Serologiczne i

molekularne metody

stosowane w diagnostyce

chorób zakażnych

Dorota Wultańska

Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Antygen

Antygenami nazywamy złożone cząsteczki (substancje)

rozpoznawane przez organizm immunologicznie kompetentny

jako obce.

Charakterystyczne cechy antygenów to:

1. Immunogenność- zdolność wywoływania odpowiedzi

immunologicznej.

2. Swoistość- właściwość swoistego reagowania z

przeciwciałami lub uczulonymi komórkami.

Antygeny: białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, związki

chemiczne np. formaldehyd, antybiotyki np. penicylina.

Przeciwciała

Przeciwciałami albo immunoglobulinami nazywamy

cząsteczki białkowe syntetyzowane po pobudzeniu

antygenem wytwarzane przez komórki plazmatyczne

(aktywowane limfocyty B) i skierowane swoiście

przeciwko temu antygenowi.

Immunoglobuliny: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

Budowa przeciwciała

Immunoglobuliny człowieka dzieli się na 5 klas

oznaczonych symbolami:

IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

Ig są zbudowane z 4 łańcuchów białkowych: 2

łańcuchów ciężkich H i 2 łańcuchów lekkich L.

Rozczepiając cząsteczkę Ig za pomocą enzymu

papainy w obecności cysteiny uzyskuje się trzy

fragmenty, dwa fragmenty Fab i jeden fragment Fc.

Fragment Fab- jest częścią zmienną Ig mającą

zdolność wiązania antygenu i warunkującą swoistość

immunologiczną przeciwciała

FragmentFc- fragment stały dla danej klasy Ig,

bierze udział w wiązaniu się z receptorami pewnych

limfocytów i makrofagów, odgrywa rolę w wiązaniu

i aktywacji układu dopełniacza.

Immunoglobulina IgA występuje w postaci

monomeru, dimeru bądź polimerów. IgM występuje

w postaci pentameru. Pozostałe Ig występują w

postaci monomeru.

IgM- jest pentamerem, występuje w surowicy, nie przechodzi przez

łożysko, jej obecność u płodu świadczy o zakażeniu. IgM powstaje jako

pierwsza w odpowiedzi na zakażenie. Nie mają zdolności przenikania

przez naczynia krwionośne, nie odgrywają więc większej roli w obronie

tkanek przed zakażeniem. Są szczególnie aktywne w procesie

aglutynacji, opsonizacji i wiązania dopełniacza.

IgG- z łatwością przechodzi przez łożysko. IgG bierze udział w

opsonizacji antygenów np. mikroorganizmów ułatwiając w ten sposób

fagocytozę. Posiadają zdolność aglutynacji, precypitacji, wiązania

dopełniacza i neutralizacji wirusów. IgG jest główną Ig powstającą we

wtórnej odpowiedzi immunologicznej na antygen czy po szczepieniu.

Odpowiedź immunologiczna-(odpowiedź odpornościowa)

Jest to złożony zespół reakcji obronnych organizmu zarówno

swoistych jak i nieswoistych, zapoczątkowany kontaktem z

antygenem.

Głównymi komórkami, które uczestniczą w odpowiedzi

immunologicznej są limfocyty, makrofagi i granulocyty.

Współdziałają one również z innymi komórkami układu

odpornościowego.

Odpowiedź immunologiczna jest procesem dwufazowym, na

który składa się:

- faza rozpoznania antygenu (swój czy obcy)

- faza efektorowa obejmująca cykl reakcji zmierzających do

neutralizacji i eliminacji obcego antygenu

Odporność przeciwzakaźną organizmu można podzielić

na dwa rodzaje:

1. Odporność fizjologiczną (naturalną, nieswoistą, związaną

z pewnymi właściwościami ustroju, które utrudniają

wniknięcie drobnoustrojów do organizmu i ich

namnożenie).

2. Odporność swoistą.

U podstaw odporności swoistej leżą swoiste reakcje

antygenu z Ig lub odpowiednimi komórkami układu

immunologicznego.

Odporność nieswoista

Mechanizmy odporności nieswoistej odgrywają ważną rolę w początkowej

obronie gospodarza przed zakażeniem.

Można je podzielić na:

1. Mechanizmy miejscowe

- ciągłość skóry i błon śluzowych

- kwas mlekowy i kwasy tłuszczowe znajdujące się w wydzielinie

gruczołów potowych i łojowych, działających niekorzystnie na większość

bakterii patogennych

- lizozym we łzach, ślinie, pocie i innych wydzielinach uszkadza ścianę

komórkową głównie bakterii Gram(+)

- spłukiwanie śluzem błon śluzowych

- ciągły przepływ śliny zawierającej substancje bakteriobójcze( między

innymi lizozym)

- odruchy obronne: kaszel, kichanie, ruch rzęsek nabłonka, wymioty,

skurcze jelit, strumień moczu

- kwas żołądkowy o pH 1-2, enzymy proteolityczne

- działanie antagonistyczne flory fizjologicznej przewodu pokarmowego czy

flory fizjologicznej skóry

- laktoferyna występująca we łzach, mleku, ślinie wiążąca Fe, które

potrzebne jest do wzrostu bakteriom

2. Mechanizmy układowe

- produkcja cytokin, w tym i interferonów. Cytokiny

wydzielane są głównie przez komórki układu

immunologicznego i powodują aktywację tych

komórek. Interferony hamują replikację, czyli

namnażanie się wirusów.

Odczyny serologiczne

Odczyny serologiczne są to metody, za pomocą których

można wykazać obecność i stężenie Ig w surowicy,

płynie mózgowo-rdzeniowym i innych płynach

tkankowych bądź też wykryć antygen (bakterie, wirusy,

grzyby, pierwotniaki) przy użyciu znanej surowicy

odpornościowej.

Aglutynacja

Reakcja zachodząca pomiędzy Ig a antygenem w formie

komórkowej (bakterie, drożdże, erytrocyty, leukocyty itp.).

Polega ona na zlepianiu się komórek pod wpływem

swoistych Ig i wypadaniu ich z roztworu pod wpływem

elektrolitów.

Precypitacja

Reakcja zachodząca pomiędzy Ig i rozpuszczalnym

antygenem przejawiająca się powstawaniem strątów.

�

odczyn aglutynacji lateksowej (rotawirusy) �

odczyn hemaglutynacji (TPHA – kiła) �

odczyn zahamowania hemaglutynacji (grypa) �

odczyn antyglobulinowy Coombsa (listerioza)

ODCZYNY AGLUTYNACYJNE W MIKROBIOLOGII

�

odczyn Widala (dur brzuszny)

� odczyn Weila-Felixa (dur plamisty) �

odczyn Wrighta (bruceloza)

Pobieranie materiałów do badań serologicznych

Surowica - do badania serologicznego pobiera się krew żylną na czczo,

najczęściej z żyły łokciowej z zachowaniem wszelkich zasad aseptyki przy

użyciu jałowej suchej strzykawki. Od dorosłych pobiera się 5-10 ml, od dzieci

2-5 ml, aby można było uzyskać 1-2 ml surowicy. Krew należy przelać do

jałowej suchej probówki i zamknąć jałowym gumowym korkiem. W celu

uzyskania surowicy próbki z krwią należy wstawić do cieplarki w temp. 37°C

na 30-45 minut do czasu powstania skrzepu. Surowicę najłatwiej oddzielić od

skrzepu zlewając ją ostrożnie do nowej jałowej probówki lub odciągając jałową

pipetą. Jeżeli przy zlewaniu surowicy lub odciąganiu dostanie się do niej nawet

niewielka ilość czerwonych krwinek, surowicę należy odwirować i ponownie

odciągnąć. Wirować należy przy obrotach 1200-1700 obr/minutę.

Surowice parzyste

Wykrycie Ig w surowicy krwi chorego może świadczyć zarówno

o aktualnym, jak i przebytym zakażeniu wirusowym. Dlatego do

serologicznego potwierdzenia rozpoznania niezbędne jest

stwierdzenie zwiększania się ilości Ig w trakcie rozwoju

choroby. Aby móc śledzić dynamikę narastania Ig, od chorego

pobiera się dwie próbki - pierwszą w ostrym okresie choroby,

drugą po 10 - 14 dniach. Są to tzw. surowice parzyste.

Stwierdzenie 4-krotnego lub większego wzrostu miana Ig w

przeciągu dwóch tygodni stanowi dowód aktualnie toczącego się

procesu chorobowego.

Płyn mózgowo-rdzeniowy

Przy neuroinfekcji do badań w kierunku ściśle

określonego zakażenia wystarczy 0,5-1 ml płynu m-r

pobranego z nakłucia lędźwiowego. Materiał powinien

być pobrany jałowo do wyjałowionych probówek.

Miano Ig w płynie m-r nie spada, jeżeli próbka ulega

zamrożeniu. Wykrywanie Ig w płynie m-r dotyczy

przede wszystkim przypadków o etiologii wirusowej.

Metody serologiczne, w których za pomocą wzorcowych

znakowanych Ig wykrywa się antygeny wirusowe bądź

bakteryjne

Zależnie od klinicznego obrazu choroby do badań pobiera się różne

materiały. Enterowirusy, takie jak poliowirus, znacznie łatwiej jest

izolować z kału (wrotami zakażenia enterowirusów jest układ pokarmowy)

niż płyn m-r. Materiał musi być pobrany do jałowych naczyń. Do próbek

nie wolno dodawać żadnych środków konserwujących. Do tych próbek, w

których wirus narażony jest na wysychanie, a ponadto występuje flora

bakteryjna (np. wymazy z gardła, nosa, odbytu, kał) dodaje się

zbuforowany roztwór soli fizjologicznej z antybiotykami hamującymi

wzrost innych niepożądanych drobnoustrojów. Każda próbka musi być

wyraźnie i trwale oznakowana: data i godzina pobrania, imię i nazwisko

itd.

Zalety metod serologicznych

Metody serologiczne są szczególnie przydatne w

diagnostyce zakażeń wywoływanych przez

drobnoustroje trudne lub niemożliwe do izolowania i

hodowli w laboratorium diagnostycznym.

Np. wirusy (np. HBV, HIV), pałeczki tularemii,

mykoplazmy, legionelle, riketsje.

Test

ELISA

Precypitacja

Metody precypitacyjne w mikrobiologii:

1) Test Eleka (diagnostyka błonicy)- pozwala na wykrycie

zjadliwości Corynebacterium diphtheriae poprzez sprawdzenie

obecności toksyny bakteryjnej

2) testy kłaczkujące VDRL oraz USR (nieswoiste odczyny kiłowe)

Kardiolipina (wyciąg z serca wołu) zawiera chlorek choliny, który

unieczynnia dopełniacz. Odczyn można wykonać na szkiełku

podstawowym dodając kroplę surowicy pobranej od pacjenta do

kropli odczynnika. Jeżeli na szkiełku następuje wykłaczanie,

świadczy to o występowaniu Ig (reagin) kiłowych.

Wykrywanie antygenów

Wykrywanie antygenów

Odczyn wiązania dopełniacza:

Stosowany w wykrywaniu chorób o różnej etiologii wirusowej (np. w zakażeniach

wirusami: parainfluenzy, HSV, CMV, adenowirusami, RSV, odry, różyczki,

enterowirusami i innymi). Badaną surowicę inkubuje się z wzorcowym antygenem i

określoną ilością dopełniacza. Swoiste Ig, jeśli występują w badanej próbce tworzą

kompleks z antygenem i dopełniaczem. Wolny (nie związany dopełniacz) wykrywany

jest przez dodanie erytrocytów uczulonych przeciwciałami. Jeżeli dopełniacz nie jest

związany dochodzi do lizy erytrocytów (wynik ujemny). Jeżeli dopełniacz został

związany przez kompleks antygen wirusowy i przeciwciało pacjenta erytrocyty nie

ulegają lizie (wynik dodatni)

OWD wykorzystywany w diagnostyce: chorób bakteryjnych- kiła, bruceloza,

tularemia, listerioza, chorób wirusowych- grypa, polio, KZM chorób grzybiczych-

kandydoza

Hemaglutynacja

- bierna - odczyn TPHA (w diagnostyce kiły)

Krwinki baranie opłaszczone są szczepem

chorobotwórczym T.pallidum. Wykonuje się kolejne

rozcieńczenia surowicy czy płynu mózgowo-rdzeniowego

i dodaje do zawiesiny krwinek baranich. Miana 1:80 dla

surowicy i 1:40 dla płynu mózgowo-rdzeniowego

potwierdzają zakażenie.

Wykrywanie przeciwciał

• ASO-odczyn antystreptolizynowy- pomiar stężenia

przeciwciał przeciwko antystreptolizynie O. Przeciwciała

te powstają po kontakcie z paciorkowcami grupy A.

Lekarz zleca badanie ASO, by potwierdzić lub wykluczyć

powikłania po infekcji streptokokowej. Do takich

powikłań należeć mogą: bakteryjne zapalenie wsierdzia,

kłębuszkowe zapalenie nerek, gorączka reumatyczna.

Immunofluorescencja

Jest to metoda, w której za pomocą Ig wyznakowanych fluoresceiną

(izotiocyjanian fluoresceiny) możemy wykryć antygeny wirusowe, bakteryjne

lub specyficzne Ig. Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym. W

mikroskopie fluorescencyjnym barwnik emituje zielone światło. Metody

immunofluorescencyjne mogą być stosowane do identyfikacji antygenu

wirusowego w materiale klinicznym np. wirusa RSV, w popłuczynach z

gardła, lub np. wykryć bakterie Legionella pneumophila, Bordetella pertussis

w materiałach pochodzących z dróg oddechowych czy Chlamydia trachomatis

w materiałach z dróg moczowo-płciowych i ze spojówek.

Metody hybrydyzacji

-wykrywanie wirusów HPV, HSV

-wykrywanie zakażeń chlamydią i rzeżączką

Sondy genetyczne

wyznakowany odcinek nici DNA do poszukiwania

komplementarnej nici DNA

Test Western blotting

Białka wirusa rozdziela się elektroforetycznie w żelu

poliakrylamidowym.

Z żelu antygeny są przeniesione (blotting) na błonę

nitrocelulozową, z którą się silnie wiążą. Paski nitrocelulozowe

są inkubowane z surowicą pacjenta. Jeżeli w surowicy

występowały Ig swoiste wobec wyznakowanych antygenów,

to nastąpi ich połączenie. Następnie uwidacznia się związane

przeciwciała, poprzez dodanie znakowanych

antyimmunoglobulin (wyznakowanych enzymem,

a kolejno substrat reakcji enzymatycznej). Ocenia się

występowanie zabarwionych pasm przez porównanie z pasmami

wzorcowymi. Występowanie pasm świadczy o występowaniu

swoistych Ig. Metoda Western-blotting jest bardzo czuła i

swoista, używa ją się między innymi do potwierdzenia wyników

dodatnich badań zakażenia wirusem HIV.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Wynaleziona w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa (Nagroda Nobla w 1993)

Polega na powielaniu określonych fragmentów DNA

Etapy PCR:

1) przygotowanie próbki (izolacja)

2) oczyszczenie DNA,

3) amplifikacja DNA

4) wizualizacja produktu (np. za pomocą elektroforezy żelowej lub hybrydyzacji

ze znakowanymi sondami)

Przykłady metod molekularnych w diagnostyce

mikrobiologicznej

PCR -(polymerase chain reaction)-polimerazowa reakcja

łańcuchowa

zastosowanie: wykrywanie wirusów HIV, CMV, HBV,

HPV, HCV,

wykrywanie oporności szczepów bakteryjnych na

antybiotyki (oporność gronkowców na metycylinę,

oporność enterokoków na wankomycynę)

zastosowanie metody PCR w diagnostyce Chlamydii i

Mykoplazm.

1. Wykrycie oraz identyfikacja patogenu w dowolnym materiale

klinicznym

2. Identyfikacja patogenów trudnych w hodowli, niemożliwych do

hodowania, wolnorosnących

3. Wykrywanie genów oporności na leki

4. Wykrywanie genów czynników zjadliwości

Zastosowanie PCR w mikrobiologii

1. Metody typowania oparte na analizie sekwencji kwasów nukleinowych

umożliwiają wyznaczenie pokrewieństwa filogenetycznego

mikroorganizmów oraz analizę epidemiologiczną

2. Najczęściej stosowane metody genotypowania: rybotypowanie, analiza

restrykcyjna chromosomalnego DNA z elektroforezą pulsacyjną (RFLP-

PFGE), analiza restrykcyjna powielonego rybosomalnego DNA

(ARDRA),różne odmiany techniki PCR (fingerprinting)

Typowanie mikroorganizmów w oparciu o sekwencje kwasów

nukleinowych

Rybotypowanie

Elektroforetyczny rozdział produktów uzyskanych po amplifikacji DNA izolowanego

ze szczepów C. difficile, wyhodowanych z materiałów od dzieci hospitalizowanych

na oddziale patologii noworodków ze starterami P3 i P4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ścieżki: 1 - P 45/04, 2 - P 89/04, 3 - P 287/04, 4 - P 133/05, 5 - P 173/05, 6 - P 272/05, 7 - P

287/05, 8 - P 54/06, 9 - P 203/06.

� 1.Trawienie w żelu całogenomowego DNA enzymami rzadko

tnącymi (np. SmaI) �

2. Długotrwały rozdział elektroforetyczny produktów

restrykcji w zmiennym polu elektrycznym

� 3. Najbardziej miarodajna metoda typowania

wewnątrzgatunkowego szczepów

� 4. Pracochłonna i wymagająca stosownej aparatury

PFGE- pulsed-field gel electrophoresis

Dziękuję za uwagę