia finală în mediu să fie de 0,1% şi se solidifică din nou. - pentru analiză se utilizează câte două eprubete de mediu care se inoculează prin înţepare cu firul exact în zona centrală a tubului de gel. - în una din eprubete se acoperă suprafaţa mediului cu 1 cm3 ulei de parafină steril. - după termostatare corespunzătoare se examinează eprubetele şi se notează virarea culorii indicatorului şi eventual formarea de gaz. Posibile rezultate - acidifiere la suprafaţa mediului din eprubeta fără parafină; - absenţă modificări în eprubeta cu parafină - metabolism oxidativ; - absenţă acidifiere sau formare de gaz; uneori creşte alcalinitatea în eprubeta cu parafină - metabolism inactiv sau "inert"; - acidifiere în ambele eprubete cu sau fără formare de gaz; modificarea poziţiei dopului de parafină - metabolism fermentativ. După inoculare şi termostatare corespunzătoare rezultatele se interpretează astfel: - absenţă formare gaz; absenţă acidifiere sau alcalinizare mediu; uneori acidifiere mediu fără formare de gaz - metabolism oxidativ sau "inert"; - acidifiere cu formare de gaz; formare gaz fără acidifiere; uneori acidifiere fără formare de gaz - metabolism fermentativ (bacterii).

24. Studiul capacitatii microorganismelor de a metaboliza glucidele Pentru identificarea microorganismelor, este important să se studieze şi capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin urmărirea potenţialului de metabolizare a unor compuşi introduşi în mediul de cultură al microorganismului studiat. Asimilarea glucidelor simple – auxanograma - Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le favorizează creşterea, atunci când acestea reprezintă unica sursă de carbon prezentă în mediul de cultură. Dintre acestea mai frecvent se utilizează: arabinoza, xiloza, glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza, lactoza. Prin metabolizarea specifică a acestor substanţe se pot forma acizi organici, gaze, aldehide şi cetone. Studiul potenţialului de hidroliză al amidonului - Unele microorganisme (bacterii şi mucegaiuri) sunt capabile să sintetizeze hidrolaze extracelulare de tipul α şi β amilaze, glucoamilaze, care pot hidroliză enzimatic amidonul până la produse cu greutăţi moleculare din ce în ce mai mici, şi anume erithrodextrine, achrodextrine, maltoză, glucoza, ce pot fi utilizate de microorganisme drept surse de carbon şi energie. Pentru punerea în evidenţă a acestor proprietăţi se foloseşte un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0,2% amidon solubil. După sterilizare, mediul se repartizează în plăci Petri şi după solidificare, cu firul inoculat în suspensia de celule se inoculează "în punct" sau se trasează o linie de-a lungul diametrului plăcii. După 7-10 zile se observă vizual hidroliza amidonului după zona clară aflată în jurul coloniei sau în jurul liniei de inoculare. Zona devine mai evidentă prin adăugarea în placă a unei soluţii de Lugol. In acest caz amidonul nehidrolizat va căpăta culoare albastră, zona de formare a dextrinelor o culoare roşie-brună, iar zona în care amidonul este complet hidrolizat va rămâne incoloră. Determinarea semicantitativă a activităţii amilolitice a diferitelor microorganismese poate realiza prin stabilirea raportului intre diametrul zonei în care s-a produs hidroliza completă a amidonului şi diametrul coloniei microorganismului de

studiat, în condiţii determinate de timp şi temperatură de termostatare. Studiul fermentaţiei alcoolice - Pentru studiul fermentaţiei aicoolice şi al factorilor care condiţionează viteza de fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparţinând genului Saccharomyces. Pentru obţinerea inoculului, celulele de drojdie din eprubeta cu cultură pură, pe must de malţ-agar înclinat, se transferă în must de malţ lichid cu concentraţie 6°P (baloane cu 25 cm3 mediu) şi se termostatează 24 h la 25...30°C. Inoculul obţinut se transferă, în proporţie de 2-4 %, cu o pipetă sterilă în 3 vase de fermentare ce conţin 150 cm3 must de malţ cu aceeaşi concentraţie sau must de struguri cu 20% zahăr, prevăzute cu ventile de fermentaţie. După montarea ventilului de fermentaţie, sterilizat separat de vasul ce conţine mediul, în ventil se introduce, prin orificiul superior, un volum redus (2-3 cm3) de acid sulfuric concentrat. Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul fermentaţiei şi va reţine vaporii de apă şi alte substanţe volatile. După cântărirea iniţială a fiecărui vas, la o balanţă cu precizie, acestea se termostatează la 30°C, timp de 3 zile. La intervale de 6, 24, 48, 72 ore se face agitarea mustului pentru eliminarea Co2 format, apoi se cântăreşte fiecare vas şi se calculează prin diferenţă cantitatea medie de CO2 degajată. Studiul fermentaţiei lactice - Fermentaţia lactică este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este metabolizat sub acţiunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice în acid lactic ca produs principal al fermentaţiei. In cazul bacteriilor lactice homofermentative, pe lângă acid lactic se acumulează şi produse secundare: acid acetic, alcool etilic, glicerol, CO2.

25. Metabolismul aminoacizilor Pentru studiul metabolismului aminoacizilor se analizează mai multe aspecte: Formarea amoniacului. Amoniacul poate să rezulte în urma dezaminării aminoacizilor prezenţi în mediul de cultură al microorganismului de studiat. Acesta este parţial folosit drept sursă de azot, iar excesul se elimină şi poate fi evidenţiat pe cale chimică. Pentru evidenţierea producerii de amoniac, drept medii de cultură se recomandă apa peptonată sau un mediu lichid care conţine un aminoacid special (de exemplu, bulion-arginină). Mediul se repartizează în eprubete, se sterilizează şi se inoculează cu celulele aparţinând microorganismului de studiat. După termostatare în condiţii oprime, producerea de amoniac este evidenţiată prin reacţia de culoare cu reactivul Nessler (câteva picături), când proba capătă culoare galben-oranj. Producerea de H2S Sub acţiunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conţin sulf în moleculă (metionină, cistină. cisteină), prezenţi în mediul de cultură, are loc eliberarea de H2S. Această proprietate se poate pune în evidenţă prin cultivarea microorganismelor în mediu de bulion de carne cu peptonă repartizat în eprubete şi sterilizat. După inocularea mediului cu o suspensie de celule, între dopul de vată şi gâtul eprubetei se introduce o bandă de hârtie sterilă îmbibată în soluţie 10% acetat de plumb, astfel încât să nu atingă suprafaţa mediului. Se recomandă ca dopul eprubetei să se acopere cu o folie din plastic pentru a evita evaporarea rapidă a gazului ce se formează. Durata cultivării este 7-10 zile. Eliberarea de H 2S se evidenţiază prin înnegrirea hârtiei ca rezultat al formării sulfurii de plumb (PbS). O altă metodă de evidenţiere a H2S eliberat de către microorganisme constă în cultivarea acestora pe un mediu specific, care conţine proteine şi sulfat de fier: mediul peptonă-fier-agar, mediul Mossel, mediul Lingby cu geloză. Mediul cu agar repartizat în eprubete se sterilizează la 0,5 atm şi se înclină sau se păstrează ca atare, sub formă de tub de gel. Cu firul încărcat cu celule se aplică striuri la suprafaţa mediului (pentru microorganisme aerobe), sau inocularea se realizează în profunzimea tubului de gel drept (pentru microorganisme anaerobe, facultativ anaerobe sau microaerofile). Prin creşterea biomasei, o dată cu eliberarea de H2S are loc înnegrirea mediului ca rezultat al formării sulfurii de fier. Degradarea specifică a unor aminoacizi Numeroase specii de microorganisme conţin enzime capabile să producă degradarea specifică a unor aminoacizi. - prin reacţii de decarboxilare a aminoacizilor (decarboxilaze) rezultă amine, - prin dezaminare (dezaminaze) se formează acizi şi amoniac, - caz special este degradarea triptofanului sub acţiunea enzimei triptofanază, când rezultă indol. Producerea de indol este o caracteristică taxonomică importantă pentru caracterizarea şi identificarea enterobacteriilor şi a bacteriilor aparţinând genului Pseudomonas.

26. Studiul metabolismului lipidic Activitatea lipazică (esterazică) a microorganismelor poate fi pusă în evidenţă prin diferite metode, şi anume: - inocularea celulelor "în punct" pe suprafaţa unui mediu de cultură solidificat (mediul Sierra) sau Tween 80 (polisorbat 80), repartizat în plăci Petri - după termostatare în condiţii optime de creştere, tulpinile cu activitate lipazică vor prezenta în jurul coloniilor o zonă opacă, drept urmare a precipitării oleatului de calciu; - cultivarea "în punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de măsline steril - înainte de repartizarea în plăci Petri. În mediu se adaugă 0,006 % albastru de Victoria. Tulpinile cu activitate lipolitică vor fi puse în evidenţă prin prezenţa în jurul coloniilor a unui precipitat de culoare albastru-deschis, dat de sărurile acizilor biliari; - cultivarea "în punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin - prin aceasta, tulpinile lipazo-pozitive vor prezenta în jurul coloniilor o zonă clară. În acest caz se pot utiliza şi variante de mediu de cultură cu

adaos de compuşi indicatori. De exemplu, dacă mediul conţine albastru Evans, în jurul coloniilor cu activitate lipazică va apărea o zonă clară, comparativ cu restul mediului de culoare albastră. Dacă în compoziţia mediului de cultură se utilizează un indicator de pH (de exemplu, roşu de fenol), în jurul coloniilor tulpinilor active va apărea o zonă cu coloraţie galbenă ca urmare a acidifierii produse de acidul butiric format; - studiul activităţii lecitinazice - se face utilizând un mediu cu gălbenuş de ou. In geloză nutritivă obişnuită se adaugă o soluţie (5-10%) de gălbenuş de ou în ser fiziologic steril. Mediul se repartizează în plăci Petri sterile şi după solidificare celulele microorganismelor de studiat se inoculează "în punct" pe suprafaţa mediului. După termostatare în condiţii optime de creştere, tulpinile cu activitate lecitinazică vor prezenta în jurul coloniilor o zonă opacă. Potenţialul de degradare a acizilor graşi se poate evidenţia prin utilizarea acestora ca unică sursă de carbon.

27. Studii imunologice.Principiul metodei imunologice.Reactii imunologice de baza.Tehnici principale de analiza Imunologia constă în studiul relaţiilor dintre substanţele străine unui organism superior (antigeni) şi apărătorii specifici ai acelui organism (anticorpi). Antigenii sunt macromolecule cu compoziţie chimică diferită care au situsuri active. Microorganismele conţin numeroase tipuri de antigeni, de natură bine definită, care caracterizează fiecare specie şi uneori unele varietăţi (serotipuri). Principiul metodelor imunologice Atunci când un antigen pătrunde în organismul gazdă, induce formarea anticorpilor specifici (puterea antigenică). Această reacţie se produce in vivo dar şi in vitro. Manifestările unei astfel de reacţii sunt variabile: - un antigen molecular (element microbian sau toxină) reacţionează cu un anticorp printr-o reacţie de precipitare sau neutralizare; - o bacterie, care conţine un ansamblu de antigeni, reacţionează cu anticorpii printr-o reacţie de precipitare. Reacţia antigen-anticorp realizată in vitro permite, în cazul unor analize, să se identifice antigenul, deci un microorganism necunoscut, cu ajutorul anticorpului cunoscut sau să se identifice un anticorp necunoscut, în cazul unei îmbolnăviri, şi microorganismul responsabil de aceasta cu ajutorul antigenilor cunoscuţi. Aceste reacţii sunt utilizate şi în taxonomia microorganismelor şi pentru realizarea unor analize microbiologice. De obicei se pun în evidenţă antigenii, utilizând fie anticorpi "naturali" policlonali (obţinuţi de la animale: iepure, cal ş.a), fie anticorpi monoclonali, cu specificitate înaltă, obţinuţi prin inginerie genetică (hibridoame). Reacţii imunologice de bază a - reacţia în tub (ring-test): test simplu în capilar (1); test cu antigen colorat (2); b - reacţia pe lamă (se observă o aglutinare în picătura din dreapta); c - tipuri de anticorpi utilizaţi: anticorpi nemarcaţi (1); anticorpi marcaţi direct (2); anticorpi marcaţi indirect (3); d - inhibiţie prin hemaglutinare: hematie şi antigen (1); competiţie faţă de anticorpi între antigenii purtaţi de hematii şi antigenii de detectat (2).

Tehnici principale de analiză - Precipitarea sau aglutinarea în mediu lichid se bazează pe reacţii care au loc în prezenţa antigenilor şi anticorpilor corespondenţi, prin interacţiunea dintre situsurile active. Precipitarea are loc în cazul unor antigeni moleculari (de exemplu toxine). Aglutinarea are loc în cazul unei legături dintre anticorp şi un antigen particular (aglutinare simplă sau directă, numită şi aglutinare activă sau omogenă). Reacţia în tub sau test inel (ring - test) utilizează un tub capilar care conţine un ser (anticorp), la care se adaugă antigenul. În zona de contact se formează un precipitat floconos (în formă de inel). Testul anticorp Brucella utilizează antigen colorat (fig. a). Reacţia pe lamă sau placă. Reacţiile de precipitare sau aglutinare se pot realiza pe lamă sau pe microplacă de titrare (fig b). Citirea se poate face vizual sau automatizat. Microplăcile sunt folosite pentru evidenţierea şi dozarea anticorpilor şi toxinelor prin utilizarea diluţiiior. Pentru evidenţierea celulelor se folosesc lame sau microplăci care permit efectuarea de teste multiple cu o serie de anticorpi. Reacţia în eprubetă. Se amestecă antigenii

cu anticorpii în eprubete şi se observă apariţia unei precipitări sau aglutinări. Pentru dozări cantitative de antigeni sau anticorpi se realizează diluţii şi se analizează probele turbidimetric sau nefelometric (λ = 350-400 nm). Sisteme particulare. Atunci când se utilizează un suport pe care se fixează anticorpul are loc o precipitare sau aglutinare pasivă. Suportului are natură diferită (bile de latex, hematii, particule magnetice). De exemplu, testul de aglutinare "Spectate" (RP Diag, Rhône-Poulenc) permite evidenţierea prezenţei bacteriilor din genul Salmonella. Anticorpii sunt imobilizaţi pe microbile de latex care se colorează diferit în funcţie de tipul de anticorpi. Rezultatele sunt interpretate în funcţie de culoarea obţinută. Imunofluorescenţa . Marcajul fluorescent al anticorpului permite vizualizarea antigenului. Metoda directă utilizează antigen şi anticorp marcat specific. Metoda indirectă utilizează un anticorp specific şi o antiglobulină (fig. c). In cazul utilizării microscopului cu

epifluorescenţă, preparatul se colorează cu ajutorul unui marker specific fluorescent. Astfel, se pot distinge cu uşurinţă celulele fluorescente de altele. Această metodă permite evaluarea cantitativă a celulelor aparţinând unei tulpini sau evidenţierea contaminanţilor. Tehnici de separare a antigenilor şi anticorpilor. Pentru separarea antigenilor sau anticorpilor se apelează în prezent la tehnici de imuno-afinitate. Există sisteme comerciale pentru analize de înaltă specificitate. De exemplu, sistemul RP Diag (Rhône-Poulenc) permite detectarea şi extracţia aflatoxinelor şi ochratoxinei prin utilizarea anticorpilor monoclonali, reţinuţi pe coloană (Aflascan. Aflaprep, Ochraprep). Metodele de extracţie şi solvenţii utilizaţi variază în funcţie de produs, şi anume: metanol : apă - pentru lapte: cloroform - pentru produse solide ş.a. Detectarea se face în UV, prin fluorescenţă.

28. Studiul potentialului patogen al microorganismelor Sunt analizate enzimele care produc patogenitate şi se evidenţiază pericolul toxicogen al microorganismelor. Studiul enzimelor care determină patogenitatea Enzimele care produc patogenitate sunt de mai multe tipuri. Hemolizinele sunt enzime care produc liza hematiilor. Ele sunt puse în evidenţă prin cultivarea microorganismelor pe medii solidificate cu sânge (de miel sau de cal). În mediul cu geloză de fiuidificat se adaugă 20-25 picături de sânge, apoi se omogenizează, se repartizează în plăci Petri şi, după solidificarea microorganismului test, se inoculează în strii. După termostatare corespunzătoare se analizează aspectul zonei din imediata vecinătate a coloniilor, şi anume: - zona verzuie, dată de methemoglobină - hemoliză α; - formarea unei aureole clare, ca urmare a eliberării hemoglobinei -hemoliză β; - fără modificări - absenţă hemoliză. Coagulazele sunt enzimele care coagulează plasma şi împiedică fagocitoza. După cultivarea microorganismelor, pe medii specifice (de exemplu, pentru bacterii din genurile Staphylococcus, Streptococcus), timp de 24 h, se recoltează 0,5 cm3 cultură, care se transferă într-o eprubetă de hemoliză, după care se adaugă 0,5 cm3 plasmă de iepure diluată (1:5). Amestecul se termostatează la 37°C şi se examinează din oră în oră, timp de 24 h. Coagularea se examinează comparativ cu o probă martor (0,5 cm3 cultură + 0,5 cm3 ser fiziologic steril). ADN-azele (cu referire la enzimele care distrug materialul nuclear al celulelor) se evidenţiază prin cultivare pe un mediu specific care conţine ADN. Mediul se repartizează în plăci Petri şi se inoculează "în punct" cu celulele de studiat. După termostatare corespunzătoare, hidroliza ADN-ului este evidenţiată prin vaporizare cu acid clorhidric 1N. Prezenţa unei zone clare în jurul coloniilor certifică un test pozitiv. Acidul poate fi înlocuit cu o soluţie de albastru de toluidină 0,1% şi în acest caz developarea unei zone de culoare roz în jurul coloniilor certifică un test ADN-ază pozitiv. Evidenţierea producerii de toxine Pentru evidenţierea potenţialului toxicogen al microorganismelor sunt utilizate mai multe metode. Metode chimice se aplică în special pentru evidenţierea toxinelor cu greutate moleculară redusă, specifice microorganismelor eucariote. Metode generale presupun în primă fază extracţia şi purificarea toxinelor. Pentru identificarea şi dozarea lor se apelează la metode cromatografice, chimice sau prin fluorescenţă. De exemplu, pentru dozarea aflatoxinelor se realizează mai întâi extracţia cu soluţie metanolică, urmată de separare princromatografie de afinitate cu anticorpi monoclonali (anti B1, B2, G1). După eluţie cu metanol, dozarea aflatoxinelor se realizează prin măsurarea fluorescenţei, după reacţia cu SFB (Solution Fluorometry with Bromine). Metode imunologice se utilizează tehnica ELISA sau tehnica de aglutinare în mediu lichid. Tehnicile cele mai actuale de evidenţiere a patogenităţii microorganismelor presupun utilizarea sondelor moleculare sau studiul secvenţelor de cromozoni şi al plasmidelor implicate în imprimarea acestui caracter.