podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii...

1

Podstawowe procedurylaboratoryjnew bakteriologii klinicznej

3

Podstawoweprocedurylaboratoryjnew bakteriologiiklinicznej

4

Wydane przez World Health Organization w 2003 r. pod tytułem ,,Basic LaboratoryProcedures in Clinical Bacteriology’’, wydanie 2

World Health Organization 2003 Copyright for the Polish edition by Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005

Dyrektor Generalny World Health Organization udzielił prawna wydanie w jezyku polskim Wydawnictwu Lekarskiemu PZWL,ktore jest całkowicie odpowiedzialne za polskie wydanie.

Wszelkie prawa zastrzezone.Przedruk i reprodukcja w jakiejkolwiek postacicałosci badz czesci ksiazkibez pisemnej zgody wydawcy sa zabronione.

Redaktor ds. publikacji medycznych mgr Anna PlewaRedaktor mgr Alicja PałkiewiczRedaktor techniczny Maria KarczewskaKorekta Zespoł

Projekt okładki i stron tytułowych Jolanta Krafft-Przezdziecka

Dawkowanie lekowAutorzy i Wydawnictwo dołozyli wszelkich staran, aby wybor i dawkowanie lekow w tymopracowaniu były zgodne z aktualnymi wskazaniami i praktyka kliniczna. Mimo to, zewzgledu na stan wiedzy, zmiany regulacji prawnych i nieprzerwany napływ nowychwynikow badan dotyczacych podstawowych i niepozadanych działan lekow, Czytelnikmusi brac pod uwage informacje zawarte w ulotce dołaczonej do kazdego opakowania, abynie przeoczyc ewentualnych zmian we wskazaniach i dawkowaniu. Dotyczy to takzespecjalnych ostrzezen i srodow ostroznosci. Nalezy o tym pamietac, zwłaszcza w przypad-ku nowych lub rzadko stosowanych substancji.

ISBN 83-200-3133-8Wydanie I

Wydawnictwo Lekarskie PZWL00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10tel. (0-prefiks-22) 695-40-33

Ksiegarnia wysyłkowa:tel. (0-prefiks-22) 695-44-80infolinia: 0 801-142-080

www.pzwl.ple-mail: promocja0pzwl.pl

Skład i łamanie: EGRAF, WarszawaDruk i oprawa: Pabianickie Zakłady Graficzne S.A., Pabianice

5

Przedmowa do polskiego wydania

Pierwszym, podstawowym celem diagnostyki mikrobiologicznej jest identyfika-cja czynnika etiologicznego zakazenia. Wskazanie drobnoustroju odpowiedzial-nego za infekcje jest podstawa wyboru sposobu leczenia, postepowania zmierzaja-cego do ograniczenia jego rozprzestrzeniania sie, a takze oceny rokowania.Rozpoznanie danego mikroorganizmu moze byc dokonane przez bakterio-skopowe badanie probki od pacjenta, hodowle i identyfikacje. Czynnik etiologicz-ny zakazenia mozna tez identyfikowac na podstawie obecnosci w probkachantygenow, ktore wykrywa sie za pomoca serologicznych metod diagnostycz-nych. Jeszcze inna droga postepowania jest wykrywanie charakterystycznego dladrobnoustroju kwasu nukleinowego, do czego słuza wprowadzone w ostatnichlatach techniki molekularne. Posrednio czynnik etiologiczny zakazenia moze bycrozpoznany na podstawie swoistych przeciwciał wytworzonych w zakazonymorganizmie. Odpowiednio dobrane antygeny i metody pozwalaja na oznaczeniezarowno klas, jak i miana przeciwciał.

Wybor metody diagnostycznej jest podyktowany wieloma wzgledami, takimi jak:zdolnosc drobnoustrojow do wzrostu w warunkach in vitro i szybkosc jegowzrostu, charakter zakazenia i jego przebieg, wyposazenie laboratorium, wy-kształcenie personelu, wreszcie mozliwosci finansowe. Prawidłowe wykonaniebadania mikrobiologicznego, niezaleznie od zastosowanej metody, wymagapostepowania według okreslonych szczegołowo procedur, ktore obejmuja:pobranie i transport probek, metode przeprowadzenia badania w pracownimikrobiologicznej, sposob opracowania, wydania i interpretacji wyniku. Wydanepod patronatem WHO ,,Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologiiklinicznej’’ (Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology) to publikacjapodsumowujaca aktualne wytyczne w zakresie doboru materiału w okreslonychzakazeniach i pobierania probek, identyfikacji drobnoustrojow oraz oznaczanialekoopornosci. Informacje w niej zawarte maja na celu ujednolicenie technikibadan mikrobiologicznych i podniesienie jakosci usług laboratoryjnych w krajachrozwijajacych sie i tych, w ktorych diagnostyka mikrobiologiczna nie jest dobrzezorganizowana lub doceniana, na co wskazuje wysokie zuzycie antybiotykowi szybko wzrastajaca liczba szczepow wieloopornych.

Publikacji, ktora maja Panstwo przed soba, nie mozna traktowac jako zbioruobowiazujacych procedur, moze ona jednak pomoc w tworzeniu własnychprocedur w laboratorium mikrobiologicznym, byc cennym zrodłem nauki metoddiagnostycznych, szczegolnie prostych i tanich, szczegołowo w podrecznikuopisanych. Niektore metody diagnostyczne dotycza chorob w Polsce nie spotyka-nych, np. cholera, wrzod miekki, mycetoma, jednak szybkie i czeste przemiesz-czanie sie ludzi ustawicznie grozi przemieszczaniem sie drobnoustrojow, a łatwydostep do mało popularnych w Polsce procedur diagnostycznych moze pomocw rozpoznaniu, a wiec w zapobieganiu i rozpowszechnieniu sie niekonwencjonal-nego zakazenia. Niniejsza publikacja bedzie z pewnoscia cennym podrecznikiem,szczegolnie dla studentow analityki medycznej, wydziału lekarskiego i stomatolo-gii, na rynku brak bowiem opracowania z zakresu diagnostyki mikrobiologicznej,ktorej studenci ucza sie na cwiczeniach.

Opisane w publikacji procedury nie uwzgledniaja komercyjnych metod badaw-czych opartych na aparatach i podłozach do monitorowanego posiewu krwii płynow ustrojowych, do przyspieszonej diagnostyki gruzlicy oraz gotowych

6

podłozach do przesiewowych połilosciowych badan moczu. ,,Podstawowe proce-dury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej’’ zawieraja opis metod identyfikacjii oznaczania lekowrazliwosci drobnoustrojow opierajacych sie na podłozachroznicujacych i prostych testach wskaznikowych, bez uwzglednienia metodpołautomatycznych lub automatycznych. Metody oznaczania lekowrazliwoscii identyfikacja nowych mechanizmow opornosci, ze wzgledu na zmieniajaca siesytuacje epidemiologiczna, wymagaja ciagłej modyfikacji i aktualizacji, stadprocedury opisane w podreczniku nalezy traktowac jako ogolne, w praktyceopierajac sie przede wszystkim na rekomendacjach Krajowego Osrodka Referen-cyjnego ds. Lekowrazliwosci Drobnoustrojow.

Podrecznik nie uwzglednia metod molekularnych i immunochemicznych w diag-nozowaniu zakazen. Zgodnie z tytułem przedstawione sa rzeczywiscie pod-stawowe procedury laboratoryjne i warto podkreslic, ze korzysci dla mikrobiologaz takiego podejscia do diagnostyki sa naprawde duze. Szczegolnie cenne jestprzypomnienie, jak wazny jest i ile informacji moze dostarczyc preparatbezposredni: mozna nauczyc sie oszczednosci, liczyc czas badania. Cenna czesciapodrecznika jest podkreslanie w kazdym z rozdziałow koniecznosci kontroliwewnatrz- i zewnatrzlaboratoryjnych procedur oraz kontroli sprzetu i testow.

Podsumowujac, przedstawiona publikacja moze byc pomocna w opracowaniui wdrozeniu tanszych, a jednoczesnie rzetelnych metod diagnostyki mikro-biologicznej.

Prof. dr hab. med. Anna Przondo-Mordarska

7

Spis tresciWstep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Zapewnienie jakosci badan bakteriologicznych . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12Definicje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12Wewnetrzna kontrola jakosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Zewnetrzna kontrola jakosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

CZESC I. BADANIA BAKTERIOLOGICZNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Krew . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30Kiedy i u kogo moze wystapic bakteriemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30Pobieranie probek krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Podłoza do posiewu krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32Prowadzenie hodowli z krwi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Płyn mozgowo-rdzeniowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Pobieranie i transport probek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Ocena makroskopowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Badanie mikroskopowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Wstepna identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Oznaczanie lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Mocz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41Pobieranie materiału do badania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41Hodowla i interpretacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43Interpretacja wynikow posiewu ilosciowego moczu . . . . . . . . . . . . . . . 46Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47Oznaczanie lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Kał . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Własciwe ukierunkowanie diagnostyki laboratoryjnej . . . . . . . . . . . . . . 50Pobieranie i przesyłanie probek kału . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51Badanie wizualne probek kału . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52Podłoza transportowo-wzbogacajace i posiew probek kału . . . . . . . . . 53Podłoza do hodowli patogenow jelitowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53Wstepna izolacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54Wstepna identyfikacja izolowanych szczepow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56Koncowa identyfikacja mikrobiologiczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62Identyfikacja serologiczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

8

SPIS TRESCI

Zakazenia gornych drog oddechowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Flora fizjologiczna gardła . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Bakteryjne czynniki zapalenia gardła . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74Pobieranie i przesyłanie probek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75Mikroskopia bezposrednia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76Hodowla i identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76Badanie lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Zakazenia dolnych drog oddechowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79Najczestsze postacie kliniczne zakazen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79Pobieranie probek plwociny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81Opracowanie plwociny w laboratorium

(w zakazeniach niegruzliczych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81Hodowla Mycobacterium tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85Interpretacja hodowli M. tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88Podstawowe zasady bezpieczenstwa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Choroby przenoszone droga kontaktow seksualnych . . . . . . . . . . . . 89

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89Zapalenie cewki moczowej u mezczyzn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90Probki z zenskich narzadow płciowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93Probki z owrzodzen narzadow płciowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

Ropne wydzieliny, rany i ropnie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100Postacie kliniczne i najczestsze czynniki etiologiczne . . . . . . . . . . . . . 100Pobieranie i transport probek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103Ocena makroskopowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104Badanie mikroskopowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105Hodowla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107Identyfikacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108Badanie lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Zakazenia bakteriami beztlenowymi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113Podział bakterii ze wzgledu na wymagania tlenowe . . . . . . . . . . . . . . 113Diagnostyka zakazen bakteriami beztlenowymi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

Oznaczanie wrazliwosci na antybiotyki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119Podstawowe zasady oznaczania lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . . . . . 119Kliniczna definicja terminow ,,oporny’’ i ,,wrazliwy’’ . . . . . . . . . . . . . . . 120Wskazania do rutynowego oznaczania lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . 122Wybor lekow do oznaczania lekowrazliwosci

w laboratoriach klinicznych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125Bezposrednie a posrednie oznaczanie lekowrazliwosci . . . . . . . . . . . . 133Czynniki techniczne wpływajace na wielkosc

strefy zahamowania w metodzie dyfuzyjno-krazkowej . . . . . . . . . . . 134Kontrola jakosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

9

SPIS TRESCI

Badania serologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138Metody kontroli jakosci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138Reakcje serologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142Wykrywanie aglutynin w goraczce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150Odczyn ASO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152Wykrywanie antygenow bakteryjnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

CZESC II. NAJWAZNIEJSZE PODŁOZA I ODCZYNNIKI . . . . . . . . . . . 157

Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

Patogeny, podłoza i odczynniki diagnostyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

Krew . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160Płyn mozgowo-rdzeniowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161Mocz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161Kał . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162Gorne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164Dolne drogi oddechowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165Probki z układu moczowo-płciowego do diagnostyki chorob

przenoszonych droga kontaktow seksualnych . . . . . . . . . . . . . . . . . 165Ropa i wysieki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166Lista rekomendowanych podłozy i odczynnikow diagnostycznych dla

laboratoriow mikrobiologicznych o srednim poziomie referencyjnosci 167

Wybrana literatura uzupełniajaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Skorowidz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

10

Wstep

Choroby zakazne sa najczestsza przyczyna zgonow w krajach rozwijajacych sie,ich diagnozowanie i leczenie stanowi wazne wyzwanie dla słuzby zdrowia.Swiatowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) od wielu latwspiera rozwoj i wprowadzanie standardowych technik w diagnostyce laborato-ryjnej. Pierwszy program pod patronatem WHO z 1960 roku dotyczył stan-daryzacji oznaczania lekowrazliwosc patogenow bakteryjnych. W 1976 roku1

WHO Expert Committee on Biological Standardization wskazał na koniecznoscstosowania metody dyfuzyjno-krazkowej w oznaczaniu wrazliwosci na anty-biotyki2.

Rownoczesnie podjeto działania w celu wprowadzenia kontroli jakosci badanlaboratoryjnych. W 1981 roku WHO ustanowiła Miedzynarodowy ProgramKontroli Jakosci Badan Mikrobiologicznych. Laboratoria, ktore uczestniczaw programie, moga pełnic przewodnia role we wprowadzaniu kontroli jakoscibadan w skali kraju na wszystkich poziomach systemu usług medycznych.

Publikacja, ktora maja Panstwo przed soba, jest podsumowaniem aktualnychwytycznych WHO, dotyczacych pobierania probek do badan laboratoryjnych,identyfikacji drobnoustrojow oraz oznaczania lekoopornosci. Wprowadzenie dopraktyki laboratoryjnej informacji zawartych w podreczniku ma na celu ujed-nolicenie techniki badan mikrobiologicznych i oceny lekowrazliwosci orazpodniesienie jakosci usług laboratoryjnych, zarowno na poziomie centralnym, jaki srednim. Podrecznik koncentruje sie raczej na procedurach niz na podstawowychtechnikach mikroskopowania i barwienia, ktore zostały opisane szczegołowow innych publikacjach WHO3.

1 The public health aspects of antibiotics in feedstuffs. Report on a Working Group, Bremen,1–5 October 1973. Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1973 (document no. EURO 3604(2)).2 WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eight report. Geneva, World HealthOrganization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610).3 Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health Organization,2003.

11

Wprowadzenie

Koszty zwiazane z chorobami zakaznymi wciaz stanowia nieproporcjonalnie duzeobciazenie dla budzetu zdrowia w krajach rozwijajacych sie. Według SwiatowegoRaportu Zdrowia (The world health report)1 ostra biegunka jest przyczyna2,2 milionow zgonow rocznie. Ostre infekcje układu oddechowego (głowniezapalenie płuc) sa kolejna wazna przyczyna smiertelnosci, odpowiedzialna zaokoło 4 miliony zgonow rocznie. Analiza dostepnych danych wskazuje, zew krajach rozwijajacych sie patogenami wywołujacymi zapalenie płuc w dziecin-stwie sa czesciej niz wirusy, takie bakterie, jak Haemophilus influenzaei Streptococcus pneumoniae. W roznych regionach swiata pojawiły sie szczepyH. influenzae wytwarzajace β-laktamazy i S. pneumoniae o zmniejszonej wraz-liwosci na benzylopenicyline, sprawiajac, ze nadzor nad tymi patogenami jestcoraz bardziej istotny.

Choroby przenoszone droga kontaktow seksualnych sa coraz czestsze. W konsek-wencji niewystarczajacego nadzoru epidemiologicznego i niedostatecznychdziałan profilaktycznych aktualne sa wciaz zagrozenia epidemia lub pandemia,wywołana czynnikami bakteryjnymi lub wirusowymi. Dla skutecznej kontrolii profilaktyki chorob zakaznych konieczny jest rozwoj prostych narzedzi nadzoruepidemiologicznego i monitorowania choroby oraz prostych i czułych metoddiagnostycznych.

Aby sprostac wyzwaniom w wyzej opisanej sytuacji, system usług laboratoryj-nych musi byc oparty na wspołpracy sieci laboratoriow wykonujacych diagnos-tyke mikrobiologiczna dla centrow medycznych, lekarzy klinicystow i epidemio-logow. Złozonosc zadan powinna wzrastac proporcjonalnie: od podstawowych,poprzez srednie, do centralnych laboratoriow (zaleznie od poziomu referencyjno-sci laboratorium — przyp. tłum.). Tylko w ten sposob mozliwe bedzie dostatecznieszybkie zebranie istotnych informacji, ktore usprawnia nadzor, umozliwiawczesna diagnostyke epidemii lub nietypowych zakazen oraz rozwoj, za-stosowanie i ocene okreslonych srodkow interwencji.

1 The world health report 2000, Geneva, World Health Organization, 2000.

12

Zapewnienie jakosci badanbakteriologicznych

Wprowadzenie

Programy zapewniania jakosci sa skutecznym sposobem zagwarantowaniastandardow usług diagnostyki laboratoryjnej i podnoszenia tych standardow, jeslizachodzi potrzeba. W mikrobiologii pojecie jakosci wykracza poza zagadnieniatechniczne, dotyczac szybkosci, kosztow oraz przydatnosci klinicznej testu. Testylaboratoryjne sa stosunkowo drogie i wraz z postepem medycyny proporcjonalniezwiekszaja obciazenie budzetu słuzby zdrowia.

Definicje

Cecha testu dobrej jakosci jest jego wartosc kliniczna, np.: w profilaktycei leczeniu choroby. Inne cechy jakosci testu, to:• Niezawodnosc: Czy wynik jest wiarygodny?• Powtarzalnosc: Czy otrzymamy taki sam wynik w powtornym badaniu?• Szybkosc: Czy test jest wystarczajaco szybki, aby był uzyteczny dla lekarza

zalecajacego leczenie?• Wspołczynnik koszt–korzysc: Czy koszt badania jest proporcjonalny do korzysci

dla pacjenta i społeczenstwa?

Czynniki wpływajace na wiarygodnosci powtarzalnosc wynikow laboratoryjnych

Przyczyny błedow:• Personel. Wyniki pracy personelu laboratorium pozostaja w scisłym zwiazku

ze stopniem edukacji i dokształcaniem, doswiadczeniem oraz warunkamizatrudnienia.

• Czynniki srodowiskowe. Na wyniki moga wpływac: warunki przestrzenne,oswietlenie, wentylacja, temperatura, nadmierny poziom hałasu, niebezpiecznewarunki pracy.

• Materiał do badan. Sposob i czas pobrania materiału do badan oraz po-chodzenie probki, czesto pozostajace poza kontrola laboratorium, maja bezpo-sredni zwiazek z mozliwoscia uzyskania wiarygodnych wynikow. Czynnikami,wpływajacymi na jakosc wynikow, ktore pozostaja pod kontrola laboratorium,sa: transport, przechowywanie, przygotowanie probek do badania oraz iden-tyfikacja. Laboratorium pełni funkcje edukacyjna wobec osob odpowiedzial-nych za pobieranie i transport probek. Pisemne instrukcje powinny bycprzygotowane w przystepny sposob i regularnie omawiane z klinicystamii pielegniarkami.

• Materiały laboratoryjne. Jakosc odczynnikow, chemikaliow, szklanych na-czyn, barwnikow, podłozy do hodowli oraz zwierzat laboratoryjnych wpływana wiarygodnosc wynikow badan.

• Metody badan. Niektore metody sa bardziej wiarygodne niz inne.• Sprzet. Brak sprzetu, niewystarczajace lub niezgodne ze standardem wyposaze-

nie sa przyczyna uzyskiwania niewiarygodnych wynikow.

13

PODSTAWOWE PROCEDURY LABORATORYJNE W BAKTERIOLOGII KLINICZNEJ

• Badanie i odczyt. Pospieszne odczytywanie wynikow lub brak badaniawystarczajacej liczby pol mikroskopowych moga byc powodem błedow.

• Sprawozdanie. Błedy w przepisywaniu lub niekompletne opisy wynikow.

Jakosc interpretacji wynikow badan

W mikrobiologii szczegolnie wazna jest interpretacja wynikow. Na kazdym etapiebadania probki rezultaty powinny byc interpretowane w celu wyboru, dokolejnego etapu badania, testu optymalnego pod wzgledem szybkosci i wiarygod-nosci.

Zapewnienie jakosci w laboratoriummikrobiologicznym

Zapewnienie jakosci jest suma działan, w ktore zaangazowane jest laboratorium,aby zapewnic dobra jakosc wynikow. Działania te musza byc:– kompletne: aby zapewnic kontrole na kazdym etapie procesu — od pobrania

probki do przedstawienia koncowego wyniku lekarzowi (ryc. 1);– racjonalne: aby skoncentrowac sie na najbardziej krytycznych etapach procesu;– regularne: aby zapewnic stała kontrole procedur;– czeste: aby szybko wykryc i skorygowac błedy.

DOBRA JAKOSC BADAN LABORATORYJNYCHTO DOBRA JAKOSC MEDYCYNY

Zapewnienie jakosci pozwala na mozliwie oszczedne stosowanie drogich testow;okresla takze zasadnosc i wartosciowosc nowych testow, podnosi jakosc usługszpitalnych i pozaszpitalnych laboratoriow oraz zapewnia porownywalnoscotrzymanych wynikow niezaleznie od miejsca ich wykonania.

Rodzaje gwarancji jakosci

Istnieja dwa rodzaje gwarancji jakosci: wewnetrzna i zewnetrzna.• Wewnetrzna. Tak zwana KONTROLA JAKOSCI. Kazde laboratorium ma

system sprawdzania jakosci wykonywanych przez siebie testow.

Na wewnetrzna kontrole jakosci składaja sie:– ciagły monitoring jakosci testow;– pełne sprawdzanie wszystkich etapow diagnostyki: od pobrania probki do

badania (jesli jest to mozliwe) do odesłania koncowego wyniku.

Laboratoria maja etyczna odpowiedzialnosc wobec pacjenta za przedstawieniedokładnych i przydatnych wynikow.

WEWNETRZNA KONTROLA JAKOSCI JEST NIEZBEDNADLA PRAWIDŁOWEGO FUNKCJONOWANIA PROCEDURY

14

ZAPEWNIENIE JAKOSCI BADAN BAKTERIOLOGICZNYCH

• Zewnetrzna. Tak zwana OCENA JAKOSCI. Wyniki działalnosci laboratoriumkontrolowane sa przez zewnetrzna instytucje. W niektorych krajach podleganiezewnetrznej ocenie jakosci jest obowiazkowe (regulacje rzadowe) i wymaganedo uzyskania licencji.

Na zewnetrzna ocene jakosci składaja sie:– okresowy monitoring jakosci testow;– wybiorcza kontrola procesu identyfikacji i niekiedy technik izolacji.

Kryteria jakosci w mikrobiologii

Przydatnosc kliniczna

Waznym kryterium jakosci badania mikrobiologicznego jest jego przydatnoscw zapobieganiu i leczeniu chorob zakaznych; jest to tak zwana przydatnosckliniczna. Warunkiem koniecznym do uzyskania pozadanego efektu klinicznegojest wspołpraca miedzy lekarzem i laboratorium.

Ponizsze przykłady obrazuja przydatnosc kliniczna:1. Izolacja kilku kolonii Gram-ujemnych pałeczek z plwociny lub z wymazu

z gardła hospitalizowanego pacjenta oraz identyfikacja drobnoustrojow z anty-biogramem nie maja zadnego znaczenia klinicznego, poniewaz zadna z tychprocedur nie wpłynie na podjete leczenie.

2. W przypadku izolacji Streptococcus pyogenes wykonanie pełnego antybio-gramu nie ma znaczenia klinicznego, poniewaz benzylopenicylina jest lekiemz wyboru, zawsze aktywnym in vitro.

3. W przypadku izolacji Escherichia coli u pacjenta z biegunka bez domieszkikrwi, identyfikacja serotypu nie jest klinicznie przydatna, jesli nie moznawykazac zwiazku miedzy serotypem a chorobotworczoscia.

4. Rutynowa identyfikacja mieszanej flory beztlenowej widocznej w preparaciebarwionym metoda Grama nie ma znaczenia klinicznego. Jest czasochłonna,droga i nie wpłynie na leczenie pacjenta.

5. Jesli z probek pobranych z drog oddechowych zostana wyizolowane grzyby,celowe jest wykonanie testu identyfikujacego Cryptococcus. Dalsza iden-

PACJENT Z INFEKCJA

Pobieraniemateriału Transport, oznaczanie

Probka,dane klinicznePrzechowywanie

Ocena makroskopowa, zapach

Mikroskopia, interpretacja

Hodowla: wybor podłoza, temperatury, atmosfery

Izolacja czystych kolonii, antybiogram

Identyfikacja, interpretacja(zanieczyszczenie, komensal lub patogen)

WYNIK WSTEPNYprzekazany lekarzowi

WYNIK KONCOWYprzekazany lekarzowi

WHO 90960

10�

�

�

�

�

�

�

�

��

Ryc. 1. Etapy diagnostyki mikrobiologicznej zakazenia u pacjenta.

15


tyfikacja nie ma znaczenia klinicznego, poniewaz nie wpłynie na sposobleczenia pacjenta.

Podsumowujac, badanie dobrej jakosci to takie, ktore jest dokładne i dostarczainformacji uzytecznych w zapobieganiu i leczeniu chorob zakaznych. Izolacjai identyfikacja wszystkich mikroorganizmow w probce nie jest konieczna.

Wiarygodnosc

Dla badan ilosciowych wiarygodnosc badania jest mierzona przez porownanieotrzymanych wynikow z rzeczywista wartoscia. Ponizej przedstawiono przykładybadan tego typu:– okreslanie stezenia antybiotykow w surowicy;– pomiar wartosci minimalnego stezenia hamujacego (MIC) antybiotykow

in vitro;– okreslanie miana przeciwciał w surowicy.

Dla badan jakosciowych wiarygodnosc badania okreslana jest przez ocenezgodnosci wyniku ze stanem rzeczywistym. Ponizej przedstawiono przykładyopisanych badan:– identyfikacja patogenow;– oznaczanie wrazliwosci izolatow na antybiotyki metoda dyfuzji krazkowej.

Konieczne jest stosowanie standardowej terminologii. Zawsze nalezy uzywacmiedzynarodowych nazw drobnoustrojow, np.: Staphylococcus aureus, NIE,,patogenne gronkowce’’; Streptococcus pyogenes, NIE: ,,paciorkowce hemo-lizujace’’.

Niezbedne jest stosowanie jednolitych, uznanych metod diagnostycznych. Ozna-czanie lekowrazliwosci metoda dyfuzji krazkowej powinno byc wykonywanezgodnie z przyjetymi, miedzynarodowymi standardami, na przykład zmodyfiko-wana metoda Kirby-Bauera (str. 125).

Powtarzalnosc

Powtarzalnosc i precyzja wykonywanych badan ograniczone sa przez dwaczynniki:1. Brak jednorodnosci. Pojedyncza probka pochodzaca od pacjenta moze

zawierac wiecej niz jeden drobnoustroj. Powtarzanie hodowli moze wiecprowadzic do izolacji roznych mikroorganizmow.

2. Brak stabilnosci. Wraz z upływem czasu mikroorganizmy w probce w roznymstopniu namnazaja sie lub gina. Powtarzanie hodowli moze prowadzic doizolacji roznych drobnoustrojow. W zwiazku z powyzszym, w celu uzyskaniawiekszej dokładnosci, badania powinny byc przeprowadzane jak najszybciejpo pobraniu probek.

Skutecznosc

Skutecznosc badan mikrobiologicznych jest to mozliwosc uzyskania własciwejdiagnozy dotyczacej patogenu lub stanu patologicznego. Powyzsza wartoscoceniana jest według dwoch kategorii:

16


1. Czułosc diagnostyczna.

Czułosc =ogolna liczba dodatnich wynikow

ogolna liczba zakazonych pacjentow

Im wieksza czułosc testu, tym mniejsza liczba fałszywie ujemnych wynikow.

Na przykład czułosc agaru MacConkeya jest zbyt niska w odniesieniu do izolacjiSalmonella typhi z kału. Ten wazny patogen jelitowy moze zostac przeoczonyz powodu nadmiernego wzrostu niepatogennych bakterii jelitowych.

2. Swoistosc diagnostyczna

Swoistosc =ogolna liczba ujemnych wynikow

ogolna liczba niezakazonych pacjentow

Im wieksza swoistosc testu, tym mniejsza liczba fałszywie dodatnich wyni-kow.

Przykłady:• Barwienie preparatow z plwociny metoda Ziehl-Neelsena jest wysoce

swoiste w diagnostyce gruzlicy, poniewaz daje nieliczne fałszywie dodatniewyniki.

• Barwienie preparatow moczu metoda Ziehl-Neelsena jest duzo mniejswoiste, poniewaz daje wiele fałszywie dodatnich wynikow (z powoduobecnosci atypowych pratkow).

• Test Widala ma bardzo niska swoistosc w diagnostyce duru brzusznego,poniewaz krzyzowo reagujace przeciwciała, powstałe w przebiegu infekcjiwywołanych pokrewnymi serotypami Salmonella, daja fałszywie dodatniewyniki.

Czułosc i swoistosc testu sa ze soba zwiazane. Czułosc testu moze byc wyzszakosztem zmniejszenia jego swoistosci i vice versa. Obydwie wartosci pozostajatakze w zwiazku z czestoscia wystepowania danej choroby w badanej populacji.

Wewnetrzna kontrola jakosci

Wymagania

Program wewnetrznej kontroli jakosci powinien byc praktyczny, realny i ekono-miczny.

Program wewnetrznej kontroli jakosci nie powinien oceniac kazdej procedury,odczynnika czy podłoza do hodowli kazdego dnia pracy. Powinien oceniacprocedure, odczynniki czy podłoze do hodowli zgodnie z praktycznym schema-tem, uwzgledniajacym wpływ kazdego elementu na jakosc badania.

Procedury

Wewnetrzna kontrola jakosci rozpoczyna sie od własciwych działan labora-torium.

17


Spis działan laboratoryjnych

Kazde laboratorium powinno miec wykaz działan, ktory obejmuje:– sprzatanie miejsca pracy,– zasady higieny osobistej,– zasady bezpieczenstwa,– wyznaczone poza obszarem laboratorium strefy socjalne i dla palacych,– postepowanie ze skazonym materiałem i jego usuwanie,– odpowiednie szczepienia personelu, np. przeciw wirusowemu zapaleniu

watroby typu B,– dbałosc o sprzet,– pobieranie probek na badania,– rejestracje probek,– eliminacje nieodpowiednich probek,– postepowanie z probka,– zapis wynikow,– wydawanie wynikow.

Zawarte w spisie działania powinny byc dokładnie realizowane, regularnieoceniane i aktualizowane.

Dbałosc o sprzet

Istotne znaczenie ma dbałosc o wyposazenie laboratorium. Badania wysokiejjakosci nie moga byc wykonywane sprzetem niskiej jakosci lub niewłasciwieutrzymanym.

W tabeli 1 przedstawiono wykaz rutynowych działan, majacych zapewnicwłasciwa dbałosc o sprzet. Zakres temperatur działajacego urzadzenia moze bycrejestrowany w formie przedstawionej na ryc. 2.

Podłoza do hodowli

Podłoza do hodowli moga byc przygotowywane ze składnikow podstawowych,z komercyjnie dostepnych podłozy sypkich lub zakupione w formie gotowej douzycia. Ze wzgledow ekonomicznych, z uwagi na łatwosc transportu i prze-chowywania oraz wyzsza jakosc w porownaniu z podłozami przygotowanymiw laboratorium, rekomendowane sa komercyjnie dostepne podłoza sypkie. Dlauzyskania najlepszych wynikow konieczne jest uwzglednienie uwag ujetychw ponizszych punktach.

Wybor podłoza

Sprawnie działajace laboratorium zaopatrzone jest w najmniejszy mozliwyasortyment podłozy zgodnych z profilem wykonywanych badan. Dobrymprzykładem jest podłoze agarowe, ktore moze byc uzyte jako baza do przygotowa-nia agaru z krwia, agaru czekoladowego oraz kilku innych selektywnych podłozy.

Do izolacji patogennych Enterobacteriaceae z kału niezbedne jest jedno wy-soce selektywne podłoze (agar Salmonella-Shigella lub agar z cytry-

18


nianem deoksycholanu) oraz jedno mniej selektywne podłoze (agar MacCon-keya).

W celu identyfikacji Campylobacter spp. nalezy zastosowac specjalne podłoze.

Zamawianie i przechowywanie suchych podłozy

1. Nalezy zamawiac ilosc, ktora zostanie zuzyta w ciagu 6 miesiecy lubmaksymalnie w ciagu roku.

2. Całosc nalezy podzielic i umiescic w pojemnikach, ktorych zawartosc powinnazostac zuzyta w ciagu 1–2 miesiecy.

3. Szczelnie domknac pokrywki pojemnikow. Suche podłoza absorbuja wilgocz otoczenia. W wilgotnym klimacie nalezy uszczelnic zamkniecie pojemnika,uzywajac parafiny woskowej (wypełnic przestrzen miedzy pokrywka i pojem-nikiem roztopionym woskiem i poczekac do zastygniecia).

4. Zapisac date zamkniecia na kazdym pojemniku.5. Przechowywac w ciemnym, chłodnym, przewiewnym miejscu.6. Odwracac pojemnik tak, aby najpierw został zuzyty starszy materiał.

Tabela 1. Kontrola jakosci sprzetu

Sprzet Podstawowe czynnosci MonitorowaniePrzeglad

technicznyi konserwacja

Anaerostat Cotygodniowe czyszczenie wnetrza po-jemnikow.

Reaktywacja katalizatora po kazdym cy-klu (160°C, 2 h).

Wymiana katalizatora co 3 miesiace

Uzycie paska wskaznikowego z błeki-tem metylenowym w kazdym cyklu.

Odnotowanie czasu odbarwienia wska-znika co tydzien

Cotygodniowakontrola uszcze-lek i szczelnoscizamkniecia

Autoklaw Co miesiac czyszczenie i wymiana wody Sprawdzenie poziomu i uzupełnieniewody przed kazdym cyklem.

Zapis czasu i temperatury lub cisnieniakazdego cyklu.

Cotygodniowyzapis wyniku testu z uzy-ciem przetrwalnikow (przyp. tłum.:testy biologiczne)

Co 6 miesiecy

Wirowka Przemywanie scian wewnetrznych srod-kiem dezynfekcyjnym co tydzien orazpo uszkodzeniu probowki lub rozlaniuzawartosci

Wymiana szczo-tek co rok

Sterylizator szkła nasuche, gorace po-wietrze

Czyszczenie urzadzenia wewnatrz comiesiac

Zapis czasu i temperatury kazdegocyklu

Co 6 miesiecy

Cieplarka Czyszczenie scianek wewnetrznychi połek co miesiac

Zapis temperatury na poczatku kaz-dego dnia pracy (zakres temp. 35± 1°C)

Co 6 miesiecy

Mikroskop Przecieranie soczewek szmatka lub bi-buła do soczewek po kazdym dniupracy

Czyszczenie i smarowanie mechanizmustolika co tydzien

Przykrycie pokrowcem nie uzywanegourzadzenia

Sprawdzenie ustawienia kondensatoraco miesiac

Umieszczenie w pokrowcu z mikrosko-pem naczynia z błekitem krzemion-kowym, w celu zapobiegania wzros-towi grzybow w wilgotnym srodowisku

Co rok

Chłodziarka Czyszczenie i rozmrazanie co 2 miesiacei po kazdym przerwaniu zasilania pra-dem

Zapis temperatury kazdego dnia rano(zakres temp.: 2 –8°C)

Co 6 miesiecy

Łaznia wodna Przecieranie scian wewnetrznych i wy-miana wody co miesiac

Codzienne sprawdzanie poziomu wodyZapis temperatury pierwszego dnia ka-

zdego tygodnia (zakres temp.:55 –57°C)

Co 6 miesiecy

19


TemperaturaPokojUrzadzenie

Odczytywac codziennie. Sprawdzic, czy odczytana wartosc temperatury jest dopuszczalna.W przypadku nieprawidłowosci zapisac temperature w rubryce.

Data I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII Data

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

7 7

8 8

9 9

10 10

11 11

12 12

13 13

14 14

15 15

16 16

17 17

18 18

19 19

20 20

21 21

22 22

23 23

24 24

25 25

26 26

27 27

28 28

29 29

30 30

31 31

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

Ryc. 2. Zapisy temperatury działajacych urzadzen.

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

20


7. Jesli pojemnik został otwarty, zapisac date jego otwarcia.8. Wyrzucic wszystkie suche podłoza, ktore sciemniały lub w ktorych powstały

zlepione grudki.9. Prowadzic rejestr przechowywanych podłozy.

Przygotowanie podłoza

1. Nalezy scisle przestrzegac zalecen producenta.2. Przygotowac ilosc, ktora zostanie zuzyta przed upływem terminu przydatnosci

(patrz ponizej).

Przechowywanie gotowych podłozy

1. Ochrona przed swiatłem.2. Ochrona przed ciepłem. Podłoza zawierajace krew, inne składniki organiczne

lub antybiotyki powinny byc przechowywane w chłodziarce.3. Termin przydatnosci gotowego podłoza, ktore jest przechowywane w niskiej

temperaturze, w ciemnym miejscu, zalezy od jego składu.

Przecietne terminy uzytecznosci:– probowki z bawełnianym korkiem — 3 tygodnie;– probowki z nieszczelna nakładka — 2 tygodnie;– pojemniki z zakretka — 3 miesiace;– płytki Petriego szczelnie zamkniete w plastikowych woreczkach — 4 tygodnie.

Kontrola jakosci przygotowanych podłozy

1. Oznaczenie pH. Wartosc pH prawidłowo przygotowywanych sypkich podłozynie musi byc rutynowo sprawdzana. Podłoza przygotowywane ze składnikow

Tabela 2. Zestaw szczepow zalecanych w kontroli jakoscia

Gram-dodatnie ziarenkowceEnterococcus faecalis (ATCC 29212 lub

33186)Staphylococcus aureus (ATCC 25923)Staphylococcus epidermidisStreptococcus agalactiaeStreptococcus mitisStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pyogenes

Gram-ujemne kwasooporne bakterieMoraxella catarrhalisHaemophilus influenzae typ b

β-laktamazoujemneβ-laktamazododatnie

Haemophilus parainfluenzaeNeisseria gonorrhoeaeNeisseria meningitidis

Bakterie beztlenoweBacteroides fragilisClostridium perfringens

EnterobacteriaceaeCitrobacter freundiiEnterobacter cloacaeEscherichia coli (ATCC 25922)Klebsiella pneumoniaeProteus mirabilisSalmonella typhimuriumSerratia marcescensShigella flexneriYersinia enterocolitica

Inne Gram-ujemne pałeczkiAcinetobacter lwoffiPseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)Vibrio cholerae (nie-01)

GrzybyCandida albicans

a Powinny zostac wybrane szczepy najbardziej odpowiadajace wymaganiom laboratorium.

21


Tabela 3. Testy kontrolne dla powszechnie stosowanych podłozy

Podłoze Inkubacja Organizm wskaznikowy Oczekiwany wynik

Agar z zołcia i eskulina 24 h Enterococcus faecalis Wzrost i zaczernienieStreptococcus α-hemolizujacy Brak wzrostu

Agar z krwia 24 h, CO2 Streptococcus pyogenes Wzrost i β-hemolizaS. pneumoniae Wzrost i α-hemoliza

Agar czekoladowy 24 h, CO2 Haemophilus influenzae Wzrost

Dekarboksylaza (pokryta sterylnymolejem)

– lizyny 48 h Shigella typhimurium DodatniShigella flexneri Ujemny

– ornityny 48 h S. typhimurium DodatniKlebsiella pneumoniae Ujemny

Dihydrolaza– argininy 48 h S. typhimurium Dodatni

Proteus mirabilis Ujemny

Zelatynaza (szybki test) 24 h Escherichia coli UjemnySerratia marcescens Dodatni

Agar Kliglera (patrz Trojcukrowy agarzelazowy)

Agar MacConkeya z fioletem krystali-cznym

24 h E. coli Czerwone kolonieP. mirabilis Bezbarwne kolonie (brak wzros-

tu mgławicowego)E. faecalis Brak wzrostu

Bulion malonianowy 24 h E. coli Ujemny (kolor zielony)K. pneumoniae Dodatni (kolor niebieski)

Agar z mannitolem 24 h Staphylococcus aureus Zołte kolonieStaphylococcus epidermidis Rozowe kolonieE. coli Brak wzrostu

Czerwien metylowa/Voges-Proskauer 48 h E. coli Dodatni/ujemnyK. pneumoniae Ujemny/dodatni

Agar Mueller-Hintona 24 h E. coli ATCC 25922S. aureus ATCC 25923Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853

Akceptowane rozmiary strefy za-hamowania (tab. 24, str. 126)

Bulion azotanowy 24 h E. coli DodatniAcinetobacter lwofii Ujemny

Utlenianie/fermentacja dekstrozy (bezoleju)

24 h P. aeruginosa Utlenianie na powierzchniA. lwofii Brak reakcji

Woda peptonowa (indol) 24 h E. coli DodatniK. pneumoniae Ujemny

Deaminaza fenyloalaniny/chlorek zela-za

24 h E. coli UjemnyP. mirabilis Dodatni

Salmonella-Shigella agar lub agar z cyt-rynianem deoksycholanu

24 h E. coli Bez wzrostuS. typhimurium Bezbarwne kolonieYersinia enterocolitica Bezbarwne kolonieS. flexneri Bezbarwne kolonie

Bulion seleninowy 24 h S. typhimurium Wzrost po przesianiuE. coli Brak wzrostu po przesianiu

Agar cytrynianowy Simmonsa (inkuba-cja z luzna zakretka)

48 h E. coli Brak wzrostuK. pneumoniae Wzrost, kolor niebieski

Agar z solami zołci i cytrynianem tiosiar-czanowym

24 h Vibrio spp. (nieaglutynujace) Zołte kolonie

Agar Thayer-Martina 24 h, CO2 Neisseria meningitidis WzrostNeisseria gonorrhoeae WzrostStaphylococcus spp. Brak wzrostuE. coli Brak wzrostuC. albicans Brak wzrostu

Bulion tioglikolanowy 24 h Bacteroides fragilis Wzrost

22


podstawowych nalezy wczesniej schłodzic. W przypadku stałych podłozy dooznaczenia pH nalezy uzyc powierzchniowej elektrody lub rozmiekczycpodłoze w wodzie destylowanej. Jesli pH rozni sie od zalecanego wiecej nizo 0,2 jednostki, nalezy je skorygowac kwasem lub zasada, lub przygotowacnowa partie.

2. Kontrola sterylnosci. Testy sterylnosci powinny byc przeprowadzane rutyno-wo dla podłozy, do ktorych po sterylizacji w autoklawie dodano krew lub inneskładniki. 3–5% probek nalezy poddac inkubacji w temperaturze 35°C przez2 dni. Pozostałe schłodzic. Jesli na płytce pojawia sie wiecej niz dwie kolonie,nalezy odrzucic cała badana partie.

3. Kontrola jakosci. Laboratorium powinno miec zapas zestawow szczepowwzorcowych do monitorowania jakosci podłozy. Lista zalecanych szczepowwzorcowych została przedstawiona w tabeli 2. Szczepy te moga byc uzyskanew trakcie rutynowej pracy lub pochodzic z komercyjnych czy tez oficjalnychzrodeł. Rekomendacje dotyczace utrzymania i wykorzystania szczepowwzorcowych opisane zostały na str. 24.

Lista testow przeprowadzanych dla powszechnie uzywanych podłozy przed-stawiona została w tabeli 3.

Procedury postepowania przy ocenie jakosci nowych partii podłoza:1. Przygotowac lekko metna zawiesine szczepow kontrolnych, porownujac ja ze

wzorcem standardowego roztworu siarczanu baru uzywanego w zmodyfiko-wanej metodzie Kirby-Bauera (McFarland 0,5) (patrz str. 125) i uzyc jednooczko ezy jako inoculum.

2. Inkubowac przez rutynowo stosowany okres i odczytac zgodnie z przyjetymizasadami.

3. Własciwie zapisac wyniki.

Barwniki i odczynniki

Zalecenia dotyczace testowania niektorych odczynnikow przedstawiono w ta-beli 4. Testy powinny byc przeprowadzane:– za kazdym razem przy przygotowywaniu nowej partii roztworu roboczego;– co tydzien (niezbedne w przypadku zimnego barwnika Ziehl-Neelsena:

klasyczny ma kilkumiesieczny termin przydatnosci).

Odczynniki i barwniki powinny byc dyskwalifikowane, jesli:– termin waznosci okreslony przez producenta jest przekroczony;– widoczne sa oznaki psucia (zmetnienie, osad, zmiana barwy).

Tabela 3 cd.

Podłoze Inkubacja Organizm wskaznikowy Oczekiwany wynik

Trojcukrowy agar zelazowy (głebokoscco najmniej 2,5 cm; inkubacja z luznazakretka)

24 h Citrobacter freundii A/A gaza + H2SS. typhimurium K/A gaza + H2SS. flexneri K/A gaza

A. lwofii Brak reakcji

Podłoze z mocznikiem 24 h E. coli UjemnyP. mirabilis Dodatni (rozowy)

Voges-Proskauer (patrz Czerwien me-tylowa/Voges-Proskauer)

a A/A: punkt kwasny; K/A: punkt zasadowy.

23


Antygeny i surowice odpornosciowedo diagnostyki

W celu otrzymania mozliwie najlepszych wynikow badan z uzyciem antygenowi surowic odpornosciowych nalezy:• Zawsze przestrzegac instrukcji producenta.• Przechowywac w zalecanej temperaturze. Niektore odczynniki serologiczne

nie toleruja zamrazania.

• Unikac powtarzanych zamrozen i rozmrozen. Przed zamrozeniem po-dzielic surowice na odpowiednie porcje, wystarczajace do wykonania kilkutestow.

• Wyrzucic, jesli upłynał termin waznosci podany przez producenta.• Do testu aglutynacji z surowicami odpornosciowymi nalezy uzywac zawsze

swiezych, czystych, zidentyfikowanych hodowli.• Zawsze, w kazdej serii badan, wykonac test z surowica kontrolna o znanej

reaktywnosci. Surowica moze pochodzic od pacjenta lub z komercyjnegozrodła.

• Jesli to mozliwe, aktywnosc surowicy powinna byc wyrazana w jednostkachmiedzynarodowych (International Units, IU) na mililitr.

• Pary surowic, pobranych od jednego pacjenta w ostrej fazie choroby i w fa-zie zdrowienia, powinny byc badane z uzyciem odczynnikow z tej samejpartii.

• Diagnostyke serologiczna kiły prowadzic zgodnie z przyjetymi krajowymii miedzynarodowymi procedurami.

• Kazda partia testow serologicznych powinna zawierac:– surowice ujemna (kontrola swoistosci);

Tabela 4. Testy jakosci powszechnie stosowanych odczynnikow

Odczynnik lub barwnik PodłozeGatunek uzyty do testowania

Wzrost Brak wzrostu

Krazek z bacytracyna S. pyogenes (strefa zahamo-wania)

E. faecalis Agar z krwia

Katalaza S. aureus E. faecalis Agar tryptozowo-sojowy

Osocze do koagulazy S. aureus S. epidermidis Agar tryptozowo-sojowy

β-Glukuronidaza (PGUA)a E. coli K. pneumoniae Agar tryptozowo-sojowy

Barwienie metoda Grama Staphylococcus spp. E. coli Preparaty z mieszankiszczepow

ONPGb E. coli S. typhimurium Trojcukrowy agar zelazo-wy lub agar Kliglera

Krazek z optochina S. pneumoniae (strefa zaha-mowania)

Streptococcus mitis Agar z krwia

Oksydaza Pseudomonas aeruginosa E. coli Agar tryptozowo-sojowy

Krazek z tellurydem E. faecalis (brak strefy zaha-mowania)

Streptococcus agalactiae(strefa zahamowania)

Agar z krwia

Czynnik V (krazek lub pasek) Haemophilusparainfluenzae Haemophilus influenzae Agar tryptozowo-sojowy

Czynnik XV (krazek lub pasek) H. influenzae Agar tryptozowo-sojowy

Barwienie metoda Ziehl-Neelsena Mycobacterium tuberculosis Mieszana, niekwasoopornaflora

Preparat z rozmazemz plwocinyc

a Kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydouronowy (PGUA).b o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd.c Przygotowac wymazy od pacjentow zdrowych i chorych. Utrwalic w cieple, owinac kazdy papierem i przechowywacw chłodziarce.

24


– surowice słabo dodatnia (kontrola czułosci);– surowice silnie dodatnia (kontrola miareczkowania), ktora powinna byc

przygotowana w rozcienczeniu odpowiadajacym jej mianu uzyskanemuw ostatnio wykonywanym tescie.

• Zawsze zapisywac wszystkie miana surowic kontrolnych.

Oznaczanie wrazliwosci na antybiotyki

Zalecane jest rutynowe stosowanie zmodyfikowanej metody Kirby-Bauera (str.125). W celu unikniecia błedow, nalezy przestrzegac ponizszych zasad:• Krazki powinny miec własciwa srednice (6,35 mm).• Krazki powinny zawierac własciwe stezenie antybiotyku (tabela 24, str. 126).• Zapas krazkow powinien byc przechowywany w zamrazarce (–20°C).• Zestaw podreczny powinien byc przechowywany nie dłuzej niz 1 miesiac

w chłodziarce (2 – 8°C).• Do przeprowadzania badania jakosci nalezy uzywac tylko agaru Mueller-

-Hintona.• Własciwe pH (7,2 – 7,4) gotowego podłoza jest bardzo istotne w przypadku

niektorych antybiotykow.• Gestosc inoculum powinna byc standaryzowana, okreslona na podstawie

wzorca zmetnienia (str. 127).• Pomiar wielkosci strefy powinien byc dokładny.• Uzyskana srednica strefy zahamowania wzrostu powinna byc interpreto-

wana według wartosci granicznych podanych w tabeli. Srednica strefydla szczepow kontrolnych powinna zgadzac sie z zakresami podanymi w tabeli24 (str. 126).

• Trzy standardowe szczepy kontrolne, to1:– Staphylococcus aureus (ATCC 25923; NCTC 6571);– Escherichia coli (ATCC 25922; NCTC 10418);– Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; NCTC 10622).

• Badania kontrolne z wykorzystaniem wymienionych szczepow powinny bycprzeprowadzane:– dla kazdej nowej partii krazkow;– dla kazdej nowej partii podłozy;– raz w tygodniu, rownolegle do antybiogramow wykonywanych rutynowo.

• W celu zapisu i interpretacji wynikow kontroli jakosci, zalecane jest stosowaniewykresu przedstawionego na ryc. 16 (str. 137).

Pozyskiwanie i przechowywanieszczepow kontrolnych

Wybor szczepow i zrodło ich pochodzenia

Nalezy wybrac szczepy, ktorych maksymalna liczba morfologicznych, metabo-licznych i serologicznych cech moze byc identyfikowana mozliwie najmniejszaliczba testow; zalecane szczepy kontrolne zebrano w tabeli 2.

1 Wymienione szczepy moga byc uzyskane z: American Type Culture Collection (ATCC), 10801University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA; lub National Collection of Type Cultures (NCTC),PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, England.

25


Szczepy te mozna uzyskac z nastepujacych zrodeł:– prawidłowo zidentyfikowane izolaty z probek klinicznych;– oficjalne kolekcje szczepow;– komercyjni producenci;– referencyjne laboratoria;– inne zrodła z zewnetrzna kontrola jakosci.

Przechowywanie szczepow

Długoterminowe przechowywanie szczepow

Metody długoterminowego przechowywania szczepow pozwalaja na kilku-miesieczne lub nawet kilkuletnie przerwy miedzy przesiewami. Najlepszymimetodami sa: liofilizacja (suchy lod), przechowywanie w zamrazarce lubw ciekłym azocie, w temperaturze –70°C lub nizszej. Metody alternatywneopisano ponizej.

Glicerol w temperaturze –20°°C

1. Wzrost czystych hodowli na odpowiednim stałym podłozu.2. Wyrosłe kolonie zebrac eza.3. Zawiesic niewielka ilosc materiału w sterylnym neutralnym glicerolu.4. Umiescic 1 – 2 ml porcje w zakrecanych pojemnikach lub w fiolkach.5. Przechowywac w temperaturze –20°C. Unikac powtarzania zamrozen i roz-

mrozen. Przesiewac co 12 – 18 miesiecy.

Olej mineralny w temperaturze pokojowej1

1. Przygotowac probowki ze skosem agarowym zawierajacym wyciag z serca.Dla wymagajacych mikroorganizmow dodac swieza lub ogrzana krew.

2. Wysterylizowac olej mineralny (liquid petrolatum) w suchym goracympowietrzu (170°C przez godzine).

3. Posiac szczep na skosy agarowe.4. Jesli widoczny jest wzrost hodowli, dodac sterylny olej mineralny na wysokosc

około 1 cm ponad poziom agaru.5. Konieczne przesiewy uzyskuje sie przez zebranie hodowli spod warstwy oleju.6. Przechowywac w temperaturze pokojowej. Przesiewac co 6 – 12 miesiecy.

Przechowywanie hodowli w temperaturze pokojowej (stosowane tylko dlaniewymagajacych bakterii, takich jak gronkowce i Enterobacteriaceae)

1. Przygotowac probowki z wysokim słupkiem agaru, bez weglowodanu.Zalecany jest agar tryptozowo-sojowy (trawiony kazeina agar sojowy).

2. Posiac szczepy wkłuwajac je w agar.3. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.4. Zamknac probowke zakretka lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyc

zakretke lub korek w płynnej parafinie.5. Przechowywac w temperaturze pokojowej. Przesiewac raz w roku.

1 Morton H.E., Pulaski E.J.: The preservation of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 1938,38: 163 – 183.

26


Przechowywanie szczepow na agarze cysteinowo-tryptozowym (CTA) (dlaNeisseria i paciorkowcow)

1. Przygotowac probowki zawierajace podstawowe podłoze CTA.2. Posiac wkłuwajac bakterie w podłoze.3. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.4. Zamknac probowke zakretka lub korkiem. W celu uszczelnienia zanurzyc

zakretke lub korek w płynnej parafinie.5. W przypadku Neisseria, przechowywac w temperaturze 35°C i przesiewac co

2 tygodnie. W przypadku paciorkowcow, przechowywac w temperaturzepokojowej i przesiewac co miesiac.

Podłoza z wyciagiem miesnym dla bakterii beztlenowych

1. Posiac szczepy.2. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.3. Zamknac probowke zakretka lub korkiem.4. Przechowywac w temperaturze pokojowej i przesiewac co 2 miesiace.

Krotkoterminowe przechowywanie szczepow

Hodowle szczepow kontrolnych, aktualnie wykorzystywane do badan rutyno-wych, moga byc przygotowywane w ponizszy sposob.

Szybko rosnace mikroorganizmy

1. Posiac na skos agarowy tryptozowo-sojowy w zakrecanych probowkach.2. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.3. Przechowywac w chłodziarce. Przesiewac co 2 tygodnie.

Paciorkowce

1. Posiac na skos agarowy z krwia w zakrecanych probowkach.2. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.3. Przechowywac w chłodziarce. Przesiewac co 2 tygodnie.

Meningokoki i Haemophilus

1. Posiac na skos lub płytke z agarem czekoladowym.2. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C.3. Przechowywac w temperaturze pokojowej. Przesiewac 2 razy w tygodniu.

Gonokoki

1. Posiac na agar czekoladowy.2. Inkubowac przez noc w temperaturze 35°C. Przesiewac co 2 dni.3. Zastepowac szczepy kontrolne nowymi klinicznymi izolatami.

27


Rola referencyjnych laboratoriow

Ponizsze rodzaje materiałow do badan powinny byc przesyłane do regionalnychlub centralnych laboratoriow referencyjnych:– materiały badane w kierunku rzadko izolowanych drobnoustrojow lub wyma-

gajace zastosowania wysoko specjalistycznych testow (np.: wirusologia,diagnostyka serologiczna chorob pasozytniczych);

– pojedyncze duplikaty materiałow do badan, w celu kontroli wydawanych przezlaboratorium wynikow;

– materiały wymagajace w przyszłosci badan potwierdzajacych, roznicujacych,oznaczania grup badz typow patogenow o duzym znaczeniu dla zdrowiapublicznego (np.: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Brucella, menin-gokoki i pneumokoki).

Referencyjne laboratoria powinny dostarczac zestawy szczepow kontrolnychoraz, na potrzeby szkolen, standardowe surowice i odczynniki uzywane w labora-torium referencyjnym.

Jesli laboratorium nie jest objete programem zewnetrznej kontroli jakosci,referencyjne laboratorium jest zobowiazane do przygotowywania slepych, kodo-wanych probek i hodowli, ktore słuza do kontroli jakosci pracy laboratoriumw zakresie izolacji i hodowli.

Zewnetrzna kontrola jakosci

W czesci tej omowiono elementy podlegajace ocenie w programie zewnetrznejkontroli jakosci (okreslanym jako ,,program testowania biegłosci’’).

Cele

Celem programu kontroli jakosci jest:– zagwarantowanie lekarzom i społeczenstwu dobrej jakosci diagnostyki labora-

toryjnej;– ocena i porownanie wiarygodnosci wynikow laboratoryjnych w skali kraju;– identyfikacja powszechnie popełnianych błedow;– motywacja do przestrzegania ujednoliconych procedur;– motywacja do uzywania standardowych odczynnikow;– podjecie czynnosci administracyjnych (łacznie z cofnieciem licencji) wobec

laboratoriow nie spełniajacych standardow;– motywacja do wprowadzenia wewnetrznych programow jakosci.

Zasady kontroli

Zewnetrzna kontrola jakosci polega na wysyłaniu kodowanych probek douczestniczacych w niej laboratoriow. Powyzsze probki powinny byc właczone dobadan rutynowych, traktowane i badane dokładnie w ten sam sposob, jak probkikliniczne.

Kontrole nalezy prowadzic zgodnie z ponizszymi zaleceniami:– powinna byc przeprowadzana co najmniej 4 razy w roku;– powinna obejmowac co najmniej 3 probki;– czas na przygotowanie sprawozdania powinien byc krotki, np. 2 tygodnie od

otrzymania materiału do badan;

28


– instrukcje i formularze dotyczace sprawozdania powinny byc dołaczone dokazdego zestawu probek, a raport powinien byc przygotowany w dwochkopiach i przesłany w scisle ustalonym terminie.

Hodowle

Hodowle powinny byc właczone do identyfikacji i oznaczania wrazliwosci naokreslona liczbe antybiotykow; moze to byc czysta hodowla lub mieszaninadwoch lub wiecej szczepow.

Hodowle powinny nalezec do co najmniej 3 pierwszych z ponizszych 6 grup:1. Bakterie o duzym znaczeniu dla zdrowia publicznego, ktore sa rzadko

izolowane w rutynowej diagnostyce, np.: Corynebacterium diphtheriae,Salmonella paratyphi A.UWAGA: Brucella i Salmonella typhi nie powinny byc wykorzystywanew programach kontroli jakosci, poniewaz moga wywoływac powazne,przypadkowe zakazenia.

2. Nietypowe biotypy, ktore sa czesto identyfikowane nieprawidłowo, np.:H2S-dodatnie Escherichia coli, laktozoujemne E. coli, ureazoujemne Proteus.

3. Nowe lub oportunistyczne patogeny, np.: Yersinia enterocolitica, Vibrioparahaemolyticus, Burkholderia, Pseudomonas cepacia.

4. Mieszane hodowle Shigella, Citrobacter, E. coli i Klebsiella moga zostacwykorzystane w celu oceny zdolnosci laboratorium do izolacji patogenowsposrod wielu mikroorganizmow komensalnych.

5. Mieszane hodowle niepatogennych mikroorganizmow moga zostac wykorzys-tane w celu oceny zdolnosci rozpoznawania probek ujemnych.

6. Bakterie o specyficznym wzorze opornosci, np.: metycylinooporny S. aureus(MRSA).

Surowice

Program kontroli jakosci powinien obejmowac takze badania serologicznestosowane w ponizszych zakazeniach:– kiła,– rozyczka,– bruceloza,– infekcje paciorkowcowe,– dur brzuszny.

Ocena i przedstawienie wynikow

Gdy wszystkie objete programem kontroli laboratoria dostarcza swoje wyniki,nalezy przesłac im zestaw prawidłowych odpowiedzi. W ciagu miesiaca dolaboratoriow powinny zostac wysłane sprawozdania z analiza wynikow. Kazdelaboratorium oceniane jest według punktacji. Laboratorium powinno miecnadany, sobie tylko znany numer. W ten sposob moze porownac własne rezultatyz wynikami innych laboratoriow, ktore pozostaja anonimowe.

29

Czesc I

Badania bakteriologiczne

30

Krew

Wprowadzenie

Hodowle z krwi prowadzone sa w celu izolacji i identyfikacji bakterii lub innychmozliwych do wyhodowania mikroorganizmow (drozdze, grzyby nitkowate).Obecnosc powyzszych drobnoustrojow we krwi okresla sie mianem bakteriemiilub fungemii, ktora zazwyczaj jest stanem patologicznym. U zdrowych osob krewjest jałowa. Istnieje jednak kilka wyjatkow: okresowa bakteriemia, ktora pojawiasie krotko po ekstrakcji zeba lub po innych zabiegach stomatologicznychi chirurgicznych w obrebie zakazonych błon sluzowych, po bronchoskopii lub pocewnikowaniu pecherza. Opisany typ bakteriemi dotyczy zwykle bakterii komen-salnych i zazwyczaj przemija samoistnie dzieki fagocytozie zachodzacej w wat-robie i sledzionie.

Sepsa jest terminem klinicznym, okreslajacym bakteriemie z objawami klinicz-nymi ciezkiej infekcji, takimi jak: dreszcze, goraczka, złe samopoczucie i spadekcisnienia tetniczego. Skrajna postacia sepsy jest wstrzas. Wstrzas moze bycwywołany toksynami produkowanymi przez Gram-ujemne pałeczki lub Gram--dodatnie ziarenkowce.

Kiedy i u kogo moze wystapic bakteriemia

Bakteriemia jest cecha niektorych chorob zakaznych, np.: brucelozy, leptospirozyi duru brzusznego. Przewlekła bakteriemia wystepuje w zakazeniach łozyskanaczyniowego, np.: w zapaleniu wsierdzia (endocarditis), zakazonym tetniakui w zakrzepowym zapaleniu zył (thrombophlebitis).

Przejsciowa bakteriemia czesto towarzyszy zlokalizowanym infekcjom, takimjak: zapalenie stawow (arthritis), odlezyny, zapalenie pecherzyka zołciowego(cholecystitis), zapalenie jelita cienkiego i okreznicy (enterocolitis), zapalenieopon mozgowo-rdzeniowych (meningitis), zapalenie szpiku (osteomyelitis),zapalenie otrzewnej (peritonitis), zapalenie płuc (pneumonia), odmiedniczkowezapalenie nerek (pyelonephritis) oraz zakazenia ran pourazowych i chirurgicz-nych. Moze pojawic sie w wyniku roznych interwencji chirurgicznych, leczu zdrowych osob zwykle ustepuje samoistnie.

Bakteriemia i fungemia moga byc pochodzenia jatrogennego i wystapic w wynikuwprowadzenia mikroorganizmow droga dozylna: przez skazony płyn podawanydozylnie, cewnik lub miejsce wkłucia. Obydwa typy infekcji moga wystapicu osob przyjmujacych dozylnie narkotyki oraz u osob w immunosupresji, doktorych zalicza sie pacjentow zakazonych ludzkim wirusem uposledzeniaodpornosci — z zespołem nabytego uposledzenia odpornosci (HIV/AIDS). Sa oneczesto wynikiem zakazen ,,oportunistycznymi’’ mikroorganizmami i moga miecpowazne konsekwencje. W tabeli 5 przedstawiono najczestsze przyczyny bak-teriemii i fungemii.

31

CZESC I

Pobieranie probek krwi

Czas pobrania probki

Jesli to mozliwe, krew powinna zostac pobrana przed zastosowaniem anty-biotykow. Najlepiej przed wystapieniem dreszczy lub szczytu temperatury.Zaleca sie pobranie dwu lub korzystniej trzech probek krwi w około godzinnychodstepach (lub krotszych, jesli nie mozna opozniac rozpoczecia leczenia). Rzadkowskazane jest pobranie wiecej niz trzech probek. Zalety powtarzanych hodowliz krwi, to:– zmniejszone prawdopodobienstwo przeoczenia przejsciowej bakteriemii;– potwierdzenie patogennej roli ,,saprofitycznych izolatow (np.: Staphylococcus

epidermidis) przez wykazanie ich obecnosci w probkach z kilku wkłuc.

Wazne jest pobranie probek krwi przed wprowadzeniem antybiotykoterapiiempirycznej. Jesli to konieczne, wybor antybiotykow moze zostac zmodyfikowa-ny po uzyskaniu wynikow antybiogramu.

Objetosc probki krwi

Poniewaz liczba bakterii w mililitrze krwi jest zwykle mała, wazne jest pobraniewłasciwej objetosci krwi: 10 ml z wkłucia u dorosłych; 2 – 5 ml moga bycwystarczajace u dzieci, u ktorych zwykle bakteriemia osiaga wyzsze wartosci;u niemowlat i noworodkow czesto mozna uzyskac maksymalnie 1 – 2 ml. Kazdaprobka powinna byc posiana do dwoch butelek: pierwszej do optymalnej hodowliscisle tlenowych mikroorganizmow, drugiej dla szczepow beztlenowych.

Dezynfekcja skory

Skora w miejscu wkłucia powinna byc starannie przygotowana, z uzyciembakteriobojczego preparatu dezynfekujacego: 2% roztworu jodyny, 10% roztworupoliwidonu jodyny, 70% alkoholu lub 0,5% roztworu chlorheksydyny w 70%alkoholu. Przed pobraniem krwi srodek dezynfekujacy powinien odparowacz powierzchni skory. W celu unikniecia ewentualnych podraznien przy stosowa-niu jodyny skore nalezy przetrzec 70% alkoholem.

Tabela 5. Czeste przyczyny bakteriemii i fungemii

Gram-ujemne mikroorganizmy Gram-dodatnie mikroorganizmy

Escherichia coli Staphylococcus aureusKlebsiella spp. S. epidermidisEnterobacter spp. α-Hemolizujace (zieleniejace paciorkowce)Proteus spp. Streptococcus pneumoniaeSalmonella typhi E. faecalis (grupa D)Salmonella spp., inne niz S. typhi S. pyogenes (grupa A)Pseudomonas aeruginosa S. agalactiae (grupa B)Neisseria meningitidis Listeria monocytogenesHaemophilus influenzae Clostridium perfringensBacteroides fragilis (beztlenowe) Peptostreptococcus spp. (beztlenowe)Brucella spp. Candida albicans i inne drozdzopodobne

grzyby (np. Cryptococcus neoformans)Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei(w niektorych regionach)

32

KREW

Nawet po starannym przygotowaniu skory niektore bakterie moga przetrwacw głebszych warstwach i przedostac sie do krwi, np.: S. epidermidis, Propioni-bacterium acnes, przetrwalniki Clostridium.

Pseudobakteriemia (fałszywie dodatnie hodowle z krwi) moze byc efektem uzyciaskazonych roztworow dezynfekujacych, strzykawek lub igieł.

Powtarzalne izolacje nie wystepujacych powszechnie mikroorganizmow (np.:Burkholderia (Pseudomonas) cepacia, Pantoea (Enterobacter) agglomerans lubSerratia spp.) z jednego szpitala wzbudzaja podejrzenie zakazenia szpitalnegoi wymagaja szczegołowych badan. Inna przyczyna skazenia probki jest kontaktigły z niesterylnymi probowkami (lub roztworami), jesli ta sama strzykawkazostała wczesniej uzyta do pobrania krwi do badan biochemicznych lub odczynuopadania krwinek czerwonych (OB — odczyn Biernackiego — przyp. tłum.).

Antykoagulant

Zalecane jest uzycie jako srodka przeciwkrzepliwego polianetosulfonianu sodu(sodium polyanethol sulfonate — SPS), poniewaz hamuje on jednoczesnieaktywnosc przeciwbakteryjna osocza i fagocytow. Jesli natychmiast po pobraniukrew zostanie dodana do wystarczajacej objetosci (50 ml) bulionu i dokładniewymieszana w celu unikniecia tworzenia sie skrzepow, zastosowanie anty-koagulantu nie jest konieczne. Kazdy szpital i wiekszosc osrodkow zdrowiapowinna byc wyposazona w butelki z podłozem do posiewu krwi. Jesli płynnepodłoze jest niedostepne, krew nalezy przesłac do laboratorium w probowcezawierajacej sterylny roztwor antykoagulantu (cytrynian, heparyna lub SPS).W laboratorium probka krwi natychmiast po otrzymaniu powinna zostacw warunkach aseptycznych przeniesiona do butelki z podłozem. Jesli krewpobrana jest bez antykoagulantu, skrzep w laboratorium moze zostac w aseptycz-nych warunkach przeniesiony do bulionu, a surowica wykorzystana do wykonanianiektorych testow serologicznych (np.: odczyn Widala).

Podłoza do posiewu krwi

Wybor podłozy płynnych

Bulion do posiewu z krwi i bulion tryptozowo-sojowy (TSB) powinny umozliwicwzrost wszystkich bakterii o znaczeniu klinicznym.

Objetosc bulionu

Optymalnie krew powinna byc wymieszana z bulionem w stosunku 1:10 (5 mlkrwi w 50 ml podłoza), co zmniejsza stezenie antybiotyku i redukuje aktywnoscprzeciwbakteryjna ludzkiego osocza.

Butelki z podłozem do posiewu krwi

Nalezy uzywac butelek z podłozem do posiewu krwi (125 ml), z podwojnanakretka, ktorej druga warstwe stanowi gumowy krazek. Po napełnieniu butelki

33

CZESC I

50 ml podłoza odkrecic nakretke o poł obrotu. Nakryc zamkniecie kwadratowymfragmentem folii aluminiowej i umiescic butelke w autoklawie w 120°C na20 minut. Natychmiast po autoklawowaniu, gdy butelka i podłoze sa jeszczegorace, delikatnie dokrecic nakretke, bez usuwania folii aluminiowej (w innymprzypadku nakretka nie bedzie sterylna). Podczas stygniecia podłoza wytwarza sieczesciowa proznia, ktora ułatwi wprowadzenie probki krwi przez gumowawarstwe.

Tuz przed wprowadzeniem materiału do butelki nalezy starannie zdezynfekowacgumowa czesc nakretki.

Przed wydaniem gotowej butelki z podłozem i przed jej uzyciem powinno siesprawdzic przejrzystosc zawartosci. Podłoze, ktore wykazuje zmetnienie, niepowinno zostac uzyte.

Jesli podejrzewa sie obecnosc bakterii tlenowych (Pseudomonas, Neisseria) lubdrozdzy, w laboratorium po otrzymaniu probki nalezy zdezynfekowac gumowaczesc nakretki i przekłuc ja sterylna igła z bawełniana zatyczka. Igła moze zostacusunieta w chwili, gdy cisnienie wewnatrz butelki osiagnie wartosc cisnieniaatmosferycznego. Komercyjne butelki do posiewu krwi zawieraja dwutlenekwegla stymulujacy wzrost. W krajach, gdzie powszechnie wystepuje bruceloza,zalecane jest stosowanie, umozliwiajacego wzrost Brucella spp., dwufazowegopodłoza, złozonego z bulionu oraz stałej warstwy agaru na jednej z gładkichpowierzchni naczynia (Castaneda bottle). Do hodowli wiekszosci szczepowB. abortus wymagana jest obecnosc dwutlenku wegla.

Prowadzenie hodowli z krwi

Czas inkubacji

Butelki do posiewu krwi powinny byc inkubowane w 35 – 37°C i kontrolowanedwukrotnie w ciagu dnia (co najmniej przez pierwsze 3 dni) w celu oceny cechmikrobiologicznych wzrostu. Jałowe posiewy zwykle zawieraja warstwe osadukrwi, pokryta jasnozołtym przezroczystym bulionem. Dowodem wzrostu sa:– kłaczkowaty osad na powierzchni warstwy krwi,– jednolite lub podpowierzchniowe zmetnienie,– hemoliza,– koagulacja bulionu,– kozuszek na powierzchni,– wytwarzanie gazu,– białe ziarna na powierzchni lub w głebszej warstwie krwi.

Kiedy tylko pojawi sie wzrost, butelke nalezy otworzyc w warunkach aseptycz-nych, pobrac sterylna eza lub pipeta Pasteura niewielka ilosc bulionu i przygoto-wac rozmaz barwiony metoda Grama w celu oceny obecnosci mikroorganizmow.

Jednoczesnie nalezy wykonac przesiew eza na odpowiednie podłoza:– dla Gram-ujemnych pałeczek: agar MacConkeya, agar Kliglera, podłoze

ruch-indol-ureaza (MIU), cytrynianowy agar Simmonsa;– dla małych Gram-ujemnych pałeczek: agar z krwia;– dla gronkowcow: agar z krwia, agar z mannitolem;– dla paciorkowcow: agar z krwia, z krazkiem z optochina, bacytracyna

i telurynem, agar z krwia barania do testu CAMP, agar z zołcia i eskulina.

34

KREW

W rutynowych posiewach krwi inkubacja dłuzsza niz 7 dni nie jest konieczna.W niektorych przypadkach inkubacja moze byc przedłuzona o kolejne 7 dni, naprzykład przy podejrzeniu zakazenia pałeczkami Brucella lub innymi mikroor-ganizmami o wysokich wymaganiach odzywczych, w przypadku zapaleniawsierdzia lub jesli pacjent jest w trakcie antybiotykoterapii.

Probki krwi z niewidocznym wzrostem

Niektore mikroorganizmy moga rosnac bez zmetnienia lub widocznych zmianw podłozu. Inne, jak na przykład pneumokoki, wykazuja tendencje do autolizyi szybko gina. Z tego powodu niektore laboratoria prowadza rutynowe przesiewyna agar czekoladowy po 18 – 24 godzinach inkubacji. Probki z niewidocznymwzrostem moga byc opracowywane w siodmym dniu inkubacji przez przeniesie-nie kilku kropel dobrze zmieszanej hodowli krwi (z uzyciem sterylnych pipetPasteura) do probowki z podłozem tioglikolanowym, ktora inkubuje sie i obser-wuje przez kolejne 3 dni.

Antybiogram

Przy podejrzeniu obecnosci gronkowcow lub Gram-ujemnych pałeczek moznaoszczedzajac czas wykonac bezposredni, niestandaryzowany antybiogram, uzy-wajac dodatnich probek jako inoculum. Sterylna wymazowke nalezy zanurzyc wewstrzasnietym podłozu i odsaczajac nadmiar płynu, posiac na podłoze Mueller--Hintona jak w metodzie standardowej (patrz str. 126). Wstepny odczyt moze bycwykonany po 6 – 8 godzinach inkubacji. W 95% przypadkow rezultaty uzyskaneta metoda sa zgodne ze standaryzowanym testem.

Zanieczyszczenia

Zanieczyszczenia hodowli krwi mozna uniknac przez staranne przygotowanieskory i dokładne przestrzeganie procedur aseptycznych w czasie posiewui przesiewow. Jednakze nawet w idealnych warunkach 3 – 5% posiewow krwi jest,,skazonych’’ bakteriami ze skory (S. epidermidis, P. acnes, Clostridium spp.,dyfteroidy) lub ze srodowiska (Acinetobacter spp., Bacillus spp.).

Powyzsze mikroorganizmy moga byc w niektorych sytuacjach patogenne,wywołujac np. zapalenie wsierdzia. Rzeczywista infekcje nalezy podejrzewacw ponizej wymienionych sytuacjach:– jezeli ten sam organizm wyhodowano z dwoch butelek tej samej probki krwi;– jezeli ten sam organizm rosnie w hodowli wiecej niz jednej probki;– jezeli wzrost jest szybki (w ciagu 48 godzin);– jezeli rozne izolaty jednego gatunku wykazuja ten sam biotyp i wzor

lekowrazliwosci.

Wszystkie wyniki hodowli powinny byc przedstawiane lekarzowi łaczniez wynikami probek prawdopodobnie zanieczyszczonych. Jednakze dla tychostatnich nie nalezy wykonywac antybiogramu, a jedynie umiescic na wynikuodpowiedni komentarz, np. Propionibacterium acnes (flora skory), Staphy-lococcus epidermidis (prawdopodobnie zanieczyszczenie). Jest to istotne dlanawiazania dobrej wspołpracy miedzy lekarzami a personelem laboratorium.

35

CZESC I

Identyfikacja dwoch lub wiecej drobnoustrojow z krwi prawdopodobnie wskazujena wieloczynnikowa bakteriemie, ktora moze wystepowac u wyniszczonychpacjentow, ale moze byc rowniez rezultatem skazenia probki. ,,Beztlenowcowa’’bakteriemia czesto wywołana jest przez kilka patogenow, np. w ciezkiej,piorunujacej bakteriemii, zwiazanej z powaznym urazem lub zabiegiem chirur-gicznym na jelicie grubym, wystepuje jeden lub kilka patogenow beztlenowychz jednym lub kilkoma patogenami tlenowymi.

36

Płyn mozgowo-rdzeniowy

Wprowadzenie

Badanie płynu mozgowo-rdzeniowego jest wazne w diagnostyce bakteryjnegoi grzybiczego zapalenia opon mozgowo-rdzeniowych i musi byc traktowane jakobadanie nadrzedne, wymagajace własciwej uwagi personelu laboratoryjnego.

Prawidłowy płyn mozgowo-rdzeniowy jest jałowy i przejrzysty, zwykle zawieratrzy lub mniej leukocytow w 1 mm3, nie zawiera erytrocytow. Jego chemicznyi cytologiczny skład zmienia sie w stanach zapalnych opon mozgowo-rdzenio-wych i mozgu, np. w zapaleniu mozgu (encephalitis) lub opon mozgowo--rdzeniowych (meningitis). W rozdziale omowione zostanie jedynie badaniemikrobiologiczne, choc ocena liczby białych krwinek w płynie mozgowo--rdzeniowym ma takze istotne znaczenie.

Najczestsze, zaleznie od wieku pacjenta, przyczyny zapalenia opon mozgowo--rdzeniowych, zostały wymienione w tabeli 6, nalezy jednak pamietac, zeczynniki te moga wspołistniec.

Pobieranie i transport probek

Podczas wykonywania przez lekarza punkcji ledzwiowej lub komorowej dodwoch sterylnych probowek nalezy pobrac około 5 – 10 ml płynu mozgowo--rdzeniowego. Ze wzgledu na niebezpieczenstwo jatrogennego bakteryjnegozapalenia opon mozgowo-rdzeniowych, konieczna jest dokładna dezynfekcjaskory. Czesc probki płynu mozgowo-rdzeniowego jest przeznaczona do prze-prowadzenia badan biochemicznych i cytologicznych, pozostała objetosc płynuwykorzystuje sie do badan mikrobiologicznych. Poniewaz komorki szybkoulegaja rozpadowi, probka powinna zostac niezwłocznie dostarczona do laborato-rium i opracowana. Kazde opoznienie moze byc przyczyna nieprawidłowej ocenyliczby komorek, nie odzwierciedlajacej klinicznego stanu pacjenta.

Tabela 6. Czeste przyczyny bakteryjnego i grzybiczego zapalenia opon mozgowo--rdzeniowych

U niemowlat (do 2 miesiaca zycia)Escherichia coliInne Enterobacteriaceae: Salmonella spp., Citrobacter spp.Listeria monocytogenesStreptococcus agalactiae (grupa B)

W innych grupach wiekowychHaemophilus influenzae (otoczkowy typ b)a

Neisseria meningitidisStreptococcus pneumoniaeMycobacterium tuberculosisListeria monocytogenes b

Cryptococcus neoformans b

Staphylococcus spp.c

a Rzadko powyzej 5. roku zycia.b U pacjentow z niedoborem odpornosci (łacznie z pacjentami z zespołem nabytegoniedoboru odpornosci — AIDS).c Zwiazane z zabiegami neurochirurgicznymi i drenami pooperacyjnymi.

37

CZESC I

Ocena makroskopowa

Wyglad płynu mozgowo-rdzeniowego powinien byc oceniony i opisany jako:klarowny, mglisty, metny, ropny, zołty (zwiazany z hemoliza lub zołtaczka jaderpodkorowych), z domieszka krwi, z włoknami lub warstwa fibryny.

Badanie mikroskopowe

Przygotowanie probki

Jesli w ocenie makroskopowej stwierdza sie ropny płyn mozgowo-rdzeniowy(bardzo metny), to badanie mozna przeprowadzic bez odwirowania. W pozo-stałych przypadkach płyn mozgowo-rdzeniowy powinien zostac odwirowanyw sterylnej probowce (najlepiej o objetosci 15 ml) w 10 000 g przez 5 – 10 minut.Usunac supernatant, uzywajac sterylnej pipety Pasteura z dopasowanym gumo-wym kapturkiem, i przeniesc do innej probowki do testow biochemicznych i/lubserologicznych. Osad uzyc do wykonania dalszych testow mikrobiologicznych.

Mikroskopia bezposrednia

Do badania mikroskopowego uzyc kropli osadu umieszczonej miedzy szkiełkiempodstawowym i nakrywkowym, oceniajac obecnosc:– leukocytow (wielojadrzaste neutrofile lub limfocyty),– erytrocytow,– bakterii,– grzybow.

Przy podejrzeniu obecnosci drozdzakow Cryptococcus neoformans na szkiełkupodstawowym nalezy zmieszac pobrany eza osad z tuszem chinskim, nakrycszkiełkiem nakrywkowym i ogladac preparat, poszukujac typowych, otocz-kowych, sferycznych form grzybow.

W regionach, w ktorych wystepuje spiaczka afrykanska, konieczne jest uwazneposzukiwanie aktywnego ruchu wyposazonych w witke swidrowcow z rodzajuTrypanosoma.

Wolno zyjace w wodzie ameby (Naegleria fowleri), ktore dostaja sie doosrodkowego układu nerwowego przez nos, wywołuja rzadkie i zazwyczajsmiertelne zapalenie opon mozgowo-rdzeniowych. Moga byc widoczne w prepa-racie bezposrednim w postaci aktywnie poruszajacych sie ogranizmow, wielkos-cia zblizonych do neutrofilow.

Barwienie preparatow metoda Grama

Czynniki wywołujace zapalenie opon mozgowo-rdzeniowych sa czesto widocznew preparatach barwionych metoda Grama, stad badanie to jest bardzo istotne.Preparaty nalezy wysuszyc na powietrzu, utrwalic łagodnie podgrzewajaci wybarwic metoda Grama. Ogladac pod powiekszeniem ×1000 (w immersji)przez co najmniej 10 minut lub do chwili stwierdzenia obecnosci bakterii.W tabeli 7 przedstawiono wazne obserwacje diagnostyczne zwiazane z roznymiformami zapalenia opon mozgowo-rdzeniowych.

38

PŁYN MOZGOWO-RDZENIOWY

Barwienie bakterii kwasoopornych(metoda Ziehl-Neelsena)

Pomimo niskiej czułosci metody, przy podejrzeniu gruzliczego zapalenia oponmozgowo-rdzeniowych, zalecane jest barwienie rozmazu z osadu metoda Ziehl--Neelsena. Barwiony preparat nalezy starannie ogladac przez co najmniej15 minut. Jesli wynik jest ujemny, nastepnego dnia powtorzyc badanie, wykonu-jac nastepny preparat z probki.

Hodowle

Po stwierdzeniu obecnosci bakterii w preparacie barwionym metoda Gramanalezy wykonac posiew na odpowiednie podłoza (tabela 8). Jesli nie wykazanoobecnosci drobnoustrojow, nalezy wykonac posiew na podłoza o szerokimspektrum wzrostu, takie jak agar z krwia z posianym Staphylococcus aureus, ktoryumozliwia wzrost H. influenzae. Płytki zawierajace agar z krwia i agarczekoladowy powinny byc inkubowane w 35°C w powietrzu atmosferycznymwzbogaconym w dwutlenek wegla. Wszystkie podłoza inkubowac przez 3 dnii codziennie obserwowac.

Przy podejrzeniu gruzliczego zapalenia opon mozgowo-rdzeniowych nalezywykonac posiew z osadu na co najmniej 3 podłoza Löwensteina-Jensenai inkubowac przez 6 tygodni. Przez pierwsze 2 – 3 dni probowki powinny bycinkubowane w pozycji poziomej z odkrecona o poł obrotu nakretka. Wzrost

Tabela 7. Cechy płynu mozgowo-rdzeniowego w zapaleniu opon mozgowo-rdzeniowych

Badana cechaTyp zapalenia opon mozgowo-rdzeniowych

Bakteryjne Gruzlicze Grzybicze Wirusowe (,,aseptyczne’’)

Leukocytoza Segmentowe polimor-ficzne neutrofile

Monocyty (młode neu-trofile)

Monocyty Monocyty

Stezenie glukozy Bardzo niskie:0,28 –1,1 mmol/l

Niskie:1,1 –2,2 mmol/l

Niskie:1,1 –2,2 mmol/l

Prawidłowe:3,6 –3,9 mmol/l

Stezenie białka Podwyzszone Podwyzszone Podwyzszone Nieco podwyzszone wewczesnej fazie zakazenia

Preparat barwiony Zwykle widoczne ba-kterie (Gram)

Rzadko dodatni(kwasooporne)

Zwykle dodatni (tuszchinski)

Ujemny

Tabela 8. Wybor podłoza dla płynu mozgowo-rdzeniowego w zaleznosci od wynikow barwienia metoda Gramaa

Obserwacja

Gram-ujemneziaren-kowce

Gram-dodatniepałeczki

Brakmikroor-

ganizmow

Gram-ujemnepałeczki

Gram-dodatnieziarenkowce

Noworodki Inne grupywiekowe Noworodki Inne grupy

wiekowe

Agar z krwiab + + + + zkrazkiem

z optochina

+ + +

Agar z krwia z S. aureusb + + +

Agar czekoladowy (+) (+) (+)

Agar MacConkeya + + + + + + +

Bulion tryptozowo-sojowy + + + + + + +

a + = uzyc; (+) = ewentualnie uzyc.b Inkubacja w atmosferze wzbogaconej CO2 (eksykator).

39

CZESC I

oceniac w cotygodniowych odstepach. Po zaobserwowaniu jakiegokolwiekwzrostu, najlepiej w bakteriologicznie bezpiecznych komorach, nalezy przygoto-wac preparat, wysuszyc, utrwalic ciepłem i wybarwic metoda Ziehl-Neelsena.Obecnosc kwasoopornych pratkow jest rownoznaczna z diagnoza gruzlicy.Wszystkie izolaty powinny zostac przesłane do laboratorium referencyjnegow celu potwierdzenia diagnozy i okreslenia lekowrazliwosci.

Gdy na podstawie barwienia tuszem chinskim lub objawow klinicznych podej-rzewa sie zakazenie Cryptococcus neoformans, nalezy wykonac posiewy z osadudo dwoch probowek z agarem Sabouraud i inkubowac w 35°C do miesiaca.C. neoformans rosnie takze na płytkach zawierajacych agar z krwia, ktore, jesli towskazane, powinny byc inkubowane w 35°C przez tydzien.

Wstepna identyfikacja

Wzrost na agarze MacConkeya sugeruje obecnosc Enterobacteriaceae, ktoranastepnie powinna byc potwierdzona z uzyciem metod i podłozy zalecanych dlapatogenow jelitowych.

Kolonie Gram-dodatnich ziarenkowcow ze strefa brzeznej hemolizy typu β mogawskazywac na obecnosc S. agalactiae (paciorkowce grupy B), ktora powinnazostac potwierdzona w odwrotnym tescie CAMP (str. 117).

Płaskie kolonie z wklesła czescia centralna i niewielka zielona strefa hemolizytypu α to prawdopodobnie S. pneumoniae. Dla potwierdzenia nalezy na agarzez krwia, zawierajacym gesto posiane czyste kolonie badanego szczepu, umiescic6-milimetrowy krazek z optochina. Po całonocnej inkubacji pneumokoki wykaza14-milimetrowa lub wieksza strefe zahamowania wzrostu wokoł krazka. Najlep-sze rezultaty uzyskuje sie po inkubacji na agarze zawierajacym krew baraniaw atmosferze wzbogaconej w dwutlenek wegla. Jesli odczyt pierwszej hodowli naagarze z krwia nie jest jednoznaczny, nalezy przesiac szczep i powtorzyc badanie.

Kolonie H. influenzae rosna tylko na agarze czekoladowym oraz jako koloniesatelitarne w poblizu gronkowcowych posiewow na agarze z krwia. Dalszaidentyfikacja moze byc przeprowadzona w tescie aglutynacji szkiełkowej przyuzyciu surowicy odpornosciowej H. influenzae typ b.

Gram-ujemne dwoinki rosnace na agarze z krwia lub agarze czekoladowym, ktoredaja szybko dodatni test oksydazowy, moga byc uznane za meningokoki.Potwierdzenie i identyfikacja grup serologicznych N. meningitidis (A, B, C) saoparte na odczynie aglutynacji szkiełkowej z uzyciem własciwych surowicodpornosciowych. Ujemny odczyn aglutynacji nie wyklucza meningokokow,poniewaz istnieja co najmniej cztery dodatkowe serogrupy. W tej sytuacji dlaizolowanych szczepow nalezy okreslic zdolnosc do rozkładu weglowodanow,a hodowle przesłac do referencyjnego laboratorium centralnego. Wstepne wynikipowinny byc przedstawiane lekarzowi na kazdym etapie identyfikacji (barwieniemetoda Grama, wzrost, aglutynacja itp.), z komentarzem, ze zostanie przygotowa-ny raport koncowy.

Kolonie Gram-dodatnich pałeczek z brzezna strefa β-hemolizy na agarze z krwiamoga wskazywac na Listeria monocytogenes. Zalecane jest wykonanie na-stepujacych testow potwierdzenia: dodatnia reakcja z katalaza, ruch w podłozupłynnym lub w MIU, wzrost i czarne przebarwienie na agarze z zołcia i eskulina.

40

PŁYN MOZGOWO-RDZENIOWY

Oznaczanie lekowrazliwosci

W przypadku Gram-ujemnych pałeczek i gronkowcow nalezy zastosowacstandardowa metode krazkowa (Kirby-Bauera).

Niepotrzebne jest oznaczanie lekowrazliwosci dla szczepow Listeria mono-cytogenes, S. agalactiae lub N. meningitidis, poniewaz w tej grupie opornosc naampicyline i benzylopenicyline jest wyjatkowo rzadka.Wszystkie szczepy pneu-mokokow powinny miec oznaczona na agarze z krwia wrazliwosc na chloramfeni-kol i benzylopenicyline. W ostatnim przypadku zalecany jest test krazkowyz oksacylina (1 µg) (patrz str. 84, ,,Zakazenia dolnych drog oddechowych’’).

Szczepy H. influenzae powinny miec oznaczona wrazliwosc na chloramfenikol naagarze czekoladowym lub wzbogaconym krwia. Wiekszosc ampicylinoopornychszczepow wytwarza β-laktamazy, ktorych obecnosc mozna wykazac wykonujacszybkie testy rekomendowane do badan skriningowych dla β-laktamazododatnichgonokokow (str. 92).

41

Mocz

Wprowadzenie

Mocz jest materiałem najczesciej pobieranym do badan. Sprawia takze najwiecejproblemow, zwiazanych z własciwym pobraniem, wyborem metod hodowlii interpretacja wynikow. Podobnie jak w przypadku innych materiałow, uzupeł-niajace informacje dostarczone przez lekarza pozwalaja laboratorium na uzys-kanie mozliwie najlepszych wynikow posiewu.

Najczestsza lokalizacja zakazen układu moczowego jest pecherz moczowy(cystitis) i cewka moczowa. Stad infekcja droga wstepujaca moze dotrzec domoczowodow (ureteritis), a nastepnie objac nerke (pyelonephritis). Kobiety sabardziej predysponowane do zakazen układu moczowego niz mezczyzni, trud-niejsze w ich przypadku jest takze prawidłowe pobranie probki moczu.

Zarowno u kobiet, jak i mezczyzn zakazenie układu moczowego moze przebiegacbezobjawowo, ostro lub przewlekle. Bezobjawowe infekcje moga byc zdiag-nozowane przez posiew. Ostre zakazenie obserwowane jest czesciej u kobiet(w roznym wieku); pacjenci zwykle leczeni sa ambulatoryjnie i rzadko pod-dawani hospitalizacji. Przewlekłe zakazenie u mezczyzn, podobnie jak i u kobietw kazdym wieku, zwykle skojarzone jest z choroba podstawowa (np.: odmied-niczkowe zapalenie nerek, choroba prostaty, wady wrodzone układu moczowo--płciowego) i wiaze sie z czestsza hospitalizacja. Bezobjawowe, ostre i przewlekłezakazenia układu moczowego to trzy rozne jednostki chorobowe, dlatego wynikibadan laboratoryjnych czesto wymagaja roznej interpretacji.

Bezobjawowe odmiedniczkowe zapalenie nerek u kobiet moze pozostac nieroz-poznane, czesto diagnozowane jest dopiero po wykonaniu dokładnego ilos-ciowego badania mikrobiologicznego moczu. Wystepujace powszechnie prze-wlekłe zapalenie prostaty czesto jest przyczyna nawracajacych zakazen układumoczowego.

Niezaleznie od typu najczestszym czynnikiem etiologicznym zakazenia układumoczowego sa bakterie jelitowe, w tym izolowana znacznie czesciej niz innepatogeny Escherichia coli. U około 10% pacjentow moga byc obecne dwapatogeny jednoczesnie odpowiedzialne za proces chorobowy. Obecnosc trzechi wiecej roznych drobnoustrojow w posiewie moczu zdecydowanie wskazuje naniewłasciwe pobranie materiału do badania lub zanieczyszczenie probki. Obec-nosc licznych patogenow obserwowana jest u pacjentow z załozonym na stałecewnikiem moczowym.

Pobieranie materiału do badania

W badaniu mikrobiologicznym moczu trudno przecenic znaczenie prawidłowegopobrania probek moczu, transportu do laboratorium oraz badania wstepnegoi posiewu. Laboratorium jest odpowiedzialne za dostarczenie lekarzowi steryl-nych, szklanych lub plastikowych kubkow, słoikow czy innych odpowiednichpojemnikow o szerokim wlocie. Powinny one zostac wysterylizowane goracymsuchym powietrzem w autoklawie, nastepnie szczelnie zamkniete, a wieczkaprzykryte folia aluminiowa.

42

MOCZ

Probka moczu moze zostac pobrana z wykorzystaniem metod chirurgicznych, np.:przez nakłucie nadłonowe pecherza moczowego, cystoskopie lub cewnikowanie.W innym przypadku laboratorium powinno dopilnowac, aby mocz został pobranyze srodkowego strumienia po dokładnym umyciu okolicy cewki moczowej,zwłaszcza u kobiet i dzieci. Poniewaz mocz sam jest dobra pozywka dladrobnoustrojow, posiew powinien zostac wykonany w ciagu 2 godzin od pobranialub przechowywany w chłodziarce w 4°C do czasu dostarczenia do laboratoriumi posiany nie pozniej niz 18 godzin od pobrania.

Jesli to mozliwe, do posiewu nalezy uzyc moczu pobranego rano. Zaleca siepoprosic pacjenta w przeddzien wieczorem o powstrzymanie sie od oddaniamoczu do chwili pobrania probki.

Pacjentki powinny:

1. Umyc dokładnie rece woda z mydłem i wytrzec w czysty recznik.2. Rozchylic wargi sromowe, łechtaczke i wargi sromowe przemyc starannie

sterylnym płatkiem gazy i ciepła woda z mydłem, w kierunku od przodu dotyłu. Nie powinno sie uzywac srodkow do dezynfekcji.

3. Spłukac dokładnie łechtaczke i wargi sromowe ciepła woda i osuszycsterylnym płatkiem gazy. Podczas tej czynnosci wargi sromowe powinnypozostawac rozchylone, pacjentka nie powinna dotykac umytej powierzchnipalcami.

4. Oddac niewielka ilosc moczu. Nastepnie zebrac wiekszosc pozostałego moczudo sterylnego pojemnika, zamykajac pokrywke zaraz po pobraniu probki. Jestto probka ze srodkowego strumienia moczu.

5. Zaniesc do pielegniarek zamkniety pojemnik, ktory powinien zostac nie-zwłocznie dostarczony do laboratorium.

Pacjenci powinni:

1. Umyc dokładnie rece woda z mydłem i wytrzec w czysty recznik.2. Odsunac napletek (jesli pacjent nie jest obrzezany) i umyc zoładz sterylnym

płatkiem gazy i ciepła woda z mydłem. Nie powinno sie uzywac srodkow dodezynfekcji.

3. Spłukac dokładnie zoładz ciepła woda i osuszyc sterylnym płatkiem gazy.Podczas tej czynnosci pacjent nie powinien dotykac palcami umytej powierz-chni.

4. Nasunac napletek i oddac niewielka ilosc moczu. Trzymajac nasunietynapletek pacjent powinien zebrac wiekszosc pozostałego moczu do sterylnegopojemnika, zamykajac pokrywke zaraz po pobraniu. Jest to probka zesrodkowego strumienia moczu.

5. Zaniesc do pielegniarek zamkniety pojemnik, ktory powinien zostac nie-zwłocznie dostarczony do laboratorium.

Dla pacjentow lezacych obowiazuje ta sama procedura, z wyjatkiem koniecznosciskorzystania z pomocy pielegniarki lub, jesli to konieczne, wykonania przez niacałej procedury przygotowania pacjenta przed oddaniem moczu.

W obydwu sytuacjach powinny zostac podjete starania, aby własciwie pobracmocz do sterylnego pojemnika oraz aby niezwłocznie przesłac do laboratoriumprobke wraz z informacjami o pacjencie, rozpoznaniem klinicznym, z za-chowaniem wymaganych procedur.

43

CZESC I

Niemowleta i dzieci

Uzyskanie własciwie pobranej probki moczu w przypadku chorych lezacychi nie wspołpracujacych niemowlat oraz dzieci moze stanowic problem.Nalezy podac dziecku wode lub inny napoj do wypicia. Umyc narzady płcio-we zewnetrzne. Dziecko mozna posadzic na kolanach matki, pielegniarkilub innej osoby z personelu medycznego, ktora powinna zachecic dziecko dooddania jak najwiekszej ilosci moczu do sterylnego pojemnika. Pojemnik nalezyzamknac i dostarczyc do laboratorium, gdzie niezwłocznie podjeta zostaniediagnostyka.

Hodowla i interpretacja

Wszystkie probki moczu dostarczone do laboratorium medycznego powinny bycod razu posiane lub umieszczone w chłodziarce w 4°C do momentu wykonaniabadania. Procedura badania obejmuje nastepujace etapy:1. Barwienie preparatow metoda Grama.2. Testy przesiewowe w kierunku znamiennej bakteriurii.3. Hodowle probek moczu, w ktorych wykazano obecnosc drobnoustrojow

w badaniach przesiewowych i wszystkich probek uzyskanych podczascystoskopii, przez nakłucie nadłonowe (suprapubic bladder puncture — SBP)i cewnikowanie.

4. Badanie lekowrazliwosci izolatow bakteryjnych o znaczeniu klinicznym.

Przygotowanie preparatow i barwienie metoda Grama jest waznym elementemdiagnostyki laboratoryjnej. Uzywajac sterylnej pipety Pasteura (jedna dla jednejprobki) nalezy naniesc na szkiełko krople wstrzasnietego, nie odwirowanegomoczu. Pozostawic krople do wyschniecia, bez rozmazywania, utrwalic przezpodgrzanie i wybarwic. Ogladac uzywajac olejku immersyjnego (w powiekszeniu× 600 lub wiecej) — poszukiwac bakterii, polimorficznych leukocytow i komorekpłaskonabłonkowych.

Jedna lub wiecej komorek bakteryjnych w polu widzenia w olejku immersyjnymzwykle wskazuje na obecnosc 105 lub wiecej bakterii w mililitrze probki.Obecnosc jednego lub wiecej leukocytow w polu widzenia w olejku immersyjnymjest kolejna wskazowka zakazenia układu moczowego. W niezakazonych prob-kach moczu bakterie i leukocyty wystepuja w niewielkiej liczbie lub nie stwierdzasie ich wcale. W probkach pochodzacych od pacjentek wykazanie licznychkomorek płaskonabłonkowych, bez lub z obecnoscia bakterii, wskazuje nazanieczyszczenie flora pochwowa i koniecznosc powtornego badania z ocenaliczby bakterii w polu widzenia. Jesli konieczny jest szybki wynik badania,lekarzowi powinna byc dostarczona wstepna ocena barwionych preparatowz informacja o prowadzonej hodowli.

Metody badan przesiewowych

Brak leukocytow i bakterii w preparatach moczu barwionych metoda Grama,pochodzacych z probek pobranych według powyzej opisanych zasad, wykluczainfekcje. ,,Ujemna’’ probka moczu w starannie wykonanym badaniu mikro-skopowym nie musi byc poddana hodowli. Alternatywnym prostym i skutecznymtestem przesiewowym jest test paskowy na obecnosc esterazy leukocytowej

44

MOCZ

(redukcji azotanow). Paski zanurza sie w probce moczu zgodnie z instrukcjazawarta w ulotce. Rozowe zabarwienie jest dodatnim wynikiem i wskazuje naobecnosc esterazy leukocytowej i/lub bakteriurie rzedu 105 w 1 ml. Probkidodatnie w testach przesiewowych nalezy jak najszybciej poddac hodowli, abyzapobiec przerostowi przez nieznaczace szczepy. Jesli paski nie wykaza rozowe-go zabarwienia, badanie przesiewowe interpretowane jest jako ujemne i hodowlanie jest konieczna. Testy paskowe nie sa wystarczajaco czułe, aby wykrycbakteriurie mniejsza niz 105 komorek w 1 ml moczu.

Posiew ilosciowy i wstepna identyfikacjaZalecane sa dwie metody posiewu ilosciowego i wstepnej identyfikacji: metodaz uzyciem kalibrowanej ezy oraz metoda z uzyciem zanurzonego papierowegofiltra paskowego.

Metoda z uzyciem kalibrowanej ezy

Zalecane jest uzycie kalibrowanej plastikowej lub platynowej ezy, za pomocaktorej nalezy przeniesc 1 µl moczu na podłoze do hodowli (agar MacConkeyaz fioletem krystalicznym i nieselektywny agar z krwia).

1. Wstrzasnac delikatnie mocz, a nastepnie przechylic i 1-mikrolitrowa ezadotknac powierzchni w taki sposob, aby zawiesic w niej płyn. Nigdy niezanurzac oczka ezy w moczu.

2. Umiescic 1 µl moczu na podłozu agarowym z krwia i rozmazac, tworzac prostalinie do srodka płytki (1), nastepnie gestym zygzakiem, pod katem w prawo,przez poczatkowa linie (2) i na koniec skosnym zygzakiem, przecinajacymdwa poprzednie pasma (3) (ryc. 3).

3. Posiac na podłoze MacConkeya w ten sam sposob.4. Inkubowac płytki przez noc w 35°C.

Agar z krwia i podłoze MacConkeya mozna zastapic innymi nieselektwnymipodłozami (np.: CLED1, agar z fioletem krystalicznym i laktoza).

Metoda paskow bibułowych

Metoda paskow bibułowych Leigh&Williams2 polega na absorpcji okreslonejilosci moczu, ktory nastepnie jest przenoszony na płytke z własciwym podłozemagarowym.

Paski o długosci 7,5 cm i szerokosci 0,6 cm moga byc przygotowane na miejscuz uzyciem specjalnego typu bibuły (patrz ryc. 4). Sa oznaczone ołowkiem z jednejstrony — 1,2 cm od konca. Metoda paskow bibułowych przed wprowadzeniem dorutynowych badan powinna zostac porownana z metoda z uzyciem kalibrowanejezy.

Bibułowe paski nalezy przygotowac w odpowiedniej ilosci, umiescic wewłasciwym pojemniku i autoklawowac. Sterylne paski sa komercyjnie dostepne.

1 CLED: z niedoborem cystyny, laktozy i elektrolitow; Cystine-Lactose-Electrolyte Deficient.2 Leigh D.A., Williams J.D.: Metoda wykorzystywana do oznaczenia znamiennej bakteriuriiw szerokiej grupie pacjentow. Journal of Clinical Pathology, 1964, 17: 498 – 503.

45

CZESC I

Dla kazdej badanej probki moczu wyjac z pojemnika sterylny pasek. Oznaczonykoniec zanurzyc do wyznaczonej linii w dokładnie wstrzasnietej probce moczu.Pasek natychmiast wyciagnac, nadmiar moczu zostanie wchłoniety.

Obszar ponizej oznaczenia, ktory zagina sie na kształt litery ,,L’’, nalezy umiescicna 2 – 3 sekundy na płytce z agarem brolacynowym1 lub agarze z fioletemkrystalicznym i laktoza. Na jednej płytce mozna posiac kilka paskow, dzielacpowierzchnie na maksymalnie 16 prostokatow (ryc. 5). Nalezy zapewnic moz-liwosc identyfikacji kazdego prostokata na podstawie numeru lub nazwiskapacjenta. Wyciagnac drugi pasek z pojemnika i dokładnie powtorzyc procedure,wykonujac kolejne odciski identycznie jak pierwsze. Po naniesieniu duplikatu

1 Agar laktozowo-cystynowy z błekitem bromotymolowym.

Ryc. 3. Posiew bakterii na płytki hodowlane.

1,2 cm 0,6 cm

6,3 cmWHO 91125

Ryc. 4. Bibułowy pasek stosowany w metodzie Leigh & Williamsa.

CFU — colony-forming units (jednostki tworzace kolonie)

Ryc. 5. Odciski zanurzonych w moczu bibułowych paskow na płytce agarowej i przeliczenieliczby kolonii na liczbe zywych komorek bakterii w 1 ml.

46

MOCZ

odciskow płytke inkubowac w 35 – 37°C, a nastepnie zliczyc wyrosłekolonie z powierzchni kazdego odcisku paska. Posługujac sie ryc. 5, na podstawiesredniej liczby kolonii kazdej pary paskow, mozna okreslic liczbe bakterii w 1 mlmoczu.

Natychmiast po wykonaniu powyzszej procedury, uzywajac sterylnej ezy, posiacprobki moczu na poł płytki agaru MacConkeya (z fioletem krystalicznym).Hodowla na agarze z krwia ułatwia szybka identyfikacje Gram-dodatnichziarenkowcow. Płytki nalezy inkubowac przez noc w temperaturze 35 – 37°Ci nastepnego dnia ocenic wzrost. Do identyfikacji uzyc izolowanych koloniio podobnym wygladzie. Jesli istnieje taka potrzeba, inoculum konieczne dooznaczenia lekowrazliwosci szczepu metoda dyfuzyjno-krazkowa mozna przygo-towac z kazdej z płytek (str. 112). W ten sposob nastepnego dnia dostepne bedazarowno wyniki identyfikacji, jak i lekowrazliwosci.

Interpretacja wynikow posiewu ilosciowegomoczuPrzez wiele lat warunkiem rozpoznania zakazenia układu moczowego byłowykazanie obecnosci co najmniej 105 jednostek tworzacych kolonie (CFU— colony-forming units) w 1 ml odpowiednio pobranego moczu ze srodkowegostrumienia. Załozenie to zostało zakwestionowane; według niektorych ekspertowobecnosc 104 CFU lub mniej moze swiadczyc o infekcji. Inni twierdza, zeobecnosc polimorficznych leukocytow odgrywa istotna role w patologii i klinicz-nej manifestacji zakazenia układu moczowego. Nie mozna zdefiniowac precyzyj-nie minimalnej liczby bakterii w 1 ml moczu, ktora jednoznacznie swiadczyo ZUM. Ogolne zasady sporzadzania raportow przedstawiono ponizej.

Kategoria 1: mniej niz 104 CFU w 1 ml. W raporcie prawdopodobnie brakZUM. (Wyjatki: jesli mniej niz 104 CFU w 1 ml moczu pobra-nego bezposrednio z pecherza moczowego przez nakłucie nad-łonowe lub cystoskopie; u kobiet z objawami zakazenia lubleukocyturia nalezy przeprowadzic identyfikacje i wykonac anty-biogram.)

Kategoria 2: 104 – 105 CFU w 1 ml. Jesli pacjent bez objawow, powtorzycbadanie moczu. Jesli pacjent zgłasza objawy zakazenia układumoczowego, przeprowadzic identyfikacje i wykonac antybiogramjednego lub dwu roznych obecnych w moczu typow koloniibakteryjnych. Powyzsza liczba bakterii przemawia za zakazeniemukładu moczowego u pacjentow z objawami lub z leukocyturia.Jesli liczba bakterii, jakosc probki moczu lub charakter zgłasza-nych objawow wzbudzaja watpliwosci, nalezy powtorzyc badanie.Raport powinien zawierac wartosc CFU.

Kategoria 3: wiecej niz 105 CFU w 1 ml. Przedstawic wynik lekarzowi,przeprowadzic identyfikacje i wykonac antybiogram jednego lubdwu roznych obecnych w moczu typow kolonii bakteryjnych.Powyzsza liczba bakterii zdecydowanie wskazuje na zakazenieukładu moczowego u wszystkich pacjentow, rowniez u kobiet bezobjawow zakazenia.

Jesli w probkach moczu kategorii 2 lub 3 obecne sa wiecej niz dwa rozne typybakterii, nalezy przedstawic wynik jako: ,,Prawdopodobnie materiał zanieczysz-czony. Prosze dostarczyc swieza probke moczu ze srodkowego strumienia’’.

47

CZESC I

Identyfikacja

Identyfikacja powinna zostac przeprowadzona mozliwie najszybciej. Jesli masy-wna infekcja drog moczowych wywołana jest przez E. coli, do identyfikacjiczerwonych kolonii na podłozu agarowym MacConkeya nalezy uzyc szybkiegotestu.

Test ββ-glukuronidazowy do szybkiej identyfikacjiE. coli 1

Test okresla zdolnosc drobnoustroju do wytwarzania enzymu β-glukuronidazy.Enzym hydrolizuje kwas 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowy (PGUA),produkt reakcji kwasu glukuronowego i p-nitrofenolu. Pojawienie sie zołtegozabarwienia wskazuje na reakcje dodatnia.

Procedura

1. Przygotowac gesta mleczna zawiesine bakterii w małej probowce zawierajacej0,25 ml fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinna zostac przygotowa-na z kolonii rosnacych na podłozu agarowym MacConkeya.

2. Rozpuscic 300 mg kwasu 4-nitrofenylo-β-D-glukopyranozydouronowego(PGUA) i 100 mg wyciagu drozdzy (Oxoid L21)2 w 20 ml buforu fos-foranowego (bufor Tris, pH 8,5). Uzyskac pH 8,5 ± 0,1. Dodac 0,25 ml podłozado kazdej z przygotowanych sterylnych probowek. Zamknac probowki.Oznaczyc probowki jako PGUA i wpisac date.

3. Zawiesic w jednej z probowek z PGUA badana gesta zawiesine bakterii.Inkubowac probowke przez 4 godziny w 35°C. Pojawienie sie zołtegozabarwienia wskazuje na obecnosc β-glukuronidazy (wynik dodatni); jesli niepojawia sie zmiana zabarwienia, wynik jest ujemny. Obecnosc zołtegopigmentowania wskazuje na brak wiarygodnosci testu; w takich przypadkachtest nalezy powtorzyc.

Szczepy kontrolne:Escherichia coli dodatni (zołty) wynikShigella flexneri ujemny (bezbarwny) wynik

Tabletki PGUA sa dostepne komercyjnie.

Oznaczanie lekowrazliwosci

Antybiogram (str. 112) powinien byc wykonany tylko dla istotnych, wedługprzedstawionych powyzej kryteriow, czystych hodowli zawierajacych kolonieo jednakowej morfologii. Oznaczanie wrazliwosci ma zazwyczaj wiekszeznaczenie dla pacjentow hospitalizowanych lub z nawracajacymi zakazeniamidrog moczowych w wywiadzie. Szczepy uzyskane w posiewach od pacjentaz ZUM wystepujacym po raz pierwszy moga nie wymagac wykonania antybio-gramu.

1 Kilian M., Borrow P.: Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. 1. Detection of bacterial glycosidases.Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, Section B, 1976, 84: 245 – 251.2 Dostepny z Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, England.

48

Kał

Wprowadzenie

Zakazenia bakteriami jelitowymi, wywołujacymi biegunke, czerwonke i goraczkijelitowe, stanowia wazny problem zdrowotny na swiecie. Infekcje biegunkowe sadruga po chorobach sercowo-naczyniowych, a wsrod dzieci najczestsza przy-czyna zgonu. W krajach rozwijajacych sie z powodu biegunek rocznie umiera1,5 miliona dzieci w wieku od 1 roku do 4 lat. Ryzyko zgonu w tej grupiewiekowej jest 600-krotnie wyzsze niz w krajach rozwinietych. W niektorychkrajach rozwijajacych sie biegunki wystepuja u dzieci dziesiec lub wiecej razyw ciagu roku.

Dzieci ulegajac zakazeniom licznymi patogenami, czesto bez wystapieniabiegunki, wydalaja z kałem potencjalnie chorobotworcze szczepy. Prowadzoneobserwacje wykazały, ze aktywna immunizacja przez wielokrotna ekspozycjeoraz przedłuzony okres karmienia piersia moga zapobiegac zachorowaniomi zabezpieczac przed wystapieniem biegunek. Na uwage zasługuja trudnosciw ustaleniu czynnika etiologicznego biegunki w hodowli z pojedynczej probkikału.

Ze wzgledu na wzrost czestosci zakazen HIV/AIDS i stosowanie chemioterapiiimmunosupresyjnej, biegunka pojawiajaca sie u pacjentow z niedoborem odpor-nosci stanowi coraz powazniejsze wyzwanie. Zakazenia te wystepuja w pozniej-szym okresie choroby, chorzy z HIV/AIDS sa czesto leczeni do konca zycia,a uzyskanie poprawy jest trudne. Lista bakterii jelitowych wywołujacychbiegunke u pacjentow z HIV/AIDS jest długa i obejmuje: Campylobacter,Salmonella, Shigella oraz mykobakterie. Ocenia sie, ze salmonelozy u pacjentowz HIV/AIDS, w porownaniu do osob niezakazonych, wystepuja 20-krotnieczesciej, a 5-krotnie czesciej dochodzi u nich do bakteriemii. W Zairze 40%pacjentow z HIV/AIDS zgłaszało przewlekła biegunke, a u 84% pacjentowz biegunka utrzymujaca sie dłuzej niz miesiac wykryto zakazenie HIV.

Czynniki etiologiczne i objawy kliniczne

Rodzaj Salmonella obejmuje ponad 2000 serotypow. Wiele z nich mozewywoływac infekcje zarowno u ludzi, jak i u zwierzat domowych. U ludzizakazenie prowadzi do rozwoju niezytu zoładka i jelit, duru brzusznegoi bakteriemii z zajeciem lub bez zajecia innych narzadow. Niezyt zoładka i jelitwywołany przez Salmonella zaczyna sie zwykle nudnosciami, wymiotami,kolkowym bolem brzucha i biegunka 8 – 48 godzin od spozycia skazonegopokarmu. Bez leczenia objawy utrzymuja sie zazwyczaj 3 – 5 dni. Leczenieprzeciwbakteryjne nie przyspiesza ustapienia objawow klinicznych, a mozeprzedłuzyc okres rekonwalescencji i bezobjawowego stanu nosicielstwa. W nie-powikłanych przypadkach zakazen wykonanie antybiogramu i leczenie przeciw-bakteryjne nie sa zalecane. Zastosowanie antybiotykow jest wskazane w przypad-ku wystapienia bakteriemii. Niektorzy pacjenci stajac sie bezobjawowyminosicielami Salmonella spp. moga wydalac bakterie z kałem i moczem przez roklub dłuzej. Dodatnie posiewy z kału uzyskuje sie przez okres dłuzszy niz roku około 3% pacjentow z durem brzusznym i u 0,2 – 0,6% pacjentow z zakazenieminnym serotypem Salmonella.

49

CZESC I

Zakazenie Shigella spp. moze przebiegac w rozny sposob: od bezobjawowychinfekcji przez biegunke bez goraczki do czerwonki o ciezkim przebiegu. Objawyobejmuja kolkowe bole brzucha, nieefektywne i bolesne parcie (tenesmus) orazczeste oddawanie małej objetosci podbarwionych krwia stolcow. Shigella spp. jestgłowna przyczyna czerwonki bakteryjnej, przed enteroinwazyjnymi i entero-krwotocznymi E. coli. Wiele przypadkow choroby o srednim nasileniu niewymaga leczenia przyczynowego. Jednakze w ciezkich zakazeniach lub gdyistnieje ryzyko rozwoju wtornego rozsiewu w organizmie, wskazane jestzastosowanie antybiotykoterapii po wczesniejszym okresleniu lekowrazliwosci,koniecznym ze wzgledu na duza w wielu krajach opornosc na powszechniestosowane antybiotyki. Znane sa cztery grupy Shigella, obejmujace 39 serotypowi podtypow. Grupa A (S. dysenteriae), grupa B (S. flexneri), obejmujaca liczneserotypy grupa C (S. boydii) oraz grupa D (S. sonnei), do ktorej nalezy tylko jedenserotyp. Najczesciej izolowanymi gatunkami Shigella w krajach rozwijajacych siesa S. dysenteriae i S. flexneri, podczas gdy w krajach rozwinietych wystepujegłownie S. sonnei.

Zidentyfikowano co najmniej szesc roznych klas Escherichia coli wywołujacychbiegunki: enteropatogenne E. coli (EPEC), enterotoksyczne E. coli (ETEC),enterokrwotoczne i produkujace werotoksyne E. coli (EHEC lub VTEC),enteroinwazyjne E. coli (EIEC), enteroadhezyjne E. coli (EAEC) oraz enteroag-regacyjne E. coli (EAggEC). Cztery z powyzszych klas sa czesta przyczynachorob biegunkowych w krajach rozwijajacych sie. Jednakze identyfikacjaszczepow wymaga przeprowadzenia testow serologicznych, testow toksycznoscina hodowlach komorkowych, oceny patogenicznosci na zwierzetach oraz za-stosowania sond genetycznych, ktore pozostaja poza zakresem mozliwoscilaboratorium sredniego stopnia referencyjnosci. Wstepna identyfikacja najczes-ciej wystepujacego serotypu O157:H7 szczepow VTEC mozliwa jest na pod-stawie charakterystycznie ujemnego testu z sorbitolem. Test ten jednak jestujemny takze w przypadku E. fergusonii i E. hermanii. Sorbitoloujemne szczepyE. coli wymagaja wiec dodatkowej identyfikacji przez serotypowanie z uzyciemsurowicy odpornosciowej E. coli O157. Wykazanie wytwarzania werotoksynywskazuje na szczep VTEC.

Cholera jest typowym przykładem toksycznej infekcji. Wszystkie objawy sazwiazane z utrata płynow, spowodowana działaniem wytwarzanej w jelitachenterotoksyny Vibrio cholerae. Stolec jest obfity, wodnisty i nie zawiera komorekzapalnych. Głownym celem leczenia jest uzupełnianie utraty płynow, a leczenieprzeciwbakteryjne ma znaczenie jedynie drugoplanowe.

V. cholerae rozprzestrzenia sie bardzo szybko. Na podstawie roznic w antygenachsomatycznych O wyroznia sie kilka serotypow, a serotyp O1 wystepuje w dwochodmianach, okreslanych jako ,,klasyczna’’ i ,,El Tor’’. Do 1992 roku uwazano, zetylko serotyp O1 V. cholerae (klasyczny lub El Tor) moze wywołac epidemiecholery, a pozostałe serogrupy odpowiedzialne sa za sporadyczne przypadkicholery i zakazenia pozajelitowe. W 1992 roku na wschodnim wybrzezu Indiiwybuchła epidemia, ktora szybko rozprzestrzeniła sie na sasiednie kraje. Taepidemia była wywołana V. cholerae nalezacym do wczesniej nieznanejserogrupy O139 Bengal. V. cholerae O139 izolowano dotychczas w 10 krajachpołudniowo-wschodniej Azji, ale serotyp ten wydaje sie zanikac.

V. parahaemolyticus i kilka innych gatunkow Vibrio (V. fluvialis, V. hollisae,V. mimicus) i Aeromonas (A. hydrophila, A. sobria, A. caviae) wywołuja zatruciapokarmowe lub niezyty zoładkowo-jelitowe u osob spozywajacych surowe lubniedogotowane owoce morza.

50

KAŁ

W wiekszosci regionow swiata Campylobacter jejuni i C. coli okazały siegłownymi patogenami jelitowymi, ktore sa izolowane rownie czesto jak Sal-monella i Shigella spp. Badania przeprowadzone wsrod dzieci w Afryce i Azjiwykazały, ze czestosc zakazen wynosi od 19 do 38%, a bezobjawowe nosicielstwodotyczy od 9 do 40% badanych. Choroba moze miec rozny przebieg, odsamoograniczajacego sie, krotkotrwałego zapalenia jelita cienkiego po piorunuja-ce zapalenie jelita cienkiego i okreznicy, z ciezka biegunka, kolka brzuszna,goraczka i bolami miesniowymi. Stolce sa poczatkowo sluzowe i płynne,a nastepnie moga zmienic sie w chlustajace, wodniste, zawierajace krew i rope.Objawy wycofuja sie zwykle po tygodniu.

U około 25% pacjentow dochodzi do nawrotu, ktory zwykle ma łagodniejszyprzebieg. Infekcja ustepuje zazwyczaj samoistnie, bez antybiotykoterapii, stadokreslanie lekowrazliwosci izolowanych szczepow nie jest konieczne.

Arcobacter butzleri, traktowane dotychczas jako rosnace w niskiej temperaturzeCampylobacter, zostały ostatnio uznane za przyczyne biegunek wystepujacychu dzieci w krajach rozwijajacych sie.

Wystepowanie u ludzi infekcji wywołanych Yersinia enterocolitica obserwowanogłownie w połnocnej Europie, Japonii i Stanach Zjednoczonych. Wiekszoscizolowanych patogenow pochodziła od dzieci ze sporadycznie wystepujacabiegunka.

Clostridium difficile jest głowna przyczyna biegunki poantybiotykowej. Mozewywołac rozne postacie choroby, od srednio nasilonej biegunki do potencjalniesmiertelnego pseudobłoniastego zapalenia okreznicy. Rozpoznanie rzekomobłoniastego colitis jest mozliwe na podstawie badania kolonoskopowego, a po-twierdzenie laboratoryjne w tym przypadku nie jest konieczne. W diagnostycelaboratoryjnej dostepne sa komercyjne testy, w tym hodowla, test aglutynacjilateksowej wykrywajacy białka komorkowe, testy ELISA wykrywajace cytotok-syny i/lub enterotoksyny, hodowle komorkowe do oceny toksycznosci cytotok-syn. Wielu pacjentow szpitalnych, zwłaszcza leczonych antybiotykami o szero-kim spektrum działania, wydala bakterie z kałem przy braku objawow. Dlatego tezhodowla bez wykazania obecnosci toksyn ma ograniczona wartosc diagnostyczna.

Rotawirusy sa jedynym niebakteryjnym czynnikiem opisanym w tym miejscu.Inne wirusy moga takze byc przyczyna biegunek, ale rotawirus wystepujepodobnie czesto zarowno w krajach rozwijajacych sie, jak i w krajach roz-winietych. Infekcje zwykle pojawiaja sie u dzieci miedzy 6. a 18. miesiacemzycia, czesciej w chłodnych miesiacach roku. Rozpoznanie moze byc potwier-dzone laboratoryjnie na podstawie testu immunoenzymatycznego (ELISA) lubprostszego i bardziej praktycznego testu aglutynacji lateksowej. Odczynnikipotrzebne do wykonania powyzszych badan sa komercyjnie dostepne, lecz drogie.

Własciwe ukierunkowanie diagnostykilaboratoryjnej

Laboratorium scisle wspołpracujace ze szpitalem lub klinika w krajach roz-wijajacych sie moze szybko zostac obciazone nadmierna liczba probek do badan.W wiekszosci przypadkow czerwonki bakteryjnej i biegunek wykonanie posiewunie jest konieczne do podjecia efektywnego leczenia, poniewaz pacjenci wymaga-ja jedynie nawodnienia, a nie antybiotykoterapii. W niektorych przypadkach (np.

51

CZESC I

pacjenci z durem brzusznym) do podjecia własciwego leczenia wyniki hodowli saniezbedne. Problem, jak najlepiej wykorzystac ograniczone mozliwosci (diagnos-tyki laboratoryjnej — przyp. tłum.) jest wciaz rozwazany.

Czesto najwazniejsze staja sie aspekty zdrowia publicznego, stad laboratoriumjest zobligowane do dostarczania danych dotyczacych powszechnie wystepuja-cych w danym regionie patogenow i ich wrazliwosci na antybiotyki, a takzepowinno uczestniczyc w badaniu epidemiologicznym. Konieczna jest scisławspołpraca klinicystow z laboratorium. Utworzenie przez laboratorium wartos-ciowej bazy danych jest mozliwe na podstawie systematycznie przeprowadza-nych, randomizowanych badan, szpitalnych lub klinicznych pacjentow z biegun-ka. Badanie proporcjonalnej czesci pacjentow umozliwia ograniczenie liczbyprobek, z jednoczesna pełna diagnostyka kazdej z nich. Jesli badania wykonuje sieu okreslonych, pojedynczych chorych (np. u co dwudziestego piatego), wynikimozna wykorzystac do oszacowania czestosci wystepowania infekcji w całejpopulacji pacjentow. W szczegolnych grupach pacjentow lub o szczegolnej porzeroku, w sytuacji pojawienia sie typowego zespołu objawow, laboratorium mozeukierunkowac diagnostyke na okreslony problem.

Laboratorium podejmuje decyzje o ewentualnym ograniczeniu diagnostyki dopewnych patogenow jelitowych. Yersinia enterocolitica wystepuje wyjatkoworzadko w regionach tropikalnych. Jesli nie obserwuje sie wystepowania okres-lonego patogenu w danym regionie, laboratorium moze zrezygnowac z wykony-wania wykrywajacych go testow. W wyniku laboratorium powinno uwzglednicfakt wykrywania tylko okreslonych patogenow. Jesli wykonywane sa badaniajedynie w kierunku Salmonnella i Shigella, w wyniku nie mozna napisac ,,brakpatogenow’’. Nalezy umiescic informacje: ,,nie wykazano obecnosci Salmonellai Shigella spp.’’

Pobieranie i przesyłanie probek kału

Probki powinny byc pobierane we wczesnym okresie biegunki, poniewaz w tymczasie liczba patogenow w kale jest najwyzsza, oraz, jesli to mozliwe, przedrozpoczeciem ewentualnej antybiotykoterapii. Probke nalezy pobrac rano i do-starczyc ja do laboratorium do południa, tak by mozna było wykonac badanie tegosamego dnia. Uformowany stolec nalezy odrzucic. Najlepszym materiałem dobadan jest swiezy kał. Jezeli jednak pobranie kału nie jest mozliwe lub gdytransport materiału do laboratorium jest zbyt długi, mozna pobrac wymazz odbytu.

Procedura pobierania kału do badania

Przygotowac dla pacjenta dwie drewniane szpatułki i odpowiedniej wielkoscipojemnik ze szczelnym zamknieciem (np.: czysty szklany kubek, plastikowe lubpokryte warstwa wosku tekturowe pudełko, specjalny pojemnik z łopatkaprzymocowana do wieczka). Nie wolno uzywac butelek po lekach.

Poinstruowac pacjenta, aby oddał stolec na papier toaletowy lub do basenu,a nastepnie przeniosł czesc do pojemnika za pomoca szpatułek.

Probka powinna zawierac co najmniej 5 g stolca i fragmenty z widoczna krwia,sluzem lub ropa, jesli sa obecne w kale. Materiał nie powinien byc zanieczysz-czony moczem. Po umieszczeniu probki pojemnik szczelnie zamknac.

52

KAŁ

Pacjenta nalezy poinformowac, aby dostarczył materiał do badania natychmiastpo pobraniu. Jesli dostarczenie probki do laboratorium w ciagu 2 godzin nie jestmozliwe, nalezy niewielka ilosc materiału (łacznie ze sluzem, krwia i pasmaminabłonka, jesli sa obecne) podzielic i umiescic w dwu lub trzech pojemnikachz podłozem transportowym (Cary-Blair, Stuart lub Amies) lub w 33 mmol/l buforufosforanowo-glicerolowego. W przypadku cholery i zakazen innymi Vibrio spp.,doskonałym (i wzbogaconym) podłozem transportowym jest alkaliczna wodapeptonowa. Patogeny moga przetrwac w takich warunkach przez okres dotygodnia w temperaturze pokojowej, chociaz zalecane jest przechowywanietakich probek w chłodziarce.

Procedura pobierania wymazow z odbytu

1. Zwilzyc bawełniana wymazowke sterylna woda. Umiescic za zwieraczemodbytu, obrocic i wyjac. Sprawdzic, czy widoczna jest wystarczajaca iloscmateriału, jesli nie, powtorzyc czynnosc. Liczba wymazow uzalezniona jest odrodzaju prowadzonych badan.

2. Jesli materiał zostanie zbadany w ciagu 1 – 2 godzin, umiescic wymazowkew pustej, sterylnej probowce z zatyczka z waty lub zakretka. Jesli wymazowkamusi byc przechowywana dłuzej niz przez 2 godziny, nalezy umiescic jaw podłozu transportowym.

Badanie wizualne probek kału

1. Obejrzec probke, zwracajac uwage na:– konsystencje (uformowany, nieuformowany, płynny),– kolor (biały, zołty, brazowy lub czarny),– obecnosc nietypowych elementow (np. sluz, krew).

2. Umiescic niewielka ilosc kału lub wymazu z odbytu razem ze sluzem (jesli jestobecny) w kropli 0,05% roztworu błekitu metylenowego na czystym szkiełkui dokładnie wymieszac.

3. Przykryc szkiełkiem nakrywkowym zabarwiona zawiesine uwazajac, aby niepowstały pecherzyki powietrza. Poczekac 2 – 3 minuty. Ogladac preparat podmikroskopem w duzym powiekszeniu (obiektyw × 100).

4. Zwrocic uwage na komorki jednojadrzaste lub o polimorficznych jadrach;pominac zdegenerowane komorki.

Badanie wysieku komorkowego biegunkowego kału moze dostarczyc wskazowekpozwalajacych na identyfikacje czynnikow wywołujacych:– zlepy leukocytow wielojadrzastych (> 50 komorek w polu widzenia), makro-

fagi i erytrocyty sa typowe dla zakazen pałeczkami Shigella;– mniejsza liczba wielojadrzastych leukocytow (< 20 komorek w polu widzenia)

obecna jest w salmonelozach i w zakazeniach inwazyjnymi szczepami E. coli.W czerwonce pełzakowej wiekszosc komorek jest zdegenerowana (cieniekomorek). W około 50% przypadkow biegunki wywołanej przez Campylobac-ter spp. obecne sa leukocyty i erytrocyty;

– w przypadku cholery, zakazen wywołanych przez enterokrwotoczne i entero-patogenne E. coli oraz biegunek wirusowych obecne sa nieliczne leukocyty(2 – 5 komorek w polu widzenia).

53

CZESC I

Podłoza transportowo-wzbogacajacei posiew probek kału

Podłoza transportowo-wzbogacajace sa powszechnie stosowane do izolacjiSalmonella spp. i Vibrio cholerae z kału. W przypadku Salmonella spp. zalecanesa buliony zawierajace selenin F lub tetrationian, natomiast dla Vibrio choleraestosowana jest alkaliczna woda peptonowa (APW, alkaline peptone water).Podłoza takie nie sa zalecane w hodowli Shigella spp., Campylobacter spp.,Yersinia enterocolitica i Clostridium difficile.

Procedura posiewu na podłoza wzbogacajace

1. Przygotowac zawiesine kału zawieszajac około 1 g probki w probowcezawierajacej 1 ml sterylnego fizjologicznego roztworu soli. Jesli probka jestpłynna, nie trzeba dodawac roztworu soli. Wymazy z odbytu, swieze lubw podłozu Cary’ego-Blaira, wytrzasnac w 1 ml fizjologicznego roztworu soli.Przed wyrzuceniem wymazowki odcisnac reszte płynu na sciance probowki.

2. Eza dodac trzy lub wiecej oczek zawiesiny do odpowiedniego podłozawzbogacajacego.

3. Inkubowac bulion z seleninem F przez 18 godzin, APW przez 6 – 8 godzin.W niektorych laboratoriach dwa lub trzy oczka zawiesiny poczatkowej w APWsa przesiewane do swiezego APW i inkubowane przez kolejne 6 – 8 godzin.

4. Przesiac hodowle z bulionu eza na płytki z selektywnym i nieselektywnympodłozem.

V. cholerae szybko rosnie w APW i przez 6 – 8 godzin przerasta inne mikroorgani-zmy. Po dłuzszej inkubacji, powyzej 8 godzin, pozostałe bakterie moga zdomino-wac V. cholerae. Szczepy nie-V. cholerae O1 rosna szybciej niz V. cholerae O1 i,jesli obecne sa jednoczesnie dwa serotypy, moga przerosnac cała płytke.

Podłoza do hodowli patogenow jelitowych

Dla Shigella spp., Salmonella spp. i Y. enterocolitica zalecane sa podłozastosowane do posiewu ogolnego o niskiej selektywnosci oraz podłoza o sredniejlub wysokiej selektywnosci. Agar MacConkeya z fioletem krystalicznym jestzalecany jako podłoze podstawowe. W przypadku Y. enterocolitica agar MacCon-keya nalezy inkubowac przez dzien w 35°C, a nastepnie, przez kolejny dzien,w temperaturze pokojowej (22 – 29°C).

Agar ksylozo-lizyno-deoksycholanowy (XLD) jest rekomendowany jako podłozeo sredniej lub wysokiej selektywnosci do izolacji Shigella spp. i Salmonella spp.Agar deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA), agar Hektoen dla pałeczek jelito-wych (HEA) lub agar Salmonella-Shigella (SS agar) moga byc stosowanealternatywnie. Shigella dysenteriae typ 1, S. sonnei i enteroinwazyjne E. coli nierosna dobrze na agarze SS. Jednakze agar SS moze byc wykorzystany do izolacjiY. enterocolitica z zastosowaniem zasad izolacji opisanych dla agaru MacCon-keya. Wiele laboratoriow do izolacji Salmonella typhi i innych gatunkowSalmonella stosuje agar siarczanowo-bizmutowy.

Dla Campylobacter spp. stosowanych jest kilka podłozy selektywnych (Blaser,Butzler, Skirrow), zawierajacych rozne dodatki antybakteryjne. Mozna rowniez

54

KAŁ

zastosowac podstawowy agar z krwia zawierajacy 5 – 10% krwi baraniejz dodatkiem cefalosporyny (15 µg/ml), wankomycyny (10 µg/ml), amfoterycy-ny B (2 µg/ml) i 0,05% siarczanu zelaza–metadwusiarczanu sodu–pirogronianusodu (FBF).

Dla Vibrio spp. konieczne sa selektywne podłoza, aczkolwiek wiele szczepowmoze rosnac na agarze MacConkeya. Agar zawierajacy cytrynian tiosiarczanowy,sole zołci i sacharoze (TCBS) jest podłozem selektywnym dla V. cholerae O1i nie-O1 oraz dla V. parahaemolyticus, ale drogim. Podłoze selektywne,zawierajace telluryn, taurocholan i zelatyne (TTG), nie jest komercyjnie dostepne.Prostymi, niedrogimi podłozami, ktore moga byc przygotowywane we własnymzakresie i stosowane z bardzo dobrym efektem, sa: agar z zasadowym ekstraktemmiesnym (MEA) i zasadowy agar z solami zołci (BSA).

Izolacja Clostridium difficile przed wprowadzeniem agaru cefoksytyno-cyklo-seryno-fruktozowego (CCFA) była trudna. W przypadku lecytynazo- i lipazo-ujemnych C. difficile zalecane jest stosowanie podłozy agarowych, zawierajacychzołtko jaja; inne laseczki wystepujace w jelicie, takie jak C. perfringens,C. bifermentans i C. sordelli, sa lecytynazododatnie.

Wstepna izolacja

Probka powinna byc badana i hodowana natychmiast po dostarczeniu dolaboratorium, co daje najwyzszy wskaznik izolacji Shigella spp. i Campylobacterspp. Jesli nie jest to mozliwe, probka powinna byc przechowywana w tem-peraturze 4°C.

Do posiewu na podłoza o wysokiej selektywnosci powinna byc uzyta gestazawiesina kału, a na podłoza o niskiej selektywnosci — mniej gesta. W wielulaboratoriach wymaz z odbytu posiewany jest bezposrednio na podłoza, nalezyjednak uwazac, aby nie doszło do przerosniecia płytki.

Procedura posiewu na podłozado wstepnej izolacji

1. Posiac eza na wysoko selektywne podłoza trzy oczka zawiesiny kału, a jednona podłoze o niskiej selektywnosci. Inoculum umiescic centralnie na płytceagarowej, a nastepnie rozprowadzic w gore, w doł i w poprzek płytki,jak zilustrowano na ryc. 6. Procedura ta umozliwia uzyskanie maksymalnejliczby pojedynczych kolonii. Drobne kolonie pojawia sie peryferycznie napłytce.

2. Po inokulacji inkubowac płytki agarowe. W celu izolacji Salmonella, Shigellai Yersinia spp. oraz V. cholerae płytki inkubowac w cieplarce w warunkachtlenowych (bez CO2) w 35°C, w przypadku Campylobacter spp. w 42°Cw srodowisku mikroaerofilnym z 10% CO2, a płytki z Clostridium difficilew 35°C w srodowisku beztlenowym.

Warunki inkubacji Campylobacter

Płytki do izolacji Campylobacter spp. powinny byc inkubowane w 42 – 43°Cw srodowisku mikroaerofilnym, zawierajacym 5% O2, 10% CO2 i 85% N2.

55

CZESC I

Powyzsza temperatura hamuje wzrost naturalnej flory jelitowej, nie wpływajac nawzrost bakterii z rodzaju Campylobacter. Podczas izolacji gatunkow nie toleruja-cych podwyzszonej temperatury, inkubacja powinna byc prowadzonaw 35 – 37°C.

• Odpowiednie warunki wzrostu dla Campylobacter spp. sa uzyskiwane na kilkasposobow. Wybor metody zalezy od zakresu i obciazenia praca danegolaboratorium oraz relatywnych kosztow.

• Eksykator zapewnia atmosfere zawierajaca ok. 17 – 19% O2 i 2 – 3% CO2. Niesa to optymalne warunki wzrostu Campylobacter spp. i nie wszystkie szczepyw nich wyrosna. Według niektorych zrodeł inkubacja w 42°C podłozyz dodatkiem FBP wpływa korzystnie na skutecznosc izolacji. Dodatek FBPinaktywujac nadtlenki i nadtlenek wodoru poprawia tolerancje tlenu przezCampylobacter spp. Ujemna strona metody jest dłuzsza inkubacja i zahamowa-nie wzrostu niektorych wrazliwych na tlen Campylobacter spp.

• Inna prosta i niedroga metoda wykorzystuje technike wspolnych hodowli.Płytki z szybko rosnacymi fakultatywnie beztlenowymi bakteriami inkubowanesa z płytkami do izolacji Campylobacter spp. w zamknietym pojemniku lubplastikowym woreczku. Przy wzroscie fakultatywnie beztlenowych bakteriizawartosc tlenu maleje, a CO2 rosnie. Ujemna strona metody jest zwykledłuzszy czas inkubacji potrzebny do wzrostu Campylobacter spp.

• Komercyjnie dostepna jest specjalnie przystosowana do izolacji Campylobac-ter spp. saszetka z generatorem wodoru i CO2 oraz katalizatorem. Saszetkenalezy umiescic w anaerostacie uzywajac kazdorazowo przy otwarciu pojem-nika nowej saszetki. Aby uzyskac maksymalna skutecznosc izolacji, w słoju nienalezy umieszczac wiecej niz szesciu płytek.

• Zestaw do inkubacji w plastikowym woreczku jest takze dostepny komercyjnie.W skład zestawu wchodzi plastikowy woreczek, za kazdym razem oproznianydwu- lub trzykrotnie recznie badz za pomoca prozniociagu, a nastepniekazdorazowo wypełniany 5% O2, 10% CO2 i 85% N2.

• System oproznianego i wypełnianego anaerostatu bez katalizatora. Pojemnikjest dwukrotnie oprozniany do uzyskania cisnienia 38 cm (15 mm Hg)i wypełniany za kazdym razem mieszanina 10% H2 i 90% N2.

Ryc. 6. Posiew bakterii na płytke.

56

KAŁ

Wstepna identyfikacja izolowanych szczepow

Identyfikacja odbywa sie na podstawie testow zarowno biochemicznych, jaki serologicznych, ktorych zakres zalezy od mozliwosci laboratorium. Schematidentyfikacji waznych bakterii jelitowych przedstawiony jest na ryc. 7a-c.

Na płytce Petriego, zawierajacej pierwszy posiew, nalezy oznaczyc na dnie dobrzeodgraniczone kolonie o typowym wygladzie. Wybrane kolonie zostana poddanedalszej identyfikacji. Jesli w posiewie widoczne sa rozne typy kolonii, nalezyprzeprowadzic identyfikacje kazdej z nich.

Małe i bezbarwne kolonie niefermentujacych laktozy bakterii, takich jakSalmonella spp. i Shigella spp., rosna na podłozu agarowym MacConkeya, agarzeSS i DCA. Kolonie Proteus spp. moga byc mylone z Salmonella spp. i Shigellaspp., zwłaszcza na podłozu MacConkeya ze wzgledu na ich wyglad, typowydla bakterii laktozoujemnych. Fermentujace laktoze mikroorganizmy, takiejak E. coli i Enterobacter/Klebsiella spp., wytwarzaja małe rozowe i czer-wone kolonie na podłozu agarowym MacConkeya, DCA i agarze SS. Na agarzeXLD Salmonella spp. i Shigella spp. wytwarzaja małe czerwone kolonie,z czarnym srodkiem w przypadku wiekszosci szczepow Salmonella. Koloniez czarnym centrum moga tworzyc na tym podłozu rowniez niektore szczepyProteus spp. Na agarze bizmutowo-siarkowym Salmonella typhi wytwarzajaczarne kolonie z metalicznym połyskiem, dobrze widocznym w przypadkuodgraniczonych kolonii. Yersinia enterocolitica rosnie na agarze MacConkeyai agarze SS w postaci małych, bladych kolonii, najszybszy wzrost nastepujew temperaturze 22 – 29°C.

Salmonella i Shigella spp.

Do wstepnych badan szczepow Salmonella spp. i Shigella spp. zalecane sa trzyrozne podłoza:– bulion z mocznikiem, lekko buforowany (UREA),– podłoze ruch-indol-lizyna (MIL),– agar Kliglera (KIA).

Procedura posiewu i odczytu UREA

1. Uzywajac do posiewu ezy zebrac z płytki 2 – 3 nie fermentujace laktozykolonie i przeniesc do probowki zawierajacej UREA.

2. Inkubowac probowki przez 2 – 4 godziny w 35°C i obserwowac ewentualnazmiane zabarwienia na rozowe (ureazododatnie). Odrzucic ureazododatnieprobowki.

3. Przesiac materiał z probowek zawierajacych szczepy ureazoujemne na MILi KIA (patrz ponizej) i inkubowac wszystkie probowki, łacznie z ureazoujem-nymi, przez noc w 35°C, w warunkach tlenowych.

Procedura posiewu i odczytu MIL i KIA

1. Posiac materiał do podłoza MIL przez nakłucie prosta igła (eza) na głebokosc2 mm od dna probowki. Wyjac igłe w tej samej linii.

57

CZESC I

2. Posiac materiał na podłoze KIA nakłuwajac słupek agaru prosta igłai prowadzac zygzakiem po powierzchni skosu.

3. Opisac wszystkie probowki numerem probki i inkubowac przez noc w tem-peraturze 35°C.

4. Obserwowac probowki UREA w kierunku opoznionej reakcji rozkładumocznika (patrz powyzej). Odrzucic hodowle z reakcja ureazododatnia.

5. Obserwowac podłoza MIL w kierunku obecnosci ruchu, reakcji rozkładulizyny i wytwarzania indolu. Ruchliwe mikroorganizmy rozprzestrzenia siew podłozu poza linie nakłucia i widoczny bedzie rozsiany wzrost. Bakterieniezdolne do ruchu beda rosły jedynie w kanale wkłucia. Na dodatnia reakcjelizynowa wskazuje odczyn zasadowy (kolor fioletowy) na dnie podłoza, nareakcje ujemna odczyn kwasny (kolor zołty) spowodowany jedynie fermenta-cja glukozy. Aby wykazac obecnosc indolu, nalezy dodac do podłoza 3 – 4krople odczynnika Kovacsa. Czerwony i rozowy kolor wskazuja na reakcjedodatnia, natomiast kolor jasnozołty swiadczy o ujemnym wyniku testu.

6. Obserwowac podłoze KIA. Wszystkie Enterobacteriaceae fermentuja glukozez wytworzeniem kwasu i gazu lub tylko kwasu, ktory jest odpowiedzialny zazołte zabarwienie podłoza. Powstajacy gaz powoduje powstanie pecherzykowi pekniec na powierzchni agaru, ktory, jesli powstaje duza ilosc gazu, mozeuniesc sie w probowce (np. w przypadku Enterobacter spp.). Jesli rownoczes-nie fermentacji ulega laktoza, zarowno słupek agarowy, jak i skos staja sie zołtez powodu kwasnego pH (np. w przypadku E. coli). Jesli nie zachodzifermentacja laktozy (np. Shigella spp. i Salmonella spp.), słupek agaru jestzołty, a skos pozostaje czerwony. Zaczernienie wzdłuz linii wkłucia lubw całym agarze wskazuje na obecnosc siarkowodoru. Nalezy zanotowacrezultaty i przeprowadzic wstepna identyfikacje mikroorganizmu, wykorzys-tujac schemat przedstawiony w tabeli 10 i 11.

Gram-ujemne pałeczki wzgledniebeztlenowe fermentujace cukry

oksydazoujemne

�

Laktoza+ –� �

Siarkowodor Siarkowodor+ – + –

� � �Citrobacterfreundii Lizyna Lizyna Fenyloalanina

+ – + – + –� �

�

� � �

Ureaza Indol Indol Ornityna Lizyna+ – + –

�

� � �

Indol+ –

Klebsiellaoxytoca

Klebsiellapneumoniae

Indol+ –

Escherichiacoli

Enterobacteraerogenes

+ –

Citrobacterkoseri

Enterobactercloacae

+ –

Proteusvulgaris

Proteusmirabilis

Indol+ –

�Edwardsiella

tardaOrnityna

+ –

Salmonellawiekszosc serotypow

Salmonellatyphi

+ –

Morganellamorgani

Trehaloza

+ –�

Providenciastuartii

Mannitol

+ –�

Providenciarettgeri

Providenciaalcalifaciens

Ureaza+ –

�Yersinia

enterocoliticaRuch

+ –�

Salmonellaparatyphi A

Ornityna

Shigellasonnei

Shigellaserotyp A, B, C

�

Sorbitol+ –�

Arabinoza Hafniaalvei+ –

Serratialiquifaciens

Serratiamarcescens

Ryc. 7a. Schemat wstepnej identyfikacji czesto wystepujacych Enterobacteriaceae.

58

KAŁ

Szczepy Salmonella sa oksydazoujemne, ruchliwe i indoloujemne. Nie hydro-lizuja mocznika i — z wyjatkiem S. paratyphi A — wytwarzaja dekarboksylazelizyny. Na agarze KIA obserwowany jest zołty słupek, czerwony skos, H2S i gaz,z wyjatkiem S. typhi, ktora nie wytwarza gazu, i wiekszosci szczepow S. para-typhi A, ktore sa H2S-ujemne. Jesli powyzsze kryteria sa spełnione, zanotowac:,,izolacja Salmonella (identyfikacja wstepna)’’.

Szczepy Shigella sa oksydazoujemne, nieruchliwe, nie wytwarzaja dekarboksy-lazy lizyny i nie hydrolizuja mocznika. Na KIA obserwowany jest zasadowy(czerwony) skos i kwasny (zołty) słupek, bez H2S i bez gazu, z wyjatkiem S. flex-nerii serotyp 6 (warianty Newcastle i Manchester) i S. boydii serotyp 14, ktorewytwarzaja gaz. Z wyjatkiem S. dysenteriae serotyp 1 bakterie wytwarzajakatalaze. Jesli powyzsze kryteria sa spełnione, zanotowac: ,,izolacja Shigella(wstepna identyfikacja)’’.

Yersinia enterocolitica

Wzrost małych, bladych, czy tez bezbarwnych koloni na podłozu MacConkeyalub agarze SS po całonocnej inkubacji moze wskazywac na obecnosc Yersiniaenterocolitica. Typowe kolonie nalezy posiac na KIA i inkubowac w temperaturze25°C przez noc. Inne kolonie, prawdopodobnie chorobotworczych szczepow,posiac na dwa podłoza UREA i dwa podłoza MIL, inkubowac rownolegle pojednej z probowek w temperaturze 25°C i w temperaturze 35°C. Typowe szczepyYersinia enterocolitica na podłozu KIA zakwaszaja słupek, nie ma gazu i H2S.

Gram-dodatnie tworzace spory laseczki,niektore gatunki nie tworzace spor,

wzglednie beztlenowe lubkatalazoujemne

+ –

Podwojna strefa hemolizy Indol+ – + –

Clostridiumperfringens

Indol Propionibacteriumacnes

Redukcjaazotanu+ –

+ –

Małe (1 µm) przezroczystekolonie ziarenko-pałeczek

,,Beztlenowe pałeczkiGram-dodatnie nie

tworzace spor,niemozliwe do

zidentyfikowania’’(obejmuje Lactobacillus,Bifidobacterium i innegatunki Eubacterium)

Ureaza Ruch+ –

C. sordelli Wzrostmgławicowy

+ –

C. tetani Laktoza+ –

C. sphenoides C. bifermentans

+ –

Charakterystycznafluorescencja

Mannitol

+ –

C. ramosum

C. clostridioforme

+ –

C. difficili Laktoza+ –

Wzrostmgławicowy

Wzrostmgławicowy

+ – + –

C. septicum C. tertium C. sporogenes C. novyi typ A

+ –

Eubacteriumlentum

Katalaza15% H2O2

+ –

Redukcjaazotanu

Actinomyces species(kolonie ,,zebow

trzonowych’’)+ –

Actinomycesviscosus

Propionibacteriumspecies

Ryc. 7b. Schemat wstepnej identyfikacji Gram-dodatnich pałeczek beztlenowych.

59

CZESC I

Jesli szczep jest ruchliwy i ureazododatni w temperaturze 25°C oraz nieruchliwyi słabo ureazododatni lub ureazoujemny w temperaturze 35°C, zanotowac:,,izolacja Yersinia (wstepna identyfikacja)’’.

Vibrio cholerae i V. parahaemolyticus

Szczepy Vibrio rosna na agarze MacConkeya w postaci bladych, nie fermentuja-cych laktozy kolonii. Na agarze TCBS V. cholerae tworza sredniej wielkosci,wypukłe, gładkie, zołte kolonie, w odroznieniu od V. parahaemolyticus, ktorychkolonie sa duze, płaskie i niebieskozielone.

Niektore szczepy V. cholerae, z powodu opoznionej fermentacji sacharozy, mogarowniez na podłozu TCBS tworzyc zielone lub bezbarwne kolonie. Na podłozuTTGA kolonie sa ciemne w centrum, z powodu redukcji tellurynu, oraz otoczonestrefa zmetnienia, zwiazana z aktywnoscia zelatynazy. Na podłozu BSA i MEAkolonie V. cholerae sa bezbarwne, zwykle płaskie i dobrze odgraniczone;zazwyczaj łatwo je odroznic od kolonii Enterobacteriaceae w ukosnym oswiet-leniu lub podczas badania w swietle dziennym padajacym pod katem. Dlapodejrzanych kolonii nalezy wykonac test na obecnosc oksydazy i test sluzowy.

Wzrost na agarzez zołcia i eskulina

+ –� �

Wrazliwe na kanamycyne (Km)i wankomycyne (Vm)

Wrazliwe na kanamycyne (Km)i wankomycyne (Vm)

Km-oporneVm-wrazliwe

Km-oporneVm-oporne

Km-wrazliweVm-oporne

Km-oporneVm-oporne

Km-oporneVm-oporne

Porphyromonas Prevotella GrupaBacteroides fragilis

GrupaFusobacterium

mortiferum/varium

�

Kolonie z pigmentemlub fluoryzujace

na czerwono+ –

�

Prevotella Ureaza+ –� �

Katalaza Indol+ – + –

� �

Bilophilawadsworthia

Bacteroidesureolyticus

Fusobacterium nucleatumF. necrophorum

inne gatunki Fusobacterium

Kolonie, bardzo małeprzezroczyste

+ –� �

Nierozpuszczalnew zołci

Fusobacteriumspecies

+ –� �

Katalaza Campylobacterspecies+ –

� �

Bilophilawadsworthia

Suterellawadsworthensis

WHO 01.50

Ryc. 7c. Schemat wstepnej identyfikacji Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych.

� � � � �

60

KAŁ

Tabela 9. Morfologia kolonii powszechnie wystepujacych bakterii jelitowych na roznicujacych i selektywnychpodłozach

Gatunki

AgarMacConkeya

z fioletemkrystalicznym

Agar XLD Agar SS DCA HEA

Escherichia coli Rozowoczer-wone

Duze, płaskie, zoł-te, nieprzejrzy-ste

Rozowoczerwonezahamowaniewzrostu

Rozowe, otoczonestrefa precypitacji

Duze, łososioworo-zowe lub pomaran-czowe, otoczonestrefa precypitacji

Shigella spp. Bezbarwne Czerwone Bezbarwne Bezbarwne lub jasno-brazowe

Zielone, wilgotne, wy-pukłe

Salmonella spp. Bezbarwne Czerwone z czar-nym centrumlub bez

Bezbarwne z czar-nym centrumlub bez

Bezbarwne lub jasno-brazowe z czarnymcentrum lub bez

Niebieskozielone zczarnym centrumlub bez

Enterobacter//Klebsiella spp.

Rozowe, sluzo-we

Zołte, sluzowe Rozowe, zahamo-wanie wzrostu

Duze, blade, sluzo-we, z rozowym cen-trum

Duze, łososiowopo-maranczowe

Proteus//Providenciaspp.

Bezbarwne, za-hamowanepełzanie

Czerwone, nie-ktore

Proteus spp. ma-ja czarne cen-trum

Bezbarwne, z sza-roczarnym cen-trum lub bez

Duze, bezbarwne lubjasnobrazowe zczarnym centrumlub bez

Niebieskozielone lubłososiowe z czar-nym centrum lubbez

Yersiniaenterocolitica

Bezbarwne Zołte, nieregular-ne

Bezbarwne Bezbarwne Łososiowe

Enterococcus spp. Brak wzrostu Brak lub słabywzrost

Brak wzrostu Brak lub słaby wzrost Brak lub słaby wzrost

XLD: deoksycholan ksylozo-lizynowy; DCA: cytrynian deoksycholowy; SS: Salmonella-Shigella; HEA: hektoen jelitowy.

Tabela 10. Interpretacja reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze zelazowymKliglera (KIA)

Reakcja Interpretacja

Słupek kwasny (zołty) i skos zasadowy (czer-wony)

Tylko fermentacja glukozy

Kwasne całe podłoze (słupek i skos zołte) Fermentacja glukozy i laktozyZasadowe całe podłoze (słupek i skos czer-

wone)Brak fermentacji glukozy i laktozy

Pecherzyki gazu w słupku lub peknieciaw podłozu

Bakterie wytwarzajace gaz

Zaczernienie w słupku Wytwarzanie siarkowodoru (H2S)

Procedura testu na oksydaze

1. Na papierowym filtrze w szalce Petriego umiescic 2 – 3 krople odczynnika dotestu na oksydaze (1% tetrametylo-parafenylenodiamina).

2. Platynowa (nie niklowo-chromowa) eza, czysta drewniana szpatułka lubwykałaczka zebrac niewielka liczbe swiezych kolonii z agaru MacConkeya.Rozprowadzic bakterie na nawilzonej czesci papierowego filtra.

3. O reakcji dodatniej swiadczy ciemnofioletowe zabarwienie papierka w ciagu10 sekund. Sposrod Gram-ujemnych pałeczek oksydazododatnie sa Vibrio,Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas i Alcaligenes; wszystkie Enterobac-teriaceae sa oksydazoujemne. Odczynnik do testu na oksydaze powinien bycregularnie testowany za pomoca dodatnich i ujemnych szczepow kontrolnych.

61

CZESC I

Tabela 11. Wzory typowych reakcji pałeczek Enterobacteriaceae na agarze Kliglera(KIA)

Reakcja Fermentacja cukru(ow) Gatunek bakterii

Kwasny słupek1 Glukoza: kwas i gaz Escherichia coliKwasny skos1 Laktoza: kwas i gaz KlebsiellaGaz w słupku EnterobacterBrak H2S Citrobacter diversus

Serratia liquefaciens

Kwasny słupek Glukoza: kwas i gaz SalmonellaZasadowy skos2 Laktoza: brak fermentacji ProteusGaz w słupku Citrobacter freundii*Wytwarzanie H2S

Kwasny słupek Glukoza: tylko kwas ShigellaZasadowy skos Laktoza: brak fermentacji YersiniaBrak gazu w słupku Serratia marcescens*Brak H2S Providencia stuartii

Providencia rettgeri*

Kwasny słupek Glukoza: kwas i gaz Salmonella paratyphi AZasadowy skos Laktoza: brak fermentacji Hafnia alveiGaz w słupku Serratia marcescens*Brak H2S Morganella morgani

Obojetny/zasadowy słupek2 Brak fermentacji cukrow AlcaligenesZasadowy skos PseudomonasBrak gazu AcinetobacterBrak H2S

1 Kwasne pH powstałe w wyniku rozkładu cukru, obserwowane na podstawie zołtegozabarwienia podłoza (przyp. tłum.).

2 Zasadowe lub obojetne pH w wyniku braku rozkładu cukru, obserwowane na podstawieniezmienionego, rozowego koloru podłoza (przyp. tłum.).

* Reakcje atypowe.

Procedura testu sluzowego

1. Umiescic na szkiełku krople 0,5% roztworu dezoksycholanu sodu i wymieszacz mała liczba kolonii pobranych z podłoza MacConkeya.

2. Wskaznikiem dodatniej reakcji jest zmiana charakteru zawiesiny w ciagu60 sekund: z metnej w sluzowata; obecnosc sluzowych włokien moze bycwykazana za pomoca ezy, ktora zanurza sie w zawiesinie i odsuwa od szkiełka.Niektore szczepy Aeromonas moga wykazywac słaba i opozniona o około60 sekund reakcje.

Jesli powyzsze testy sa dodatnie, przeniesc czesc kolonii na KIA i po całonocnejinkubacji obserwowac w kierunku obecnosci zołtego zabarwienia słupka, zasado-wego skosu, braku wytwarzania gazu i H2S. Jesli wystapia ww. cechy, zanotowac:,,izolacja Vibrio cholerae (wstepna identyfikacja)’’.

Campylobacter jejuni i Campylobacter coli

Płytki Campylobacter nalezy ogladac po 48 – 72 godzinach inkubacji. Zalecanejest wykonanie testu na oksydaze, ogladanie preparatu natywnego w ciemnympolu widzenia lub w mikroskopie fazowo-kontrastowym oraz preparatu bar-wionego metoda Grama. Jesli mikroskop z ciemnym polem widzenia lubfazowo-kontrastowy nie jest dostepny, morfologie komorek mozna okreslic napodstawie preparatu barwionego metoda Grama, uzywajac obok fioletu krys-talicznego 0,3% fuksyny karbolowej. Campylobacter spp. sa oksydazododatnie,

62

KAŁ

wykazuja ruch, w preparacie widoczne sa jako lekko lub spiralnie zagiete pałeczki(kształt skrzydeł mewy lub ,,S’’). Jesli wystapia ww. cechy, zanotowac: ,,izolacjaCampylobacter (wstepna identyfikacja)’’.

Clostridium difficile

Kolonie C. difficile na podłozu CCFA sa duze, zołte, ze szklista podstawa. Naagarze z krwia w srodowisku beztlenowym kolonie moga wykazywac roznamorfologie, dlatego niezbedna jest identyfikacja bakterii na podstawie innychcech. Typowe kolonie na tym podłozu sa szare, nieprzejrzyste, bez cech hemolizypo 24 – 48 godzinach, tylko niekiedy zielononiebieskie z powodu α-hemolizy.Po 48 – 72 godzinach inkubacji moze pojawic sie wyrazne szare zabarwieniez białym centrum. Z doswiadczenia wynika jednak, ze mimo roznic w morfologiikolonii C. difficile jest łatwo rozpoznawany na podstawie charakterystycznegozapachu, przypominajacego odchody konskie. Jesli kolonie sa lecytynazo-i lipazoujemne, a ponadto wykazuja zołtozielona fluorescencje w swietle lampyWooda, nalezy zanotowac: ,,izolacja Clostridium difficile (wstepna identyfika-cja)’’.

Koncowa identyfikacja mikrobiologiczna

Przed wydaniem wyniku nalezy sprawdzic czystosc hodowli i potwierdzicidentyfikacje za pomoca dodatkowych testow biochemicznych.1. Pobrac z płytki dobrze odgraniczone od innych kolonie i przesiac na bulion

odzywczy w celu wykonania testow biochemicznych, na skos agarowy dotestow serologicznych oraz na płytke MacConkeya w celu potwierdzeniaczystosci hodowli.

2. Wykonac dodatkowe testy biochemiczne zgodnie z tabelami. Wyniki odczytacpo całonocnej inkubacji i zidentyfikowac izolowane szczepy.

Identyfikacja Shigella i Salmonella moze niekiedy stanowic problem, poniewazniektore szczepy roznia sie wynikami reakcji biochemicznych, a takze mogawykazywac obecnosc antygenow wspolnych z innymi Gram-ujemnymi bak-teriami. Nieruchliwe, laktozoujemne, nie wytwarzajace gazu szczepy E. coli saczesto trudne do odroznienia od szczepow Shigella, a ponadto identyfikacja mozebyc skomplikowana w zwiazku z faktem wywoływania czerwonki bakteryjnejprzez niektore z tych szczepow.

Salmonella

Jesli wyniki wstepnych testow wskazuja na obecnosc szczepow Salmonella,nalezy posiac szczepy na podłoze z ornityna, podłoze Simmonsa z cytrynianem,ONPG i wode peptydowa wzbogacona mannitolem, ramnoza, trehaloza lubksyloza. Obserwowac reakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikowac szczepywedług schematu przedstawionego w tabeli 12. Jesli wyniki wskazuja na hodowleSalmonella, przeprowadzic identyfikacje serologiczna.

63

CZESC I

Tabela 13. Biochemiczne reakcje biotypow Shigella i innych pałeczek

Shigella sonnei – – – – – – – + – d+ – –Shigella, inne gatunki – – d – – – – – – – – –E. coli, nieaktywne szczepy – – d+ d – – – d– – d d– dProvidencia – + + – v – + – + d– d –Morganella – d+ + – + – – + d+ d– – –Hafnia alvei – + – + – d+ d– + – + d– +Serratia marcescens – + – + d– + + + – + + –Salmonella paratyphi A – + – – – – – + – – – –Plesiomonas shigelloides + + + + – – – + – + – –

Skroty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; d–: 5 –25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; Lizyna:dekarboksylaza lizyny; VP: Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; Ornityna: dekarboksylaza ornityny;Fenyloalanina: deaminaza fenyloalaniny; ONPG: β-galaktozydaza.

Oks

ydaz

a

Ru

ch

Ind

ol

Liz

yna

Ure

aza

VP

Cyt

ryn

ian

Orn

ityn

a

Fen

ylo

alan

ina

ON

PG

Sac

har

oza

Ksy

loza

Tabela 14. Biochemiczne reakcje gatunkow i serotypow Shigella

Dekarboksylazaornityny

Fermentacja:laktoza/sacharoza

Fermentacja:mannitol Katalaza Glukoza: gaz

Shigella dysenteriaeSerotyp 1 (shigae) – – – – –Serotyp 2 (schmitzii) – – – + –Serotypy 3 –10 – – – + –

Shigella flexneriSerotyp 1 –5, X i Y – – + + –Serotyp 6 Newcastle – – – + +Serotyp 6 Manchester – – + + +Serotyp 6 Boyd 88 – – + + –

Shigella boydiiSerotyp 1 –13, 15 – – – – –Serotyp 14 – – – – +

Shigella sonnei + + (opozniona) + + –

Tabela 12. Biochemiczne reakcje biotypow Salmonella i innych pałeczek

Salmonella (wiek-szosc serotypow)

– – – + + + – – + + + +

S. choleraesuis – d – + + d – – + – + +S. arizonae – + – + + + + – + + + +S. typhi – +w – + – – – – + + – +S. paratyphi A – d– – – + – – – + + + –Edwardsiella tarda – + + + + – – – – – – –Citrobacter freundii – + – – – + + d + + + +Proteus spp. + + –/+ – +/– v – + – + – +

Skroty: +: > 95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; d–: 5 –25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienne wyniki; w: słaba reakcja.H2S/KIA: wytwarzanie siarkowodoru na agarze Kliglera; Lizyna: dekarboksylaza lizyny; Ornityna: dekarboksylaza ornityny;Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa; ONPG: β-galaktozydaza.

Ru

chm

gła

wic

ow

y

H2S

KIA

Ind

ol

Liz

yna

Orn

ityn

a

Cyt

ryn

ian

ON

PG

Ure

aza

Man

nit

ol

Tre

hal

oza

Ram

no

za

Ksy

loza

64

KAŁ

Tabela 15. Biochemiczne reakcje Yersinia enterocolitica i innych niepatogennych gatunkow Yersinia

Y. enterocolitica +/v/– + + v – v – – +* +Y. frederiksenii +/+/– + + + d + + – + +Y. intermedia +/+/– + + + + + + + + +Y. kristensenii +/d/– + + – – – – – + +Y. pseudotuberculosis +/–/– + – – – – + + – –

Skroty: +: > 95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: zmienny wynik; MIL: podłoze ruch-indol-lizyna; VP 25°C:inkubacja w 25°C na agarze Voges-Proskauera; Cytrynian: agar cytrynianowy Simmonsa.

* Z wyjatkiem biotypu 5.

MIL

Ure

aza

Orn

ityn

a

VP

25°C

Cyt

ryn

ian

Sac

har

oza

Ram

no

za

Mel

ibio

za

So

rbit

ol

Cel

ob

ioza

Shigella

Jesli wyniki wstepnych testow wskazuja na pałeczki Shigella, nalezy posiacbadany szczep na podłoza z ornityna, fenyloalanina i ONPG oraz wode peptonowaz sacharoza i ksyloza. Obserwowac reakcje po całonocnej inkubacji i ziden-tyfikowac izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 13. Jesli wynikiwskazuja na hodowle Shigella, przeprowadzic identyfikacje serologiczna.

Do rodzaju Shigella naleza cztery gatunki: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydiii S. sonnei. Zwykle oznaczane sa jako podgrupy, odpowiednio A, B, C i D.Niektore serotypy mozna wstepnie zidentyfikowac i podzielic na biotypy napodstawie reakcji biochemicznych.

Wsrod S. dysenteriae (podgrupa A) wyroznia sie 10 serotypow. Serotyp 1 jestkatalazoujemny i wytwarza toksyne Shiga. Pozostałe serotypy sa katalazododat-nie. Wiekszosc szczepow nie fermentuje mannitolu i laktozy.

Wsrod S. flexneri (podgrupa B) wyroznia sie 8 serotypow. Wiekszosc szczepowfermentuje mannitol, nie fermentuje sacharozy ani laktozy. Nalezacy do seroty-pu 6 szczep Newcastle nie fermentuje mannitolu, ale wytwarza gaz z glukozy;szczep Manchester wytwarza kwas i gaz z glukozy oraz mannitolu; szczepBoyd 88 rozkłada glukoze i mannitol do kwasu, bez wytwarzania gazu.

Wsrod S. boydii (podgrupa C) wyroznia sie 15 serotypow. Fermentuja onemannitol, nie fermentuja laktozy.

Wsrod S. sonnei (podgrupa D) wyroznia sie jeden serotyp, wykazujacy dwie fazyreakcji: I i II. Fermentuje mannitol. Wykazuje dodatnia reakcje ONPG, alefermentacja laktozy i sacharozy zachodzi pozniej niz po 24 godzinach (patrztabela 14).


Jesli wyniki wstepnych testow wskazuja na obecnosc szczepow Yersinia, nalezyposiac szczep na podłoza z ornityna, Voges-Proskauera, ONPG, cytrynianowepodłoze Simmonsa oraz wode peptonowa wzbogacona sacharoza, ramnoza,melibioza, sorbitolem lub celobioza. Obserwowac reakcje po jednodniowejinkubacji i zidentyfikowac izolaty według schematu przedstawionego w tabeli 15.Jesli wyniki wskazuja na hodowle Y. enterocolitica, wydac wynik: ,,Yersiniaenterocolitica’’.

65

CZESC I

Tabela 16. Reakcje biochemiczne przecinkowcow wystepujacych w kale

Vibrio cholerae + K/A +/+/+ + + + + – –

V. mimicus + v/A +/+/+ + + – + – –

V. parahaemolyticus + K/A +/+/+ + – – + d+ –

V. fluvialis + K/A +/d/– – + + + + –

V. furnissii + K/AG +/–/– – + + + + –

V. hollisae + K/A +/+/– – – – – + – słaby wzrost

Aeromonas hydrophila + A/AG +/+/+ – d + + + + Arb+/VP+

A. caviae + A/A +/+/– – + + + + d Arb–/VP–

A. veronii biotyp sobria + A/AG +/+/+ – + + + – – Arb–/VP+

Plesiomonas shigelloides + K/A +/+/+ + – – – – + Arb–/VP–

Skroty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich; –: < 5% dodatnich; KIA: agar Kliglera; MIL: podłozeruch-indol-lizyna; Ornityna: dekarboksylaza ornityny; Eskulina: hydroliza eskuliny; K: odczyn zasadowy; A: odczyn kwasny; G:gaz; Arb: fermentacja arbutyny; VP: Voges-Proskauer.

Oks

ydaz

a

KIA

słu

pek

/sko

s

MIL

Orn

ityn

a

Cyt

ryn

ian

Sac

har

oza

Man

nit

ol

Ara

bin

oza

Esk

ulin

a

Ko

men

tarz

Tabela 17. Roznice biotypow Vibrio cholerae

Biotyp

Klasyczny El Tor

Hemaglutynacja Reakcja ujemna, brak wzrostu* Reakcja dodatnia, wzrost*Polimyksyna B (50 j.) Wrazliwy OpornyVoges-Proskauer Reakcja ujemna, brak wzrostu* Reakcja dodatnia, wzrost*Hemoliza Reakcja ujemna, brak wzrostu Zmienne

* Moga wystapic odchylenia od normy.

Vibrio cholerae

Jesli wyniki wstepnych testow wskazuja na obecnosc szczepow Vibrio, nalezywykonac posiew na podłoze z ornityna, agar cytrynianowy Simmonsa oraz wodepeptonowa z sacharoza i inkubowac przez noc. Jesli jedna z opisanych reakcji jestujemna, wykonac posiew na podłoze Voges-Proskauera i przeprowadzic test nahydrolize eskuliny, fermentacje mannitolu, arabinozy i arbutyny. Obserwowacreakcje po całonocnej inkubacji i zidentyfikowac izolaty według schematuprzedstawionego w tabeli 16.

Jesli dostepna jest swoista surowica anty-Vibrio cholerae serogrupy O1, na-lezy wykonac szybki test aglutynacji szkiełkowej. W przypadku makroskopo-wej aglutynacji, opisac: ,,Vibrio cholerae O1’’. Jesli surowica nie jest dostepnalub identyfikacja nie jest pewna, przesłac szczep do referencyjnego labora-torium.

Roznicowanie V. cholerae O1 na biotypy klasyczny i El Tor nie jest niezbedne doleczenia lub monitorowania, powinno jednak zostac przeprowadzone dla nie-ktorych izolatow (tabela 17).

66

KAŁ

Test hemaglutynacji posredniej

1. Przez wielokrotne odwirowanie przygotowac w fizjologicznym roztworze soli2,5% zawiesine kurzych lub bydlecych krwinek czerwonych.

2. Na szkiełku zaznaczyc ołowkiem kilka pol i eza naniesc na kazde z nich oczko(3 mm) zawiesiny krwinek czerwonych.

3. W kazdej z przygotowanych zawiesin krwinek umiescic niewielka liczbebakterii pobranych z agaru lub skosu KIA, dobrze wymieszac.

W przypadku szczepow biotypu El Tor, aglutynacja pojawia sie w ciagu30 – 60 sekund. Znane szczepy hemaglutynujace (El Tor) i nie hemaglutynujacepowinny byc uzyte jako kontrola dla kazdej z nowo przygotowanych zawiesinkrwinek. Swiezo izolowane szczepy klasycznych biotypow daja zwykle ujemnywynik testu, jednak w przypadku starych szczepow laboratoryjnych wynik ten niezawsze jest ujemny.

Test wrazliwosci na polimiksyne B

1. Na podłozu Mueller-Hintona lub na agarze z wyciagiem miesnym roz-prowadzic oczko hodowli szczepow inkubowanej przez noc w wodziepeptonowej.

2. Umiescic krazek zawierajacy 50 jednostek polimiksyny B w centrum hodowli.3. Umiescic płytke w chłodziarce na 1 godzine.4. Inkubowac płytke przez noc w temperaturze 36°C.

Zidentyfikowane szczepy biotypu klasycznego i El Tor powinny byc zawszewłaczane do grupy szczepow kontrolnych. Klasyczne szczepy sa wrazliwe napolimiksyne B, dlatego zawsze obserwuje sie wyrazna strefe zahamowaniawzrostu wokoł krazka. Szczepy El Tor sa niewrazliwe i strefa zahamowania niejest widoczna.

Campylobacter jejuni i Campylobacter coli

W laboratoriach klinicznych dostepnych jest tylko kilka testow do identyfikacjigatunkow i podgatunkow Campylobacter. Ze wzgledu na temperature wzrostuCampylobacter spp. mozna podzielic na dwie grupy: gatunki ciepłolubne, ktorerosna w temperaturze 42 – 43°C, i gatunki nieciepłolubne, ktore rosna w tem-peraturze 15 – 25°C.

Do gatunkow ciepłolubnych naleza: Campylobacter jejuni podgatunek jejuni,C. coli, C. lari, C. upsaliensis i niektore szczepy C. hyointestinalis. C. larii C. hyointestinalis sa oporne, natomiast C. jejuni, C. coli i C. upsaliensis sawrazliwe na kwas nalidyksowy; C. jejuni podgatunek jejuni, C. coli, C. lari saoporne, natomiast C. hyointestinalis i C. upsaliensis sa wrazliwe na cefalotyne.Roznicowanie miedzy tymi grupami odbywa sie na podstawie zdolnosci dohydrolizy hipuranu i wytwarzania siarkowodoru na agarze Kliglera.

Do gatunkow nieciepłolubnych naleza: C. jejuni podgatunek doylei, C. fetusi Arcobacter butzleri. C. jejuni podgatunek doylei nie rosnie w temperaturze 15°Cani w temperaturze 25°C; C. fetus rosnie dobrze w 25°C, ale nie rosnie w 15°C;A. butzleri rosnie w obydwu temperaturach. A. butzleri jest oporny na cefalotyne,a C. jejuni podgatunek doylei i C. fetus sa na nia wrazliwe (tabela 18).

67

CZESC I

Tabela 18. Identyfikacja biochemiczna gatunkow Campylobacter izolowanych z kału

H2S/KIA Hydrolizahipuranua

Redukcjaazotanu

Wzrost w temperaturze Wrazliwosc

15°C 25°C 42°C Kwasnalidyksowyb Cefalotynac

Campylobacter jejunisubsp. jejuni

– – + – + + S R

C. jejuni subsp. doylei – – – – d – S SC. coli – – + + – + S RC. lari – – + – – + R RC. upsaliensis – – + – – + S SC. fetus subsp. fetus – + – – – + R SC. hyointestinalis – + v + – + R SArcobacter butzleri d + + – – – + v R

Skroty: +: > 95% dodatnich; d+: 75 –95% dodatnich; d: 26 –74% dodatnich d–: 5 –25% dodatnich; –: < 5% dodatnich; v: reakcjazmienna; S: wrazliwy; R: oporny; H2S/KIA: agar Kliglera.a Jedynie kolor ciemnej purpury jest dowodem na reakcje dodatnia.b Krazek zawierajacy 30 µg kwasu nalidyksowego.c Krazek zawierajacy 30 µg cefalotyny.d Katalazoujemne lub słabo dodatnie; agar Kliglera.

Identyfikacja serologiczna

Salmonella

Nazewnictwo i klasyfikacja pałeczek Salmonella kilkakrotnie ulegały zmianomi nadal poddawane sa pod dyskusje. Zgodnie z obecnym nazewnictwem wszystkieserotypy Salmonella naleza do jednego gatunku, ktory podzielony jest na szescpodgrup (zwanych takze podgatunkami), do ktorych zaliczany jest dawny rodzajArizona. Podgrupa 1 odpowiada typowym pałeczkom Salmonella i obejmujem.in.: Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. enteritidis, S. typhimurium, S. chole-raesuis. Podgrupa ta obejmuje około 2000 serotypow, ktore moga byc roz-nicowane na podstawie wzoru antygenow (antygeny O, H, Vi). Serotypy nalezacedo podgrupy 1 sa nazywane w sposob sugerujacy przynaleznosc do rzeczywistychgatunkow: Salmonella podgrupa 1 serotyp typhimurium jest nazywana po prostuS. typhimurium. Ponad 99% izolowanych od ludzi pałeczek Salmonella nalezy dopodgrupy 1.

Waznymi antygenami w serotypowaniu Salmonella sa antygeny somatyczneO i antygeny rzeskowe H. Antygeny O wystepuja zarowno u ruchliwych, jaki u nieruchliwych szczepow, sa odporne na gotowanie; antygeny H wystepujajedynie u ruchliwych pałeczek i sa wrazliwe na gotowanie. Wiekszosc gatunkowSalmonella wykazuje dwufazowa ruchliwosc i moze wytwarzac dwie formyantygenow okreslanych jako antygeny fazy I i II. W obu fazach szczepy maja tensam antygen O, lecz roznia sie forma antygenu H. Do identyfikacji serotypukonieczne jest okreslenie specyficznosci antygenu H obu faz. Nie zawsze jest tomozliwe, dlatego niekiedy, dla potwierdzenia obecnosci fazy latencji, koniecznejest jej zahamowanie.

Antygeny O oznaczone sa cyframi arabskimi. Antygeny H fazy I oznaczone samałymi literami rzymskimi, a antygeny H fazy II cyframi arabskimi. Na przykład,wzor antygenowy S. typhimurium to 1,4,[5],12:i:1,2, gdzie antygeny O to 1,4,5i 12; antygeny H fazy I to ,,i’’, a fazy II to 1 i 2. Nawiasy oznaczaja, ze antygenmoze byc nieobecny, a podkreslenie wskazuje, ze antygen zwiazany jestz lizogenna konwersja wywołana przez bakteriofagi. Taka zmiana we wzorze

68

KAŁ

antygenow mozliwa jest jedynie w obecnosci bakteriofaga i moze stanowic jedynaroznice miedzy niektorymi serotypami.

Gatunki Salmonella podzielono na grupy na podstawie obecnosci okreslonychantygenow O. Wspomniany podział jest takze okreslany jako schemat Kauffman-na-White’a. Duze litery rzymskie okreslaja grupy O. W oryginalnym schemaciegrupy oznaczone były literami A, B, C, D i E; stopniowo poszerzono zakres grupod A do Z, z czterema podgrupami C, trzema D, czterema E i dwiema G. GrupyO okreslane sa na podstawie obecnosci nastepujacych antygenow O:

Grupa: A Ba C1 C2 D E1 FAntygen: 2 4;5 6;7 6;8 9 3;10 11

Istnieja inne roznice w strukturze antygenowej: zmiana w wygladzie koloniiod gładkich do szorstkich w zaleznosci od obecnosci lub braku antyge-nu Vi. Obecnosc antygenu Vi hamuje aglutynacje w swoistej surowicy anty-O.Antygen Vi jest zwykle wykrywany w swiezo izolowanych szczepach i szybkotracony podczas ich przechowywania. Antygen ten jest wazny w identyfikacjiszczepow S. typhi, czesto nie ulegajacych aglutynacji w heterogennej surowicyanty-H.

Procedura identyfikacji antygenu somatycznego O

Bezposredni test aglutynacji szkiełkowej

1. Przed rozpoczeciem badania umiescic roztwor soli i odczynniki w tem-peraturze pokojowej.

2. Umiescic krople roztworu soli na czystym szkiełku mikroskopowym.3. Za pomoca sterylnej ezy pobrac niewielka ilosc materiału z hodowli na sko-

sie agarowym i rozprowadzic w kropli soli uzyskujac jednolita, metna za-wiesine.

4. Pod lupa lub pod mikroskopem w niewielkim powiekszeniu (× 10) obejrzeczawiesine bakterii, aby wykluczyc autoaglutynacje zawiesiny w soli.

5. Pobrac eza 10 µl poliwalentnej surowicy odpornosciowej O Salmonella (A-Ii Vi) i umiescic ja na szkiełku tuz obok zawiesiny bakterii.

6. Wymieszac surowice z zawiesina bakterii i przechylac szkiełko do przodu i dotyłu przez 1 minute. Obserwowac tworzenie sie grudek ogladajac szkiełkow dobrym swietle. Pojawienie sie w tym czasie wyraznych grudek jestwynikiem dodatnim.

7. Jesli wynik jest dodatni, powtorzyc badanie z monowalentna surowicaodpornosciowa.

Niektore pałeczki Salmonella maja antygen powierzchniowy Vi i zywe lubnieinaktywowane termicznie nie ulegaja aglutynacji z surowica odpornoscio-wa grupy C1 (O:6,7) lub grupy D (O:9). Aby zapobiec otrzymaniu nieprawidło-wego wyniku, w celu usuniecia antygenu Vi, zawiesine nalezy podgrzac w go-tujacej sie wodzie, schłodzic, oddzielic bakterie przez wirowanie, ponowniezawiesic w swiezym fizjologicznym roztworze soli i przeprowadzic test z tasama surowica.

a Wszystkie szczepy Salmonella podgrupy B zawieraja antygen 4, tylko niektore antygen 5.

69

CZESC I

Bio

chem

iczn

aid

enty

fikac

ja:

gatu

nek

Sal

mon

ella

Bio

chem

iczn

aid

enty

fikac

ja:

Sal

mon

ella

typh

iB

ioch

emic

zna

iden

tyfik

acja

:S

alm

onel

lapa

raty

phiA

Test

zpo

liwal

entn

asu

row

ica

anty

-Sal

mon

ella

A-I

+V

iTe

stz

poliw

alen

tna

suro

wic

aTe

stz

poliw

alen

tna

suro

wic

aan

ty-S

alm

onel

laA

-I+

Vi

anty

-Sal

mon

ella

A-I

+V

i

doda

tni

anty

-gru

paB

anty

-gru

paD

ujem

nyuj

emny

doda

tni

doda

tni

doda

tni

doda

tni

H:1

,2do

datn

ian

ty-H

:bH

:iH

:1,2

doda

tni

doda

tni

H:1

,2uj

emny

doda

tni

doda

tni

doda

tni

ujem

nyD

-win

ian

doda

tni

doda

tni

Sal

mon

ella

spec

ies

Sal

mon

ella

para

typh

iBS

alm

onel

lase

roty

ppa

raty

phiB

Sal

mon

ella

spec

ies

Sal

mon

ella

typh

imur

ium

Sal

mon

ella

spec

ies

Sal

mon

ella

ente

ritid

isS

alm

onel

lasp

ecie

sS

alm

onel

laty

phi

Sal

mon

ella

spec

ies

Sal

mon

ella

para

typh

iAS

alm

onel

lasp

ecie

s

anty

-H:m

anty

-gru

paD

+an

ty-V

i*an

ty-g

rupa

A

wsz

ystk

ieuj

emne

ujem

nyuj

emny

obyd

wa

doda

tnie

jede

nlu

bob

ydw

auj

emne

doda

tni

anty

-H:d

anty

-H:a

ujem

ny

Test

zan

ty-H

:b;

anty

-H:1

,2;

H:i

H:b

H:1

,2H

:ido

datn

ido

datn

ido

datn

i

Aga

rdo

ocen

yA

gar

dooc

eny

Aga

rdo

ocen

yru

chu

ruch

uru

chu

zan

ty-H

:bz

anty

-H:1

,2z

anty

-H:i

Tes

tz

anty

-H:1

,2Te

stz

anty

-H:i

Tes

tz

anty

-H:1

,2H

:1,2

ujem

ny

WH

O01

.51

*Je

slir

eakc

jaag

luty

nacj

izac

hodz

ijed

ynie

zsu

row

ica

anty

-Vi,

nale

zyza

goto

wac

zaw

iesi

neba

kter

iiip

owto

rzyc

bada

nie

zsu

row

ica

O:D

.

Ryc

.8.

Iden

tyfik

acja

sero

logi

czna

gatu

nku

Sal

mon

ella

.

70

KAŁ

Procedura identyfikacji antygenu H

Wstepna identyfikacja antygenu rzeskowego H moze byc przeprowadzonaw tescie bezposredniej aglutynacji, jak opisano powyzej dla antygenu somatycz-nego O. Niekiedy konieczne jest zwiekszenie ekspresji ruchu badanych szczepowprzez kilkakrotne kolejne przesiewy na połpłynne podłoza odzywcze (,,swarmagar’’, patrz nizej). Surowice odpornosciowe do wykonania testu z tymiantygenami sa dostepne komercyjnie. Mimo to, jesli identyfikacja obu fazrzeskowych jest niezbedna do klasyfikacji, wymagana jest faza zahamowania.Czesto konieczna jest takze inwersja faz z uzyciem przeznaczonych do tego celusurowic1.

1. Przygotowac połpłynne podłoza odzywcze zawierajace 0,2 – 0,4% agaru.Umiescic po 1 ml podłoza w probowkach.

2. Zastapic korki probowek korkami z waty.3. Upłynnic agar w gotujacej sie wodzie i umiescic probowki z płynnym agarem

w łazni wodnej w temperaturze 45°C na 30 minut.4. Opisac kazda probowke numerem probki i surowicy anty-H (H:b, H:i i H:1,2).

Rowniez probowke kontrolna.5. Dodac 10 µl heterogennej surowicy H kazdej fazy inwersji do odpowiednich

agarow, delikatnie wstrzasnac probowki i pozostawic agar do skrzepnieciaw skosie.

6. Sporzadzic gesta zawiesine izolowanych kolonii w roztworze fizjologicznymsoli, posiac eza, nakłuwajac skos, i inkubowac przez noc.

7. Z hodowli uzyskanej na skosie pobrac eza materiał i rozprowadzic rowno-miernie w kropli roztworu fizjologicznego soli.

8. Eza o objetosci 10 µl pobrac krople jednej z heterogennych suro-wic odpornosciowych H i umiescic ja na szkiełku, tuz obok zawiesinybakterii.

9. Wymieszac surowice z zawiesina bakterii, przechylajac szkiełko do przodui do tyłu przez 1 minute. Obserwowac tworzenie sie grudek, ogladajacszkiełko w dobrym swietle. Pojawienie sie w tym czasie wyraznych grudekswiadczy o dodatnim wyniku.

10. Jesli to konieczne, nalezy powtorzyc test aglutynacji z innymi heterogennymisurowicami i zidentyfikowac serotyp, wykorzystujac schemat przedstawionyna str. 69.

Salmonella typhi

Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej nalezy przeprowadzic testyz surowicami odpornosciowymi Vi, O grupy D (O:D) i H:d. Z powodu obecnosciantygenu Vi hodowle aglutynujace w surowicy Vi moga nie aglutynowacw surowicy O:D. Nalezy usunac antygen Vi, podgrzewajac zawiesine w tem-peraturze 100°C przez 20 minut, i powtornie przeprowadzic test z surowica O:D.Po uzyskaniu aglutynacji w surowicach Vi, O:D i H:d zanotowac: ,,Salmonellatyphi’’. Jesli wynik jest dodatni jedynie w surowicy O:D, zanotowac: ,,Salmonella,grupa D’’.

1 Dostepne w Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300 Copenhagen S, Denmark.

71

CZESC I

Salmonella paratyphi A

Dla potwierdzenia identyfikacji biochemicznej nalezy przeprowadzic test z suro-wica odpornosciowa Salmonella grupy A. Jesli wynik jest dodatni, przeprowadzictest z surowica H:a i w przypadku uzyskania dodatniego wyniku zanotowac:,,Salmonella paratyphi A’’. Jesli wynik z surowica H:a jest ujemny, zanotowac:,,Salmonella grupa A’’. Jesli nie wykazano ruchu, mozna rozwazyc obecnoscS. flexneri typ 6 lub S. boydii typ 13 lub 14 i przeprowadzic test z surowicaodpornosciowa Shigella B i D.

Inne serotypy Salmonella

Jesli wyniki powyzej opisanych testow wskazuja na obecnosc typowych pałeczekSalmonella, nalezy przeprowadzic testy z surowicami odpornosciowymi Sal-monella O grup A, B, C, D i E.

• Jesli dodatni wynik wskazuje na grupe B, wykonac test z surowica H:b, H:ii H:1,2. Jesli uzyskamy wynik dodatni z surowica H:b, identyfikowanymmikroorganizmem moze byc S. wien lub S. paratyphi B. S. wien mozna odroznicod S. paratyphii B w odczynie alutynacji z surowica H:1,w i H:2 (jesli sadostepne). S. wien aglutynuje w surowicy H:1,w, a S. paratyphi w H:2.

• Jesli wynik z surowica H:i lub H:1,2 jest dodatni, wywołac inwersje fazyi przeprowadzic test z heterogenna surowica H. Jesli wynik jest dodatni,zanotowac: ,,S. typhimurium’’. Jesli wynik jest ujemny, zanotowac: ,,Salmonel-la grupa B’’.

• Jesli wynik z surowica C jest dodatni, zanotowac: ,,Salmonella grupa C’’.• Jesli wynik z surowica D jest dodatni, przeprowadzic testy z surowicami Vi, H:d

i H:m. Jesli wynik z surowica Vi lub H:d jest dodatni, zanotowac: ,,Salmonellatyphi’’. Jesli wynik z surowica H:m jest dodatni, zanotowac: ,,Salmonellaenteritidis’’. Jesli testy z surowicami Vi, H:d i H:m sa ujemne, zanotowac:,,Salmonella grupa D’’.

• Jesli identyfikacja biochemiczna wskazuje na szczep Salmonella, ale testy zewszystkimi surowicami grup O sa ujemne, zanotowac: ,,Prawdopodobniegatunek Salmonella’’ i przesłac do Centralnego Laboratorium Referencyjnego.

Shigella

Pałeczki Shigella mozna podzielic na serogrupy i serotypy na podstawieszkiełkowych i probowkowych odczynow aglutynacji ze swoistymi surowicamiodpornosciowymi O. Odczyn aglutynacji szkiełkowej zwykle wystarcza, jesliwynik badania jest jednoznaczny. Zawiesina antygenu powinna byc przygotowa-na z nieselektywnego podłoza, np. z agaru odzywczego lub KIA, i uwaznieobserwowana w celu wykluczenia autoaglutynacji przed dodaniem surowicy.

Testy z surowicami odpornosciowymi Shigellagrupy A, B, C i D

• Jesli pojawi sie aglutynacja z surowica grupy A, zanotowac: ,,Shigelladysenteriae’’. Przeprowadzic test z surowica S. dysenteriae typ 1. Jesli jestdodatni, zanotowac: ,,S. dysenteriae typ 1’’.

72

KAŁ

• Jesli pojawi sie aglutynacja z surowica grupy B, zanotowac: ,,Shigellaflexneri’’.

• Jesli pojawi sie aglutynacja z surowica grupy C, zanotowac: ,,Shigella boydii’’.• Jesli pojawi sie aglutynacja z surowica grupy D, zanotowac: ,,Shigella sonnei’’.

Czasami szczepy Shigella z powodu obecnosci antygenu K moga nie ulegacaglutynacji w homologicznych surowicach. Podgrzanie zawiesiny szczepoww roztworze fizjologicznym soli w łazni wodnej przez 20 minut i ponowneprzeprowadzenie testu moze zniesc hamujacy wpływ antygenu K.

Niektore Gram-ujemne mikroorganizmy moga miec antygeny wspolne zeszczepami Shigella i dawac fałszywie dodatnie wyniki aglutynacji z surowicamido typowania Shigella. Dobrze znanym przykładem bakterii dajacych krzyzowareakcje sa szczepy Plesiomonas shigelloides i Shigella sonnei fazy I oraz Hafniai Shigella flexneri serotyp 4a; najwazniejsza jest jednak krzyzowa reakcjaz niektorymi odpowiedzialnymi za biegunke szczepami E. coli.


Y. enterocolitica ma kilka antygenow somatycznych O, ktore zostały wykorzys-tane do podziału gatunku na 17 serogrup. Wiekszosc zakazen u ludzi w Kanadzie,Europie i Japonii wywołana jest przez serotyp O3. Infekcje wywołane przezserotyp O9 opisywano głownie w Skandynawii, infekcje wywołane przez serotypO8 wystepuja prawie wyłacznie w USA. Istnieje krzyzowa reakcja serologicznamiedzy Y. enterocolitica O9 i Brucella spp.

73

Zakazenia gornych drogoddechowych

Wprowadzenie

Gorne drogi oddechowe obejmuja obszar od krtani do nozdrzy, w skład ktoregowchodza: jama ustna, gardło i jama nosowo-gardłowa oraz przylegajace jamyzatok i ucho srodkowe.

Zakazenia wystepujace w gornych drogach oddechowych, to:– zapalenie gardła, niekiedy z zapaleniem migdałkow, prowadzace do ,,boles-

nego gardła’’,– zapalenie jamy nosowo-gardłowej,– zapalenie ucha srodkowego,– zapalenie zatok,– zapalenie nagłosni.

Sposrod wymienionych infekcji zdecydowanie najczesciej wystepuje zapaleniegardła; nie leczone zakazenia moga miec powazne konsekwencje. W niniejszymopracowaniu zostanie omowione tylko zapalenie gardła.

Wiekszosc przypadkow zapalenia gardła ma etiologie wirusowa i samoogranicza-jacy sie przebieg. Jednakze około 20% infekcji wywołanych jest przez bakteriei zwykle wymaga leczenia odpowiednimi antybiotykami. Lekarz opierajac sietylko na badaniu fizykalnym rzadko moze rozroznic zakazenie wirusowei bakteryjne, dlatego najlepiej, jesli leczenie jest oparte na wyniku badaniamikrobiologicznego.

Diagnostyka bakteriologiczna zapalenia gardła jest skomplikowana ze wzgledu naobecnosc licznej, mieszanej flory fizjologicznej złozonej z tlenowych i bez-tlenowych bakterii. Flora naturalna przewyzsza zwykle liczebnie patogenna, rolamikrobiologa polega wiec na rozroznieniu komensali od patogenow. Jesli tomozliwe, w wyniku badania nalezy uwzglednic tylko bakterie patogenne.

Flora fizjologiczna gardła

W skład naturalnej flory gardła wchodzi tak duza liczba gatunkow, ze pełnaidentyfikacja i uwzglednienie wszystkich w wyniku nie jest konieczne, zwłaszczagdy w posiewie zaobserwowano:• paciorkowce zieleniejace (α-hemolizujace) i pneumokoki,• niepatogenne Neisseria spp.,• Moraxella (wczesniej Branhamella) catarrhalis (moze byc rowniez patogenem

układu oddechowego),• gronkowce (S. aureus, S. epidermidis),• dyfteroidy (z wyjatkiem C. diphtheriae),• Haemophilus spp.,• drozdze (Candida spp.) w ograniczonej liczbie,• rozne bezwzglednie beztlenowe ziarenkowce Gram-dodatnie, pałeczki Gram-

-ujemne, kretki i formy nitkowate.

74

ZAKAZENIA GORNYCH DROG ODDECHOWYCH

U osob starszych, o obnizonej odpornosci lub niedozywionych, zwłaszczapo antybiotykoterapii, gardło moze byc skolonizowane przez pałeczki Ente-robacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp. i in.) oraz Gram-ujemnepałeczki niefermentujace (Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp.). Rownieczesto u takich pacjentow dochodzi do namnazania sie w gardle szczepow S.aureus lub Candida spp. i innych gatunkow drozdzopodobnych grzybow.

Wymienione mikroorganizmy moga wywoływac zapalenie gardła jedynie u pac-jentow w okresie granulocytopenii, zaleca sie jednak uwzglednienie w wynikuinformacji o izolacji takich szczepow, poniewaz ich obecnosc moze wskazywacna infekcje (czy tez ryzyko infekcji) dolnych drog oddechowych (np.: zapaleniepłuc) lub bakteriemie. Dla kolonizujacych gardło mikroorganizmow zwykle nienastawia sie antybiogramu.

Bakteryjne czynniki zapalenia gardła

Streptococcus pyogenes (grupa A wg Lancefielda) jest z pewnoscia najczestszaprzyczyna bakteryjnego zapalenia gardła i migdałkow. Zakazenie wystepujenajczesciej u małych dzieci (5 – 12 lat). Jesli zapaleniu gardła towarzyszycharakterystyczna wysypka, chorobe okresla sie mianem goraczki płoniczej.U dzieci podczas paciorkowcowej infekcji gardła moze dojsc do zajecia jamynosowo-gardłowej z towarzyszaca ropna wydzielina z nosa.

Nie nalezace do grupy A β-hemolizujace paciorkowce (np. grupa B, C i G) rzadkosa przyczyna bakteryjnego zapalenia gardła i ich izolacje nalezy odnotowacw wyniku. Nieodpowiednio leczone infekcje gardła wywołane przez S. pyogenesmoga miec konsekwencje w postaci goraczki reumatycznej i — rzadziej— kłebuszkowego zapalenia nerek. Dokładna identyfikacja i ukierunkowaneleczenie przeciw S. pyogenes maja na celu zapobieganie pojawieniu sie goraczkireumatycznej.

Corynebacterium diphtheriae wywołuje błonice, chorobe wystepujaca ende-micznie w wielu krajach. Tam, gdzie przerwano realizacje programowszczepien, choroba moze przyjac rozmiary epidemii. Typowy dla C. diphtheriaeprzebieg infekcji (z kilkoma wyjatkami) charakteryzuje sie obecnoscia szarawo-białych nalotow w miejscu zakazenia (gardło, migdałki, nos lub krtan). Błonicajest ciezka choroba, w ktorej diagnoza stawiana jest na podstawie objawow.Lekarz moze zlecic dodatkowo wykonanie posiewu w kierunku maczugowcowbłonicy.

W niektorych krajach coraz czesciej rozpoznawane jest gonokokowe zapaleniegardła, ktorego czestosc wystepowania staje sie porownywalna do rzezaczkowegozapalenia szyjki macicy i cewki moczowej. Posiew wymazow z gardła powinienbyc wykonywany na wyrazne polecenie lekarza z uzyciem własciwego podłozaselektywnego (zmodyfikowane podłoze Thayer-Martina).

Martwicze, wrzodziejace zapalenie gardła (angina Vincenta) jest rzadkim stanem,charakteryzujacym sie wystepowaniem martwiczych owrzodzen gardła z tworze-niem błon rzekomych lub bez błon rzekomych. W miejscu infekcji obecna jestliczna, bezwzglednie beztlenowa flora mieszana z przewaga Gram-ujemnychbakterii nitkowatych i spiralnych, nalezacych głownie do Fusobacterium spp.i Treponema vincenti. Bakterie te naleza do fizjologicznej flory jamy ustnej,jednak ich duza liczba widoczna w barwionym metoda Grama preparacie

75

CZESC I

z wrzodziejacych zmian powinna zostac odnotowana jako ,,kompleks wrzeciono-wcowo-kretkowy’’. Rozpoznanie mikroskopowe nie wymaga potwierdzeniaw hodowli beztlenowej, ktora jest trudna i czasochłonna. Obecnosc kompleksu niewyklucza potrzeby poszukiwania innych patogenow, zwłaszcza S. pyogenes.

C. albicans i inne gatunki Candida obecne w niewielkiej liczbie uznawane sa zaelement flory fizjologicznej jamy ustnej, jednak w pewnych stanach chorobo-wych, np. u niedozywionych wczesniakow, u dorosłych z niedoborami odpornosci(np. pacjenci z HIV/AIDS) lub u pacjentow otrzymujacych antybiotykoterapie,ich liczba wzrasta, prowadzac do wystapienia kandydozy jamy ustnej. Zakazonepowierzchnie — jezyk, migdałki, gardło i błona sluzowa policzkow — moga bycintensywnie czerwone, pokryte białymi plamkami lub zlewajaca sie szarobiałabłona (plesniawka). Potwierdzeniem kandydozy jest obecnosc w preparaciebezposrednim barwionym metoda Grama licznych, drozdzopodobnych grzybow,tworzacych niekiedy długie, przypominajace grzybnie nici.

Posiewy z gornych drog oddechowych moga byc przesyłane do laboratoriumnie tylko w celu zdiagnozowania infekcji, ale takze w celu wykrycia obec-nosci potencjalnie patogennych szczepow u zdrowych ludzi — ,,nosicieli’’.Takie badania powinny byc wykonywane w ramach dobrze prowadzonegonadzoru epidemiologicznego. W gornych drogach oddechowych wystepujenosicielstwo:• Staphylococcus aureus. Badania wymazow z nosa pacjentow i personelu

szpitalnego w kierunku nosicielstwa jest zalecane podczas ustalania zrodłazakazenia metycylinoopornym S. aureus (MRSA).

• Neisseria meningitidis. Nawet poza okresem epidemii nosicielstwo menin-gokokow moze byc bardzo czeste (20% i wiecej). Identyfikacja nosicieli rzadkojest konieczna i nie ma potrzeby wykonywania badan w tym kierunku przedzaleceniem profilaktyki antybiotykowej u rodziny i u osob z bliskiego kontaktupacjenta z zapaleniem opon mozgowo-rdzeniowych.

• Streptococcus pyogenes. Nosicielstwo niewielkiej liczby tych bakterii mozebyc powszechne, zwłaszcza wsrod dzieci szkolnych (20 – 30%).

• Corynebacterium diphtheriae. Wysoki odsetek nosicielstwa wystepuje w popu-lacjach nie szczepionych. W takich społecznosciach uzasadnione moze bycwykonywanie identyfikacji i leczenie nosicielstwa u osob z otoczenia pacjentaz potwierdzona błonica. Nosicielstwo jest rzadkie w krajach, w ktorychwłasciwie realizowany jest program szczepien.

Pobieranie i przesyłanie probek

Najlepiej, jesli materiał pobierany jest przez lekarza lub przez inna osobewykwalifikowana. Pacjent powinien siedziec twarza do zrodła swiatła. Nalezyprzytrzymac jezyk szpatułka i sterylna wymazowka energicznie pobrac wy-maz z kazdego migdałka, z tylnej sciany gardła i z innych zmienionych za-palnie miejsc (wymazowke nalezy wczesniej zwilzyc jałowym fizjolo-gicznym roztworem soli — przyp. tłum.). Nalezy uwazac, aby nie dotknacjezyka lub błony sluzowej policzkow. Najlepiej, jesli zostana pobrane po dwawymazy z kazdego miejsca. Jeden moze byc wykorzystany do przygotowaniapreparatu bezposredniego, a drugi nalezy umiescic w szklanej lub plastikowejprobowce i przesłac do laboratorium. Mozna takze obydwa wymazy przesłac dolaboratorium. Jesli posiew pobranego materiału nie moze byc wykonany w ciagu4 godzin, wymazowki nalezy umiescic w podłozu transportowym (np. Amies lubStuart).

76



Charakterystyczny dla wrzodziejacego zapalenia gardła (angina Vincenta) kom-pleks wrzecionowcowo-kretkowy oraz grzyby Candida sa najlepiej widocznew preparacie barwionym metoda Grama, ktory powinien byc wykonany nazlecenie lekarza. Barwienie metoda Grama jest nieprzydatne w wykrywaniupaciorkowcow czy Neisseria spp. Preparat bezposredni jest takze niewystar-czajaco specyficzny i czuły w wykrywaniu maczugowca błonicy, chyba zemateriał został pobrany bardzo starannie i zbadany przez doswiadczonegomikrobiologa. Przy braku wskazan klinicznych lub bez zlecenia lekarza nie mapotrzeby wykonywania preparatow bezposrednich z gardła.

Hodowla i identyfikacja

Hodowla Streptococcus pyogenes

Natychmiast po dostarczeniu do laboratorium materiał musi zostac posianywymazowka na jedna czwarta płytki agarowej z krwia i rozsiany eza na pozostałaczesc płytki. Agar z krwia powinien byc przygotowany z podstawowego podłozaagarowego bez glukozy (lub z mała zawartoscia glukozy), np. z agaru tryptozowo--sojowego (TSA). Kwasny rozkład glukozy przez S. pyogenes hamuje wy-twarzanie hemolizyn. Do przygotowania podłozy mozna wykorzystac krewkazdego gatunku (swiezo pobrana) w stezeniu 5%. Płytki nalezy wypełnic4 – 5 mm warstwa podłoza. Preferowana jest krew wołowa, poniewaz ulegahemolizie pod wpływem pewnych komensalnych pałeczek Haemophilus spp. i niedaje hemolizy w obecnosci zymogennego wariantu Enterococcus faecalis.

Mozna poprawic rozpoznawanie β-hemolizujacych kolonii i przyspieszyc ichwstepna identyfikacje, umieszczajac na płytce w strefie pierwszego posiewukrazek z kotrimoksazolem (taki, jakiego uzywa sie podczas okreslania lekowraz-liwosci) i specjalny krazek o niskiej zawartosci bacytracyny. PoniewazS. pyogenes w odroznieniu od wielu innych bakterii jest oporny na kotrimoksazol,krazek ułatwia obserwacje β-hemolizy. Inkubacja w eksykatorze pozwala nawykrycie wiekszosci β-hemolizujacych paciorkowcow. Prostym sposobem nasi-lajacym hemolize jest głebokie, pionowe nakłucie agaru eza, ktore przyspieszawzrost kolonii pod powierzchnia. Po 18 godzinach i ponownie po 48 godzinachinkubacji w 35 – 37°C odczytac płytki z krwia, poszukujac małych (0,5 – 2 mm)kolonii, otoczonych stosunkowo duza strefa wyraznej hemolizy. Po wykonaniupreparatu barwionego metoda Grama i potwierdzeniu obecnosci Gram-dodatnichziarenkowcow bakterie nalezy identyfikowac w kierunku S. pyogenes. Dlapotrzeb klinicznych wstepna identyfikacja oparta jest na ocenie wrazliwosci naniskie stezenie bacytracyny. W tym celu wykorzystuje sie specjalnie przygotowa-ne krazki roznicujace, zawierajace 0,02 – 0,05 IU bacytracyny. Zwykłe krazkiwykorzystywane do antybiogramow zawieraja 10 IU i sa nieprzydatne doidentyfikacji. Obecnosc β-hemolizujacych paciorkowcow ze strefa zahamowaniawzrostu wokoł krazka swiadczy o izolacji S. pyogenes. Jesli w pierwszymposiewie hemolizujace kolonie sa liczne, obecnosc lub brak strefy zahamowaniawzrostu sa wyraznie widoczne juz na pierwszej posianej płytce zawierajacej agarz krwia. Jesli kolonie sa mniej liczne, nalezy z pierwszej płytki pobrac jedna lubdwie kolonie, posiac je na 1/5 kolejnej płytki w celu uzyskania ciagłego wzrostui na kazdym posianym polu umiescic krazek z bacytracyna. Strefy zahamowaniawzrostu nalezy odczytac po całonocnej inkubacji.

77

CZESC I

W niektorych laboratoriach wstepna identyfikacja potwierdzana jest serologicznieprzez wykazanie obecnosci specyficznych polisacharydow sciany komorkowej.Test moze byc przeprowadzony z uzyciem klasycznej metody precypitacji lub— szybciej — z uzyciem komercyjnych przeciwciał w tescie szybkiej koa-glutynacji szkiełkowej lub w tescie aglutynacji lateksowej. Jesli istnieje takapotrzeba, β-hemolizujace paciorkowce oporne na bacytracyne mozna iden-tyfikowac wykorzystujac do tego celu proste testy (patrz tabela 19).

Obecnosc S. pyogenes w posiewie z gardła powinna zostac okreslona w wynikuw sposob połilosciowy (nieliczne, +, ++ lub +++). Masywny wzrost S. pyogenesna całej powierzchni płytki jest charakterystyczny dla materiałow pobranych odpacjentow z paciorkowcowym zapaleniem gardła. Hodowle od nosicieli wykazujazwykle wzrost mniej niz 20 kolonii na płytce. Obecnosc nawet nielicznych koloniiβ-hemolizujacych paciorkowcow powinna zostac potwierdzona i zanotowana.

Hodowla Corynebacterium diphtheriae

Mimo ze maczugowiec błonicy dobrze rosnie na zwykłym agarze z krwia, lepszywzrost uzyskuje sie przy posiewie na jedno z dwoch specjalnych podłozy:• Skoagulowana surowica Löfflera lub podłoze jajeczne Dorseta. Jakkolwiek

nieselektywne, obydwa te podłoza umozliwiaja obfity wzrost maczugowcabłonicy po jednodniowej inkubacji. Ponadto morfologia komorek jest bardziej,,typowa’’: nieregularnie wybarwione, krotkie lub długie, lekko zakrzywionepałeczki wykazujace metachromatyczne ziarnistosci i ułozone w kształt V lubrownoległych palisad. Metachromatyczne ziarnistosci sa wyrazniej widocznepo wybarwieniu błekitem metylenowym lub barwieniu Alberta niz po zabar-wieniu metoda Grama.

• Selektywny agar tellurynowy z krwia. Podłoze to ułatwia izolacje, jeslimaczugowce sa nieliczne, jak np. w przypadku nosicieli. Na tym podłozukolonie maczugowcow błonicy sa szarawe lub czarne, a pełny wzrost pojawiasie po 48 godzinach. Charakterystyczne kolonie, zawierajace w preparaciebarwionym metoda Grama pałeczki o morfologii podobnej do maczugowcow,nalezy przesiac na płytke z agarem z krwia i okreslic ich czystosc oraz

Tabela 19. Roznicowanie ββ-hemolizujacych paciorkowcow

Gatunki S. pyogenes S. agalactiae E. faecalisvar. zymogenesa Inne

Grupa Lancefield A B D C, G, F

Hemoliza β βb β βStrefa wokoł roznicujace-

go krazka z bacytracy-na

+ 0c 0c 0d

Agar z zołcia i z eskulina(wzrost i zaczernienie)

0 0 + 0

Odwrotny test CAMP 0 + 0 0Wrazliwosc na kotrimok-

sazole0 0 0 +

Test PYRf + 0 + 0

a E. faecalis var. zymogenes wykazujace β-hemolize tylko na agarze z krwia konska.b 5% niehemolizujacych.c 5% dodatnich.d 10% dodatnich.e Krazek jak w tescie Kirby-Bauera.f PYR: pirolidonylo-β-naftylamid.

78


,,typowa’’ morfologie. Nalezy pamietac, ze kolonie C. diphtheriae najczesciejwystepujacego biotypu mitis, wytwarzaja na agarze z krwia wyrazna strefeβ-hemolizy.

Wstepny wynik identyfikacji C. diphtheriae moze zostac wydany juz na tymetapie. Wynik ten powinien zostac potwierdzony lub wykluczony za pomocaprostych testow biochemicznych oraz przez wykazanie zdolnosci szczepu dowytwarzania toksyn. Badanie immunogennosci jest wykonywane na swinkachmorskich lub za pomoca testu toksygennosci in vitro (proba Eleka) i powinno bycprzeprowadzane w centralnych laboratoriach, w pozostałych identyfikacja jestoparta na szybkich testach biochemicznych. C. diphtheriae jest katalazo-i azotanododatni. Nie hydrolizuje mocznika. Z glukozy i maltozy, ogolnie niez sacharozy, wytwarza kwas bez gazu. Test fermentacji glukozy moze bycprzeprowadzony na podłozu Kliglera. Aktywnosc ureazy mozna wykryc napodłozu MIU, a redukcje azotanu na bulionie azotanowym, w ten sam sposob, jakdla Enterobacteriaceae. Do oceny fermentacji maltozy i sacharozy mozna uzycjako bazy wody peptonowej Andrade’a z koncowym 1% stezeniem kazdegowodoroweglanu. Wyniki zwykle odczytuje sie po 24 godzinach, choc koniecznamoze okazac sie reinkubacja przez noc. Nalezy podkreslic, ze diagnostykalaboratoryjna ma na celu potwierdzenie klinicznie rozpoznanej błonicy. Nienalezy zwlekac z rozpoczeciem terapii do czasu otrzymania wynikow z laborato-rium. Wiecej informacji na temat izolacji i identyfikacji C. diphtheriae znalezcmozna w podreczniku Guidelines for laboratory diagnosis of diphtheria1.

Badanie lekowrazliwosci

Rutynowe badanie lekowrazliwosci szczepow izolowanych z gardła zazwyczajnie jest wymagane, a nawet moze okazac sie mylace. W wiekszosci bakteryjnychzakazen gardła czynnikami etiologicznymi sa S. pyogenes i C. diphtheriae,a lekiem z wyboru w antybiotykoterapii sa benzylopenicylina i erytromycyna.W przypadku błonicy wskazane jest rowniez leczenie antytoksyna.

1 Begg N.: Manual for the menagement and control of diphtheria in the European region.Copenhagen, WHO Regional Office for Europe, 1994.

79

Zakazenia dolnych drogoddechowych

Wprowadzenie

Zakazenia dolnych drog oddechowych wystepuja ponizej poziomu krtani, np.w tchawicy, oskrzelach lub tkance płucnej (zapalenie tchawicy, zapalenieoskrzeli, ropien płuca, zapalenie płuc). Czasami w zapaleniu płuc zakazeniemobjeta jest przyległa błona pokrywajaca płuca, w konsekwencji pojawia siezgrubienie opłucnej (zapalenie opłucnej) i płyn w jamie opłucnej (wysiekopłucnej).

Specyficzna forma zakazenia dolnych drog oddechowych jest gruzlica płucna,ktora wystepuje powszechnie w wielu krajach. Pacjent kaszlac moze uwalniacaerozol zawierajacy pratki gruzlicy (Mycobacterium tuberculosis), ktore mogazostac zainhalowane przez innych ludzi. Taka forma choroby (,,czynna’’ gruzlica)szybko szerzy sie z osoby na osobe i dlatego zaliczana jest do niebezpiecznychchorob zakaznych.

Wielu pacjentow z zakazeniem dolnych drog oddechowych odkrztusza ropna(zawierajaca rope) wydzieline, ktora zwykle ma zielony lub zołtawy kolor; takaplwocina moze byc posiewana, badana makroskopowo i mikroskopowo.

W niektorych zakazeniach plwociny jest bardzo niewiele lub nie obserwuje sie jejwcale: choroba legionistow (wywołana przez Legionella pneumophila), zapaleniepłuc wywołane przez Mycoplasma pneumoniae (,,pierwotne atypowe zapaleniepłuc’’) i zapalenie płuc wywołane przez chlamydie. Choroby te wymagajaspecjalnych metod diagnostycznych (serologia, izolacja na specjalnych pod-łozach) i nie beda omawiane w niniejszym opracowaniu. Poza gruzlica płuc (patrzponizej) wiekszosc badan mikrobiologicznych plwociny dotyczy pacjentowz infekcjami drog oddechowych, u ktorych wystepuje ropna plwocina.

Najczestsze postacie kliniczne zakazen

Ostre i przewlekłe zapalenie oskrzeli

U pacjentow z ostrym zapaleniem oskrzeli (rozwijajacym sie najczesciej po ostrejinfekcji wirusowej, takiej jak typowe przeziebienie czy grypa) zwykle niewykonuje sie posiewu plwociny, chyba ze stan kliniczny pacjenta sie niepoprawia.

Przewlekłe zapalenie oskrzeli jest długotrwajaca choroba uposledzajaca funkcjeukładu oddechowego, ktora przebiega z okresowymi zaostrzeniami. Wiekszoscpacjentow codziennie wykrztusza szara, sluzowa plwocine; w trakcie chorobywystepuja epizody pogorszenia stanu pacjenta i wykrztuszania wyraznie ropnejplwociny. Jest to tak zwane zaostrzenie przewlekłego zapalenia oskrzeli.W probkach plwociny czesto obecne sa typowe patogeny układu oddechowego(Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae lub — rzadziej — Moraxel-la (Branhamella) catarrhalis).

80

ZAKAZENIA DOLNYCH DROG ODDECHOWYCH

Ropien płuca

Ropien płuca moze uformowac sie w nastepstwie aspiracji ciała obcego,zawartosci zoładka lub wydzieliny gornych drog oddechowych (jama ustna lubgardło). Ten stan niekiedy jest okreslany terminem ,,aspiracyjnego zapaleniapłuc’’. Mozna podjac probe hodowli z odkrztuszonej plwociny (ktora zwykle mawyjatkowo brzydki zapach), lecz — jesli obecny jest ropien (uwidocznionyw badaniu radiologicznym) — materiałem do badan powinna byc zawarta w nimropa, ktora nalezy wykorzystac do badania mikroskopowego i posiewu. Niestetybrak jest wytycznych dotyczacych sposobu jej uzyskania, choc jedna z mozliwoscijest bezposrednia biopsja i usuniecie ropy. Czestym i waznym czynnikiemetiologicznym sa bakterie beztlenowe, takie jak Prevotella melaninogenica(wczesniej Bacteroides melaninogenicus) i Peptostreptococcus spp., pochodzacez flory jamy ustnej i gardła. Nalezy pobrac rope, dostarczyc do laboratoriumi opracowac zgodnie ze standardowymi metodami hodowli bakterii beztlenowychz ropy (patrz str. 104 i str. 117).

Zapalenie płuc oraz zapalenie oskrzeli i płuc

Ostre płatowe zapalenie płuc zwykle dotyczy pojedynczego płata płuca. Prawiezawsze wywoływane jest przez S. pneumoniae. Ta postac zapalenia pojawia sieepidemicznie. Przyczyna rzadziej wystepujacej podobnej formy zapalenia płucjest Klebsiella pneumoniae.

Klasyczna postac zapalenia płuc rozwija sie u niewielu pacjentow zakazonychS. pneumoniae lub K. pneumoniae, czestsza forma choroby jest zapalenie oskrzelii płuc z plamkami naciekowymi i zapalnymi (okreslanymi jako ,,konsolidacja’’),rozproszonymi w jednym lub czesciej w obu płucach.

Z zapaleniem oskrzeli i płuc zwiazanych jest wiele roznych czynnikow wiruso-wych i bakteryjnych. Poza S. pneumoniae i niekiedy H. influenzae, przyczynazapalenia oskrzeli i płuc, zwłaszcza podczas epidemii grypy lub odry, jestStaphylococcus aureus. Czesto takze stwierdza sie obecnosc Gram-ujemnychpałeczek (szczegolnie E. coli i K. pneumoniae) oraz Pseudomonas aeruginosa.Zakazenia te wystepuja powszechnie na oddziałach intensywnej terapii, zwłasz-cza w trakcie stosowania antybiotykow o szerokim spektrum działania lub przyprowadzeniu wentylacji mechanicznej i sa efektem nadmiernego zuzycia anty-biotykow oraz niewłasciwego monitorowania wczesnych objawow infekcjiu pacjentow.

W przypadku wystapienia wysieku w jamie opłucnej płyn nalezy zbadacmikroskopowo i wykonac posiew zgodnie z procedura opisana dla ropyi wysiekow.

Gruzlica płuc

Plwocina pacjentow z gruzlica płuc zwykle nie jest wyraznie ropna, niemniejropny charakter nie jest przeciwwskazaniem do jej wykorzystania w diagnostycegruzlicy. Wybarwione preparaty (metoda Ziehl-Neelsena) nalezy obejrzec w mi-kroskopie w celu szybkiej identyfikacji pacjentow z obecnoscia kwasoopornych

81

CZESC I

bakterii w plwocinie1. Po wykonaniu preparatu plwocina powinna zostac poddanaprocedurze dekontaminacji (patrz str. 85) w celu zniszczenia mozliwie najwiek-szej liczby niepratkowych drobnoustrojow i zachowania zywych pratkow gruzlicydo posiewu na podłoze Löwensteina-Jensena.

Poniewaz procedury bakteriologicznej diagnostyki ropnych infekcji drog od-dechowych, takich jak zapalenie oskrzeli i zapalenia płuc, zasadniczo roznia sieod procedur stosowanych w gruzlicy, zostana one omowione oddzielnie. Lekarzw skierowaniu do laboratorium musi jasno okreslic kierunek badan:• bakterie ropotworcze (H. influenzae, S. pneumoniae i in.),• pratki gruzlicy (M. tuberculosis),• obydwa typy bakterii.

Pobieranie probek plwociny

Pobieranie odpowiednich probek plwociny jest sztuka sama w sobie i zostałoopisane w innych opracowaniach2. Badanie zle pobranej probki plwociny mozedac fałszywe wyniki z powodu zanieczyszczenia probki bakteriami wchodzacymiw skład naturalnej flory jamy ustnej i gardła; ,,plwocina’’ zawierajaca slinei czastki pozywienia nie powinna byc badana.

Probke plwociny nalezy pobrac do sterylnego pojemnika z szerokim wlotem orazz bezpiecznym, szczelnym zamknieciem i niezwłocznie przesłac do laboratorium.Opoznione przesłanie plwociny po pobraniu moze spowodowac przerost probkizanieczyszczajacymi ja bakteriami i prowadzi do otrzymania mylacych wynikowbarwienia i hodowli. Z tego powodu nie zaleca sie przesyłania probek dolaboratorium poczta. Wyjatek stanowia probki pobrane do badan w kierunkugruzlicy, ktore moga byc przesyłane do lokalnych lub regionalnych laboratoriow.Nalezy scisle przestrzegac lokalnych i panstwowych przepisow, dotyczacychprzesyłania zakaznego (patogennego) materiału.

Opracowanie plwociny w laboratorium(w zakazeniach niegruzliczych)

Po pobraniu plwocina musi zostac natychmiast opracowana lub umieszczonaw chłodziarce.

Ocena makroskopowa

Nalezy odnotowac ocene makroskopowa plwociny. Mozliwe opisy obejmuja:ropna, zielonaropna, zołtasluzowo-ropna (tj. czesciowo sluzowa i czesciowo ropna)

1 Patrz Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World HealthOrganization, 2003.2 Specimen collection and transport for microbiological investigation. Alexandria, WHO RegionalOffice for the Eastern Mediterranean, 1995 (WHO Regional Publicatinos, Eastern MediterraneanSeries 8).Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva World Health Organization, 2003.Technical guide for sputum examination for tuberculosis by direct microscopy. Bulletin of theInternational Union Against Tuberculosis and Lung Disease, 4th ed. 1996.

82


podbarwiona krwiapodbarwiona krwia, z zielonymi kłaczkami*szara, sluzowa*szara, spieniona*biała, sluzowa*biała, spieniona*biała, sluzowa z czastkami pozywienia*wodnista (tj. obecna tylko slina)*wodnista z czastkami pozywienia

Probki oznaczone gwiazdkami nie powinny byc badane w kierunku zakazenniegruzliczych.


Preparat barwiony metoda Grama nalezy przygotowac z probki ropnej lubsluzowo-ropnej plwociny.

Jesli nie obserwuje sie sladow ropy (np. w probce szarej, sluzowej plwociny),barwienie metoda Grama moze wykazac jedynie obecnosc duzych komoreknabłonka płaskiego, czesto pokrytych masa przylegajacych bakterii. Jest towskazowka, ze probka zawiera głownie wydzieline jamy ustnej lub gardła i niepowinno sie prowadzic hodowli, ktorej wyniki beda niewiarygodne czy tez bardzomylace. Zaleca sie rezygnacje z hodowli w przypadku, gdy probka zawiera mniejniz 10 neutrofilow wielojadrzastych na 1 komorke nabłonka1.

U wielu pacjentow z ostra infekcja oddechowa (np. zapalenie płuc) i ropnaplwocina natychmiastowe wykonanie preparatu barwionego metoda Grama mozepomoc klinicyscie w wyborze antybiotykoterapii. Mozliwe wyniki to:• Gram-dodatnie dwoinki otoczone pusta przestrzenia z powodu niezabar-

wionych otoczek (podejrzenie S. pneumoniae);• małe Gram-ujemne krotkie pałeczki (prawdopodobnie H. influenzae);• Gram-ujemne dwoinki, widoczne wewnatrz- i zewnatrzkomorkowo (podej-

rzenie Moraxella catarrhalis);• Gram-dodatnie ziarenkowce w skupiskach, przypominajacych grona (podej-

rzenie S. aureus);• Gram-ujemne pałeczki (podejrzenie obecnosci Enterobacteriaceae lub Pseudo-

monas spp.);• duze Gram-dodatnie drozdzopodobne komorki czesto z grzybnia (wskazuja na

obecnosc Candida spp.).

Procedury hodowli i interpretacja

Jesli mikroskopowo probka przedstawia akceptowalna jakosc plwociny, wybracfragment ropnego materiału (lub najbardziej przypominajacego ropny) uzywajacsterylnej wymazowki lub ezy i posiac na rozne podłoza hodowlane.

1 Heinemann H.S., Radano R.R.: Acceptability and cost savings of selective sputum microbiology ina community teaching hospital. Journal of Clinical Microbiology, 1979, 10: 567 – 573.

83

CZESC I

Sugerowany zestaw podłozy obejmuje:• agar z krwia z rozmazem S. aureus, ułatwiajacym satelitarny wzrost H. in-

fluenzae i z krazkiem zawierajacym optochine, umieszczonym w centrumrozsiewu,

• agar czekoladowy,• agar MacConkeya.

Płytki z agarem z krwia i z agarem czekoladowym nalezy inkubowac w 35 – 36°Cw atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem wegla (np. eksykator), a płytkeMacConkeya w powietrzu atmosferycznym.

Jesli w barwionym preparacie obecne sa skupiska Gram-dodatnich ziarenkow-cow, przypominajace kształtem winogrona, zaleca sie wykorzystanie dodatkowopłytki agarowej z mannitolem (MSA). Obecnosc Gram-dodatnich drozdzopodob-nych struktur moze byc wskazaniem do posiewu na podłoze Sabouraud (dlaktorego konieczna jest inkubacja przez co najmniej 3 dni w 35 – 37°C). Posiew napodłoza MSA i Sabouraud nie musi byc wykonywany rutynowo dla wszystkichprobek plwociny.

Posiewy powinny byc odczytywane po całonocnej inkubacji (18 godzin),a reinkubacja przez dodatkowe 24 godziny jest wskazana, jesli wzrost jest słabszyniz oczekiwany na podstawie obserwacji mikroskopowych lub gdy obecne sabardzo drobne kolonie.

Typowe wyniki obserwacji przedstawiono ponizej:• Płaskie, jasne kolonie z wgłebionymi srodkami i strefa zielonej (α-) hemolizy

oraz strefa zahamowania wzrostu wokoł krazka z optochina moga wskazywacna S. pneumoniae. Jesli odczyt testu z krazkiem z optochina w pierwszymposiewie nie jest rozstrzygajacy, nalezy powtorzyc test na przesiewie. Niemozna zapominac, ze w fizjologicznej florze jamy ustnej i gardła wystepujainne α-hemolizujace szczepy (wspolnie nazywane paciorkowcami zielenieja-cymi).

• Drobne, kropelkowe kolonie rosnace na płytce agarowej z krwia w postaciniehemolizujacych kolonii satelitarnych i znacznie wieksze kolonie na płytceagaru czekoladowego lub agaru z krwia sugeruja obecnosc H. influenzae.Kolonie te najczesciej sa liczne, zwykle ponad 20 na płytce. Niektorelaboratoria dla potwierdzenia identyfikacji wykonuja testy z czynnikamiwzrostu X i V, ktore jednak wymagaja uwaznej kontroli. Serologicznetypowanie szczepow izolowanych z układu oddechowego najczesciej nie jestprzydatne, poniewaz wiekszosc z nich jest ,,szorstka’’ i nie podlega typowaniu.

• Kruche, suche, szarobiałe kolonie na płytkach agaru z krwia lub agaruczekoladowego, ktore mozna przesuwac w całosci za pomoca ezy, mogawskazywac na M. catarrhalis. Jesli istnieje potrzeba, mozna przeprowadzictesty rozkładu cukrow (wszystkie wyniki testow ujemne), ale wiekszosclaboratoriow ich nie wykonuje. Drobnoustroje Moraxella sa silnie oksydazodo-datnie, a wyglad ich kolonii i obraz mikroskopowy sa bardzo charakterystyczne.Jakkolwiek morfologicznie Moraxella przypomina Neisseria spp., do roz-nicowania mozna uzyc testu z trojmaslanem glicerolu, ktory jest hydrolizowanyprzez Moraxella.

• Sredniej wielkosci, złotoszare kolonie tworzone sa przez S. aureus. Testykoagulazowy i test fermentacji mannitolu sa dodatnie, choc szkiełkowy odczynkoagulacji (odczyn ,,zwiazanej’’ koagulazy) jest czasami ujemny. Jesli istniejesprzecznosc miedzy wygladem kolonii i testem szkiełkowym, nalezy prze-prowadzic probowkowy test koagulazy (,,wolna’’ koagulaza).

84


• Kolonie na agarze MacConkeya sugeruja obecnosc Enterobacteriaceae lubPseudomonas spp. lub Acinetobacter spp.

• Białawe, okragłe, matowe kolonie na agarze z krwia i agarze czekoladowymmoga wskazywac na Candida albicans, ktory bedzie rowniez rosnac po 3 – 4dniach na podłozu Sabouraud.

Warto podkreslic, ze pojedyncze kolonie kazdego z powyzszych organizmowpochodza z flory naturalnej układu oddechowego lub sa wynikiem kolonizacji (np.bakterie jelitowe, grzyby). Poniewaz nie maja wpływu na postepowanie z pacjen-tem, nie nalezy uwzgledniac ich w wyniku lub, jezeli zostana uwzglednione,zaznaczyc, ze jest to flora kolonizujaca.


Badanie lekowrazliwosci nalezy wykonywac tylko dla drobnoustrojow dominuja-cych w hodowli, natomiast nie ma takiej potrzeby w przypadku szczepowobecnych w posiewie jedynie w niewielkiej liczbie.

Interpretacje niektorych uzyskiwanych wynikow przedstawiono w tabeli 20.

Tabela 20. Interpretacja wynikow testow wrazliwosci dla bakterii o wyzszych wymaga-niach odzywczycha

Srednica strefy (mm)

Oporny Srednio wrazliwy Wrazliwy

S. pneumoniae (podłoze Mueller-Hin-tona z 5% krwi baraniej, inkubacjaw 5% CO2)

Oksacylina (1 µg) (dla benzylopenicyli-ny)

2 19b — 1 20

Tetracyklina (30 µg) 2 18 19 –22 1 22

Erytromycyna (15 µg) 2 15 16 –20 1 21

Chloramfenikol (30 µg) 2 20 — 1 21

Kotrimoksazol (25 µg) 2 15 16 –18 1 19

M. catarrhalis (podłoze Mueller-Hinto-na)

Tetracyklina (30 µg) 2 14 15 –18 1 19

Erytromycyna (15 µg) 2 13 14 –22 1 23Kotrimoksazol (25 µg) 2 10 11 –15 1 16

a National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards forantimicrobial susceptibility testing. M100-S8. Vol 18, 1998.

b Oporny lub srednio wrazliwy.

W badaniu lekowrazliwosci pałeczek Enterobacteriaceae i gronkowcow nalezywykorzystac standaryzowana metode dyfuzyjno-krazkowa (Kirby-Bauera). Wra-zliwosc szczepow S. pneumoniae na tetracykline, chloramfenikol, erytromycynei benzylopenicyline powinna byc oceniana na agarze Mueller-Hintona, wzboga-conym 5% krwia bydleca. Mozna rowniez uzyc zwykłego agaru z krwia.Wrazliwosc na benzylopenicyline lepiej oznaczyc uzywajac krazka zawierajace-go 1 µg oksacyliny, ktory wykazuje wieksza zgodnosc z wartosciami MIC dlabenzylopenicylin; jest rowniez bardziej stabilny. Krazki zawierajace benzylopeni-cyline moga szybko ulegac dezaktywacji w wyzszych temperaturach, co powodu-je uzyskanie niewiarygodnych wynikow.

85

CZESC I

Dla szczepow H. influenzae nalezy okreslic zdolnosc wytwarzania β-laktamaz,np. za pomoca testu z nitrocefina. Nie wytwarzajace β-laktamaz H. influenzaerzadko wykazuja opornosc na ampicyline. W zwiazku z powyzszym nie zaleca sieoznaczania wrazliwosci metoda dyfuzyjno-krazkowa.

Izolaty M. catarrhalis powinny byc badane w kierunku wytwarzania β-laktamaz.Dodatkowo mozna oznaczyc wrazliwosc na tetracykline i erytromycyne.

Dla Candida albicans nalezy ocenic wrazliwosc na wszystkie leki przeciw-grzybicze.

Wiekszosc laboratoriow przedstawia połilosciowe wyniki hodowli bakteryjnychna podłozach stałych, ktore mozna okreslic jako:(+) = kilka kolonii+ = słaby wzrost++ = srednio intensywny wzrost+++ = intensywny wzrost.

Hodowla Mycobacterium tuberculosis

Poza przygotowaniem preparatu bezposredniego barwionego metoda dla bakteriikwasoopornych, zawsze gdy istnieje kliniczne podejrzenie choroby, materiał(zwykle, choc nie zawsze, plwocina) nalezy posiac w kierunku M. tuberculosis.Niektorzy pacjenci z podejrzeniem gruzlicy płuc moga nie odkrztuszac plwociny.Wytwarzana przez nich niewielka ilosc plwociny jest natychmiast połykana.W takiej sytuacji lekarz powinien pobrac probke soku zoładkowego na czczo(zwykle wczesnie rano) i zneutralizowana wodoroweglanem sodu (100 mg)przesłac do laboratorium. Sok zoładkowy nalezy traktowac w ten sam sposob jakplwocine. Wykonywanie posiewow w kierunku pratkow gruzlicy wszystkichpobranych probek plwociny jest drogie i (chociaz pozwala zdiagnozowacpacjentow bez podejrzenia gruzlicy) nie zalecane rutynowo.

Procedura przygotowania probki do badania

Plwocina pochodzaca od pacjentow z infekcja gruzlicza czesto zawiera fragmentytkanki płucnej, ktore, jesli sa obecne, nalezy pobrac na posiew. Plwocina gruzliczawykrztuszana jest przez jame ustna i gardło, dlatego zanieczyszczenie probki florafizjologiczna gardła jest nieuniknione. Bakterie zanieczyszczajace probke muszazostac zniszczone, aby nie doszło do przerostu podłoza Löwensteina-Jensena.Procedura przygotowania probki (zageszczenie–trawienie–dekontaminacja) obo-wiazuje w przypadku kazdej probki pobranej z miejsca wystepowania floryfizjologicznej. Szeroko stosowane sa trzy procedury z uzyciem:– wodorotlenku sodu (NaOH) (Petroff);– wodorotlenku sodu N-acetyl-L-cysteiny (NALC-NaOH);– Zephiranu i fosforanu trojsodowego.

Procedura z uzyciem wodorotlenku sodu (Petroff)

Procedura ta pozwala na eliminacje zanieczyszczajacych mikroorganizmow,a ponadto umozliwia upłynnienie niekiedy sluzowej plwociny. Wodorotlenek

86


sodu jest toksyczny rowniez dla pratkow, dlatego w trakcie wykonywania metodynalezy upewnic sie, ze:– koncowe stezenie NaOH nie przekracza 2%;– pratki gruzlicze nie sa eksponowane na wodorotlenek sodu dłuzej niz przez

30 minut, wliczajac czas wirowania.

1. Wymieszac rowne objetosci plwociny i 4% wodorotlenku sodu 40 g/l(uprzednio poddanego sterylizacji w autoklawie) w sterylnej, szczelnej,50-mililitrowej szklanej butelce lub plastikowej stozkowatej probowce wirow-kowej.

2. Inkubowac w temperaturze pokojowej (25 – 30°C) przez 15 minut, delikatniewstrzasac mieszanine w mechanicznym mieszadle przez 5 minut. W goracymklimacie potrzebne moze byc schłodzenie lub skrocenie czasu reakcji do10 – 15 minut.

3. Odwirowac lub uzupełnic mieszanine do 50 ml destylowana woda lub buforemfosforanowym (pH 6,8), hamujac działanie NaOH.

4. Po 15 minutach odwirowac w 3000 g przez 15 minut. Ostroznie zlacsupernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim srodkiem dezyn-fekujacym (na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego). Zneutralizowac osadwkraplajac 2 mol/l roztworu HCl zawierajacego 2% czerwien fenolowa,połaczyc, wstrzasajac do chwili, gdy kolor zmieni sie trwale z czerwonego nazołty. Alternatywnie: dodac krople roztworu wskaznikowego, a nastepniedodawac po kropli HCl ciagle mieszajac.

5. Jesli posiew na podłoze bedzie wykonywany natychmiast, zawiesic zneut-ralizowany osad w 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wodydestylowanej. W innym przypadku zawiesic osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcjiV albumin bydlecych.

Procedura z uzyciem wodorotlenku soduN-acetyl-L-cysteiny

Nizsze stezenie NaOH w obecnosci czynnikow mukolitycznych, takich jakN-acetyl-L-cysteina (NALC), jest mniej agresywne wobec pratkow gruzlicy.Zarowno czas inkubacji, jak i temperatura nie maja tak kluczowego znaczenia, jakw przypadku procedury z NaOH. Krotki, nie przekraczajacy 24 godzin, czasprzechowywania aktywnego roztworu NALC-NaOH wymaga przeprowadzeniaprocedury w ciagu jednego dnia.

1. Połaczyc rowne objetosci roztworu cytrynianu sodu (29 g dwuwodzianucytrynianu sodu na litr wody destylowanej) oraz 4% wodorotlenku sodu(40 g/l) i autoklawowac mieszanine. Roztwor moze byc przechowywanyw temperaturze pokojowej.

2. Tuz przed uzyciem dodac 0,5 g NALC do 100 ml roztworu zawierajacegoNaOH i cytrynian sodu.

3. W zaleznosci od liczby probek przeznaczonych do dekontaminacji przygoto-wac 2,5 g NALC w 500 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu lub 5 g NALCw 1000 ml roztworu NaOH i cytrynianu sodu. Odczynniki sa przydatne dobadania przez 24 godziny.

4. Do probki umieszczonej w sterylnej, szczelnej, 50-mililitrowej szkla-nej butelce lub plastikowej stozkowej probowce wirowkowej dodacrowna objetosc aktywnego roztworu NALC-NaOH. Ostroznie dokrecic

87

CZESC I

zakretke, odwrocic probowke i wstrzasac delikatnie, nie dłuzej niz 30sekund.

5. Pozostawic na 15 minut w temperaturze pokojowej (20 – 25°C).6. Uzupełnic mieszanine do 50 ml woda destylowana lub 67 mmol/l buforem

fosforanowym (pH 6,8) w celu zahamowania działania NaOH. Ostroznie zlacsupernatant do pojemnika wypełnionego odpowiednim srodkiem dezyn-fekujacym (na bazie fenolu lub aldehydu glutarowego).

7. Jesli posiew na podłoze bedzie wykonywany natychmiast, zawiesic osadw 1 – 2 ml sterylnego 0,85% NaCl lub sterylnej wody destylowanej. W innymprzypadku zawiesic osad w 1 – 2 ml sterylnej frakcji V albumin bydlecych.

Procedura z uzyciem fosforanu trojsodowego

Pratki moga przezyc mimo przedłuzonego poddawania ich tej łagodnej procedu-rze. Dlatego czas inkubacji i temperatura nie sa restrykcyjne.

1. Przygotowac roztwor 1 kg trojfosforanu sodu (Na3 PO4 ·12H2O) w 4 litrachgoracej wody destylowanej, dodac 7,5 ml 17% chlorku benzylidenu (Ze-phiran), dobrze wymieszac i przechowywac w temperaturze pokojowej.

2. Wymieszac rowne objetosci plwociny (do 10 ml) z roztworem Zephiranui fosforanu trojsodowego w 50-mililitrowej, sterylnej, szczelnej, szklanejprobowce wirowkowej. Dokrecic zakretke i wytrzasac energicznie przez30 minut.

3. Odstawic mieszanine na dodatkowe 30 minut.4. Odwirowac w 3000 g przez 15 minut. Ostroznie zlac supernatant do pojemnika

wypełnionego odpowiednim srodkiem dezynfekujacym (na bazie fenolu lubaldehydu glutarowego) i ponownie zawiesic osad w 20 ml neutralizujacegobuforu fosforanowego, pH 6,61.

5. Odwirowac ponownie w 3000 g przez 15 minut. Zlac supernatant, a osad posiacna podłoze.

Hodowla

1. Posiac 3 krople (około 0,1 ml) osadu na co najmniej trzy probowki z podłozemLöwensteina-Jensena lub inne.

2. Sprawdzac regularnie wskaznik zanieczyszczenia inkubowanych podłozyi notowac liczbe zanieczyszczonych płytek.

Wskaznik zanieczyszczenia powinien wynosic 3 – 5%. Wyzszy wskaznik (ponad5%) zanieczyszczonych hodowli na podłozu Löwensteina-Jensena zwykle wska-zuje na niewystarczajaca skutecznosc procedury dekontaminacji. Wskaznikzanieczyszczenia < 3% sugeruje, ze procedura dekontaminacji została prze-prowadzona zbyt intensywnie i obecne w probce pratki moga nie wyrosnac.

1 Przygotowanie neutralizujacego buforu fosforanowego 67 mmol/l.Roztwor podstawowy:

A. Rozpuscic 9,47 g nieuwodnionego fosforanu sodu w 1 litrze wody destylowanej.B. Rozpuscic 9,07 g nieuwodnionego fosforanu potasu w 1 litrze wody destylowanej.Dla buforu o pH 6,8: zmieszac 50 ml roztworu podstawowego A z 50 ml roztworu pod-stawowego B.Dla buforu o pH 6,6: zmieszac 37,5 ml roztworu podstawowego A z 62,5 ml roztworupodstawowego B.Sprawdzic pH. Jesli potrzeba, dodac roztworu A, aby podniesc pH, lub roztworu B, abyobnizyc pH.

88


Interpretacja hodowli M. tuberculosis

Probowki z podłozem Löwensteina-Jensena powinny byc inkubowane przez2 – 3 dni w 35 – 37°C w pozycji poziomej, z odkrecona o poł obrotu nakretka.Nastepnie hodowle nalezy inkubowac w temperaturze 37°C przez 6 tygodnii obserwowac wzrost w cotygodniowych odstepach czasu. Podczas tej kilkutygo-dniowej obserwacji kazdy pojawiajacy sie wzrost bakterii powinien zostacodnotowany. Przygotowac preparat barwiony metoda Ziehl-Neelsena. Jeslimikroorganizmy nie sa kwasoopornymi bakteriami, hodowle mozna uznac zazanieczyszczona.

Typowe ludzkie szczepy Mycobacterium tuberculosis maja ,,szorstkie, twardei płowozołte’’ kolonie, czasem widoczne juz po 2 – 3 tygodniach inkubacji (rzad-ko wczesniej). Kolonie szczepow bydlecych (M. bovis) sa zwykle gładkiei białawokremowe. Inne, zwykle niepatogenne gatunki mykobakterii moga rosnacszybciej (niekiedy juz po kilku dniach), wytwarzajac — lub nie — pigmenty(czerwony, zołty lub pomaranczowy). Jesli szczep tworzy kolonie o typowymwygladzie i barwienie Ziehl-Neelsena preparatu z hodowli potwierdza obecnosckwasoopornych pratkow, w wyniku nalezy podac: ,,Mycobacterium spp., praw-dopodobnie M. tuberculosis’’; izolaty nalezy przesłac do referencyjnego laborato-rium krajowego lub lokalnego w celu potwierdzenia identyfikacji i oznaczenialekowrazliwosci izolowanych szczepow.

Podstawowe zasady bezpieczenstwa

Z plwocina nalezy zawsze postepowac bardzo uwaznie i uzywac szczelnychpojemnikow na probki. Jest to bardzo wazne, zwłaszcza gdy konieczne jestprzesłanie probek poczta. Zaleca sie, aby wszystkie procedury postepowaniaz plwocina (nawet jesli na skierowaniu nie ma informacji o gruzlicy) byłyprzeprowadzane w bakteriologicznie bezpiecznych warunkach. Zaleca sie, abylaboratorium przeprowadzajace badania probek prawdopodobnie zawierajacychpratki gruzlicy spełniało wymagania bezpieczenstwa biologicznego przynajmniejna poziomie 21.

Szczegolna uwage nalezy zachowac podczas otwierania, zamykania i wstrzasaniabutelek oraz podczas wirowania materiału. Tworzenie skazonego aerozolu mozebyc niebezpieczne dla personelu, dlatego nalezy przestrzegac własciwychprocedur medycyny pracy2.

Pocztowy transport hodowli M. tuberculosis do referencyjnego laboratoriumkrajowego wymaga szczegolnej ostroznosci z powodu ryzyka ewentualnegowypadku lub uszkodzenia pojemnika. Nalezy uzywac jedynie pojemnikowi materiałow wysyłkowych uznanych za bezpieczne i dostosowanych do wyma-gan poczty.

1 Manual of basic techniques for a health laboratory, 2nd ed. Geneva, World Health Organization,2003.2 Laboratory services in tuberculosis control Part I: Organization and management. Geneva, WorldHealth Organization, 1998 (niepublikowane dokumenty WHO/TB/98.258).

89

CHOROBY PRZENOSZONE DROGA KONTAKTOW SEKSUALNYCH

Choroby przenoszone drogakontaktow seksualnych

Wprowadzenie

W ciagu ostatnich dwudziestu lat ogromnie wzrosła liczba drobnoustrojowprzenoszonych droga kontaktow seksualnych oraz zwiazanych z nimi objawowklinicznych. W tabeli 21 wymienione zostały wybrane mikroorganizmy przeno-szone droga płciowa i wywoływane przez nie choroby. Diagnostyka niektorychz nich stanowi wazne wyzwanie dla klinicznego laboratorium mikrobiologicz-nego. Diagnostyka laboratoryjna jest istotnym elementem w postepowaniuz pacjentem, w kontroli takich chorob, jak rzezaczka czy kiła, i ma znaczenie nietylko dla pacjenta, ale takze dla jego partnera seksualnego.

W rozdziale zostanie krotko przedstawiona identyfikacja najczesciej pojawiaja-cych sie mikroorganizmow przenoszonych droga seksualna, wystepujacych

Tabela 21. Wybrane mikroorganizmy przenoszone droga płciowa i towarzyszace imobjawy

Czynnik etiologiczny Objaw

Neisseria gonorrhoeae Zapalenie gruczołu przedsionkowego wiekszego (Bartholina),zapalenie szyjki macicy, zapalenie kosmowkowo-owodnio-we, zapalenie spojowek, uogolniona infekcja gonokokowa(zapaleniestawow, skory, pochewek sciegnistych), zapalenieendometrium, zapalenie najadrzy, bezpłodnosc, zapaleniegardła, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenie to-rebki watroby, zapalenie odbytu, zapalenie prostaty, zapale-nie jajowodow, zapalenie cewki moczowej

Chlamydia trachomatis(serotypy D –K)

Zapalenie gruczołu przedsionkowego wiekszego (Bartholina),zapalenie szyjki macicy, zapalenie spojowek u noworodkow,zapalenie endometrium, zapalenie najadrzy, zapalenie płucu noworodkow, bezpłodnosc, zapalenie ucha srodkowegou niemowlat, zapalenie narzadow miednicy, zapalenie torebkiwatroby, przedpokwitaniowe zapalenie pochwy, zapalenieodbytu, zespoł Reitera, zapalenie jajowodow, zapalenie cewkimoczowej

Chlamydia trachomatis(serotypy L1, L2, L3)

Ziarniniak weneryczny

Treponema pallidum Kiła

Haemophilus ducreyi Wrzod miekki

Calymmatobacteriumgranulomatis

Ziarniniak pachwinowy (donovanosis)

Mobiluncus spp. Bakteryjna waginoza

Ludzki (alfa) wirus opry-szczki (HSV1 i HSV2)

Opryszczka narzadow płciowych oraz warg i jamy ustnej,zapalenie opon mozgowo-rdzeniowych, opryszczka noworo-dkow, zapalenie odbytu

Wirus cytomegalii (CMV) Zakazenie wrodzone

Ludzki Papillomavirus(HPV)

Rak szyjki macicy, kłykciny wirusowe

Ludzki wirus nabytegoniedoboru odpornosci(HIV)

Zespoł nabytego niedoboru odpornosci (AIDS) oraz chorobytowarzyszace AIDS

Wirus zapalenia watrobytypu B (HBV)

Wirusowe zapalenie watroby typu B

Gardnerella vaginalis Zapalenie cewki moczowej, zapalenie pochwy

Candida albicans Zapalenie zołedzi i napletka, zapalenie sromu i pochwy

90


w probkach pochodzacych z zenskich i meskich drog moczowo-płciowych.Czynniki wirusowe i bakteryjne, takie jak: Ureaplasma urealyticum, Myco-plasma hominis i Mobiluncus spp., nie zostana tu omowione. W celu uzyskaniabardziej szczegołowych informacji, odsyłamy czytelnika do odnosnych publikacjiWHO1.

Zapalenie cewki moczowej u mezczyzn

Zapalenie cewki moczowej u mezczyzn klinicznie charakteryzuje sie wydzielinaz cewki i/lub zaburzeniami w oddawaniu moczu, czesto jednak wystepujabezobjawowe infekcje wywołane przez Neisseria gonorrhoeae lub Chlamydiatrachomatis. Nieleczone gonokokowe lub chlamydialne zapalenie cewki moczo-wej moze rozwinac sie w zapalenie najadrzy. U homoseksualnych mezczyznmoga wystepowac infekcje odbytu i jamy ustnej wywołane przez N. gonorrhoeaei C. trachomatis.

W celu ustalenia postepowania z pacjentem zapalenia cewki moczowej powinnybyc podzielone na gonokokowe i niegonokokowe (NGU). Blisko połowaprzypadkow NGU wywołana jest przez C. trachomatis, jednak etiologia wiekszo-sci nawracajacych zakazen nie została w pełni wyjasniona. Zgodnie z badaniamiprzyczyna zapalenia cewki moczowej moze byc zakazenie Ureaplasma urealyti-cum, a w 1 – 3% przypadkow NGU Trichomonas vaginalis. Notowano rowniezinfekcje wywołane przez ludzki Herpesvirus. Czynniki bakteryjne, takie jak:gronkowce, pałeczki Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp.,moga byc izolowane z cewki zdrowych mezczyzn, lecz nie udowodniono ichudziału w zapaleniu cewki moczowej.

Badanie probki w kierunku obecnosci C. trachomatis nie jest przedmiotemniniejszego opracowania. Poza izolacja na hodowlach komorkowych bardziejdostepne stały sie ostatnio niehodowlane metody wykrywania chlamydii zapomoca testow immunoenzymatycznych, immunofluorescencji i amplifikacjikwasu nukleinowego (PCR). Powyzsze metody nadal sa zbyt drogie.


W celu pobrania do badania wydzieliny z cewki moczowej nalezy wprowadzic docewki wymazowke o małej srednicy lub sterylna eze bakteryjna i przed jejwyciagnieciem delikatnie przekrecic. Ropna wydzieline mozna pobrac bezpo-srednio na wymazowke lub eze do posiewu. Wazny jest rodzaj uzytej wymazowki.Do hodowli N. gonorrhoeae zalecana jest wymazowka bawełniana z weglemaktywnym lub z alginianem wapnia, a takze wymazowka z dakronu. Jesli dopobierania materiału te specjalne, przygotowywane komercyjnie, wymazowki niesa dostepne i uzyto zwykłych wymazowek z waty, probke nalezy natychmiastposiac. W przypadku zapalenia cewki moczowej masaz prostaty nie zwiekszaodstetka izolacji gonokokow lub chlamydii.

Wymazy odbytnicze nalezy pobrac wymazowka wprowadzajac ja do kanałuodbytu na głebokosc 4 – 5 cm. Probki z tylnej sciany gardła i krypt migdałkownalezy pobrac wymazowka i natychmiast posiac.

1 Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva,World Health Organization, 1999.

91

CZESC I

Najlepiej, jesli probki w kierunku obecnosci N. gonorrhoeae posiewane sa napodłoze hodowlane bezposrednio po pobraniu. Posiane płytki nalezy umiescicw eksykatorze lub w atmosferze zawierajacej 5 – 10% dwutlenku wegla, o wyso-kiej wilgotnosci. Jesli natychmiastowy posiew i inkubacja sa niemozliwe, nalezyuzyc podłoza transportowego, takiego jak Amies lub Stuart. Czas transportupowinien byc mozliwie najkrotszy, maksymalnie do 12 godzin, w temperaturzeotoczenia do 30°C. Nalezy unikac schłodzenia.

Badanie bezposrednie i interpretacja

W wiekszosci badan wykazano, ze obecnosc czterech lub wiecej wielojadrzastych(PMN) leukocytow w polu widzenia w immersji olejowej zdecydowanie wskazujena zapalenie cewki moczowej u mezczyzn. Opisane kryterium jest szczegolnieuzyteczne dla lekarza, ktory musi podjac decyzje o rozpoczeciu leczenia pacjentaze słabo nasilonymi objawami.

W wiekszosci przypadkow rzezaczki u kobiet wydzielina jest ropna, a w rozmaziez cewki moczowej widoczne sa liczne wielojadrzaste leukocyty (> 10 w poluwidzenia w immersji olejowej). Jakkolwiek nie zawsze jest tak w przypadkuNGU, ktore daje mniej nasilona reakcje zapalna. Rozmazy z wiecej niz 4 PMNleukocytami w polu widzenia i bez wewnatrzkomorkowych Gram-ujemnychdwoinek wskazuja na NGU.

Cienka warstwe materiału nalezy naniesc wymazowka na szkiełko podstawowe,preparat utrwalic temperatura i wybarwic błekitem metylenowym lub metodaGrama. Obecnosc Gram-ujemnych wewnatrzkomorkowych dwoinek w wielojad-rzastych leukocytach w preparacie bezposrednim z cewki moczowej wskazuje narzezaczke.

Nie zaleca sie wykonywania barwionych metoda Grama preparatow z probekpobranych z cewki moczowej u kobiet bez objawow zakazenia, ze slepychwymazow odbytniczych lub z probek z jamy ustnej. Jednakze badanie mikro-skopowe ropnego materiału otrzymanego w anoskopii ma wysoka wartoscdiagnostyczna.

Hodowla Neisseria gonorrhoeae

Posiane płytki z modyfikowanym podłozem agarowym Thayer-Martina (MTM)1

(lub agarem New York City (NYC))2 nalezy inkubowac w 35°C w wilgotnej

1 Modyfikowany agar Thayer-Martina przygotowuje sie przez dodanie w 50°C mieszaniny anty-biotykow i IsoVitaleX lub rownowaznego suplementu do agaru czekoladowego przygotowanegoz agaru GC lub agaru Columbia, stanowiacego podstawowe podłoze. Komercyjnie dostepna z wieluzrodeł jest mieszanina zawierajaca 3 lub 4 antybiotyki; mieszanina VCN zawiera wankomycyne,kolistyne i nystatyne: VCNT zawiera rowniez trimetoprim.Koncowe stezenie antybiotykow w przygotowanym podłozu:– wankomycyna: 3 µg/ml – nystatyna: 12,5 IU/ml– kolistyna: 7,5 µg/ml – mleczan trimetoprimu: 5 µg/ml2 Modyfikowane podłoze New York City przygotowuje sie przez dodanie do 500 ml bazowegosterylnego agaru GC schłodzonego do 50°C nastepujacych dodatkow:– 50 ml krwi konskiej lizowanej przez dodanie 5 ml/l saponiny,– sterylny autolizat drozdzowy,– zestaw antybiotykow zawierajacy: wankomycyne, kolistyne, amfoterycyne i trimetoprim.Składniki dostepne sa komercyjnie z Oxoid Ltd. Wade Rd, Basingstoke, Hants RG24 8PW, England.

92


atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem wegla (eksykator) i obserwowac codzien-nie przez dwa dni. Laboratoria przeprowadzajace duza liczbe badan probekw kierunku N. gonorrhoeae, poza selektywnym MTM, stosuja czesto nieselek-tywny agar czekoladowy wzbogacony dodatkiem IsoVitaleX lub innym, ponie-waz 3 – 10% gonokokow moze wykazywac wrazliwosc na stezenia wankomycynyuzyte w podłozu selektywnym.

Kolonie gonokokow po 24 godzinach moga byc jeszcze niewidoczne. Pojawiajasie po 48 godzinach jako szare lub białe, nieprzezroczyste, uniesione i opalizujacekolonie roznych rozmiarow i morfologii.

Identyfikacja Neisseria gonorrhoeae

Wstepna identyfikacja N. gonorrhoeae izolowanych z materiałow pobranychz drog moczowo-płciowych oparta jest na dodatniej reakcji oksydazoweji obecnosci Gram-ujemnych dwoinek widocznych w preparacie barwionymmetoda Grama. W celu potwierdzenia identyfikacji mozna przeprowadzic testyrozkładu weglowodanow lub inne, stosujac metody i podłoza omowione szczego-łowo w innych opracowaniach1.

Badanie wrazliwosci na antybiotyki

Istnieje geograficzne zroznicowanie wrazliwosci N. gonorrhoeae na benzylopeni-cyline. W niektorych regionach, takich jak Afryka podsaharyjska czy połu-dniowo-wschodnia Azja, wiekszosc szczepow gonokokowych wykazuje zdolnoscdo produkcji β-laktamaz. Przenoszona chromosomalnie, niezwiazana z wy-twarzaniem β-laktamaz opornosc na benzylopenicyline staje sie coraz czestszaw wielu krajach. Metoda dyfuzji krazkowej nie jest jednak przydatna dowykrywania takich szczepow.

Na obszarach, gdzie w zakazeniach gonokokowych stosowane sa benzylopenicy-lina, ampicylina i amoksycylina, szczepy N. gonorrhoeae (szczegolnie w razieniepowodzenia terapii) powinny byc rutynowo badane w kierunku wytwarzaniaβ-laktamaz jednym z zalecanych testow, takich jak test z nitrocefina2. Do testuz nitrocefina nalezy w małej probowce przygotowac gesta zawiesine z kilkukolonii i 0,2 ml fizjologicznego roztworu soli; nastepnie do zawiesiny dodac0,025 ml nitrocefiny, mieszac przez minute. Szybka zmiana koloru z zołtego narozowy lub czerwony jest dowodem na wytwarzanie β-laktamazy przez badanyszczep.

Rutynowe badanie wrazliwosci N. gonorrhoeae na antybiotyki metoda dyfuzyjno--krazkowa nie jest zalecane.

1 Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva,World Health Organization, 1999.2 Odczynnik Nitrocefin jest dostepny w firmie Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke, Hants RG248PW, England; zawiera 1 mg nitrocefiny (SR112) i fiolke rozpuszczalnika (SR112A). Testprobowkowy moze byc zastapiony testem krazkowym z uzyciem krazka nasyconego nitroce-fina (krazek cefinazowy dostepny z BD Diagnostic Systems, 7 Loveton Circle, Sparks, MD 21152,USA).

93

CZESC I

Probki z zenskich narzadow płciowych

Flora pochwy kobiety przed menopauza składa sie głownie z laseczek kwasumlekowego i roznych fakultatywnie tlenowych i beztlenowych bakterii.

Nieprawidłowa wydzielina z pochwy moze byc wynikiem:– zapalenia pochwy: Gardnerella vaginalis, Candida albicans;– bakteryjnej waginozy: przerost bakterii beztlenowych i Mobiluncus spp.;– zapalenia szyjki macicy: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis.

Inne bakterie, takie jak Enterobacteriaceae, nie sa udowodniona przyczynazapalenia pochwy. Zapalenie pochwy u dziewczynek przed okresem pokwitaniamoze byc wywołane przez N. gonorrhoeae lub C. trachomatis.

Bakteryjna waginoza (niespecyficzne zapalenie pochwy) jest stanem charak-teryzujacym sie obfita, brzydko pachnaca wydzielina, z towarzyszacym znacza-cym wzrostem Mobiluncus spp. i roznych bezwzglednych beztlenowcow orazspadkiem liczby pochwowych laseczek kwasu mlekowego. Minimalnym warun-kiem rozpoznania bakteryjnej waginozy jest obecnosc co najmniej trzechz nastepujacych objawow: nieprawidłowa wydzielina z pochwy, pH pochwy> 4,5, komorki wskaznikowe (komorki nabłonkowe z tak licznie przylegajacymibakteriami, ze niewidoczne staja sie obrysy komorki) i rybi, aminopodobnyzapach po dodaniu do wydzieliny pochwowej kropli 10% wodorotlenku potasu.

Zapalenie cewki moczowej moze byc wywołane takze przez N. gonorrhoeaei C. trachomatis.

Zakazenia wstepujace N. gonorrhoeae, C. trachomatis, beztlenowymi i wzgledniebeztlenowymi bakteriami moga powodowac zapalenie narzadow miednicy(pelvic inflammatory disease — PID) i w konsekwencji niemoznosc donoszeniaciazy lub ciaze pozamaciczna.

Bakteryjne zakazenia narzadow płciowych podczas ciazy, w tym zakazeniaN. gonorrhoeae i C. trachomatis, moga byc przyczyna powikłan, takich jak:przedwczesny porod, przedwczesne pekniecie pecherza płodowego, zapaleniebłon płodowych, poporodowe zapalenie błony sluzowej macicy u matki i zapale-nie spojowek, zapalenie płuc oraz zespoł zakazenia owodni u noworodka.

Na specjalne zlecenie materiały pobrane z szyjki macicy i pochwy moznaposiewac w kierunku S. aureus (zespoł szoku toksycznego), S. agalactiae(paciorkowiec grupy B, zakazenia noworodkow), Listeria monocytogenes (zaka-zenia noworodkow) i Clostridium spp. (poronienie septyczne).

Jakkolwiek infekcje C. trachomatis i ludzkim Herpesvirus sa powszechne, ichdiagnostyka laboratoryjna wymaga drogiego sprzetu oraz odczynnikow i niebedzie tutaj omawiana.


Wszystkie probki powinny byc pobierane podczas badania we wziernikach.Wziernik przed uzyciem mozna zwilzyc ciepła jałowa woda, nie mozna natomiastuzywac antyseptykow i kremow do badania ginekologicznego, poniewaz mogaone działac letalnie na gonokoki.

94


Do badania w kierunku obecnosci drozdzy, G. vaginalis i bakteryjnej waginozyprobki wydzieliny pochwowej mozna pobrac wymazowka z tylnego sklepieniapochwy. Probki do hodowli gonokokow i chlamydii powinny byc pobrane z błonysluzowej szyjki macicy. Po załozeniu wziernikow bawełniana wymazowka nalezyusunac czop sluzowy. Wymazowke do pobierania materiału (patrz str. 90) nalezywprowadzic do kanału szyki macicy i obracac przez co najmniej 10 sekund przedwyciagnieciem.

Probki z cewki moczowej, odbytu i z jamy ustnej pobiera sie w podobny sposobjak u mezczyzn.

W kazdym przypadku zapalenia narzadow miednicy (PID) nalezy pobracprzynajmniej probki z szyjki macicy w kierunku N. gonorrhoeae. Pobieraniemateriału z jajowodu jest bardziej wiarygodne, ale w wiekszosci regionownajlepsza dostepna probka jest aspirat z zagłebienia odbytniczo-macicznego(jamy Douglasa).

U dzieci z ciezkim noworodkowym zapaleniem spojowek nalezy wymazowka lubeza pobrac wydzieline z worka spojowkowego.

Z wyjatkiem probek badanych w kierunku C. trachomatis, do transportuwymazow z szyjki i pochwy najbardziej odpowiednie sa podłoza transportoweAmies i Stuart.

Badanie bezposrednie i interpretacja

Bezposrednie badanie wydzieliny z pochwy jest metoda z wyboru w diag-nostyce zapalenia pochwy, lecz mniej przydatna w diagnostyce zapalenia szyjkimacicy.

Preparat bezposredni przygotowywany jest na szkiełku podstawowym, na ktorymw fizjologicznym roztworze soli umieszcza sie probke materiału pobranegoz pochwy, a nastepnie nakrywa szkiełkiem nakrywkowym. Zapewnia to rozdzie-lenie komorek, ktore w innym przypadku moga sklejac sie w grudki. Preparatnalezy ogladac pod powiekszeniem × 400 poszukujac typowych ruchliwychT. vaginalis, paczkujacych drozdzy i komorek wskaznikowych (,,clue cells’’).C. albicans moze tworzyc pseudogrzybnie, obserwowane niekiedy w materialez pochwy. Komorki wskaznikowe sa obecne u wiekszosci kobiet z bakteryjnawaginoza. Ziarnisty lub brudny wyglad cytoplazmy komorek nabłonkowych jestmniej obiektywnym kryterium niz utrata granic komorki. Badanie mikroskopowepreparatow bezposrednich z szyjki macicy nie jest zalecane.

W diagnostyce bakteryjnej waginozy metoda z wyboru jest przygotowanie pre-paratow barwionych metoda Grama. Preparat nalezy wykonac delikatnie przeta-czajac wymazowke po szkiełku podstawowym. Prawidłowy rozmaz z pochwyzawiera głownie laseczki kwasu mlekowego (duze, Gram-dodatnie) oraz mniejniz 5 leukocytow w polu widzenia. W rozmazach pochodzacych od kobiet z wa-ginoza bakteryjna obserwuje sie pokryte małymi Gram-ujemnymi pałeczkamikomorki wskaznikowe (,,clue cells’’) oraz mieszana flore: liczne małe Gram--ujemne i Gram-zmienne pałeczki, ziarenko-pałeczki, czesto takze Gram-ujemnezakrzywione pałeczki, nie stwierdza sie natomiast wiekszych, Gram-dodatnichlaseczek. W polu widzenia widoczne sa jedynie nieliczne (< 5) leukocyty. Obrazten jest czułym i swoistym wskaznikiem bakteryjnej waginozy.

95

CZESC I

Duza liczba leukocytow (> 10 komorek w polu widzenia) w bezposrednimpreparacie z pochwy barwionym metoda Grama wskazuje na rzesistkowice lubzapalenie szyjki macicy.

Barwienie Grama nie jest szczegolnie przydatne w diagnostyce zakazen gonoko-kowych u kobiet. Badanie oparte na poszukiwaniu Gram-ujemnych wewnatrz-komorkowo zlokalizowanych dwoinek w barwionych metoda Grama preparatachbezposrednich z szyjki macicy ma czułosc 50 – 70% i swoistosc 50 – 90%, cowskazuje na niewielka wartosc tej metody diagnostycznej w populacji o niskiejczestosci wystepowania rzezaczki. Obecnosc Gram-ujemnych wewnatrzkomor-kowych dwoinek widocznych w preparatach z szyjki macicy powinna zostacodnotowana bez okreslenia, ze sa to N. gonorrhoeae lub gonokoki. Mozna w tensposob uniknac nadinterpretacji rozmazow z szyjki macicy, ktore czesto zawierajaGram-ujemne ziarenko-pałeczki oraz dwubiegunowo zabarwione pałeczki.

Głownym celem wykonywania preparatow bezposrednich z szyjki macicy jestpotwierdzenie rozpoznania sluzowo-ropnego zapalenia szyjki macicy: obecnoscwiecej niz 10 wielojadrzastych leukocytow w polu widzenia wskazuje na roz-poznanie zakazenia, wywołanego zwykle przez N. gonorrhoeae i/lub C. tracho-matis.

Badanie preparatow bezposrednich ze spojowek barwionych metoda Grama jestczuła i swoista metoda diagnostyczna rzezaczkowego zapalenia spojowek.Obecnosc wewnatrzkomorkowych Gram-ujemnych dwoinek potwierdza rozpo-znanie.

Hodowla

Probki z szyjki macicy, odbytu, cewki moczowej, spojowek i z zagłebieniaodbytniczo-macicznego moga byc posiewane w kierunku N. gonorrhoeae metodaopisana na str. 91, 92. Badanie probek nalezy rozpoczac natychmiast po ichdostarczeniu do laboratorium lub — korzystniej — jeszcze w klinice. U kobiet,w odroznieniu od mezczyzn, posiewy maja kluczowe znaczenie w diagnostyceinfekcji gonokokowych. Czułosc pojedynczego posiewu u kobiet wynosi80 – 90%. Jest mniejsza w przypadku probek pobranych w okresie około-porodowym.

W diagnostyce bakteryjnej waginozy nie zaleca sie prowadzenia hodowli w kie-runku G. vaginalis lub beztlenowcow, poniewaz sa one wykrywane u 20 – 40%kobiet bez infekcji pochwy. Obecnosc G. vaginalis w wydzielinie z pochwy niejest wystarczajacym wskazaniem do leczenia; leczone powinny byc tylkopacjentki spełniajace wszystkie kryteria diagnostyczne bakteryjnej waginozy.

W porownaniu z badaniem mikroskopowym hodowla zwieksza wykrywalnoscC. albicans o 50 – 100%. Poniewaz posiew w kierunku Candida jest dodatni nawetprzy niewielkiej liczbie grzybow, ktora moze wystepowac u 10 – 30% kobiet bezobjawow zapalenia pochwy, tylko obfity wzrost C. albicans stanowi dowodkandydiazy pochwy. W zwiazku z tym nie zaleca sie rutynowego prowadzeniahodowli. Podobnie, poza preparatem bezposrednim nie zaleca sie posiewuw kierunku G. vaginalis, ktory najczesciej wykrywa jedynie bezobjawowenosicielstwo.

96


Probki z owrzodzen narzadow płciowych

Owrzodzenia narzadow płciowych sa czestym problemem w wielu rozwijajacychsie krajach. Ich diagnostyka i leczenie sa wyzwaniem zarowno dla lekarzy, jaki dla laboratorium. Powszechne sa infekcje mieszane. Zmiany owrzodzeniowenarzadow płciowych moga byc wywołane przez rozne czynniki przenoszonedroga kontaktow seksualnych:– ludzki Herpesvirus,– Treponema pallidum,– Haemophilus ducreyi,– Calymmatobacterium granulomatis, wywołujacy ziarniniaka pachwiny (dono-

vanosis),– Chlamydia trachomatis serotypy L1, L2, L3.

W wielu rozwijajacych sie krajach wirus opryszczki jest najczestsza przyczynaowrzodzen narzadow płciowych i zagrazajacych zyciu powikłan u pacjentowz niedoborami odpornosciowymi oraz u noworodkow kobiet z infekcja. Diagnos-tyka laboratoryjna zakazenia nie bedzie tu omawiana.

Kiła jest wciaz najpowazniejsza choroba weneryczna, ktora moze prowadzic dociezkich poznych nastepstw oraz kiły wrodzonej. Mimo ze testy serologiczneodgrywaja wazna role w diagnostyce wszystkich stadiow kiły, w tym miejscuzostanie omowione tylko badanie w ciemnym polu widzenia. Techniki i inter-pretacja testow serologicznych w diagnostyce kiły zostały szczegołowo przed-stawione w innych opracowaniach1.

Wrzod miekki jest głowna postacia owrzodzen narzadow płciowych w wielurozwijajacych sie regionach. Objawy kliniczne obejmuja bolesne, ropne owrzo-dzenie(a), z towarzyszacym bolesnym, czesto ropnym, zapalnym obrzekiempachwinowych wezłow chłonnych. Nie obserwowano wystepowania poznychkonsekwencji zakazenia. Kliniczne roznicowanie z innymi owrzodzeniaminarzadow płciowych jest trudne. Wrzod miekki zwieksza ryzyko zakazenia HIV.

Ziarniniak pachwiny charakteryzuje sie zywoczerwonym, ziarniniakowymowrzodzeniem narzadow płciowych. Obrzek zapalny wezłow chłonnych jestrzadki.

Chlamydiowy ziarniniak limfatyczny charakteryzuje sie pachwinowa i/lub udowalimfadenopatia i rzadziej obecnoscia małych, samoistnie gojacych sie owrzodzen.Diagnostyka oparta jest na testach serologicznych i izolacji C. trachomatisserotypow L1, L2, L3.

Pobieranie probek

Treponema pallidum: Nałozyc rekawiczki chirurgiczne. Scisnac owrzodzeniemiedzy dwoma palcami i, uzywajac gazikow, oczyscic powierzchnie zmianyroztworem fizjologicznym soli. Obecne strupki usunac. Zetrzec pierwsze kroplekrwi (jesli sie pojawia) i dotykajac czystym szkiełkiem podstawowym powierz-chni zmiany pobrac probke surowiczego wysieku. Natychmiast nałozyc na krople

1 Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted disease. Geneva,World Health Organization, 1999.

97

CZESC I

wysieku czyste szkiełko nakrywkowe. Alternatywnie probka moze byc pobrana zezmiany lub powiekszonego wezła chłonnego za pomoca sterylnej igły i strzyka-wki. Preparat powinien byc niezwłocznie odczytany w ciemnym polu widzeniaprzez doswiadczonego mikrobiologa.

Haemophilus ducreyi: Probke nalezy pobrac wymazowka z podstawy owrzodze-nia i posiac bezposrednio na podłoze. Materiał mozna rowniez uzyskac z po-wiekszonych zapalnie wezłow chłonnych pachwinowych, lecz wyhodowanieH. ducreyi z takiego materiału jest mniej prawdopodobne. Przydatnosc podłozytransportowych dla H. ducreyi nie została dostatecznie oceniona.

Przy podejrzeniu ziarniniaka pachwiny nalezy wykonac biopsje tkanki lezacej podpowierzchnia aktywnie ziarninujacej zmiany. Przygotowac swieze preparaty zezmiazdzonych fragmentow materiału biopsyjnego. Alternatywnie jeden z prepa-ratow moze zawierac zeskrobiny z powierzchni zmiany.

Badanie bezposrednie

Wykazanie kretkow w materiale ze zmiany jest metoda z wyboru w diagnostycekiły pierwotnej. Mimo iz T. pallidum mozna wybarwic (np. azotanem srebra), zewzgledu na wieksza czułosc i swoistosc zalecana jest mikroskopia w ciemnympolu widzenia. Do badania potrzebny jest mikroskop wyposazony w dobre zrodłoswiatła i kondensor. Kondensor ciemnego pola widzenia przesłania padajaceprosto promienie swiatła, przepuszczajac jedynie promienie peryferyczne (od-bijane przez takie obiekty, jak kretki).

Nalezy umiescic kilka kropel olejku immersyjnego na kondensorze mikroskopuz ciemnym polem widzenia. Obnizyc nieco kondensor, tak by poziom olejku byłponizej podstawy. Umiescic szkiełko pod mikroskopem i podnosic kondensor dochwili uzyskania dobrego kontaktu miedzy olejkiem i spodem szkiełka. Unikacutworzenia sie pecherzykow powietrza w olejku.

Ryc. 9. Obraz T. pallidum pod mikroskopem w ciemnym polu widzenia.

98


Do uzyskania obrazu uzyc obiektywu o najmniejszym powiekszeniu (× 10).Regulujac pokretłem kondensora, skierowac swiatło centralnie na pole i ustawicostrosc podnoszac i obnizajac kondensor do momentu uzyskania najmniejszejsrednicy swiatła. Jesli to konieczne, ponownie ustawic swiatło w centrum.

Nastepnie, uzywajac obiektywu × 40, ustawic ostrosc i uwaznie ogladac preparat.Kontrast bedzie lepszy przy mikroskopowaniu w ciemnosci. Unikac jasnegoswiatła dziennego.

T. pallidum jest biały, swiecacy na ciemnym tle (ryc. 9). Jego identyfikacjidokonuje sie na podstawie typowej morfologii, rozmiaru i ruchliwosci. Jestcienkim (0,25 – 0,3 µm) mikroorganizmem, długosci 6 – 16 µm, z 8 – 14 regular-nymi, scisle skreconymi, wyraznymi spiralami. Wykazuje szybkie, raczejgwałtowne ruchy. Stosunkowo wolno obraca sie wzdłuz długiej osi (jakkorkociag). Rotacji towarzyszy intensywne zginanie (skrecanie). Mozna zaobser-wowac wydłuzanie i skracanie komorki (przypominajacej elastyczna, rozprezaja-ca sie spirale). W skomplikowanych skretach moga pojawiac sie zniekształcenia.Jezeli mikroorganizm przylega lub jest otoczony przez ciezszy obiekt, w wynikunasilonych ruchow dochodzi do odkształcenia zwojow. Inne niekiłowe kretkimoga byc luzno skrecone, cienkie i nieregularne; poruszaja sie inaczej (nie jakkorkociag), ruchem bardziej wijacym, z zaznaczonym zgieciem i czesta relaksacjaskretow.

Wykazanie kretkow z charakterystyczna dla T. pallidum morfologia i ruchemstanowi potwierdzenie rozpoznania pierwszo- i drugorzedowej kiły. Pacjenciz pierwotna zmiana kiłowa, z dodatnim wynikiem badania w ciemnym poluwidzenia moga byc seronegatywni. Zwykle do serokonwersji dochodzi w ciagukilku tygodni.

Niepowodzenie w wykazaniu drobnoustrojow nie wyklucza kiły. Ujemne wynikimoga swiadczyc o tym, ze:• Obecna była niewystarczajaca liczba drobnoustrojow (pojedyncze badanie

w ciemnym polu widzenia ma czułosc nie wieksza niz 50%).• Pacjent otrzymał juz antybiotyki.• Zmiana ulega naturalnemu wygojeniu.• Zmiana nie była owrzodzeniem kiłowym.

Niezaleznie od wynikow badania w ciemnym polu widzenia zawsze nalezy pobrackrew do badan serologicznych.

W diagnostyce ziarniniaka pachwiny w utrwalonych acetonem preparatachwybarwionych metoda Giemsy wewnatrz histiocytow widoczne sa typowe,otoczkowe laseczki. Diagnostyka tej choroby opisana jest szczegołowo w innychzrodłach1.

W diagnostyce wrzodu miekkiego nie zaleca sie barwienia rozmazow metodaGrama, poniewaz zarowno czułosc, jak i specyficznosc wynosza mniej niz 50%.W diagnostyce chlamydiowego ziarniniaka limfatycznego nie zaleca sie stosowa-nia barwienia metoda Giemsy. Materiał z owrzodzenia powinien byc takze badanyw ciemnym polu widzenia w kierunku T. pallidum.

1 Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P.: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva,World Health Organization, 1999.

99

CZESC I

Hodowla

Z owrzodzen narzadow płciowych niekiedy izolowane sa gonokoki, ale ichznaczenie w takich probkach jest niejasne. Poza H. ducreyi nie udowodniono, abyinny gatunek bakterii — zarowno wzglednie tlenowy, jak i bezwzgledniebeztlenowy — wywoływał owrzodzenia narzadow płciowych.

Probki, ktore maja zostac zbadane w kierunku H. ducrei, nalezy posiac bezpo-srednio na wybiorcze, wzbogacone podłoze agarowe1. Podłoze uzyte do posiewumusi byc swieze (do tygodnia od przygotowania). Płytki nalezy inkubowacw 33 – 35°C w eksykatorze ze zwilzona lignina na dnie. Po 48 – 72 godzinachinkubacji pojawiaja sie małe, niesluzowe, zołtoszare, połprzezroczyste lubprzezroczyste kolonie, ktore nienaruszone mozna przesuwac po powierzchnipłytki. Czułosc pojedynczej hodowli w izolacji H. ducreyi wynosi 70 – 80%.

Wstepna diagnoza H. ducreyi moze byc przeprowadzona na podstawie morfologiikolonii na podłozu selektywnym i wykazania małych, Gram-ujemnych pleomor-ficznych ziarenko-pałeczek, czesto w pojedynczych łancuchach (paciorki),rownoległych łancuchach (,,ławica ryb’’) lub w skupiskach. Mimo ze wzrostH. ducreyi jest zalezny od heminy, wiekszosc klinicznych izolatow nie rosnie napodłozach wykrywajacych zaleznosc wzrostu od czynnikow X i V. Obecnieprawie wszystkie szczepy izolowane w krajach rozwijajacych sie wytwarzajaβ-laktamazy.

1 Agar Mueller-Hintona wzbogacony 5% sterylna krwia konska podgrzana do 75°C, 1% IsoVitaleXi 3 g/ml wankomycyny.

100

Ropne wydzieliny, rany i ropnie

Wprowadzenie

Jednym z najczesciej obserwowanych objawow chorob zakaznych jest wy-twarzanie ropnej (czasami surowiczo-ropnej) wydzieliny powstajacej w wynikuinwazji bakterii do tkanki, narzadu lub jamy ciała. Zakazenia te moga bycstosunkowo łagodne (nieszkodliwy ,,pryszcz’’) lub wywoływac liczne ropniezlokalizowane w jednym lub wielu miejscach. Wysiek składa sie z białychkrwinek, głownie wielojadrzastych leukocytow, zakazajacych drobnoustrojoworaz mieszaniny płynu ustrojowego i fibryny. W niektorych sytuacjach wysiekmoze byc widoczny jako warstwa na powierzchni narzadu, na przykład napowierzchni mozgu w bakteryjnym zapaleniu opon mozgowo-rdzeniowych.W innych przypadkach wysiek moze byc otoczony warstwa włoknika i sieciakomorek tkanki (np. czyrak mnogi lub podskorny ,,czyrak’’), a niekiedy zwiazanyjest z otwarta rana, z ktorej wycieka gesty płyn lub ropa.

Zarowno anatomiczna lokalizacja wysieku, jak i mikroorganizmy zwiazanez wymienionymi infekcjami moga sie znacznie roznic. Wpływ na tworzeniewysieku moga miec wszystkie bakterie wchodzace w skład flory fizjologicznej,a takze grzyby, szczegolnie te, ktore maja zdolnosc namnazania sie w tkankach.W infekcjach wirusowych rzadko dochodzi do powstania ropnej wydzieliny.

Mikrobiolog powinien, uwzgledniajac roznorodna lokalizacje i etiologie ropnychzakazen, przeprowadzic własciwe badania makroskopowe i mikroskopowez posiewem na odpowiednie podłoza, ktore umozliwia izolacje najwazniejszychpatogennych drobnoustrojow. Mozliwie najszybciej po uzyskaniu czystychhodowli nalezy przeprowadzic identyfikacje oraz okreslic wrazliwosc na anty-biotyki.

Wspołpraca miedzy klinicysta i mikrobiologiem ma zasadnicze znaczeniew diagnostyce i leczeniu pacjentow z ropnymi zakazeniami. Mikrobiolog musiwspołpracowac z lekarzem, zapewniajac własciwe pobieranie probek i szybkitransport do laboratorium w celu natychmiastowego i własciwego prowadzeniabadan.

Postacie kliniczne i najczestsze czynnikietiologiczne

Probki chirurgiczne

Probki chirurgiczne moga byc uzyskane przez nakłucie zlokalizowanego ropnialub w innej procedurze chirurgicznej. Chirurg powinien pobrac kilka małychreprezentatywnych probek z tkanki i kazdego ropnego wysieku. Jesli to mozliwe,nalezy unikac wymazow. Materiał powinien byc pobrany za pomoca igłyi strzykawki. Jesli konieczne jest uzycie wymazowki, nalezy pobrac mozliwieduzo wysieku i w odpowiednich pojemnikach przesłac do laboratorium. W chwiliotrzymania probki laboratorium musi, uwzgledniajac dostarczone informacje,zaplanowac hodowle drobnoustrojow prawdopodobnie obecnych w danej probce.

101

CZESC I

Ponizej przedstawiono kilka przykładow stanow klinicznych i drobnoustrojowobecnych w roznych typach probek chirurgicznych:

• Jama otrzewnej zawiera prawdopodobnie Gram-ujemne bakterie jelitowe,Gram-ujemne pałeczki beztlenowe (Bacteroides fragilis) i laseczki.

• Otorbiony ropien moze zawierac kazdy typ drobnoustrojow, jeden lub kilkagatunkow: Gram-dodatnie ziarenkowce i Gram-ujemne laseczki sa izolowanenajczesciej. W zaleznosci od lokalizacji nalezy rowniez uwzglednic bakteriebeztlenowe i pełzaki.

• Wezły chłonne czesto właczone sa w infekcje układowe. Sa powiekszone,czesto dosc twarde i gromadza ropny wysiek. Jesli wezeł jest chełboczacy,zawarty płyn moze zostac zaaspirowany przez lekarza. Biopsje wezłowchłonnych i aspiraty pobrane od dzieci nalezy hodowac w kierunku Mycobac-terium tuberculosis i innych pratkow. Poza hodowla w kierunku gronkowcow,ziarenkowcow i Gram-ujemnych bakterii jelitowych wezły chłonne stanowiadobry materiał do diagnostyki układowych i podskornych grzybic (histoplaz-moza, sporotrychoza).

• Skora i tkanka podskorna sa pierwotnym miejscem powstawania ropnii zakazen ran. Zgodnie z ogolna zasada, ropnie podskorne wywoływane sa przezgronkowce. Otwarte, saczace sie zmiany skorne czesto wystepuja w zakaze-niach β-hemolizujacymi paciorkowcami i/lub gronkowcami, jak np. w liszajcu.Innym rodzajem zmian skornych, powstajacych czesto w wyniku zakazenszpitalnych, wymagajacych interwencji chirurgicznej, sa owrzodzenia od-lezynowe i odlezyny. Bakterie, ktore sa komensalami skory lub wchodzaw skład flory jelitowej, moga namnazac sie w zewnetrznych warstwachowrzodzenia i sa odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach i wyglad. Najczesciejizolowanymi drobnoustrojami z biopsji tkanki sa laseczki; mozna je rowniezobserwowac w posiewach z powierzchownego wysieku. Nie zawsze mozliwajest ocena udziału tych drobnoustrojow w powstawaniu owrzodzenia od-lezynowego, ale warunkiem zagojenia sie rany jest utrzymywanie czystegoi suchego owrzodzenia bez bakterii. Czasami drobnoustroje z odlezyny mogaprzenikac do krwi, wywołujac powazne powikłania.

• Oparzenia, szczegolnie drugiego i trzeciego stopnia, sprzyjaja infekcjomwywołanym przez rozne gatunki bakterii. Bardzo wazne jest dokładnechirurgiczne opracowanie rany przeprowadzone przed pobraniem materiału dohodowli. Najczesciej izolowane bakterie to gronkowce i Pseudomonas aerugi-nosa.

• Wysieki. Czasami surowiczy lub ropny płyn moze byc pobrany z jamy ciała,ktora normalnie zawiera niewielka ilosc sterylnego płynu, np. worek osier-dziowy, jama opłucnej, kaletka lub staw. Aspiracja igłowa w aseptycznychwarunkach dostarczy laboratorium materiału, z ktorego mozna wyizolowaci zidentyfikowac zakazajacy mikroorganizm. Zazwyczaj przyczyna zakazeniasa bakterie, moga wystepowac rowniez grzyby i wirusy. Infekcje wywołane sanajczesciej przez jeden gatunek, ale pojawiaja sie takze mieszane tlenowo--beztlenowe zakazenia. Z aspiratow z jamy opłucnej mozna uzyskac pneumo-koki, paciorkowce, H. influenzae, beztlenowe paciorkowce lub beztlenoweGram-ujemne pałeczki (Prevotella i Porphyromonas) oraz M. tuberculosis.

Rany penetrujace

Kazde uszkodzenie spowodowane przedmiotem, ktory przebija skore, zawieraprawdopodobnie mieszanine mikroorganizmow; drobnoustroje naleza głownie doflory skory lub naturalnej flory mikrobiologicznej gleby i wody. Rany penetrujace

102

ROPNE WYDZIELINY, RANY I ROPNIE

z uszkodzeniem jelit stanowia jeszcze powazniejsze zagrozenie, poniewazw infekcji moze wspołuczestniczyc flora jelitowa.

Rany penetrujace i ciete moga byc spowodowane ostrymi i tepymi narzedziami.Powstaja czesto z uzyciem metalu, szkła, drewna itp., w sposob przypadkowy lubumyslny (np. dzgniecie nozem lub rany postrzałowe). Tezec rozwijajacy siew wyniku rany penetrujacej jest dla nieszczepionych osob choroba zagrazajacazyciu. Botulizm przyranny moze pozostac nie rozpoznany, jesli lekarz i mikro-biolog nie sa swiadomi takiej mozliwosci. Tezec i botulizm sa rozpoznawane napodstawie objawow klinicznych, a laboratoryjne potwierdzenie powinno bycprzeprowadzone przez centralne laboratorium referencyjne. Ludzie pracujacy zezwierzetami lub produktami zwierzecymi sa narazeni na zakazenie sporamiBacillus anthracis, ktore moga wniknac przez małe rany lub uszkodzenia skory,wytwarzajac typowa dla waglika postac czarnej krosty. Wystepujacy takzew glebie Clostridium perfringens moze wniknac do rany penetrujacej i wywołaczgorzel gazowa.

Zadrapania i ugryzienia przez zwierzeta wystepuja czesto zarowno w obszarachmiejskich, jak i wiejskich. Ugryzienia moga pochodzic od domowych, hodow-lanych lub dzikich zwierzat. W pierwszej kolejnosci i niezwłocznie nalezyrozpatrzyc wscieklizne. Po wykluczeniu tej mozliwosci nalezy rozwazyc inneczynniki etiologiczne. Diagnostyka wscieklizny jest zbyt specjalistyczna, abyzostała omowiona w tym opracowaniu1.

Jama ustna zwierzat zawiera heterogenna flore, w skład ktorej wchodza tlenowei beztlenowe bakterie, grzyby, pierwotniaki i wirusy. Infekcje z powoduugryzienia lub zadrapania wywołane sa zwykle przez bakterie. Klasycznymprzykładem jest zakazenie Pasteurella multocida, ktore czesto towarzyszyugryzieniom przez psa lub kota, gdy rana nie została własciwie oczyszczonai leczona. Ugryzienia przez człowieka moga niekiedy wywoływac powaznemieszane zakazenia tlenowymi i beztlenowymi bakteriami.

Szpitalne zakazenia ran

Jednym z głownych załozen w opiece i leczeniu hospitalizowanych pacjentow jestzasada nieszkodzenia (,,primum non nocere’’ — przyp. tłum.) w przebiegudiagnozowania i terapii. Niestety 5 – 10% hospitalizowanych pacjentow nabywainfekcje w szpitalu. Zakazenia szpitalne generuja koszty, zwykle mozna ichuniknac lub znacznie ograniczyc ich wystepowanie. Wiele nabytych w szpitaluinfekcji pojawia sie na oddziałach chirurgicznych. Wspołczynnik pooperacyjnychzakazen ran rozni sie w zaleznosci od szpitala, a w obrebie szpitala wydaje siewyzszy u pacjentow poddanych operacjom jamy brzusznej, klatki piersiowej lubzabiegom ortopedycznym. Zakazenia ran chirurgicznych moga pojawiac siekrotko po zabiegu lub kilka dni pozniej. Zakazenie moze byc ograniczone domiejsca przeciecia lub obejmowac całe miejsce operowane. Głownym czyn-nikiem etiologicznym zakazen jest Staphylococcus aureus (zwykle oporny nabenzylopenicyline, a obecnie rowniez metycylinooporny), przed E. coli i innymibakteriami jelitowymi. Beztlenowe bakterie z jelita grubego pacjenta mogazakazic operowane miejsca, wywołujac ciezka mieszana infekcje, dosc czestowystepujaca w szpitalach, w ktorych opieka nad ranami pooperacyjnymi

1 Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. (eds.): Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva,World Health Organization, 1996.

103

CZESC I

i programy profilaktyki zakazen sa słabo rozwiniete. Bacteroides fragilisi rzadziej Clostridium perfringens moga przeniknac do krwi, stajac sie przyczynauogolnionego, czesto smiertelnego zakazenia pooperacyjnego.

Po zabiegu stomatologicznym lub chirurgicznym w obrebie jamy ustnej mozerozwinac sie rzadka infekcja, w ktorej kanał przetoki prowadzi od wewnatrz napowierzchnie skory twarzy lub szyi, a wydzielina zawiera ,,siarkowe’’ ziarnapromienicy.


Nie jest mozliwe w tym miejscu szczegołowe opisanie procedury pobiera-nia probek z kazdego typu rany, ropnia itd. Wydaje sie oczywiste, ze to za-danie wymaga bliskiej wspołpracy miedzy laboratorium i lekarzem. W wie-lu przypadkach istnieje tylko jedna mozliwosc pobrania probki; zazwy-czaj nie ma mozliwosci pobrania kolejnych. Z tego powodu pobieranie,transport i przechowywanie probek maja najwieksze znaczenie i wymagajascisłego przestrzegania zalecen. Mozliwie najszybciej po pobraniu probkenalezy przesłac do laboratorium, gdzie powinna zostac natychmiast opraco-wana. Po wstepnym badaniu i załozeniu hodowli pozostała czesc materiałunalezy odpowiednio opisac i zachowac w warunkach schłodzenia do chwiliuzyskania pewnosci, ze nie ma potrzeby wykonania dodatkowych testowlaboratoryjnych.

Ropien

Jesli zostanie wykryty ropien lub mnogie ropnie, lekarz prowadzacy lubchirurg i mikrobiolog powinni skonsultowac sie w sprawie dalszego postepowa-nia. Technika pobierania ropy i fragmentow sciany ropnia jest procedurachirurgiczna. Do pobrania mozliwie najwiekszej objetosci materiału ropnegonalezy uzyc igły i strzykawki, a nastepnie przeniesc aseptycznie pobrany materiałdo sterylnego pojemnika. Jesli taki pojemnik nie jest dostepny, probke nalezyzatrzymac w strzykawce z zatknieta igła i cała strzykawke przesłac do labora-torium (metoda ta nie jest obecnie polecana z powodu ryzyka ekspozycji nazakazenie — przyp. tłum.). Materiał powinien natychmiast zostac poddanyobrobce w laboratorium; zarowno hodowle tlenowe jak i beztlenowe moznazałozyc z jednej probki.

Ze wzgledu na potencjalna koniecznosc srodoperacyjnego pobrania probkiw czasie zabiegow, w ktorych przypadkowo stwierdza sie obecnosc jednego lubwiecej otorbionych ropni w narzadach, klatce piersiowej, jamie brzusznej lubmiednicy, w sterylnym chirurgicznym wyposazeniu powinny znalezc sie zestawydo pobierania materiału. Za dostarczenie odpowiednich zestawow odpowiedzial-ne jest laboratorium. W przypadku obecnosci obfitej ropy nalezy unikacpobierania probek wymazowka. Uzycie wymazowek uzasadnione jest do pobiera-nia bardzo małych ilosci ropy lub z miejsc wymagajacych zachowania ostrozno-sci, np. z oka. Gdy dostarczone zostana fragmenty tkanek ze scian ropnia, techniklaboratoryjny powinien zmiazdzyc tkanke, uzywajac jako rozpuszczalnika nie-wielkiej ilosc sterylnego bulionu lub rozdrobnic tkanke na bardzo małe kawałkiuzywajac sterylnych nozyczek. Nalezy przygotowac hodowle tlenowe i bez-tlenowe w sposob opisany na str. 107.

104


Zakazone skaleczenia, rany drazace,rany pooperacyjne, oparzeniai owrzodzenia odlezynowe

Nie mozna sformułowac standardowej procedury pobierania probek. Nalezyjednak przestrzegac pewnych podstawowych zasad otrzymywania mozliwienajlepszych probek do badan laboratoryjnych. Po starannym oczyszczeniumiejsca chirurg powinien odnalezc zbiornik ropy, martwicze tkanki, rozpoznacobecnosc gazu (trzeszczenie) lub inne nieprawidłowe objawy. Fragmenty zaje-tych tkanek, ktore zostana uzyte do hodowli, powinny zostac pobrane na sterylnagaze. Rope lub inny wysiek nalezy pobrac starannie i umiescic w sterylnejprobowce. W razie potrzeby mozna uzyc wymazowek.

Kanały przetoki lub rany drenujacewezłow chłonnych

Jesli przetoki lub wezły chłonne wykazuja objawy samoistnego drenowania,nalezy, uzywajac sterylnej pipety Pasteura wyposazonej w gumowy balonik,starannie pobrac materiał i umiescic go w sterylnej probowce. Jesli wydzielina niejest widoczna, chirurg powinien pobrac ropny materiał za pomoca strzykawkii igły. Wymazowki nalezy stosowac tylko wtedy, gdy nie sa dostepne pipetyPasteura.

Wysieki

Nieprawidłowe zbieranie sie płynu w jamie ciała, takiej jak jama opłucnej, stawlub przestrzen otrzewnowa, wymaga interwencji chirurgicznej z aspiracjanagromadzonego materiału do sterylnego pojemnika, a nastepnie dostarczenia godo laboratorium w celu wykonania badania mikrobiologicznego i cytologicznego.W przypadku ciagłego gromadzenia sie ropy nalezy załozyc otwarty dren,konieczny do aseptycznego pobrania płynu, w celu wykonania posiewu i innychbadan.

Ocena makroskopowa

Probki ropy lub wydzieliny z rany pobrane na wymazowki sa trudne do ocenymakroskopowej, szczegolnie gdy zostały zanurzone w podłozu transportowym.Kolor, konsystencja i zapach probek ropy, otrzymanych w strzykawce lubw sterylnym pojemniku, powinny byc oceniane uwaznie przez doswiadczonegomikrobiologa.

Kolor

Ropa moze miec kolor od zielonozołtego do brazowoczerwonego. Czerwonykolor spowodowany jest domieszka krwi lub hemoglobiny. Aspirat z pierwotnegoropnia watroby wywołanego pełzakiem ma galaretowata konsystencje i barwe odzołtobrazowej do ciemnobrazowej. Ropa z ran pooperacyjnych lub urazowych

105

CZESC I

(oparzen) moze miec zabarwienie niebieskozielone z powodu obecnosci piocyja-niny, wytwarzanej przez Pseudomonas aeruginosa.

Konsystencja

Konsystencja moze byc rozna: od metnego do bardzo gestego i lepkiegopłynu. Wysieki aspirowane ze stawow, jamy opłucnej lub worka osierdzio-wego sa zwykle płynne, z mozliwa gradacja od surowiczego wysieku do ty-powej ropy.

Ropa organizujaca sie w drenowanym kanale przetoki na szyi powinna zostaczbadana w kierunku obecnosci małych zołtych ziaren ,,siarkowych’’, ktore saskupiskami promieniowcow Actinomyces israelii. Obecnosc siarkowych ziarenwskazuje na promienice szyjno-twarzowa. Małe roznokolorowe ziarenka (białe,czarne, czerwone lub brazowe) sa typowe dla mycetoma, ziarniniakowych guzow,ktore zwykle sa zlokalizowane na konczynach dolnych (np. stopa madurska)i charakteryzuja sie licznymi ropniami i przetokami. Kolorowe ziarenka od-powiadaja zarowno nitkowatym bakteriom, jak i grzybni.

Ropa z gruzliczych ,,ropni zimnych’’ (ze skapymi objawami zapalenia) porow-nywana jest z miekkim serem i nazywana ,,serowaciejaca’’ lub ,,serowata ropa’’.

Zapach

Nieprzyjemny zapach jest jedna z cech charakterystycznych dla beztlenowych lubmieszanych tlenowo-beztlenowych zakazen, ale w pewnych okolicznosciachmoze nie wystepowac. Wstepna ocena na podstawie zapachu i morfologiikomorek w preparacie barwionym metoda Grama powinna byc niezwłocznieprzedstawiona klinicyscie w celu ułatwienia empirycznego wyboru własciwegoantybiotyku. Jest ona takze pomocna w podjeciu decyzji o koniecznosci hodowlibeztlenowej.


Z kazdej probki nalezy wykonac i obejrzec preparat barwiony metoda Grama.W niektorych przypadkach lub na polecenie lekarza nalezy przygotowac preparatbezposredni barwiony metoda Ziehl-Neelsena.

Barwienie preparatow metoda Grama

Za pomoca ezy naniesc na czyste szkiełko podstawowe najbardziej ropna czescprobki. Jesli dostepny jest tylko wymaz, szkiełko nalezy najpierw wysterylizowacw ogniu nad palnikiem Bunsena i pozostawic do wystygniecia. Bawełnianawymazowke nalezy delikatnie przetoczyc po powierzchni szkiełka, bez pociera-nia lub nadmiernego wyciskania. Pozostawic szkiełko do wyschniecia napowietrzu lub umiescic w cieplarce. Utrwalic przez ogrzanie, wybarwic i ogladacpreparat w immersji (obiektyw × 100). Poszukiwac starannie i odnotowacobecnosc i liczbe (uzywajac znakow +):– wielojadrzastych granulocytow (komorki ropy);

106


– Gram-dodatnich ziarenkowcow ułozonych w skupiska, sugerujacych gron-kowce;

– Gram-dodatnich ziarenkowcow w łancuchach, sugerujacych paciorkowce lubenterokoki;

– Gram-ujemnych pałeczek podobnych do pałeczki okreznicy (Escherichia coli,Klebsiella etc.), innych Enterobacteriaceae (Proteus, Serratia etc.), niefermen-tujacych pałeczek (Pseudomonas spp.) lub bezwzglednych beztlenowcow(Bacteroides spp.);

– duzych prostych Gram-dodatnich pałeczek z kwadratowymi biegunami, suge-rujacych Clostridium perfringens, głowna przyczyne zgorzeli gazowej lubBacillus anthracis, przyczyne waglika;

– gestej i wielokształtnej mieszaniny bakterii, zawierajacej paciorkowce, Gram--dodatnie i Gram-ujemne pałeczki o roznym kształcie, rowniez wrzecionowce;taki obraz sugeruje ,,mieszana flore beztlenowa’’, ktora tak nalezy opisac;

– Candida lub innych komorek grzybow, ktore widoczne sa jako owalne, Gram--dodatnie, paczkujace komorki, czesto tworzace rozgałezione pseudogrzybnie.

Ziarenka siarki z promienicy (aktynomykozy) i ziarenka grzybni nalezy rozdrob-nic, wybarwic metoda Grama i poszukiwac Gram-dodatnich cienkich rozgałezieni fragmentow nici.


Zgodnie z zaleceniem lub gdy prawdopodobne jest grzybicze lub pasozytniczezakazenie, nalezy przygotowac niebarwiony preparat. Jesli ropa jest gesta, oczkoezy zmieszac z fizjologicznym roztworem soli. Podczas badania w kierunkugrzybow do rozjasnienia probki uzyc kropli 10% wodorotlenku potasu. Nałozycszkiełko nakrywkowe i w powiekszeniu obiektywu × 10 – × 40 poszukiwaczwłaszcza:– aktywnie ruchomych pełzakow w aspiracie z ropnia watroby;– komorek grzybow drozdzopodobnych Histoplasma capsulatum (łacznie z af-

rykanska odmiana var. duboisii), Blastomyces dermatitidis (w regionachendemicznych), Candida spp.;

– grzybni i filamentacyjnych form bakterii w rozdrobnionych ziarenkach zezmian w stopie madurskiej;

– pasozytow, takich jak mikrofilarie, skoleksow i haczykow Echinococcus, jajSchistosoma, Fasciola lub Paragonimus.

Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena)

Barwienie Ziehl-Neelsena powinno byc wykonywane na zlecenie lekarza.Przygotowanie barwionego w ten sposob preparatu zaleca sie takze, gdy w ropienie sa widoczne bakterie lub gdy w barwieniu metoda Grama obserwuje sie,,maczugowcowe’’, słabo Gram-dodatnie pałeczki. Obecnosc pratkow gruzlicynalezy podejrzewac zwłaszcza w ropnym wysieku z jamy opłucnej, stawow, ropnikosci lub wezłow chłonnych. Niegruzlicze (tak zwane atypowe) kwasoopornepratki znajdowane sa takze w ropniach posladkow, w miejscu głebokiej iniekcjidomiesniowej. Takie ropnie wywołane sa czesto przez szybko rosnace pratkinalezace do grupy Mycobacterium fortuitum-chelonei. W tropikach wydzielinazeskrobana z podstawy martwiczego owrzodzenia skory zlokalizowanego nanodze lub ramieniu moze wykazywac obecnosc wolno rosnacych pratkow

107

CZESC I

kwasoopornych M. ulcerans (owrzodzenie Buruli). M. marinum jest innymgruzliczopodobnym pratkiem, ktory moze byc izolowany z przewlekłych,wrzodziejacych zmian guzkowych na rekach, ramionach i innych eksponowanychpowierzchniach skory u pływakow i rybakow.

Hodowla

Jesli w badaniu mikroskopowym widoczne sa bakterie lub grzyby, materiał nalezyposiac na odpowiednie podłoza. Niezaleznie od wynikow badania mikro-skopowego, wszystkie probki ropy lub wysiekow powinny byc posiewane na conajmniej trzy podłoza hodowlane:– agar z krwia do izolacji gronkowcow i paciorkowcow;– agar MacConkeya do izolacji Gram-ujemnych pałeczek;– podłoze płynne, ktore moze posłuzyc jako podłoze wzbogacone zarowno dla

tlenowcow, jak i beztlenowcow, np. podłoze tioglikolanowe lub bulionz wyciagiem miesnym.

Objetosc inoculum powinna byc uzalezniona od wyniku badania mikroskopowegoi waha sie od jednego oczka ezy do kilku kropel. Jesli w barwieniu metoda Gramawidoczne sa liczne mikroorganizmy, probka powinna przed posianiem zostacrozcienczona w małej ilosci sterylnego podłoza płynnego. Jesli do posiewuuzywana jest wymazowka, materiał nalezy naniesc na niewielki obszar płytki,a nastepnie rozsiac eza na pozostałej powierzchni. Jesli wymazowka jest suchanalezy ja najpierw zwilzyc mała iloscia sterylnego bulionu lub fizjologicznegoroztworu soli. W kazdym przypadku technika posiewu powinna umozliwicuzyskanie pojedynczych kolonii do identyfikacji i antybiogramu.

Przed posiewem płytke zawierajaca agar z krwia nalezy suszyc w cieplarce przez20 minut, minimalizujac w ten sposob ryzyko przerosniecia przez rozprze-strzeniajacy sie Proteus spp. Posiane płytki powinny byc inkubowane w 35°Cw eksykatorze. Rutynowo podłoza nalezy inkubowac dwa dni i obserwowaccodziennie wzrost. Jesli prowadzona jest hodowla mikroorganizmow o wysokichwymaganiach odzywczych, konieczna bedzie dłuzsza inkubacja (1 – 2 tygodnielub wiecej). Jesli wzrost pojawia sie na podłozu płynnym, nalezy wykonacpreparat barwiony metoda Grama i hodowle przesiac na odpowiednie podłoza. Nazlecenie lub jesli na taka koniecznosc wskazuje wynik badania mikroskopowego,mozna zastosowac specjalne dodatkowe podłoza hodowlane:• Jesli uwidoczniono gronkowce, pomocny w uzyskaniu czystego wzrostu

i wstepnego rozroznienia miedzy S. aureus i innymi ziarenkowcami jest agarz mannitolem.

• Jesli zaobserwowano paciorkowce, ich identyfikacja moze byc przyspieszonaprzez umieszczenie na linii pierwszego posiewu roznicujacego krazka z bacy-tracyna.

• Jesli zaobserwowano drozdze lub grzyby, probka powinna byc takze wsiana dodwoch probowek z agarem Sabouraud, jedna do inkubacji w 35°C, drugaw temperaturze pokojowej, obydwie obserwowane przez miesiac (do izolacjiCandida spp. wystarczy agar z krwia).

• Jesli w preparacie barwionym metoda Ziehl-Neelsena uwidoczniono kwaso-oporne pratki, materiał nalezy posiac do 3 probowek z podłozem Löwensteina--Jensena. Probke zawierajaca rowniez niekwasooporne pratki przed posie-wem nalezy dekontaminowac. Szybko rosnace bakterie, takie jak M. fortuitum,moga ginac w procesie dekontaminacji; wyrastaja one na agarze z krwiai agarze MacConkeya w ciagu 3 – 7 dni. Rozgałezione, nitkowate, czesciowo

108


kwasooporne pałeczki w ropie z jamy opłucnej lub z ropnia mozgu, ktorewyrastaja na agarze z krwia w ciagu kilku dni, to prawdopodobnie Nocardiaasteroides.

• Ropa od pacjentow z zapaleniem stawow, zapaleniem opłucnej, zapaleniem koscilub tkanki podskornej, zwłaszcza od dzieci do 5 roku zycia, powinna byc takzeposiana na płytke z agarem czekoladowym w celu wykrycia H. influenzae.

• Hodowla w scisle beztlenowych warunkach jest istotna, gdy w preparaciebarwionym metoda Grama obecna jest mieszana flora beztlenowa lub gdyprobka charakteryzuje sie typowym zgniłym zapachem. Hodowla na agarzez krwia w warunkach beztlenowych jest konieczna do uzyskania wzrostuActinomyces. Posiew w kierunku beztlenowcow prowadzony jest rowniez nazlecenie klinicysty, ktory podejrzewa zgorzel gazowa. Metody diagnostykiw zakazeniach bakteriami beztlenowymi opisano na str. 113 – 118.

Identyfikacja

Z wyjatkiem zanieczyszczen ze srodowiska lub ze skory (takich jak Staphylococ-cus epidermidis) wszystkie drobnoustroje izolowane z ran, ropy lub wysiekowpowinny byc traktowane jako znaczace i nalezy je zidentyfikowac. Pełnaidentyfikacja nie zawsze jest konieczna, zwłaszcza w przypadku flory mieszanej.

Bakterie i grzyby izolowane z ropy i wysiekow moga nalezec do prawie kazdejgrupy lub gatunku. Zostana tu podane tylko zasady identyfikacji gronkowcow,czesto zwiazanych z procesami ropnymi (ropotworczych) i dwoch innychpatogenow, Pasteurella multocida i Bacillus anthracis, rzadko izolowanych z ranlub zakazen skory, ale bardzo istotnych ze wzgledu na sposob postepowaniaz pacjentem. W standardowych podrecznikach mikrobiologii klinicznej moznaznalezc pełny opis metod identyfikacji. W kazdym przypadku pierwszym etapempowinno byc uwazne badanie dobrze odgraniczonych kolonii, pobranie pojedyn-czej kolonii kazdego typu, przygotowanie preparatu barwionego metoda Gramai obserwacja mikroorganizmow pod mikroskopem.

Gronkowce

Gronkowce sa bakteriami najczesciej zwiazanymi z wytwarzaniem ropy. Rosnadobrze w warunkach tlenowych na agarze z krwia i po całonocnej inkubacjiwytwarzaja nieprzezroczyste białe lub kremowe kolonie o srednicy 1 – 2 mm. Jakojedyne rosna na podłozu z duzym stezeniem soli, takim jak MSA. Moga bycroznicowane z paciorkowcami na podstawie morfologii i zdolnosci wytwarzaniakatalazy. Wytwarzanie katalazy mozna wykazac przez dodanie kropli 3%nadtlenku wodoru do kolonii umieszczonych na czystym szkiełku. Pojawienie siepecherzykow tlenu jest wskaznikiem produkcji katalazy.

Dla potrzeb klinicznych gronkowce mozna podzielic na takie, ktore wytwarzajakoagulaze, i takie, ktore jej nie wytwarzaja. Koagulazododatnie gronkowce nalezado S. aureus, gatunku o najwiekszym znaczeniu klinicznym. Sposrod wielukoagulazoujemnych szczepow zostana tu omowione tylko dwa — S. epidermidisi S. saprophyticus.

Mimo ze S. aureus nalezy do komensalnej flory mikrobiologicznej nosa (40%zdrowych dorosłych to nosiciele), skory i przewodu pokarmowego, szczepy tego

109

CZESC I

gatunku sa odpowiedzialne za liszajec, czyraki, ropnie, zakazenia ran, zakazeniaowrzodzen i oparzen, zapalenie szpiku, zapalenie gruczołu sutkowego (ropienpiersi), ropniak opłucnej, ropne zapalenie miesnia, zespoł szoku toksycznegoi inne typy ropnych zakazen.

S. epidermidis jest rowniez czestym komensalem skory, nosa i innych błonsluzowych, wykazuje niska chorobotworczosc. Jednakze jego obecnosc w ropienie zawsze powinna byc lekcewazona i uznawana za zanieczyszczenie ze skory.Mimo niskiej infekcyjnosci S. epidermidis moze wywoływac zakazenia skornew miejscu wprowadzenia cewnika załozonego na stałe, wenflonu lub innych ciałobcych. Zakazenia S. epidermidis, uciazliwe zwłaszcza w kardiochirurgii i w chi-rurgii ortopedycznej, zwiazane sa z wszczepianiem protez (sztuczne zastawkiserca lub protezy bioder).

S. saprophyticus jest czesta przyczyna zakazen drog moczowych u młodychkobiet, zajmujac w niektorych populacjach druga pozycje po E. coli.

Cechy roznicujace trzy głowne gatunki Staphylococcus podane sa w tabeli 22.Schemat wstepnej identyfikacji gronkowcow przedstawiono na rycinie 10.

Gram-dodatnie ziarenkowcew nieregularnych skupiskach

nie wykazujace ruchu, nie tworzace spor,tlenowe lub wzglednie beztlenowe,

katalazododatnie, zwykle oksydazoujemne,fermentujace cukry

�

Koagulaza+ –

�

Staphylococcusaureus

Agar z trehaloza,mannitolemi fosfataza

Kwas Bez kwasu

�

Fosfatazaalkaliczna

Staphylococcusepidermidis

+ –�

Staphylococcusschleiferi

Oporne nanowobiocyne

+ –�

Staphylococcussaprophyticus

Dekarboksylazaornityny

– +�

Ureaza Staphylococcuslugdunensis– +

�

Hemoliza Staphylococcuswarneri/hominis– +

Staphylococcuskoagulazoujemne

Staphylococcushaemolyticus

Ryc. 10. Schemat wstepnej identyfikacji gatunku Staphylococcus.

110


Ze wzgledu na znaczenie testu koagulazowego w identyfikacji S. aureus, został ontutaj szczegołowo opisany. Koagulaza jest enzymem powodujacym krzepniecieosocza krwi. Gronkowcowa koagulaza wystepuje w dwoch formach: zwiazanejkoagulazy lub inaczej czynnika aglutynujacego (clumping factor), ktory wy-krywany jest w tescie szkiełkowym, oraz wolnej koagulazy, wykrywanej w tescieprobowkowym.

• Test szkiełkowy. Na czystym szkiełku utworzyc zawiesine z jednej lub kilkukolonii gronkowcow i kropli fizjologicznego roztworu soli. Zawiesina powinnabyc dosc gesta. Zanurzyc czysta eze w osoczu i uzyc jej do wymieszania osoczaz zawiesina bakterii. Obserwowac tworzenie sie kłaczkow przez 10 sekund.Fałszywie ujemne wyniki testu szkiełkowego pojawiaja sie w przypadku około10% szczepow S. aureus. Jesli test szkiełkowy jest ujemny dla izolatu, ktorywydaje sie patogenny na innej podstawie (pigment, informacje kliniczne),nalezy zbadac szczep w tescie probowkowym.

• Test probowkowy. Umiescic kilka kropel (0,5 ml) osocza w sterylnej pro-bowce 12 × 75 mm i dodac dwie krople czystej hodowli w bulionie. Zawiesineo porownywalnej gestosci mozna takze przygotowac bezposrednio z koloniipobranych z agaru z krwia. Inkubowac probowki w 35°C przez 4 – 18 godzin,a nastepnie obserwowac obecnosc skrzepu.

Osocze uzywane w tescie koagulazowym moze byc swiezym ludzkim lubkroliczym osoczem z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Powinnobyc przechowywane w niewielkich porcjach (1 ml) w chłodziarce, a jego przy-datnosc nalezy kontrolowac rownolegle z hodowlami S. aureus i S. epidermidis.

Pasteurella multocida

Pasteurella multocida to Gram-ujemne pałeczki najczesciej odpowiedzialne zaciezkie zakazenia u ludzi, wystepujace po ugryzieniach przez zwierzeta. Bakteriata jest komensalem wchodzacym w skład normalnej flory jamy ustnej wieluzwierzat. Rany po ugryzieniach zakazone P. multocida moga dawac objawyrozległego zapalenia tkanki podskornej, ktore moze przebiegac z zajeciemstawow. Opisywano takze zapalenia szpiku, bakteriemie, a nawet zapalenia oponmozgowo-rdzeniowych.

P. multocida powinna byc poszukiwana zwłaszcza w wydzielinie z ran po-wstałych po ugryzieniu przez zwierze. Jest bardzo mała, Gram-ujemna, nieruch-liwa ziarenko-pałeczka. Rosnie dobrze na agarze z krwia w 35°C, ale wzrost ulegacałkowitemu zahamowaniu w obecnosci soli zołciowych, zawartych w podłozach

Tabela 22. Roznicowanie klinicznie waznych szczepow Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Wytwarzanie koagulazy Tak Nie NieRozkład mannitolu Kwasny (zołty) Obojetny (czerwo-

ny)Kwasny (zołty)

Pigmentacja koloniia Szare, kremowelub zołte

Białe Białe

Wrazliwosc in vitro na nowo-biocyne

Wrazliwy Wrazliwy Opornyb

Agar z DNaza Tak Nie Nie

a Wystepuja wyjatki.b Strefa zahamowania mniejsza niz 16 mm, w standaryzowanym tescie dyfuzyjno-krazkowymz 5-mikrogramowym krazkiem.

111

CZESC I

selektywnych do hodowli bakterii jelitowych, np. agar MacConkeya. Po całonoc-nej inkubacji kolonie na agarze z krwia sa małe, niehemolizujace, połprzezroczy-ste i sluzowe (dzieki obecnosci otoczki w formie wirulentnej).

Biochemiczna identyfikacja oparta jest na nastepujacych cechach:– fermentacja glukozy bez gazu; P. multocida rosnie na agarze Kliglera

z zakwaszeniem słupka;– test oksydazowy jest słabo dodatni;– test na wytwarzanie katalazy dodatni;– redukcja azotanu do azotynu (0,1% azotan potasu w bulionie odzywczym);– test na wytwarzanie ureazy ujemny;– wytwarzanie indolu — test w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) lub MIU po

48 godzinach inkubacji;– wysoka wrazliwosc na benzylopenicyline w krazkowym tescie wrazliwosci.

Bacillus anthracis

Do rodzaju Bacillus naleza liczne gatunki tlenowych, tworzacych spory, Gram--dodatnich laseczek, powszechnie wystepujacych w glebie. Gatunek B. anthraciswywołuje wazne dla zdrowia publicznego zakazenia skory. Inne gatunkiizolowane z ran lub ropy sa zwykle zanieczyszczeniem lub w wiekszoscimikroorganizmami oportunistycznymi.

B. anthracis jest znaczacym patogenem bydła, owiec, koz i innych domowychzwierzat. Zakazenie wystepuje takze u dzikich zwierzat. Waglik moze zakazacczłowieka, a przypadki infekcji wystepuja zwłaszcza w Afryce i Azji u osobpracujacych i zyjacych w bliskim kontakcie z zywym inwentarzem. Do zakazenialudzi moze dojsc rowniez przez produkty odzwierzece, zawierajace sporywaglika, takie jak: wełna, skory, futro i kosci.

Najczestsza postacia zakazenia ludzi jest waglik skorny, z ktorego moze rozwinacsie sepsa i zapalenie opon mozgowo-rdzeniowych. Spory przechodza przezuszkodzona skore i wytwarzaja zmiane pecherzykowa z martwiczym centrum,otoczona przez rozległy obrzek (,,czarna krosta’’). W preparatach sporzadzonychz płynu pecherzykowego widoczne sa duze Gram-dodatnie, kwadratowo zakon-czone, otoczkowe pałeczki bez spor.

B. anthracis rosnie w warunkach tlenowych. Na agarze z krwia wytwarza duze,płaskie, szarawe kolonie, do 5 mm srednicy, o nieregularnych brzegach i szorst-kiej, przypominajacej kłebowisko nici strukturze powierzchni (głowa Meduzy).Na tym etapie wazne jest roznicowanie wysoce patogennych B. anthracis odogolnie niechorobotworczych gatunkow saprofitycznych.

Wstepne roznicowanie powinno byc oparte na takich cechach, jak: brak hemo-lizy, wrazliwosc na benzylopenicyline oraz brak ruchu u B. anthracis. Sapro-fityczne gatunki Bacillus wykazuja ruch i sa silnie hemolityczne. Powyzszetrzy cechy moga stanowic podstawe wstepnej identyfikacji. W celu prze-prowadzenia ostatecznej identyfikacji czyste hodowle izolatow nalezy przesłacniezwłocznie do centralnego laboratorium weterynaryjnego lub innego referen-cyjnego osrodka.

B. anthracis jest wysoce zakaznym drobnoustrojem, z tego wzgledu probkii hodowle powinny byc przesyłane ze szczegolnym zachowaniem zasad ostrozno-sci, aby uniknac skazenia srodowiska i zakazen personelu laboratoryjnego.

112



Zastosowanie antybiotykow w leczeniu pacjentow z ranami, ropniami lubwysiekami nie zawsze jest konieczne. Odpowiednie chirurgiczne naciecie, drenazi opracowanie rany sa najczesciej wazniejsze niz antybiotykoterapia.

Wynik antybiogramu powinien byc dostepny w ciagu 48 godzin od otrzymaniaprobki.

Rutynowo badanie lekowrazliwosci nie powinno byc wykonywane dla bakteriio znanej wrazliwosci, takich jak paciorkowce, Pasteurella i Actinomyces, ktorew wiekszosci sa wrazliwe na benzylopenicyliny.

W przypadku Enterobacteriaceae, niefermentujacych Gram-ujemnych pałeczeki gronkowcow, lekowrazliwosc nalezy okreslic z zastosowaniem testu dyfuzyjno--krazkowego dla aktualnie zalecanych antybiotykow. Wrazliwosc na nowei drogie antybiotyki powinna byc oznaczana (lub raportowana) tylko na specjalnezlecenie lub gdy szczep wykazuje opornosc na inne leki przeciwbakteryjne.

Problem stanowi lekoopornosc, zarowno S. aureus, jak i S. epidermidis. Ponad80% szczepow, takze pozaszpitalnych, wytwarza β-laktamazy i wykazujeopornosc na benzylopenicyline i ampicyline. Zakazenia wywołane przez szczepyoporne na benzylopenicyline sa czesto leczone stabilnymi wobec β-laktamazpenicylinami z grupy metycyliny (oksacylina, kloksacylina itp.). W antybio-gramie zalecane jest uzycie krazka z oksacylina (1 µg). Krazki z oksacylina sastabilne i skutecznie wykrywaja opornosc na cała grupe (szczepy oporne nawszystkie antybiotyki β-laktamowe okreslane sa jako oksacylino- lub metycylino-oporne, tzw. MR — przyp. tłum.). Opornosc ma czesto charakter heterogenny, np.obejmuje tylko czesc populacji bakterii. Niejednorodna opornosc gronkowcowjest łatwiej identyfikowana w niskich temperaturach, z tego powodu temperaturainkubacji nie powinna przekraczac 35°C. Szczepy o heterogennej opornosciw strefie zahamowania wzrostu wokoł krazka, wykazuja mgławicowy wzrost lubtworza liczne drobne kolonie, ktore czesto bywaja traktowane jako zanieczysz-czenie. Jesli pojawia sie taki wzrost, konieczne jest przygotowanie preparatubarwionego metoda Grama w celu wykluczenia zanieczyszczenia.

Heterooporne szczepy sa klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-lak-tamowe, w tym penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Z tego powodu dlagronkowcow nie nalezy oznaczac wrazliwosci na cefalosporyny. Istnieje takzepełna krzyzowa opornosc miedzy benzylopenicylina i ampicylina. Nie nalezywiec okreslac wrazliwosci gronkowcow na ampicyline.

113

Zakazenia bakteriami beztlenowymi

Wprowadzenie

W niniejszym opracowaniu opisane sa bakterie beztlenowe i najczesciej wywoły-wane przez nie infekcje. Zakazenia beztlenowcami moga dotyczyc praktyczniekazdej tkanki i moga byc zlokalizowane w kazdym miejscu, jesli zaistniejaodpowiednie warunki.

Wiekszosc zakazen bakteriami beztlenowymi wywołana jest przez endogenneszczepy, ktore w stanie zdrowia wchodza w skład normalnej flory ciała,wywołujac infekcje w przypadku zakłocenia rownowagi w ilosciowym skła-dzie flory fizjologicznej lub w wyniku przemieszczenia sie bakterii do innegoregionu anatomicznego. Egzogenne bakterie beztlenowe, najczesciej Clos-tridium tetani, C. botulinum, rzadziej C. perfringens oraz inne gatunki la-seczek, moga zakazac rany i sa przyczyna odpowiednio tezca, botulizmuprzyrannego lub zgorzeli gazowej. Ropien, ktory moze byc zlokalizowanypraktycznie w kazdym narzadzie, bakteriemia, zapalenie jamy otrzewnej, ropniakopłucnej, zapalenie tkanki podskornej i zapalenie wyrostka robaczkowego totylko kilka przykładow chorob, w ktorych bardzo wazna role odgrywaja bakteriebeztlenowe. W zwiazku z powyzszym, wazne jest, aby mikrobiolog wiedział,kiedy i jak nalezy prowadzic hodowle w kierunku bakterii beztlenowychz okreslonej probki klinicznej.

Podział bakterii ze wzgledu na wymaganiatlenowe

Byc moze zbyt uproszczony, lecz dobrze funkcjonujacy podział bakterii o znacze-niu klinicznym oparty jest na wymaganiach tlenowych i wyroznia:

• Bezwzglednie tlenowe bakterie wymagajace do uzyskania energii tlenu gazo-wego; nie rosna przy braku tlenu. Przykładami bezwzglednych tlenowcow sa:Micrococcus spp. i Nocardia asteroides.

• Bezwzglednie beztlenowe bakterie prowadzace przemiany metabolicznebez udziału tlenu, ktory dla wielu z nich jest toksyczny. Energie uzy-skuja w reakcjach fermentacji, z wytworzeniem cuchnacych produktowkoncowych. Przykładami mikroorganizmow nalezacych do tej grupy satakie bakterie beztlenowe, jak Bacteroides fragilis i Peptostreptococcusmagnus.

• Wzglednie beztlenowe bakterie, ktore do wzrostu i wytwarzania energii niewymagaja bezwzglednie tlenu; moga zarowno wykorzystywac tlen, jak i rosnacw warunkach beztlenowych. Sa najbardziej rozpowszechnione, zwykle adaptu-ja sie do srodowiska, uzyskujac energie potrzebna do wzrostu i namnazanianajbardziej efektywnym sposobem. Przykładami wzglednie beztlenowychbakterii sa E. coli i S. aureus.

Oprocz wyzej wymienionych istnieja bakterie mikroaerofilne, ktore najlepiejrosna w atmosferze z obnizonym stezeniem tlenu. Przykładem bakterii mikro-aerofilnej jest Campylobacter jejuni.

114

ZAKAZENIA BAKTERIAMI BEZTLENOWYMI

Diagnostyka zakazen bakteriamibeztlenowymi

Za blisko 80% diagnozowanych zakazen beztlenowych odpowiedzialne sa czterynajwieksze grupy beztlenowcow. Naleza do nich: Bacteroides, Prevotellai Porphyromonas spp., Peptostreptococcus spp. oraz Clostridium spp. Najczesciejspotykane gatunki z kazdego rodzaju to: Bacteroides fragilis, Peptostreptococcusmagnus i Clostridium perfringens. Specyficzne metody izolacji i identyfikacjitych trzech rodzajow i gatunkow powinny słuzyc jako model izolacji i wstepnejidentyfikacji innych klinicznie waznych bakterii beztlenowych.

Pobieranie probek i transport do laboratorium

Procedury pobierania materiału zostały opisane we wczesniejszych rozdziałach.Poniewaz beztlenowce sa bardzo wrazliwe na tlen atmosferyczny i wysychanie,przy pobieraniu probek nalezy unikac stosowania zwykłych wymazowek. Probkido hodowli beztlenowcow nalezy uwaznie pobierac z miejsca aktywnej infekcji.W niektorych przypadkach moze byc konieczna pomoc chirurga. Dotyczy toszczegolnie aspiracji ropy, pobierania tkanek i/lub probek ropy z zakazonych ran,ropniakow lub drazacych ropni.

Probke nalezy umiescic w sterylnym, szczelnie zamknietym pojemniku lub, jeslito niemozliwe, niezwłocznie przesłac do laboratorium cały zaaspirowany materiałw strzykawce, z igła osłonieta zatyczka lub gumowym korkiem.

Przygotowanie warunkow beztlenowychdo inkubacji hodowli

Istnieja rozne metody wytwarzania srodowiska beztlenowego. Jedna z nich, prostai niedroga, jest uzycie anaerostatu z cienkiego szkła lub poliweglanu o objetosci2,5 – 3,5 litrow, wyposazonego w nieprzepuszczajaca powietrza pokrywe, ktoramozna łatwo usunac czy wymienic. Po włozeniu płytek Petriego w anaerostacienalezy umiescic komercyjnie dostepne, jednorazowe saszetki wytwarzajacebeztlenowa atmosfere i zamknac pokrywe. Jednorazowe saszetki wytwarzajacewarunki beztlenowe maja forme płaskich, zapieczetowanych kopert, ktore pododaniu wody (lub bez — przyp. tłum.) uwalniaja wodor i dwutlenek wegla.Opisane zestawy wymagaja katalizatora palladowego przytwierdzonego do spodupokrywy słoja. Podczas uzywania katalizator ulega inaktywacji i wymagawymiany w regularnych, zalecanych przez producenta odstepach czasu. Jedno-razowe paski wskaznikowe redox, ktore w warunkach beztlenowych zmieniajakolor z niebieskiego (lub czerwonego) na bezbarwny, sa szeroko dostepnekomercyjnie.

Probowki z płynnym podłozem do hodowli bakterii beztlenowych, takim jakpodłoze tioglikolanowe lub bulion z wyciagiem miesnym, nie musza bycinkubowane w beztlenowych warunkach, poniewaz wchodzace w ich składsubstancje wytwarzaja srodowisko beztlenowe. Jesli objetosc podłoza jestwystarczajaca (10 – 12 ml w probowce o standardowej srednicy 15 mm) i jest onoswiezo przygotowane, warunki beztlenowe uzyskuje sie w dolnej czesci probow-ki. Nie zuzyte w dniu przygotowania podłoza powinny byc zregenerowane przez

115

CZESC I

15-minutowe ogrzewanie w łazni wodnej probowek z poluzowana zakretka,w celu wyeliminowania rozpuszczonego tlenu; po ogrzaniu nalezy dokrecicnakretke i pozostawic do wystygniecia.

Podłoza do hodowli bakterii beztlenowych

Hodowle w kierunku bakterii beztlenowych powinny byc prowadzone na zlecenielekarza, jesli probka ma cuchnacy zapach lub jesli wyniki barwienia metodaGrama sugeruja obecnosc beztlenowych mikroorganizmow, np.: obecnosc mie-szanej, polimorficznej flory Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych pałeczeki ziarenkowcow, obecnosc Gram-ujemnych wrzecionowcow lub kwadratowozakonczonych cienkich Gram-dodatnich laseczek, ktore moga wskazywac naClostridium.

Badan w kierunku bakterii beztlenowych rutynowo nie nalezy wykonywacw przypadku probek moczu, wydzielin z narzadow płciowych, kału lub od-krztuszonej plwociny. Obecnosc bakterii beztlenowych w tych probkach wskazu-je na zanieczyszczenie komensalna flora fizjologiczna, własciwa dla miejscapochodzenia probki. Klinicysci powinni zostac poinformowani, ze probkizawierajace flore fizjologiczna nie nadaja sie do hodowli beztlenowych, z wyjat-kiem waznych wskazan klinicznych.

Zwykły agar z krwia jest dobrym podłozem stałym do izolacji najwazniejszychpatogenow beztlenowych. Dla bardziej wymagajacych gatunkow zalecany jestagar z krwia wzbogacony w czynniki wzrostu (hemina i menadion). Takie podłozasa komercyjnie dostepne jako agar beztlenowy Wilkins-Chalgrena.

Bakterie beztlenowe czesto sa czescia złozonej mikroflory zawierajacej takzedrobnoustroje tlenowe, stad nalezy przygotowac selektywny agar do hodowlibeztlenowcow, dodajac jeden lub wiecej specyficznych czynnikow hamujacychwzrost bakterii tlenowych. Na przykład dodanie aminoglikozydu (neomycyna,kanamycyna) w koncowym stezeniu 50 µg/ml hamuje wzrost wiekszoscitlenowych i wzglednie beztlenowych bakterii. Roztwor aminoglikozydu przygo-towywany jest przez rozpuszczenie 500 mg w 100 ml wody destylowanej. Na100 ml podłoza agarowego do hodowli beztlenowcow, po ostudzeniu do 56°C,nalezy dodac aseptycznie 5 ml odwłoknionej krwi i 1 ml roztworu antybiotyku.Dobrze wymieszac i rozlac po 15 – 18 ml do sterylnych płytek Petriego. Płytkipowinny zostac jak najszybciej zuzyte lub przechowywane w chłodziarce,najlepiej w plastikowym woreczku lub rekawie.

Procedury posiewu i izolacji

Przy podejrzeniu zakazenia bakteriami beztlenowymi probki nalezy niezwłocznieposiac na jedno z ponizszych podłozy:– agar do hodowli beztlenowcow do inkubacji w anaerostacie;– agar do hodowli beztlenowcow do inkubacji w eksykatorze;– agar MacConkeya;– podłoze płynne do hodowli beztlenowcow (z tioglikolanem lub wyciagiem

miesnym).

Hodowle w kierunku bakterii tlenowych nalezy zakładac zgodnie z obowiazujacaprocedura, a rownoległe posiewy tlenowe materiału przegladac po 24 i 48 godzi-

116


nach inkubacji. Na niewielka powierzchnie płytki z podłozem dla bakteriibeztlenowych nałozyc badany materiał i rozsiac go za pomoca ezy. Płytki nalezyumiescic w anaerostacie i odczytac po 48 godzinach inkubacji. Jesli wzrost nie jestwystarczajacy, konieczna jest dalsza inkubacja przez 24 – 48 godzin. Hodowle napodłozach płynnych nalezy zakładac posiewajac duza objetosc materiału zapomoca pipety Pasteura, tak by rozprowadzic inoculum w całym podłozu.

Po 48 godzinach nalezy skontrolowac wzrost na agarze z krwia do hodowlibeztlenowcow i porownac ze wzrostem obserwowanym na podłozach do hodowlitlenowych. Z kazdego typu kolonii nalezy wykonac preparat barwiony metodaGrama. Obserwowane w preparacie bakterie o tej samej morfologii, ktore rosnazarowno na agarze tlenowym, jak i beztlenowym, to prawdopodobnie wzglednebeztlenowce. Kolonie, ktore pojawiaja sie na agarze tylko w warunkachbeztlenowych, to przypuszczalnie beztlenowce, ktore nalezy przesiac na dwapodłoza agarowe z krwia, jedno do inkubacji w anaerostacie, drugie w ek-sykatorze. Jezeli wzrost pojawi sie tylko na podłozu inkubowanym w anaero-stacie, prowadzic identyfikacje czystej kolonii w kierunku bakterii beztlenowych.

Jesli obserwuje sie wzrost w głebokich warstwach podłoza płynnego do hodowlibeztlenowcow, konieczny jest posiew na podłoza agarowe dla bakterii tlenowychi beztlenowych, z ktorymi nalezy postepowac podobnie, jak w przypadkupierwszego posiewu. Jezeli do podłoza płynnego wsiano duza objetosc ropy,wynik hodowli moze byc dodatni, przy jednoczesnym ujemnym wyniku posiewuna podłozach stałych.

Identyfikacja klinicznie waznych beztlenowcow

Grupa Bacteroides fragilis

Grupa obejmuje kilka spokrewnionych gatunkow nalezacych do fizjologicznejflory jelit i pochwy. Czesto sa one odpowiedzialne za mieszane zakazeniaw obrebie jamy brzusznej i miednicy, moga rowniez wywoływac bakteriemie.B. fragilis jest nieruchliwa Gram-ujemna pałeczka, czesto wykazujaca polimor-fizm, ktora rosnie szybko na agarze do hodowli beztlenowcow. Po 48 godzinachpojawiaja sie sredniej wielkosci (do 3 mm srednicy), połprzezroczyste, szarobiałe,niehemolizujace kolonie. Szybkiej identyfikacji mozna dokonac na podstawietestu z zołcia. Czysta kolonia badanego drobnoustroju posiewana jest głeboko dodwoch probowek z płynnym podłozem tioglikolanowym, z ktorych jedna zawiera20% (2 ml w 10 ml) sterylnej zołci wołowej. Po 24 godzinach nalezy porownacwzrost w obu probowkach: wzrost B. fragilis jest wyraznie stymulowanyw bulionie z dodatkiem zołci.

Clostridium perfringens

Rodzaj Clostridium obejmuje wiele gatunkow Gram-dodatnich, wytwarzajacychspory laseczek; niektore z nich naleza do normalnej flory przewodu pokar-mowego, inne wystepuja w kurzu i glebie. Gatunkiem o najwiekszym znaczeniuklinicznym jest C. perfringens. Bakteria ta zwiazana jest ze zgorzela gazowa,moze rowniez wywoływac bakteriemie lub inne powazne infekcje. W przeciwien-stwie do pozostałych gatunkow C. perfringens nie wykazuje zdolnosci ruchu i niewytwarza spor w zakazonych tkankach lub młodych hodowlach.

117

CZESC I

C. perfringens rosnie szybko na płynnym podłozu do hodowli beztlenowcow,wytwarzajac duze ilosci gazu. Na agarze beztlenowym po 48 godzinachobserwowane sa sredniej wielkosci (2 – 3 mm) kolonie. Wiekszosc szczepowwytwarza podwojna strefe hemolizy: wewnetrzna strefe całkowitej hemolizyi zewnetrzna strefe hemolizy czesciowej.

Szybka identyfikacja jest mozliwa na podstawie wyniku odwrotnego testuCAMP1, ktory przeprowadza sie w ponizej opisany sposob (patrz ryc. 11)2:

1. Przygotowac płytke z podłozem agarowym z dodatkiem 5% przepłukanejtrisem krwi baraniej.

2. Nałozyc czysta hodowle Streptococcus agalactiae wzdłuz srednicy płytki.Posiac badana hodowle Clostridium prostopadle do linii posiewu S. agalactiae,nie dotykajac jej.

3. Inkubowac w anaerostacie przez 24 godziny.

C. perfringens tworzy w miejscu skrzyzowania posiewow strefe widocznejhemolizy, kształtem przypominajaca strzałe. Laseczki ujemne w odwrotnymtescie CAMP moga zostac opisane jako ,,Clostridium spp. nie-C. perfringens’’.

Peptostreptococcus

Niektore gatunki bezwzglednie beztlenowych Gram-dodatnich ziarenkowcownaleza do komensalnej flory układu oddechowego, pokarmowego i moczowo--płciowego. Wywołuja, zwykle wraz z innymi tlenowymi i beztlenowymibakteriami, ropnie, zakazenia ran, a nawet bakteriemie. Wzrost beztlenowych

1 Odwrotny test CAMP: nazwa pochodzi od nazwisk Christy, Adkins i Munch-Peterson, ktorzypierwsi opisali te reakcje u paciorkowcow grupy B.2 Hansen M.V., Elliot L.P.: New presumptive identification test for Clostridium perfringens: reverseCAMP test. Journal of Clinical Microbiology, 1980, 12: 617 – 619.

Ryc. 11. Odwrotny test CAMP.

118


ziarenkowcow na podłozach laboratoryjnych zwykle jest wolniejszy niz wzrostBacteroides i Clostridium, a kolonie na agarze z krwia pojawiaja sie nie wczesniejniz po 48 godzinach inkubacji.

W rutynowej diagnostyce zakazen beztlenowcami identyfikacja gatunkow nie jestkonieczna. Gram-dodatnie ziarenkowce, ktore nie rosna w warunkach tlenowych,a na agarze z krwia dla bakterii beztlenowych wytwarzaja niewielkie, wypukłe,białe kolonie, moga byc z duzym prawdopodobienstwem uznane za Peptostrep-tococcus spp.

Badanie wrazliwosci na antybiotyki

Antybiogram dla bakterii beztlenowych nie powinien byc wykonywany rutyno-wo, ze wzgledu na brak wiarygodnosci metody dyfuzyjno-krazkowej.

Wiekszosc zakazen wywołana jest przez wrazliwe na penicyline bakterie,z wyjatkiem infekcji wywodzacych sie z przewodu pokarmowego lub pochwy.W zakazeniach takich zazwyczaj obecne sa Bacteroides fragilis, ktore wy-twarzajac β-laktamazy sa oporne na penicyliny i wiekszosc cefalosporyn. Lekiemz wyboru w tych infekcjach jest klindamycyna, metronidazol lub chloramfenikol.Aminoglikozydy i chinolony nie wykazuja aktywnosci wobec beztlenowcow, leczmoga byc stosowane z powodu aktywnosci wobec bakterii tlenowych, ktoreczesto wystepuja w zakazeniach mieszanych.

119

Oznaczanie wrazliwoscina antybiotyki

Wprowadzenie

W Genewie podczas spotkania zorganizowanego w 1977 r. przez WHO1

wyrazono niepokoj dotyczacy obserwowanego na swiecie narastania opornosci naantybiotyki, zwiazanej z czesto nieograniczonym wzrostem stosowania anty-biotykow zarowno u ludzi, jak i zwierzat. W ostatnich latach lekooporne bakteriebyły przyczyna kilku powaznych epidemii zakazen o duzej smiertelnosci.Doprowadziło to do potrzeby wprowadzenia krajowych i miedzynarodowychprogramow kontroli monitorujacych antybiotykoopornosc bakterii na podstawieoceny lekowrazliwosci z zastosowaniem wiarygodnych metod, ktore pozwoliłybyuzyskac porownywalne dane. Dostepnosc mikrobiologicznych i epidemiologicz-nych danych ułatwi klinicyscie wybor mozliwie najlepszego preparatu przeciw-bakteryjnego w leczeniu zakazen.

Aby załozenia te były skuteczne, nalezy odpowiednia, powtarzalna metodaprzeprowadzic oznaczenia lekowrazliwosci, ktorej wyniki powinny miec bezpo-srednie zastosowanie kliniczne. Najwyzszym kryterium wiarygodnosci kazdejmetody oznaczania wrazliwosci jest korelacja wyniku z odpowiedzia pacjenta naleczenie przeciwbakteryjne.

Na spotkaniu WHO ustalono, ze ze wzgledu na prostote i powtarzalnosc, zarownodla celow klinicznych, jak i w monitorowaniu, zalecana jest zmodyfikowanametoda dyfuzyjno-krazkowa Kirby-Bauera2, dla ktorej wymagania zostały ustalo-ne przez WHO w 1976 r. Metoda jest szczegolnie zalecana dla bakterii nalezacychdo rodziny Enterobacteriaceae, lecz moze byc stosowana rowniez w przypadkuwszystkich szybko rosnacych patogenow. Metoda ta została takze przystosowanadla najwazniejszych klinicznie bakterii o wyzszych wymaganiach odzywczych,z wyjatkiem scisłych beztlenowcow i mykobakterii. Jest rekomendowana,poniewaz poszczegolne elementy testu sa mozliwe do wykonania przez pracow-nikow laboratorium3.

Podstawowe zasady oznaczanialekowrazliwosci

Testy wrazliwosci na antybiotyki okreslaja zdolnosc czynnika przeciwbakteryj-nego do zahamowania wzrostu bakterii in vitro. Zdolnosc te mozna oznaczyczarowno metoda rozcienczen, jak i metoda dyfuzyjna.

1 Surveillance for the prevention and control of health hazards due to antibiotic-resistantenterobacteria. Geneva, World Health Organization, 1978 (WHO Technical Report Series, No. 624).2 WHO Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-eighth report. Geneva, WorldHealth Organization, 1977 (WHO Technical Report Series, No. 610).3 Metoda porownywalna do metody Kirby-Bauera, oparta na tych samych zasadach i wymaganiachkontroli jakosci, jest metoda NEO-SENSITABS, produced ROSCO Diagnostica, Taastrup, Dania.W metodzie zamiast bibułowych krazkow stosowane sa 9-milimetrowe oznaczone kolorem tabletkiprzeciwbakteryjne. Forma tabletek gwarantuje wyjatkowa stabilnosc antybiotyku z okresem przecho-wywania do czterech lat, nawet w temperaturze pokojowej. Zwiekszona stabilnosc jest bardzo waznadla laboratoriow w krajach tropikalnych.

120

OZNACZANIE WRAZLIWOSCI NA ANTYBIOTYKI

Test rozcienczen

Rozcienczenia antybiotyku do ilosciowej oceny aktywnosci przeciwbakteryjnejmozna przygotowac w bulionie lub podłozu agarowym, ktore nastepnie inkubujesie z badanym mikroorganizmem. Najnizsze stezenie preparatu, ktore pocałonocnej inkubacji hamuje wzrost szczepu, okresla sie jako minimalne stezeniehamujace (MIC — minimum inhibitory concentration). Wartosc MIC porownujesie nastepnie ze znanym stezeniem leku, jakie osiagane jest w surowicy i innychpłynach ustrojowych, aby ocenic przypuszczalna odpowiedz kliniczna.

Test dyfuzji

Bibułowe krazki nasaczone okreslona iloscia antybiotyku umieszcza sie napodłozu agarowym z rownomiernie posianym badanym drobnoustrojem. Gradientstezenia antybiotyku tworzy sie przez dyfuzje z krazka, a powstała strefazahamowania wokoł krazka koreluje, wsrod innych czynnikow, z wrazliwosciaszczepu.

Istnieje prawie liniowa zaleznosc pomiedzy log MIC, mierzonym w tescierozcienczen, i srednica strefy zahamowania w tescie dyfuzyjnym. Linie regresjiwyrazajaca te zaleznosc mozna uzyskac badajac duza liczbe szczepow rowno-czesnie dwoma metodami (patrz ryc. 12 i 13).

Kliniczna definicja terminow ,,oporny’’i ,,wrazliwy’’

Wynik badania wrazliwosci w formie przedstawianej lekarzowi kwalifikujemikroorganizm do jednej z dwoch lub wiecej kategorii wrazliwosci. Najprostszysystem składa sie jedynie z dwoch kategorii: wrazliwy i oporny. Klasyfikacja,

0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64

MIC (µg/ml)WHO 90961

35

30

25

20

15

10

6

•••

•••

•

••

• •

• ••

•••

• •••

Ryc. 12. Graficzna prezentacja korelacji miedzy wartoscia log2MIC i strefa zahamowaniawzrostu uzyskiwana w metodzie dyfuzyjnej z uzyciem krazkow zawierajacych jedno,okreslone stezenie antybiotyku.

121

CZESC I

mimo ze ze wzgledow statystycznych i epidemiologicznych posiada wiele zalet,jest zbyt sztywna dla klinicysty. Dlatego czesto przyjmuje sie klasyfikacje trzechkategorii. Metoda Kirby-Bauera i jej modyfikacja uwzgledniaja trzy kategoriewrazliwosci i wazne jest, aby zarowno lekarz, jak i pracownik laboratoriumrozumieli ich dokładne definicje i znaczenie kliniczne.

• Wrazliwy. Mikroorganizm okreslany jest jako ,,wrazliwy’’ na antybiotyk, jesliodpowiedz kliniczna na leczenie danym antybiotykiem, stosowanym w zaleca-nych dawkach, jest prawdopodobna.

• Srednio wrazliwy dotyczy dwoch sytuacji. Okresla szczepy o ,,umiarkowanejwrazliwosci’’ na antybiotyk, ktory moze byc zastosowany w leczeniu w wiek-szej dawce (np. β-laktam) z powodu niskiej toksycznosci lub koncentracjiw ognisku zakazenia (np. mocz). Klasyfikacja odnosi sie rowniez do szczepowwykazujacych ,,srednia wrazliwosc’’ na bardziej toksyczne antybiotyki (np.aminoglikozydy), ktore nie moga byc zastosowane w wyzszych dawkach. W tejsytuacji posrednia kategoria stanowi strefe buforowa miedzy wrazliwosciai opornoscia.Podobnie jak wiekszosc klinicystow nie jest swiadoma, mimo klinicznegoznaczenia, subtelnej roznicy miedzy srednia i umiarkowana wrazliwoscia,wiele laboratoriow w obydwu sytuacjach uzywa okreslenia ,,srednia’’.

• Oporny. Ten termin wskazuje, ze niezaleznie od zastosowanej dawki i lokaliza-cji infekcji, oczekiwany jest brak odpowiedzi klinicznej na dany antybiotyk.

W pewnych sytuacjach, na przykład w badaniu odpowiedzi gronkowcow nabenzylopenicyline, istnieja tylko kategorie ,,wrazliwy’’ i ,,oporny’’ (odpowiadaja-ce zdolnosci do wytwarzania β-laktamaz).

Najlepsza decyzja o uzyciu okreslonego antybiotyku i stosowanego dawkowaniazalezy nie tylko od wynikow antybiogramu, ale rowniez od jego interpretacjiprzez lekarza. Nalezy wziac pod uwage takze inne czynniki, takie jak własciwoscichorobotworcze mikroorganizmu, działania uboczne i farmakokinetyczne włas-ciwosci leku, jego przenikanie do roznych obszarow ciała oraz status im-munologiczny pacjenta.

0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64MIC (µg/ml)

WHO 90962

35

30

25

20

15

10

6

— — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

——

—

S I R� �

�27

�14

1

1

Sre

dnic

egr

anic

zne

Sre

dnic

ast

refy

(mm

)

S

I

R

S – susceptible/wrazliwyI – intermediate/srednio wrazliwyR – resistant/oporny

Ryc. 13. Interpretacja wielkosci stref (wrazliwy, srednio wrazliwy, oporny) w odniesieniudo wartosci MIC.

122


Wskazania do rutynowego oznaczanialekowrazliwosci

Antybiogram w laboratorium klinicznym moze zostac wykonany w dwoch celach:• aby ukierunkowac lekarza w wyborze najlepszego leku przeciwbakteryjnego

indywidualnie dla pacjenta;• aby gromadzic informacje epidemiologiczne o opornosci mikroorganizmow

o istotnym znaczeniu dla zdrowia publicznego.

Antybiogram jako wskazowkado leczenia

Antybiogramy nigdy nie powinny byc wykonywane dla zanieczyszczajacychprobke lub komensalnych mikroorganizmow, nalezacych do flory fizjologicznej,oraz innych, nie majacych zwiazku z procesem zakazenia. Na przykład obecnoscEscherichia coli w moczu w liczbie mniejszej od znaczacej nie jest uwazana zaprzyczyne infekcji i wykonanie antybiogramu byłoby bezcelowe lub wreczmylace.

Antybiogramy powinny byc wykonywane tylko z czystych hodowli mikroor-ganizmow prawdopodobnie wywołujacych zakazenie.

Rutynowe badanie wrazliwosci nie jest wskazane w nastepujacych sytuacjach:• Jesli drobnoustroj nalezy do gatunku z przewidywalna wrazliwoscia na

okreslony lek. Tak jest w przypadku Streptococcus pyogenes i Neisseriameningitidis, ktore nadal wykazuja wrazliwosc na benzylopenicyline. (Jakkol-wiek ostatnio przedstawiono w raportach sporadyczne pojawianie sie ben-zylopenicylinoopornych meningokokow.) Podobnie jest w przypadku pacior-kowcow kałowych (enterokokow), ktore poza kilkoma wyjatkami (Enterococ-cus faecium — przyp. tłum.) sa wrazliwe na ampicyline. Jesli na podstawie cechklinicznych podejrzewa sie opornosc tych mikroorganizmow, szczepy nalezyprzesłac do referencyjnego laboratorium.

• Jesli drobnoustroj wymaga wzbogaconego podłoza, np. Haemophilus in-fluenzae i Neisseria gonorrhoeae. Przy braku scisłego przestrzegania własciwejtechniki wykonania antybiogramu test dyfuzyjno-krazkowy moze dawacniewiarygodne rezultaty. Pojawienie sie wytwarzajacych β-laktamazy warian-tow wyzej wymienionych szczepow spowodowało koniecznosc wprowadzeniaspecjalnych testow, takich jak wykrywajacy β-laktamazy in vitro test opisanyna stronie 92. Za monitorowanie wrazliwosci pneumokokow, gonokokowi Haemophilus odpowiadaja regionalne i centralne laboratoria. W raziewystapienia problemu opornosci szczepow nalezy ostrzec lokalne laboratoriai dostarczyc instrukcje dotyczace własciwych w tej sytuacji metod badanialekowrazliwosci i alternatywnych schematow leczenia.

• Niepowikłane zakazenia wywołane przez Salmonella (inne niz S. typhi lubS. paratyphi). Leczenie przeciwbakteryjne takich infekcji nie jest uzasadnione,nawet z zastosowaniem antybiotykow wykazujacych aktywnosc in vitro.Istnieje wiele dowodow przemawiajacych za brakiem klinicznych korzyscileczenia niepowikłanego zapalenia zoładkowo-jelitowego wywołanego przezpałeczki Salmonella (a w praktyce wiekszosci chorob biegunkowych o niejas-nej etiologii). Paradoksalnie, stosowanie antybiotykow moze wydłuzyc wyda-lanie i rozprzestrzenianie sie tych bakterii, a takze prowadzic do selekcjiszczepow opornych.

123

CZESC I

Antybiogram jako narzedzie badanepidemiologicznych

Rutynowe okreslanie wrazliwosci wiekszosci patogenow (S. typhi, pałeczkiShigella) jest istotnym elementem programu kontroli zakazen układu pokar-mowego. Badania te dostarczaja lekarzowi informacji o pojawieniu sie opornychszczepow (S. typhi oporna na chloramfenikol, pałeczki Shigella oporne nakotrimoksazol i ampicyline) oraz o ewentualnej potrzebie modyfikacji schematustandardowego leczenia. Mimo ze antybiogramy dla niedurowych serotypowpałeczek Salmonella, odpowiedzialnych za zakazenia jelitowe, nie maja znacze-nia w leczeniu pacjenta, pojawienie sie wielolekoopornych szczepow jestostrzezeniem dla lekarzy przed nadmiernym lub niewłasciwym stosowaniemlekow przeciwbakteryjnych. Stała kontrola i analiza antybiogramow jest doskona-łym zrodłem informacji o wystepowaniu opornych gronkowcow i Gram--ujemnych pałeczek, ktore moga byc odpowiedzialne za krzyzowe zakazeniaszpitalne. Okresowe raportowanie wzorow opornosci izolowanych szczepowstanowi nieoceniona pomoc w prowadzeniu własciwej polityki antybiotykowejw szpitalu, opartej na ograniczeniu i/lub rotacji ratujacych zycie lekow, takich jakaminoglikozydy i cefalosporyny.

Wybor lekow do oznaczania lekowrazliwosciw laboratoriach klinicznych

Wybor lekow uzywanych w rutynowym antybiogramie dokonywany jest napodstawie spektrum przeciwbakteryjnego leku, jego własciwosci farmakokinety-cznych, toksycznosci, skutecznosci i dostepnosci, a takze kosztow zarowno dlapacjenta, jak i dla społeczenstwa. Sposrod wielu preparatow przeciwbakteryjnychstosowanych w leczeniu jedynie niewielka czesc starannie dobranych lekowpowinna byc wykorzystywana w oznaczaniu wrazliwosci.

W tabeli 23 wymienione zostały antybiotyki stosowane w roznych sytuacjachklinicznych. Leki podzielono na dwie grupy. Grupa pierwsza to leki dostepnew wiekszosci szpitali, ktore powinny byc uwzglednione w antybiogramie dla

Tabela 23. Podstawowe zestawy antybiotykow do rutynowego oznaczania wrazliwoscia

Staphylococcus Pseudomonasaeruginosa

Enterobacteriaceae

Układpokarmowy Mocz Krew i tkanki

Grupa 1Leki pierwszego rzutu

Benzylopenicylina Ampicylina Sulfonamid Ampicylina PiperacylinaOksacylina Chloramfenikol Trimetoprim Chloramfenikol GentamycynaErytromycyna Kotrimoksazol Kotrimoksazol Kotrimoksazol TobramycynaTetracyklina Kwas nalidyksowy Ampicylina TetracyklinaChloramfenikol Tetracyklina Nitrofurantoina Cefalotyna

Kwas nalidyksowy GentamycynaTetracyklina Amoksycylina/

/kwas klawula-nowyb

Grupa 2Leki uzupełniajace

Gentamycyna Norfloksacyna Norfloksacyna Cefuroksym AmikacynaAmikacyna Chloramfenikol Ceftriakson CiprofloksacynaKotrimoksazol Gentamycyna Ciprofloksacyna CeftazydymKlindamycyna Amoksycylina/

/kwas klawula-nowyb

PiperacylinaNitrofurantoina Amikacyna

a Informacje o poszczegolnych antybiotykach sa umieszczone w tekscie.b Amoksycylina z kwasem klawulanowym (inhibitor β-laktamaz).

124


kazdego izolowanego szczepu1. Testy dla lekow z drugiej grupy powinny bycwykonywane jedynie na specjalne zlecenie lekarza, gdy izolowany patogen jestoporny na leki pierwszego rzutu lub gdy inne powody (alergia na lek lub jegoniedostepnosc) uzasadniaja takie badanie. Wiele antybiotykow o dobrej aktywno-sci klinicznej zostało pominietych w tabeli, lecz nalezy podkreslic, ze ichzastosowanie jest rzadko konieczne w leczeniu zakazonych pacjentow. Wyjat-kowo, jesli istnieja szczegolne wskazania znane lekarzowi lub jesli dostepne sanowe i lepsze leki, do leczenia mozna właczyc jeden lub wiecej lekowdodatkowych. Wskazana jest aktualizacja informacji zawartych w tabeli wewspołpracy z personelem klinicznym. W antybiogramach wykorzystuje sieniekiedy tylko jeden lek reprezentujacy cała grupe, co moze byc przyczynanieporozumien w sytuacji, gdy klinicysci nie sa tego swiadomi. Wynik antybio-gramu dla reprezentatywnego antybiotyku mozna odniesc do wszystkich lub dowiekszosci przedstawicieli danej grupy. W niektorych krajach powazne utrud-nienia wynikaja z faktu, ze lekarze znaja tylko handlowe nazwy lekow, bez nazwmiedzynarodowych. Nalezy połozyc nacisk na informowanie personelu medycz-nego o nazwach niehandlowych antybiotykow i zachecac do ich stosowania2.

1. Krazek z benzylopenicylina stosowany jest do okreslania wrazliwosci nawszystkie β-laktamazowrazliwe penicyliny (takie jak doustna fenoksymety-lopenicylina i fenetycylina). W zakazeniach wywołanych przez gronkowcewytwarzajace β-laktamazy powinno sie stosowac β-laktamazooporne penicy-liny lub inny antybiotyk, np. erytromycyne.

2. Krazek z oksacylina jest reprezentatywny dla całej grupy β-laktamazoopor-nych penicylin (wliczajac metycyline, nafcyline, kloksacyline, dikloksacyli-ne i flukloksacyline). Istnieja dowody kliniczne na krzyzowa opornoscmiedzy metycylina i grupa cefalosporyn. Dlatego niepotrzebne i mylace jestwłaczenie cefalotyny do antybiogramu dla gronkowcow. Opornosc nametycyline i pozostałe leki tej grupy ma czesto heterogenny charakter, np.wiekszosc komorek moze byc w pełni wrazliwa i tworzyc szeroka strefezahamowania, podczas gdy czesc populacji rosnie w strefie zahamowaniaw postaci drobnych kolonii. Ten typ opornosci jest lepiej wykrywanyw temperaturze 35°C3 lub przy przedłuzonym czasie inkubacji. Powaznawada metycyliny, jako antybiotyku reprezentatywnego dla całej grupy, jestjej duza niestabilnosc, nawet w prawidłowych warunkach przechowywania.W standardowej metodzie dyfuzyjnej preferuje sie stosowanie krazkaz oksacylina, ktora jest bardziej trwała. Krazki z kloksacylina i dikloksacylinanie sa stosowane, poniewaz moga nie wykrywac heteroopornych szczepow.

3. Wynik badania wrazliwosci na tetracykline mozna odniesc do chlorotetracyk-liny, oksytetracykliny oraz innych przedstawicieli tej grupy. Jednak wiek-szosc opornych na tetracykline gronkowcow zachowuje wrazliwosc naminocykline. Krazki z minocyklina moga wiec byc przydatne w oznaczaniuwrazliwosci wieloopornych szczepow gronkowcow.

4. Wynik badania wrazliwosci na chloramfenikol mozna odniesc do tiam-fenikolu, pochodnego leku o porownywalnym spektrum przeciwbakteryj-nym, ale bez znanego ryzyka niedokrwistosci aplastycznej.

1 W Polsce dobor krazkow do wykonania antybiogramu powinien byc oparty na rekomendacjachopracowanych przez Krajowy Osrodek Referencyjny ds. Lekowrazliwosci Drobnoustrojow (przyp.tłum.).2 International Nonproprietary Names (INN) for Pharmaceutical Substances. Cumulative list No. 9.Geneva, World Health Organization, 1996.3 Sahm D.F. et al.: Current concepts and approaches to antimicrobial agent susceptibility testing. In:Cumitech 25, Washington, DC, American Society for Microbiology, 1988.

125

CZESC I

5. W antybiogramie stosowany jest tylko jeden przedstawiciel sulfonamidow(sulfafurazol).

6. Krazek z kotrimoksazolem zawiera kombinacje trimetoprimu i sulfonamidu(sulfametoksazol). Dwa składniki tego synergistycznego połaczenia majapodobne własciwosci farmakokinetyczne i generalnie działaja jak jeden lek.

7. Ampicylina jest przedstawicielem grupy penicylin o szerokim spektrumdziałania, wykazujacych aktywnosc wobec wielu Gram-ujemnych bakterii.Poniewaz jest wrazliwa na β-laktamazy, nie powinna byc stosowanaw okreslaniu lekowrazliwosci gronkowcow. Ogolnie, wynik wrazliwosci naampicyline odnosi sie rowniez do innych przedstawicieli grupy: amok-sycyliny, piwampicyliny, talampicyliny itp. (choc amoksycylina jest dwu-krotnie bardziej aktywna wobec pałeczek Salmonella i o połowe mniejaktywna wobec pałeczek Shigella i H. influenzea).

8. Rutynowo nalezy okreslac wrazliwosc jedynie na cefalotyne, poniewazwynik jest reprezentatywny dla innych cefalosporyn pierwszej generacji(cefaleksyna, cefradyna, cefalorydyna, cefazolina, cefapiryna). Ze wzgleduna dostepnosc cefalosporyn drugiej i trzeciej generacji oraz ich pochodnych(cefamycyny) o rozszerzonym spektrum, w wybranych przypadkach mozebyc uzasadnione uzycie krazkow z antybiotykami tej grupy (cefoksytyna,cefamandol, cefuroksym, cefotaksym, ceftriakson). Wrazliwosc na cefalos-poryny stosowane w ciezkich zakazeniach gronkowcowych mozna okreslicna podstawie wynikow badania wrazliwosci na oksacyline, o czym wspo-mniano juz powyzej w punkcie 2.

9. Erytromycyna jest wykorzystywana do oceny wrazliwosci takze na innemakrolidy (oleandomycyna, spiramycyna).

10. Aminoglikozydy tworza grupe chemicznie podobnych lekow obejmujacychstreptomycyne, gentamycyne, kanamycyne, netylmycyne i tobramycyne. Ichspektra przeciwbakteryjne nie zawsze sa na tyle podobne, aby mozna byłozałozyc istnienie krzyzowej opornosci, ale wobec wrazliwych patogenow lekite wykazuja identyczna skutecznosc. W licznych badaniach porownywanonefrotoksycznosc i ototoksycznosc gentamycyny, netylmycyny i tobramycy-ny, ale nie uzyskano ostatecznych dowodow, swiadczacych o mniejszejtoksycznosci ktorejkolwiek z nich. Zaleca sie, aby kazde laboratoriumwybrało jeden lek do podstawowego antybiogramu. Pozostałe antybiotykinalezy zachowac w rezerwie do leczenia pacjentow z zakazeniami wywoła-nymi przez oporne drobnoustroje.

11. Stosowanie nitrofurantoiny ograniczone jest do leczenia zakazen układumoczowego i wrazliwosc na ten lek nie powinna byc oznaczana dla szczepowpochodzacych z innych materiałow niz mocz.

Tabela 24 zawiera wartosci graniczne srednic stref zahamowania wzrostu dlaszczepow kontrolnych.

Zmodyfikowana metoda Kirby-Bauera

Metoda dyfuzyjno-krazkowa, po raz pierwszy opisana w 1966 r.1, jest dobrzewystandaryzowana i wysoko ceniona metoda. Oficjalne instytucje zaleciły ja,z niewielkimi modyfikacjami, jako referencyjna metode, ktora moze bycrutynowo stosowana w laboratoriach klinicznych.

1 Bauer A.W. et al.: Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. AmericanJournal of Clinical Pathology, 1966; 45: 493 – 496.

126


Odczynniki

Agar Mueller-Hintona

1. Przygotowac agar Mueller-Hintona z postaci sproszkowanej, zgodnie z zalece-niem producenta. Podłoza powinny byc przygotowane w sposob, ktoryumozliwi uzyskanie odpowiednich stref zahamowania dla szczepow kontrol-nych (patrz tabela 24). Wazne jest, aby nie przegrzac podłoza.

2. Schłodzic podłoze do 45 – 50°C i rozlac na płytki. Wypełnic do poziomu około4 mm. Płytka o srednicy 9 cm zawiera około 25 ml podłoza.

3. Gdy agar stezeje, płytki do natychmiastowego uzycia suszyc przez 10 – 30 minutw 35°C, umieszczajac je w cieplarce do gory dnem, z uchylonymi wieczkami.

4. Nie wykorzystane płytki mozna przechowywac w chłodziarce, w szczelniezamknietych plastikowych woreczkach. Płytki moga byc przechowywanew ten sposob przez 2 tygodnie.

W celu uzyskania wiarygodnych stref zahamowania wzrostu, do badania leko-wrazliwosci na sulfonamidy i kotrimoksazol nalezy uzyc agaru Mueller-Hintona,zawierajacego niskie stezenia inhibitorow tymidyny i tyminy. Z tego wzgledukazda nowa partia agaru Mueller-Hintona musi zostac przetestowana z uzyciem

Tabela 24. Strefy zahamowania wzrostu dla szczepow kontrolnycha

Antybiotyk Zawartoscw krazku

Srednica strefy zahamowania (mm)

S. aureus(ATCC 25923)

E. coli(ATCC 25922)

P. aeruginosa(ATCC 27853)

Amikacyna 30 µg 20 –26 19 –26 18 –26Amoksycylina/kwas

klawulanowyb20/10 µg 28 –36 19 –25 —

Ampicylina 10 µg 27 –35 16 –22 —Benzylopenicylina 10 µg 26 –37 — —Cefalotyna 30 µg 29 –37 15 –21 —Cefalozyna 30 µg 29 –35 23 –29 —Ceftazydym 30 µg 16 –20 25 –32 22 –29Cefotaksym 30 µg 25 –31 29 –35 18 –22Ceftriakson 30 µg 22 –28 29 –35 17 –23Cefuroksym 30 µg 27 –35 20 –26 —Chloramfenikol 30 µg 19 –26 21 –27 —Ciprofloksacyna 5 µg 22 –30 30 –40 25 –33Klindamycyna 2 µg 24 –30 — —Kotrimoksazol 25 µg 24 –32 24 –32 —Erytromycyna 15 µg 22 –30 — —Gentamycyna 10 µg 19 –27 19 –26 16 –21Kwas nalidyksowy 30 µg — 22 –28 —Nitrofurantoina 300 µg 18 –22 20 –25 —Norfloksacyna 10 µg 17 –28 28 –35 22 –29Oksacylina 1 µg 18 –24 — —Piperacylina 100 µg — 24 –30 25 –33Sulfonamidc 300 µg 24 –34 15 –23 —Tetracyklina 30 µg 24 –30 18 –25 —Tobramycyna 10 µg 19 –29 18 –26 19 –25Trimetoprim 5 µg 19 –26 21 –28 —Wankomycyna 30 µg 17 –21 — —

a National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimic-robial disc susceptibility tests. 6th ed. Vol. 21 No 1 (M2-A7 i M7-A5) i 11th informationalsupplement 2001 (M100-S11).

b Amoksycylina z kwasem klawulanowym (inhibitor β-laktamaz).c Sulfizoksazol.

127

CZESC I

szczepu kontrolnego Enterococcus faecalis (ATCC 29212 lub 33186) oraz krazkaz kotrimoksazolem. O odpowiedniej jakosci podłozy swiadczy wyrazna, 20--milimetrowa lub wieksza, strefa zahamowania, co wazne — bez mglistegowzrostu i drobnych kolonii.

Krazki z antybiotykami

Mozna uzywac wszystkich dostepnych komercyjnie krazkow o własciwejsrednicy i stezeniu leku. Zapasy krazkow nalezy przechowywac w –20°C;odpowiednia jest takze zamrazarka chłodziarki. Mały podreczny zestaw krazkowmozna przechowywac w chłodziarce do miesiaca. Po wyjeciu z chłodziarkipojemniki nalezy pozostawic w temperaturze pokojowej na około 1 godziny (dowyrownania temperatur). Taka procedura zmniejsza skraplanie pary, pojawiajacejsie w wyniku kontaktu ciepłego powietrza z powierzchnia zimnego pojemnika.Jesli uzywa sie dyspensera krazkow, nalezy przechowywac go w chłodziarce zeszczelnie domknieta pokrywa. Przed otwarciem dyspenser rowniez powinienzostac ogrzany do temperatury pokojowej.

Wzorzec zmetnienia

Przygotowac wzorzec zmetnienia (gestosci zawiesiny — przyp. tłum.) wlewajac0,6 ml 1% (10 g/l) roztworu dwuwodzianu chlorku baru do 100-mililitrowegokalibrowanego cylindra i wypełnic do 100 ml 1% (10 ml/l) kwasem siarkowym.Roztwor wzorcowego zmetnienia nalezy umiescic w identycznej probowce, jakprobowki z bulionem. Wzorzec moze byc przechowywany w ciemnosci,w temperaturze pokojowej przez 6 miesiecy, pod warunkiem, ze jest zamknietyw sposob uniemozliwiajacy parowanie.

Wymazowki

Przygotowuje sie zapas bawełnianych wymazowek na drewnianych patyczkach.Wymazowki sterylizuje sie w autoklawie lub w sterylizatorach na suche goracepowietrze, umieszczajac je w puszkach, probowkach lub opakowane w papier.

ProceduraAby przygotowac inoculum z hodowli na podłozu stałym, nalezy zebrac eza3 – 5 kolonii badanego mikroorganizmu o tym samym wygladzie.

128


Przeniesc do probowki z fizjologicznym roztworem soli.

Jesli inoculum przygotowywane jest z czystej hodowli, nalezy w ten sam sposobw roztworze fizjologicznym soli zawiesic eza materiał pobrany ze zlewnegowzrostu.

Porownac probowke ze wzorcem zmetnienia i dostosowac gestosc badanejzawiesiny do wzorca, dodajac wiecej bakterii lub wiecej fizjologicznego roztworusoli.

Własciwa gestosc inoculum jest konieczna do uzyskania zlewnej lub prawiezlewnej murawy wzrostu.

Badany szczep posiac na płytki, zanurzajac sterylna wymazowke w inoculum.Usunac nadmiar zawiesiny, obracajac i przyciskajac wymazowke mocno doscianki probowki powyzej poziomu płynu.

129

CZESC I

Zawiesine trzykrotnie rozprowadzic dokładnie na całej powierzchni podłoza,przekrecajac płytke za kazdym razem o 60°. Na koniec przesunac wymazowkewzdłuz brzegow powierzchni agaru. Pozostawic na kilka minut do wyschnieciaw temperaturze pokojowej, z zamknietym wieczkiem.

Krazki z antybiotykami mozna umiescic na posianej płytce za pomoca sterylnejpesety. Zastosowanie szablonu (ryc. 15) ułatwia rownomierne rozmieszczeniekrazkow.

Do umieszczenia krazkow z antybiotykami na posianej płytce mozna rowniezuzyc sterylnej igły z zatyczka.

130


Alternatywnie, do nałozenia na posiana płytke krazkow z antybiotykami moznauzyc dyspensera.

Maksymalnie na płytce o srednicy 9 – 10 cm mozna umiescic siedem krazkow.Szesc krazkow mozna rozmiescic rownomiernie w jednakowej odległosci, około15 mm od brzegu płytki, a jeden krazek nałozyc w centrum płytki. Kazdy krazeknalezy delikatnie przycisnac, zapewniajac rownomierny kontakt z podłozem.

Płytki powinny byc w ciagu 30 minut umieszczone w cieplarce w 35°C. Tempe-ratura powyzej 35°C zaburza wyniki wrazliwosci na oksacyline/metycyline.

Nie inkubowac w atmosferze dwutlenku wegla.

Po całonocnej inkubacji nalezy zmierzyc srednice kazdej strefy (wliczajacsrednice krazka) i zanotowac odczyt (w mm). Interpretowac wyniki zgodniez wartosciami przedstawionymi w tabeli 25.

Pomiar stref moze byc wykonany za pomoca linijki przyłozonej do dna płytki, bezjej otwierania.

131

CZESC I

Jesli płytka nie jest przezroczysta, pomiaru mozna dokonac za pomoca suwmiarki.

Wyniki badania lekowrazliwosci mozna odczytac posługujac sie szablonem

(ryc. 14).

132


Tabela 25. Interpretacja stref zahamowania wzrostu w zmodyfikowanej metodzieKirby-Baueraa dla bakterii szybko rosnacych

AntybiotykSrednica strefy zahamowania (mm)

Zawartoscw krazku Oporny Srednio

wrazliwy Wrazliwy

Amikacyna 30 µg < 14 15 –16 > 17

Amoksycylina/kwas klawula-nowyb

20/10 µg < 13 14 –17 > 18

Ampicylina dla:

– Enterobacteriaceae 10 µg < 13 14 –16 > 17– enterokoki 10 µg < 16 — > 17

Benzylopenicylina dla:

– gronkowce 10 IU < 28 — > 29– enterokoki 10 IU < 14 — > 15

Cefalotyna 30 µg < 14 15 –17 > 18

Cefalozyna 30 µg < 14 15 –17 > 18

Cefotaksym 30 µg < 14 15 –22 > 23

Ceftazydym 30 µg < 14 15 –17 > 18

Ceftriakson 30 µg < 13 14 –20 > 21

Cefuroksym sodium, cefa-mandol

30 µg < 14 15 –17 > 18

Chloramfenikol 30 µg < 12 13 –17 > 18

Ciprofloksacyna 5 µg < 15 16 –20 > 21

Klindamycyna 2 µg < 14 15 –20 1 21

Kotrimoksazol 25 µg < 10 11 –15 1 16

Erytromycyna 15 µg < 13 14 –22 > 23

Gentamycyna 10 µg < 12 13 –14 > 15

Kwas nalidyksowyc 30 µg < 13 14 –18 1 19

Nitrofurantoinac 300 µg < 14 15 –16 > 17

Norfloksacynac 10 µg < 12 13 –16 > 17

Oksacylina 1 µg < 10 10 –12 > 13

Piperacylina dla:

– P. aeruginosa 100 µg < 17 — > 18– inne pałeczki Gram-uje-

mne100 µg < 17 18 –20 > 21

Sulfonamidc, d 300 µg < 12 13 –16 > 17

Tetracyklina 30 µg < 14 15 –18 > 19

Tobramycyna 10 µg < 12 13 –14 > 15

Trimetoprimc 5 µg < 10 11 –15 1 16

Wankomycyna dla:

– gronkowce 30 µg — — > 15– enterokoki 30 µg < 14 15 –16 > 17

a National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimic-robial disc susceptibility tests. 6th ed., Vol. 21, No 1 (M2-A7 i M7-A5) Wayne, PA, NCCLS i 11th

informational supplement 2001 (M100-S11).b Amoksycylina z kwasem klawulanowym (inhibitor β-laktamaz).c Uzywane tylko do badania patogenow wyizolowanych z drog moczowych i niektorychszczepow jelitowych.d Sulfizoksazol.

133

CZESC I

Granice strefy zahamowania ustala sie gołym okiem w miejscu, gdzie rozpoczynasie widoczny wzrost; istnieja jednak trzy wyjatki:• W przypadku sulfonamidow i kotrimoksazolu w strefie zahamowania pojawia

sie słaby wzrost; nie nalezy go brac pod uwage.• W przypadku okreslania wrazliwosci β-laktamazododatnich gronkowcow na

benzylopenicyliny brzegi strefy zahamowania sa wyraznie widoczne i unie-sione; łatwo uznac je za dodatni wynik testu, podczas gdy niezaleznie odrozmiaru strefy zahamowania szczep nalezy opisac jako oporny.

• Pewne gatunki Proteus moga wokoł niektorych krazkow z antybiotykamiwytwarzac, w wyraznie ograniczonej strefie zahamowania, cienka warstwewzrostu mgławicowego, ktorego nie nalezy brac pod uwage.

Interpretacja wielkosci stref zahamowania

Stosowanie wzornika. Dla kazdego antybiotyku nalezy przygotowac oddzielnywzornik (patrz ryc. 14). Wynik mozna odczytac z jednoczesna interpretacja— wrazliwy, oporny lub srednio wrazliwy: ,,wrazliwy’’, jesli granica strefywykracza poza czarny pierscien; ,,oporny’’, jesli nie obserwuje sie strefy lub gdyjej granica miesci sie w polu białego pierscienia; ,,srednio wrazliwy’’, jesli granicastrefy zahamowania lezy w obrebie czarnego pierscienia.

Stosowanie linijki. Wyniki pomiarow stref zahamowania w mm nalezy inter-pretowac zgodnie z granicznymi srednicami przedstawionymi w tabeli 25.

Bezposrednie a posrednie oznaczanielekowrazliwosci

W opisanej powyzej metodzie inoculum przygotowywane jest z pierwotnej płytkihodowlanej lub z czystych hodowli. Jest to tak zwany posredni test lekowrazliwo-sci. W przypadkach, gdy niezbedny jest szybki wynik, zamiast standardowegoinoculum mozna wykorzystac badany materiał, np. mocz, dodatnie posiewy z krwilub wymazy ropy. W przypadku moczu nalezy najpierw zbadac pod mikroskopemosad, oceniajac obecnosc dowodow infekcji, np. obecnosc granulocytow i/lubdrobnoustrojow. Nastepnie mozna wykorzystac mocz jako inoculum w metodziestandardowej. Jesli barwienie Grama inkubowanych hodowli z krwi, wykazuja-cych wzrost bakterii, lub wymazow z ropy potwierdzi obecnosc duzej liczbymikroorganizmow jednego typu, materiały te moga zostac uzyte jako bezposred-nie inoculum. Jest to tzw. bezposredni test lekowrazliwosci; zaleta testu bezposred-niego jest szybsze o 24 godziny uzyskanie wyniku. Głowna wade stanowi brakwłasciwego przygotowania inoculum. Jesli na płytkach pojawi sie zbyt słaby lubzbyt intensywny wzrost lub gdy obecne sa mieszane hodowle, nalezy bardzouwaznie interpretowac wyniki i powtorzyc test uzywajac czystych hodowli.

Krazekz antybiotykiem

Strefa wewnetrzna:szczep oporny

Strefa czarna:srednia wrazliwosc

Strefa zewnetrzna:szczep wrazliwy

�

�

�

�

WHO 91127

Ryc. 14. Szablon do okreslania wrazliwosci.

134


Czynniki techniczne wpływajace na wielkoscstrefy zahamowania w metodziedyfuzyjno-krazkowej

Gestosc inoculum

W przypadku zbyt małej gestosci inoculum uzyskana strefa zahamowania,niezaleznie od wrazliwosci mikroorganizmu, bedzie wieksza. Z tego powoduoporne szczepy moga zostac opisane jako wrazliwe. W odwrotnej sytuacji, zbytduzej gestosci inoculum, wielkosc uzyskanej strefy bedzie mniejsza i szczepywrazliwe moga zostac opisane jako oporne. Zwykle najlepsze wyniki uzyskuje sieprzygotowujac inoculum warunkujace prawie zlewny wzrost.

Czas nałozenia krazkow

Na posianych płytkach, pozostawionych w temperaturze pokojowej dłuzej nizpodano w procedurze, przed nałozeniem krazkow dochodzi do namnazaniaszczepow. W rezultacie srednica strefy zahamowania jest mniejsza i szczepywrazliwe moga zostac opisane jako oporne.

Temperatura inkubacji

W celu otrzymania optymalnego wzrostu podłoza z antybiogramem nalezyinkubowac w 35°C. Jesli temperatura jest nizsza, wydłuza sie czas inkubacji,a uzyskane strefy sa wieksze. W przypadku badania wrazliwosci heterogennieopornych szczepow Staphylococcus aureus na metycyline (oksacyline) czescoporna populacji wykrywa sie w 35°C. W wyzszych temperaturach cała hodowlawykazuje wrazliwosc. W temperaturze 35°C i nizszej w strefie zahamowaniarosna oporne kolonie. Opisane kolonie sa lepiej widoczne, jesli przed odczytempłytke pozostawi sie na kilka godzin w temperaturze pokojowej. Nalezy zawszezidentyfikowac ten typ kolonii, wykluczajac zanieczyszczenie.

Czas inkubacji

Wiekszosc metod uwzglednia 16 – 18-godzinny okres inkubacji. Jakkolwiekw wyjatkowych sytuacjach wstepny wynik moze zostac przygotowany po6 godzinach. Nie jest to metoda zalecana i w kazdym przypadku wyniki nalezypotwierdzic po odpowiednim czasie inkubacji.

Rozmiar płytek, grubosc warstwy podłozaagarowego i rozmieszczenie krazkowz antybiotykami

Testy wrazliwosci przeprowadza sie zwykle na płytkach o srednicy 9 – 10 cm,umieszczajac nie wiecej niz 6 – 7 krazkow na kazdej z nich. W przypadku badaniawrazliwosci na wieksza liczbe antybiotykow zaleca sie uzycie dwoch płytek lub

135

CZESC I

jednej o srednicy 14 cm. Na bardzo cienkich podłozach moze wytwarzac siewieksza strefa zahamowania; odwrotnie dzieje sie w przypadku zbyt grubychpodłozy. Własciwe rozmieszczenie krazkow zapobiega nakładaniu sie strefzahamowania lub powstawaniu zniekształcen przy brzegach płytki (patrz ryc. 15).

Stezenie antybiotykow w krazkach

Srednica strefy zahamowania zalezy od zawartosci antybiotyku w krazku.Zmniejszeniu aktywnosci leku w zle przechowywanym krazku towarzyszyodpowiednie zmniejszenie wielkosci strefy zahamowania.

Skład podłozaPodłoze wpływa na wielkosc strefy, decydujac o stopniu wzrostu, wspołczynnikudyfuzji i aktywnosci leku. Wazne jest stosowanie podłozy odpowiednich dla danejmetody.

Mozliwosc uzyskania roznych warunkow badania lekowrazliwosci, wpływaja-cych na srednice strefy, jasno przemawia za potrzeba standaryzacji metodydyfuzyjno-krazkowej. Jedynie przestrzeganie ustalonych parametrow metodyumozliwia uzyskanie wartosciowych wynikow. Nieprawidłowosci zaburzajaceprzebieg badania moga prowadzic do przedstawienia lekarzowi razaco błednychwynikow.

Precyzja i dokładnosc metody powinny byc monitorowane za pomoca ustalonego,opisanego ponizej programu kontroli jakosci. W ten sposob mozliwa jest szybkaidentyfikacja i korekta błedow.

WHO 86961

Ryc. 15. Szablon do rownomiernego nakładania krazkow na płytke srednicy 90 mm.

136


Kontrola jakosci

Potrzeba kontroli jakosci testulekowrazliwosci

Na koncowy wynik testu dyfuzyjno-krazkowego wpływa duza liczba zmiennych.Niektore z nich, takie jak gestosc inoculum i temperatura inkubacji, łatwokontrolowac, jednak laboratorium rzadko znany jest dokładny skład podłozakomercyjnego lub roznice w jakosci kolejnych serii. Laboratorium nie mozerowniez odpowiadac za zawartosc antybiotykow w krazkach. Wyniki testowmusza byc ciagle monitorowane w programie kontroli jakosci, ktory nalezytraktowac jako element procedury.

Precyzja i dokładnosc metody powinny byc kontrolowane przez rownoległewykonywanie testow dla szczepu kontrolnego o znanej lekowrazliwosci. Szczepykontrolne i badane drobnoustroje podlegaja tej samej procedurze. Uzyskane dlamikroorganizmow kontrolnych wielkosci stref powinny odpowiadac wartosciomprzedstawionym w tabeli 24. Powtarzajace sie uzyskiwanie wynikow, ktore niemieszcza sie w okreslonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błedutechnicznego lub uzycia niewłasciwych odczynnikow. Nalezy sprawdzic kazdyodczynnik i etap testu, odnalezc i wyeliminowac bład.

Standardowa procedura kontroli jakosci

Program kontroli jakosci polega na rownoległym prowadzeniu oznaczaniawrazliwosci dla szczepow kontrolnych i badanych. Kontrole nalezy prze-prowadzac co tydzien lub dla co piatej serii badan i — dodatkowo — przy kazdejnowej partii agaru Mueller-Hintona lub krazkow.

Standardowe szczepy do kontroli jakosci

Staphylococcus aureus (ATCC 25923)Escherichia coli (ATCC 25922)Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

Powyzsze szczepy mozna uzyskac z panstwowych kolekcji szczepow. Sa takzedostepne komercyjnie w formie liofilizowanej uzyskanej z czystych hodowli.

Hodowle szczepow wzorcowych do codziennego uzytku powinny byc prowadzo-ne na skosach lub agarze odzywczym (zalecany jest agar tryptozowo-sojowy)i przechowywane w chłodziarce. Co 2 tygodnie nalezy przesiewac hodowle naswieze skosy.

Przygotowanie inoculum

Hodowle mozna zakładac na kazdym podłozu płynnym i inkubowac do chwilizmetnienia bulionu. Z kazdego podłoza płynnego nalezy przesiac szczep na płytkeagarowa i inkubowac przez noc. Nastepnie pobrac pojedyncze kolonie i prze-prowadzic badanie wrazliwosci w sposob opisany na stronach 127 – 130.

137

CZESC I

Nakładanie krazkow z antybiotykami

Po posianiu inoculum na płytki, w sposob opisany na str. 129, nałozycodpowiednie krazki na płytke. Wybrane krazki dla kazdego szczepu kontrolnegozostały wymienione w tabeli 24.

Odczytywanie wynikow

Po 16 – 18 godzinach inkubacji nalezy zmierzyc linijka srednice stref zahamowa-nia i zapisac, łacznie z data badania, na specjalnej karcie kontroli jakosci. Zapispowinien byc prowadzony dla kazdej kombinacji szczep-krazek. Karta zawieradiagram wielkosci stref w milimetrach, z zaznaczonym zakresem wartosciprawidłowych. Przykład takiej karty przedstawiono na ryc. 16. Jesli wynikisystematycznie wykraczaja poza dopuszczalne granice, nalezy podjac działania,ktore poprawia jakosc badania.

Istotne odchylenia wynikow, ktorych nie mozna wyjasnic technicznymi błedamiw procedurze, moga wskazywac na zanieczyszczenie, nagła zmiane wrazliwoscilub zmiane własciwosci szczepu kontrolnego. Nalezy wowczas uzyskac z wiary-godnego zrodła swiezy szczep wzorcowy.

25242322212019181716151413121110

XX X

X

XX X

X

�

�Akc

epto

wal

na

sred

nica

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20 2122 23 24 25 26 27 28 29 30 31Data

WHO 91093

Ryc. 16. Karta kontroli jakosci antybiogramow.

138

Badania serologiczne

Wprowadzenie

Odczyny serologicznie, w przeciwienstwie do posiewow i badan mikrobiologicz-nych, wykrywajac w probkach klinicznych antygeny bakteryjne lub przeciwciałapowstałe w odpowiedzi na nie, dostarczaja jedynie posrednich dowodowzakazenia. Testy te, ze wzgledu na wysoka swoistosc i czułosc, sa obecnie szerokostosowane w mikrobiologii.

W odpowiedzi na pierwotne zakazenie patogennym drobnoustrojem wiekszoscpacjentow wytwarza zarowno przeciwciała IgM, jak i IgG. Po kilku tygodniachdominujaca klasa przeciwciał staja sie IgG i w konsekwencji tylko IgG pozostajaw surowicy pacjenta. Kolejna infekcja wywołana przez ten sam patogen wywołujeodpowiedz z wytworzeniem przeciwciał IgG. Poniewaz komorki wytwarzajaceprzeciwciała zachowuja pamiec immunologiczna, odpowiedz taka, w porownaniuz odpowiedzia pierwotna, jest zwykle szybsza i bardziej nasilona; jest to tak zwanaodpowiedz wtorna.

Poziom przeciwciał najczesciej oznaczany jest przez ,,miareczkowanie’’. Diag-nostyczne miano jest najwiekszym rozcienczeniem surowicy pacjenta, przyktorym wykrywalne sa jeszcze przeciwciała. Na przykład, jesli przeciwciaławykrywane sa w rozcienczeniu 1:1024 i nie wyzszym, miano surowicy wynosi1024. Surowica pobrana w ostrym okresie infekcji, przy podejrzeniu pierwotnegozakazenia, nosi nazwe surowicy fazy ostrej; surowica pobrana w czasie rekon-walescencji, zwykle 2 tygodnie pozniej, nosi nazwe surowicy ozdrowienca.

Reakcja na antygen pojawia sie niezaleznie od okresu zakazenia, choc jej typmoze byc rozny. Obecnosc przeciwciał IgG w pojedynczej probce surowicy mozewskazywac na ekspozycje w przeszłosci, nie pozwala wiec na rozpoznanieswiezej infekcji. Niekiedy antygen stymuluje rowniez powstawanie przeciwciałreagujacych krzyzowo z innymi antygenami. Ze wzgledu na brak swoistoscitakich przeciwciał, badanie jednej probki surowicy moze prowadzic do niewłas-ciwej interpretacji wynikow. W wiekszosci testow serologicznych nalezy wyko-nac, najlepiej jednoczesnie, badanie surowicy pobranej w ostrym okresie chorobyi surowicy ozdrowienca; zapobiega to ewentualnym roznicom wynikajacymz warunkow przeprowadzania badania. Wzrost miana przeciwciał o dwa dwukrot-ne rozcienczenia (np. z rozcienczenia 1:8 do 1:32) swiadczy zwykle o swiezymzakazeniu. Jest to tak zwany czterokrotny wzrost miana. Badanie pojedynczejprobki surowicy moze byc przydatne tylko w niektorych przypadkach, np.w diagnostyce zakazenia Mycoplasma pneumoniae, gdy wysokie miana lubobecnosc przeciwciał IgM wskazuja na swieza infekcje. Typ reakcji antygen--przeciwciało zalezy od rodzaju antygenu.

Metody kontroli jakosci

Wiarygodnosc i spojnosc wynikow badan serologicznych całkowicie zaleza odmetod kontroli jakosci, przeprowadzanej przed, podczas i po kazdym tescie.Srodki kontroli jakosci sa niezmiernie istotne ze wzgledu na fałszywie dodatniei fałszywie ujemne wyniki, ktore moga istotnie wpływac na decyzje lekarza,dotyczace leczenia pacjenta. Na jakosc badan serologicznych wpływa wiele

139

CZESC I

czynnikow, do ktorych zaliczane sa: doswiadczenie personelu laboratoryjnego,jakosc zestawow i wyposazenie, jakosc probek, kontrole stosowane w testach orazinterpretacja i wydawanie wynikow. Po wykonaniu testu, nalezy wyrzucic zuzytemateriały do pojemnika wypełnionego srodkiem dezynfekujacym, umyc i zdezyn-fekowac rece oraz powierzchnie blatu.

Wyposazenie

Do wyposazenia laboratorium serologicznego naleza: łaznie wodne, cieplarki,chłodziarki, zamrazarki, pH-metry, wagi, wirowki, mikroskopy i wytrzasarki.Monitoring i rutynowe przeglady sprzetu sa istotnym elementem programuzapewnienia jakosci. Nalezy przestrzegac stałego serwisowania sprzetu z okreso-wymi przegladami i ewentualna kalibracja lub naprawa. Dla kazdego urzadzenianalezy prowadzic zapis dat przegladu, serwisu i naprawy.

Łaznia wodna poza czasem jej wykorzystania powinna byc pozostawiana pusta,co miesiac suszona i czyszczona. Temperature łazni wodnej nalezy staranniekontrolowac, nie dopuszczajac do zmian wiekszych niz ± 1°C; konieczny jestcodzienny pomiar i zapis temperatury, rowniez w trakcie działania. Wskazane jeststosowanie pokrywy, ktora zapobiega chłodzeniu powierzchni wody. Mieszanineantygenu i przeciwciał mozna inkubowac dopiero po uzyskaniu wymaganejtemperatury i utrzymaniu jej co najmniej przez godzine. Poziom wody powinienodpowiadac poziomowi płynu w umieszczonych w łazni probowkach lub kolbach.

Mikroskopy maja najwieksze znaczenie przy wykonywaniu testu VDRL (Venere-al Disease Research Laboratory, VDRL) oraz testu immunofluorescencji kretkoww modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i musza byc utrzymywane w mozliwienajlepszym stanie. Po uzyciu okular, obiektyw i kondensator mikroskopu nalezyprzetrzec miekka szmatka, usuwajac resztki olejku i zanieczyszczenia. Nieuzywa-ny mikroskop przechowuje sie pod przykryciem, zabezpieczony przed wilgocia.Intensywnosc lampy rteciowej w mikroskopie fluorescencyjnym nalezy spraw-dzac regularnie z uzyciem swiatłomierza.

Nalezy kontrolowac działanie wytrzasarek do testow VDRL oraz szybkiego testudo wykrywania reagin w osoczu (RPR) i korygowac wszelkie zmiany, ktore mogamiec niekorzystny wpływ na reakcje aglutynacji. Mechaniczna wytrzasarkapowinna byc regularnie oliwiona.

Materiały

Szklane naczynia i igły uzywane w testach serologicznych musza spełniacokreslone parametry.

Nie nalezy korzystac z uszczerbionych lub porysowanych naczyn, płyteki szkiełek. Uzycie brudnych lub niewłasciwie oczyszczonych szklanych naczyn,ktore moga zawierac organiczne zanieczyszczenia, jest głowna przyczynafałszywych wynikow. Przy stanowisku przeznaczonym do mycia nalezy umiescicpisemne instrukcje. Głowne etapy mycia powinny obejmowac: wstepne płukanie,mycie własciwym detergentem laboratoryjnym, płukanie woda z kranu, a nastep-nie woda destylowana, suszenie; nalezy upewnic sie, ze detergent został usuniety.

140

BADANIA SEROLOGICZNE

Wszystkie pipety nalezy zanurzyc w detergencie tak, aby roztwor wniknał dowewnatrz. Płukac pod biezaca woda co najmniej 30 minut, a nastepnie w wodziedestylowanej. Szklane płytki uzywane do odczynow VDRL musza zostacstarannie oczyszczone z pozostałosci detergentu i resztek olejku. Nalezy unikacprzedłuzonego moczenia w detergencie ze wzgledu na mozliwosc uszkodzeniapierscieni ceramicznych na płytkach. Szklane płytki z pierscieniami z parafinypowinny byc czyszczone z uzyciem własciwych rozpuszczalnikow organicznych(np. benzyny).

W odczynie RPR i VDRL do przygotowywania i rozcienczania anty-genu wykorzystuje sie igły kalibrowane. W zestawie do odczynu RPR znajduje sieigła, ktora nalezy sprawdzic przed uzyciem, okreslajac liczbe kropli/ml. Prawid-łowo funkcjonujaca 20-podziałkowa igła powinna dozowac 90 kropli/ml. Nienalezy stosowac igieł działajacych niewłasciwie. Po uzyciu umyc woda des-tylowana. Do testu VDRL przygotowac dwie igły, odłamujac czubki za pomocaszczypiec. Sprawdzic igłe okreslajac liczbe kropli/ml: 18-podziałkowa igłapowinna dozowac 60 kropli/ml, a 21 – 22-podziałkowa 100 kropli/ml. Kazdanieprawidłowo działajaca igłe nalezy odrzucic lub wyregulowac, dociskajac lubzwalniajac koniec. Po uzyciu umyc w wodzie destylowanej, 70% etanolui acetonie.

Odczynniki

Zwiazki chemiczne stosowane w serologii musza miec jakosc odczynnikowi spełniac kryteria okreslonej procedury. Musza byc przechowywane zgodniez zaleceniami producenta.

Do przygotowania odczynnikow powinna byc uzywana wysokiej jakosci wodadestylowana o pH 7,0. Nalezy przechowywac ja w odpowiednio opisanym z data,ciepłoodpornym szklanym naczyniu lub plastikowej butli ze szczelnie domknietazakretka.

Fizjologiczny roztwor soli jest uzywany sam lub jako roztwor buforowany, naprzykład buforem fosforanowym. W wilgotnym klimacie, w celu usuniecia wody,chlorek sodu nalezy suszyc goracym powietrzem w 160 – 180°C przez 30 minut.Sol rozpuscic w wodzie destylowanej lub demineralizowanej i przechowywacw ciepłoodpornym, odpowiednio opisanym z data szklanym naczyniu lubplastikowej butli, ze szczelnie zamknieta zakretka. Przed uzyciem buforuoznaczyc jego pH.

Surowice zawierajace makroskopowo widoczne czasteczki nalezy odwirowacw 3000 g przez 10 minut i do testow uzyc supernatantu. Osocze z hemoliza lubzanieczyszczone nie powinno byc uzyte. Inaktywowana surowice do testownalezy przygotowac, ogrzewajac w 56°C przez 30 minut. Jesli nie zostanie zuzytaw ciagu 4 godzin od inaktywacji, nalezy ja ponownie inaktywowac, ogrzewajacw 56°C przez 10 minut. Wszystkie surowice przed uzyciem pozostawicw temperaturze pokojowej.

W rozdziale zostana szczegołowo omowione niektore testy serologiczne najczes-ciej wykonywane w laboratoriach medycznych. Naleza do nich testy dodiagnostyki kiły, test Wrighta do diagnostyki brucelozy i test wykrywajacyantystreptolizyne O do diagnostyki poznych powikłan po zakazeniach paciorkow-cowych.

141

CZESC I

Kazdy opis procedury odnosi sie do badan wykonywanych z uzyciem komercyj-nych zestawow do przeprowadzania testow. Gotowe zestawy sa wytwarzane przezwielu producentow, zawieraja w opakowaniu szczegołowe instrukcje, ktore przeduzyciem nalezy uwaznie przeczytac.

Reakcje serologiczne

Odczyn kłaczkujacy i precypitacjiW odczynie kłaczkujacym, w wyniku reakcji rozpuszczonego antygenu z prze-ciwciałami, powstaje precypitat, ktory mozna ogladac zarowno pod mikro-skopem, jak i gołym okiem. Po zmieszaniu odczynnikow prawie natychmiastpojawia sie wstepne wiazanie antygenu przez przeciwciała. Dalsze formowaniewiekszych, widocznych kłaczkow wymaga godziny lub dłuzszego czasu i jestzalezne od temperatury. Reakcja zachodzi szybciej w strefie ,,rownowaznej’’,optymalnego stosunku antygen-przeciwciało. Probowka z najszybciej tworzacymsie precypitatem jest dobrym wskaznikiem rownowaznosci. Najszerzej stosowa-nymi odczynami kłaczkujacymi sa testy VDRL i RPR. Obydwa wykorzystywanew diagnostyce kiły (wywołanej przez Treponema pallidum) i innych zakazenkretkowych.

Odczyn kłaczkujacy dostarcza jakosciowego dowodu reakcji antygen-przeciw-ciało, ale nie wskazuje, czy obecna jest jedna, czy kilka reakcji antygen--przeciwciało. Jesli jednak test przeprowadzany jest na połpłynnym zelu, zewzgledu na rozna zdolnosc do dyfuzji i wspołczynniki migracji antygenow,mozna reakcje te rozroznic.

Odczyn aglutynacjiW odczynie aglutynacji reagent, ktorym moze byc antygen lub przeciwciało,jest osadzony lub zaabsorbowany na mikroczasteczce. Nosnikami reagentowmoga byc rozne czasteczki, np. lateks, zelatyna, mikrogranulki, bakterie lubkrwinki czerwone. Technika ta nosi rowniez nazwe biernej aglutynacji. Jeslinosnikiem sa erytrocyty, technike okresla sie mianem hemaglutynacji biernej,jezeli sa to komorki gronkowca, technika nosi nazwe koaglutynacji. Po dodaniuswoistej surowicy odpornosciowej komorki lub inne czastki tworza siec poła-czen i w rezultacie aglutynat z wyraznym supernatantem. Uzywajac surowicyo znanej swoistosci mozna przeprowadzac identyfikacje nieznanych mikro-organizmow lub ich antygenow. Test mozna wykonac na szkiełku i odczytacwynik makroskopowo lub pod mikroskopem w małym powiekszeniu. Odczynaglutynacji wykorzystuje sie takze do oceny miana aglutynin przeciw-bakteryjnych w surowicy pacjentow z nieznana choroba. Wzrost miana podczastrwania choroby przemawia jednoznacznie za zwiazkiem przyczynowo--skutkowym.

Aglutynacja szybciej zachodzi w wyzszych temperaturach (35 – 56°C) i przyruchu (np. wstrzasanie, mieszanie lub wirowanie), ktore ułatwiaja kontakt miedzyantygenem i przeciwciałem. Proces aglutynacji wymaga obecnosci soli. Potenc-jalnie powazny problem stanowi prozona: zahamowanie reakcji serologicznejwskutek nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Prozona daje fałszywie ujemnywynik testu; tego błedu mozna jednak uniknac badajac seryjne rozcienczeniasurowicy.

142


Powszechnie stosowany test aglutynacji wykorzystuje Staphylococcus aureus,zawierajacy na swojej powierzchni białko A. Jest to białko wiazace fragment Fcprzeciwciał IgG. Gronkowce opłaszczone przeciwciałami IgG w obecnosciswoistego antygenu daja wyraznie widoczna aglutynacje. Odczyn stosowany jestgłownie do identyfikacji drobnoustrojow hodowanych z probek klinicznych lubdo wykrywania antygenow bakteryjnych w płynach ustrojowych zakazonychpacjentow (płyn mozgowo-rdzeniowy w przypadku zapalenia opon mozgowo--rdzeniowych).

Odczyny aglutynacji wykorzystywane sa do wykrywania wirusa Epsteina-Barr(mononukleoza zakazna), rotawirusow, rozyczki oraz antygenow bakteryjnych(m.in. Haemophilus i Streptococcus A i B).

Odczyn immunofluorescencji

W odczynach immunofluorescencji immunoreagent (antygen lub przeciwciało)znakowany jest barwnikiem fluorescencyjnym, na przykład fluoresceina lubrodamina, a reakcja antygenu z przeciwciałem wykrywana jest w mikroskopiefluorescencyjnym. W odczynie immunofluorescencji bezposredniej do wykryciaobecnosci specyficznego antygenu wykorzystuje sie znaczone fluoresceinaprzeciwciała. Odczyny sa przydatne w szybkiej identyfikacji Chlamydia tracho-matis, C. psittaci, Rickettsia spp., Streptococcus pyogenes, Bordetella pertussis,Corynebacterium diphtheriae, Legionella pneumophila i innych drobnoustrojowizolowanych z probek klinicznych.

W odczynie immunofluorescencji posredniej (indirect fluorescent antibody— IFA) wykonuje sie badania seryjnych rozcienczen surowicy pacjenta zespecyficznym antygenem, a dla uwidocznienia reakcji dodaje sie znakowanefluoresceina przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom IgG lub IgM. Naprzykład, w serodiagnostyce kiły, szkiełko z adsorbowanym antygenem Trepone-ma pallidum zanurza sie w surowicy pacjenta i spłukuje. Nastepnie na szkiełkuumieszcza sie znakowane fluoresceina przeciwciała przeciw ludzkim immuno-globulinom, spłukuje i preparat oglada sie w mikroskopie fluorescencyjnym. Jeslisurowica pacjenta zawiera specyficzne przeciwciała przeciw Treponema pal-lidum, widoczne sa jasno fluoryzujace kretki. Przy braku specyficznych przeciw-ciał przeciwkretkowych w surowicy pacjenta kretki nie swieca. Test IFA mozebyc rowniez wykorzystywany do identyfikacji innych bakterii, na przykładpratkow gruzlicy, a z powodu wiekszej liczby znakowanych fluoresceinaprzeciwciał łaczacych sie z antygenem stanowi czesto czulsza metode niz testimmunofluorescencji bezposredniej.

Odczyny serologiczne w diagnostyce kiły

Odczyny serologiczne wykonywane w diagnostyce kiły to testy kretkowei niekretkowe. Do odczynow niekretkowych naleza: VDRL i RPR. Uzyty w nichantygen przygotowywany jest z antygenow niekretkowych, takich jak kardio-lipina-lecytyna i wykrywa podobne do przeciwciał reaginy, ktore sa obecnew surowicy wielu pacjentow z kiła, ale moga takze wystepowac w surowicypacjentow z innymi ostrymi i przewlekłymi schorzeniami. Testy sa praktyczne,niedrogie i powtarzalne, mimo ze nie całkiem swoiste. Moga potwierdzacrozpoznanie wczesno- lub poznoobjawowej kiły lub byc podstawa rozpoznania

143

CZESC I

kiły poznej. Sa lepsze niz odczyny kretkowe w monitorowaniu pacjentow poleczeniu. VDRL jest skutecznym narzedziem w badaniach epidemiologicznychkiły i innych chorob kretkowych.

Odczyny z antygenami Treponema pallidum wykrywaja swoiste przeciwciała,powstajace w odpowiedzi na zakazenie kiła. Sa wykorzystywane do potwier-dzenia dodatnich wynikow testow niekretkowych. Odczyn immunofluorescencjikretkow w modyfikacji absorpcyjnej (FTA-Abs) i odczyn hemaglutynacjiTreponema pallidum (TPHA) sa wysoce swoiste i czułe, ale nie roznicujaprzebytych i aktywnych zakazen kiły; nie mozna ich stosowac w ocenie wynikowleczenia.

Odczyn VDRL

W odczynie wykorzystuje sie czasteczki cholesterolu opłaszczone kompleksemkardiolipina-lecytyna. Inaktywowana surowice lub płyn mozgowo-rdzeniowywytrzasa sie na wytrzasarce z zawiesina antygenu VDRL przez podany okres. Jeslireaginy sa obecne w badanym płynie, obserwuje sie mikroflokulacje.

Odczyn VDRL jest wysoko dodatni we wczesnej kile. Po skutecznym leczeniumiano stopniowa spada i zwykle w ciagu 1 – 2 lat odczyn staje sie ujemny.W poznej fazie choroby przez wiele lat, nawet po skutecznym leczeniu, surowicamoze wykazywac dodatnie reakcje o niskim mianie (np. 1:8 lub mniejszym).Reaktywnosc moze spontanicznie zanikac u 20 – 30% nieleczonych pacjentoww fazie latentnej choroby, a nawet czesciej w poznej fazie kiły.

Fałszywie dodatnie wyniki obserwuje sie z powodu podobienstwa antygenuVDRL do tkanek gospodarza. Fałszywe wyniki moga wystepowac u osobzdrowych, jakkolwiek czesto zwiazane sa z okreslonymi chorobami lub przeby-tym szczepieniem. Fałszywie dodatnie reakcje, najczesciej o niskim mianie (1:8lub mniej), obserwowane sa u osob z wirusowymi i bakteryjnymi zakazeniami(atypowe zapalenie płuc, choroba papuzia, mononukleoza zakazna i zapaleniewatroby), podczas ciazy lub po niedawnym szczepieniu. Utrzymujace siefałszywie dodatnie wyniki, zwykle o duzym mianie, zwiazane sa z obecnosciaautoprzeciwciał (czynnik reumatoidalny), wystepuja u pacjentow z tradem,gruzlica, zaburzeniami odpornosci (np. toczen rumieniowaty, kolagenozy, choro-by reumatyczne, zespoł Sjögrena, dysgammaglobulinemia), rzadziej u osobz malaria lub uzaleznionych od heroiny. Dodatni i słabo dodatni wynik odczynuVDRL nie powinien byc traktowany jako ostateczny dowod kiły, podobnie jakpojedynczy ujemny wynik nie wyklucza rozpoznania. Dla kazdej słabo dodatnieji dodatniej probki, przy braku klinicznych objawow kiły, nalezy wykonac badaniaz uzyciem odczynow kretkowych FTA-Abs lub TPHA.

Materiały i odczynniki zawarte w zestawiedo odczynu VDRL

Buforowany fizjologiczny roztwor soliZestaw kontrolnych surowic (ujemna, słabo dodatnia, dodatnia)Antygen VDRL

144


Dodatkowe materiały i odczynnikipotrzebne do odczynu VDRL

Alkohol absolutny i acetonSzkiełko do aglutynacji o wymiarach około 5 × 7,5 cm z zagłebieniami o srednicy

16 mm i głebokosci 1,75 mm do badania płynu mozgowo-rdzeniowegoOdpowiednia liczba fiolekWoda destylowana lub dejonizowanaSzklane płytki z 12 parafinowymi lub ceramicznymi pierscieniami o srednicy

około 14 mm do badania surowicyKomora wilgotnaIgły podskorne bez skosu: 18-podziałkowe do badan surowicy i 21- lub

22-podziałkowe do badan płynu mozgowo-rdzeniowegoStoperMikroskop swietlny o powiekszeniu × 10 okular i × 10 obiektywWytrzasarka o ruchu kolistym o srednicy 2 cm, szybkosci 180 obr./min,

w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasupH-metrPipety serologiczne: 5,0 ml, 1,0 ml i 0,2 mlSterylne roztwory soli (0,85% i 10%)Strzykawka typu Luer, 1 lub 2 mlButelka z zawiesina antygenu VDRL, 30-ml, okragła, zamykana szklanym

korkiem, z waskim wlotem, o srednicy około 35 mm, z płaskim dnemŁaznia wodna (56°C)

Przygotowanie antygenu VDRLi surowicy kontrolnej

Antygen VDRL jest alkoholowym roztworem lipidow (kardiolipiny i lecytyny)i cholesterolu. Sa to substancje nierozpuszczalne w wodzie. Przygotowac swiezazawiesine w dniu uzycia, poniewaz antygen VDRL jest niestabilny. Zawartoscampułki z antygenem rozlac do fiolek do przechowywania. Upewnic sie, ze fiolkisa szczelnie zamkniete i przechowywac w ciemnosci w 15 – 30°C. Wyjmowacantygen według potrzeb.

Po otwarciu butelke z buforowanym roztworem soli przechowywac w chłodziar-ce. Nie uzywac, jesli pojawi sie zmetnienie.

Do kontrolnej surowicy dolac 3 ml destylowanej lub dejonizowanej wody.Nadwyzke przygotowanych na dany dzien rozpuszczonych surowic podzielic naodpowiednia liczbe porcji (dzienne zapotrzebowanie) i przechowywac w tem-peraturze –20°C do miesiaca. Nie zamrazac ponownie po rozmrozeniu. Surowice,przeznaczone do wykorzystania w ciagu dnia, przechowywac w chłodziarcew 2 – 8°C.

Przygotowanie zawiesiny antygenu VDRL

1. Ogrzac antygen i buforowany roztwor soli do temperatury pokojowej.Sprawdzic pH buforowanego roztworu soli, wartosc nie powinna przekraczacpH 6,0 ± 0,1.

2. Do butelki z zawiesina antygenu dodac pipeta 0,4 ml buforowanego roztworusoli i delikatnie przechylic naczynie, rozprowadzajac warstwe płynu na dnie.

145

CZESC I

3. Za pomoca 1-mililitrowej kalibrowanej pipety odmierzyc 0,5 ml roztworuantygenu i dodac w opisany ponizej sposob:• Trzymac pipete w 1/3 wysokosci butelki. Nie dotykac roztworu soli.• Mieszajac recznie ruchem kolistym o srednicy około 5 cm, dodawac po

kropli antygenu.• Wkraplac antygen w ten sposob przez około 6 sekund, a nastepnie dodac

pozostały antygen z pipety.• Mieszac jeszcze przez 10 sekund.

4. Dodac 4,1 ml buforowanego roztworu soli, wlewajac go po sciankach butelki.5. Zamknac butelke szklanym korkiem i wstrzasac w gore i w doł około 30 razy

przez 10 sekund.6. Pozostawic zawiesine antygenu na co najmniej 10 minut. Wstrzasnac

delikatnie przed uzyciem. Zawiesine nalezy wykorzystac w ciagu 8 godzin.7. W przypadku badania płynu mozgowo-rdzeniowego rozcienczyc antygen 10%

roztworem soli w stosunku 1:2. Wstrzasac butelke delikatnie przez 10 sekund,pozostawic na co najmniej 5 minut i uzyc najpozniej w ciagu 2 godzin.

Jakosciowy odczyn VDRL

1. Za pomoca 1,0-mililitrowej pipety kilkakrotnie wymieszac, a nastepnieumiescic 0,05 ml inaktywowanej surowicy we wgłebieniu szklanej płytkiVDRL.

2. Rozprowadzic surowice okreznymi ruchami koncowki pipety, tak by pokryłacała wewnetrzna powierzchnie parafinowego lub ceramicznego wgłebienia.Jedynie uzycie czystych płytek umozliwia rownomierne rozprowadzeniesurowicy.

3. Trzymajac poziomo strzykawke z 18-podziałkowa igła, do surowicy dodacuwaznie 1 krople antygenu (1/60 ml). Nie dotykac surowicy igła.

4. Płytki w komorze wilgotnej wstawic na 4 minuty do wytrzasarki. Jesliwytrzasarka nie jest dostepna, płytki kołysac recznie, ciagłym ruchem kolistymprzez 4 minuty.

5. Natychmiast po wymieszaniu ocenic preparat pod mikroskopem w powiek-szeniu × 10 okular i × 10 obiektyw.

6. Odczytac reakcje w ponizszy sposob:Srednie i duze grudki R — Reactive/DodatniaDrobne grudki W — Weakly reactive/Słabo dodatniaBrak grudek lub bardzo słaby slad N — Non-reactive/Ujemna

Surowica słabo dodatnia lub wykazujaca sladowy odczyn, ze wzgledu naobserwowane niekiedy reakcje prozony, powinna zostac powtornie zbadanaw tescie połilosciowym.

Połilosciowy odczyn VDRL

1. Przygotowac serie podwojnych rozcienczen inaktywowanej surowicy w 0,85%NaCl (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32).

2. Dla kazdego rozcienczenia surowicy przeprowadzic badanie jakosciowe.3. Zapisac wyniki i zgodnie z ponizszymi przykładami okreslic najwyzsze

dodatnie rozcienczenie surowicy (nie słabo dodatnie):4. W przypadku dodatnich wynikow obserwowanych w rozcienczeniu 1:32

przygotowac kolejne podwojne rozcienczenia w 0,85% NaCl (1:64, 1:128i 1:256) i przeprowadzic ponownie badanie jakosciowe.

146


Odczyn RPR

Zawiesina antygenu w tescie RPR zawiera czasteczki wegla pozwalajace namakroskopowe uwidocznienie odczynu kłaczkujacego. Głowne roznice w stosun-ku do odczynu VDRL dotycza uzycia utrwalonego antygenu, kartonikow zamiastpłytek, mozliwosci wykonania badania zarowno z surowica, jak i z osoczem, bezkoniecznosci inaktywacji surowicy. Potrzebna jest niewielka ilosc probki, moznauzyc rowniez osocza z krwi włosniczkowej. Testu RPR nie stosuje sie do badaniapłynu mozgowo-rdzeniowego.

W odczynie RPR antygen jest gotowy do uzycia. Nie wymaga wczesniejszegoprzygotowania czy rozcienczenia. Termin waznosci nieotwartego, przechowywa-nego w chłodziarce antygenu, wynosi jeden rok. Otwarty, przechowywanyw chłodziarce w plastikowym dozowniku, utrzymuje swoja aktywnosc przez3 miesiace. Test RPR jest nieco bardziej czuły, prostszy i szybszy niz test VDRL.Fałszywie dodatnie wyniki uzyskuje sie nieznacznie czesciej niz w odczynieVDRL. Niektore zestawy do testow wymagaja uzycia wytrzasarki do wymiesza-nia reagentow, podczas gdy w innych mozna wymieszac je recznie.

Materiały i odczynniki zawarte w zestawiedo odczynu RPR

Igła dozujaca 60 kropli/ml zawiesiny antygenuSurowice kontrolne, dodatnia i ujemnaJednorazowe zakraplacze do odmierzenia 50 µl surowicy lub osoczaKartoniki RPR pokryte warstwa plastiku, kazdy z dwoma rzedami po piec

dołeczkowGotowa zawiesina antygenu RPRMieszadełka

Dodatkowe materiały i odczynnikipotrzebne do odczynu RPR

Jednorazowy zakraplaczDermatografKomora wilgotnaWytrzasarka o ruchach kolistych o srednicy 2 cm, szybkosci 180 obr./min,

w ustawieniu poziomym, z automatycznym pomiarem czasuSterylny roztwor NaCl (0,85%)

WynikRozcienczenie

Surowicanierozcienczona 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

W N N N N N Słabo dodatni, bez rozcienczeniaR W N N N N Dodatni, bez rozcienczeniaR R W N N N Dodatni, rozcienczenie 1:2R R R W N N Dodatni, rozcienczenie 1:4W W R R W N Dodatni, rozcienczenie 1:8N (szorstki) W R R R N Dodatni, rozcienczenie 1:16

W — Weakly reactive/reakcja słabo dodatniaR — Reactive/reakcja dodatniaN — Non-reactive/reakcja ujemna

147

CZESC I

Jakosciowy odczyn RPR

1. Wyjac zestaw odczynnikow z lodowki i pozostawic do ogrzania do tem-peratury pokojowej.

2. Przygotowac surowice kontrolna, dodajac wskazana objetosc wody des-tylowanej.

3. Opisac kazdy dołeczek na kartoniku RPR laboratoryjnym numerem badania,pozostawiajac miejsce dla dodatniej, słabo dodatniej i ujemnej surowicykontrolnej.

4. Za pomoca jednorazowego zakraplacza umiescic 50 µl surowicy lub osoczaw odpowiednim dołeczku. Dla kazdej probki uzyc nowego zakraplacza.

5. Delikatnie wstrzasnac zawiesina antygenu i do kazdego dołeczka, dozujacaigła z zestawu, dodac bezkontaktowo krople antygenu. Ostroznie wymieszaczawiesine antygenu z surowica. Dla kazdej probki uzyc nowego mieszadełka.Dokładnie rozprowadzic.

6. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawic na 8 minut na wytrzasarke. Jesliwytrzasarka nie jest dostepna, kartoniki kołysac recznie, ciagłym ruchemkolistym przez 2 minuty, nastepnie umiescic na 6 minut w wilgotnej komorzezawierajacej zwilzona bibułe lub inny materiał. Wyjac kartonik i obracac przezchwile, do uzyskania koncowego wyniku. Uwazac, aby nie zmieszac probek zesoba.

7. Po zdjeciu z wytrzasarki obejrzec kartoniki w dobrym swietle. Dodatniasurowica kontrolna powinna wykazywac wyraznie widoczna reakcje. Ujemnasurowica kontrolna nie wykazuje reakcji. Krotkie obracanie i przechylaniekartonika w rekach moze pomoc w zroznicowaniu słabo dodatnich i ujemnychprobek.

8. Zapisac wynik badania:• Małe lub duze kłaczkowate skupiska: dodatni.• Jednolite zmetnienie zawiesiny czasteczek: ujemny.

9. Przygotowac seryjne rozcienczenia kazdej dodatniej surowicy w celu oznacze-nia miana.

Połilosciowy odczyn RPR

1. Wyjac zestaw odczynnikow z lodowki i pozostawic do ogrzania dotemperatury pokojowej.

2. Opisac rzad 5 dołeczkow na kartoniku RPR laboratoryjnym numerembadania.

3. Za pomoca jednorazowego zakraplacza dodac do kazdego dołeczka po1 kropli roztworu NaCl (0,85%). Nie rozprowadzac.

4. Za pomoca nowego zakraplacza naniesc 1 krople probki surowicy dopierwszego dołeczka. Wymieszac zakraplaczem (zaciagajac i wypuszczajaczawartosc 5 – 6-krotnie; unikac tworzenia sie pecherzykow).

5. Przeniesc 50 µl mieszaniny (rozcienczenie 1:2) do nastepnego dołeczka.Wymieszac. Powtorzyc cała czynnosc do piatego dołeczka włacznie (rozcien-czenie 1:32). Usunac 50 µl mieszaniny z ostatniego rozcienczenia.

6. Rozprowadzic przygotowane probki w dołeczkach, rozpoczynajacod najwyzszego rozcienczenia. Dla kazdej probki uzyc nowego miesza-dełka.

7. Za pomoca dozujacej igły dodac bezkontaktowo do kazdego dołeczka1 krople delikatnie wstrzasnietego antygenu. Ostroznie wymieszac zawiesineantygenu z surowica. Dokładnie rozprowadzic. Do kazdej probki uzycnowego mieszadełka.

148


8. Kartoniki w komorze wilgotnej wstawic na 8 minut na wytrzasarke. Jesliwytrzasarka nie jest dostepna, kartoniki kołysac recznie, ciagłym ruchemkolistym przez 2 minuty, nastepnie umiescic na 6 minut w wilgotnej komorzezawierajacej mokra bibułke lub inny materiał. Wyjac kartonik i obracac przezchwile, do uzyskania koncowego wyniku. Uwazac, aby nie zmieszac probekze soba.

9. Po zdjeciu z wytrzasarki obejrzec kartoniki w dobrym swietle. Najwyzszerozcienczenie z widoczna makroskopowo reakcja jest mianem probki.

10. Jesli probka jest dodatnia przy 1:32, nalezy wykonac dodatkowe serierozcienczen. Przygotowac roztwor 1:16 z NaCl (0,85%), a nastepniew opisany wyzej sposob rozcienczyc surowice.

Odczyn immunofluorescencji kretkoww modyfikacji absorpcyjnej(FTA-Abs)

W tescie FTA-Abs wykorzystuje sie utrwalony acetonem na szkiełku antygenTreponema pallidum (szczep Nicholsa). Mozna rowniez uzyc zawieszonychw roztworze soli liofilizowanych komorek T. pallidum. Inaktywowana surowicepacjenta inkubuje sie z kretkami Reitera, wiazacymi niespecyficzne przeciwciałakretkowe. Po absorpcji surowice umieszcza sie na szkiełku. Specyficzneprzeciwciała z surowicy wiaza sie na powierzchni komorek kretkow. Po spłukaniudodaje sie koniugatu znakowanych fluorescencyjnie (izotiocyjanian fluoresceiny)przeciwciał przeciw ludzkim immunoglobulinom. Koniugat zostanie zwiazanyprzez przeciwciała obecne na powierzchni kretkow i uwidoczniony w mikro-skopie fluorescencyjnym.

Dodatni odczyn pojawia sie trzy tygodnie po zakazeniu i utrzymuje sieu nieleczonych pacjentow Moze byc takze obserwowany kilka lat po skutecznymleczeniu we wczesnej fazie i przetrwac u chorych, u ktorych terapie wprowadzonodopiero w poznej fazie choroby. Dodatni wynik testu z duzym prawdopodobienst-wem wskazuje na zakazenie kiła. Fałszywie ujemne wyniki uzyskuje siewyjatkowo rzadko i zwiazane sa prawdopodobnie ze zła jakoscia antygenu.Fałszywie dodatnie wyniki moga byc efektem obnizonej jakosci odczynnikow,a w rezultacie niedostatecznej eliminacji nieswoistych przeciwciał w procesieabsorpcji. Fałszywie dodatnie wyniki obserwowano rowniez u pacjentow z mars-koscia watroby, zapaleniem zołedzi, kolagenoza, opryszczka narzadow płcio-wych, toczniem rumieniowatym i bardzo rzadko u kobiet w ciazy oraz u zdrowychosob z nieznanych przyczyn.

Wykazano krzyzowa reakcje miedzy T. pallidum i Borrelia burgdorferi (chorobaz Lyme). Probki z nieproporcjonalnie wysokim mianem w tescie FTA-Abs,w porownaniu z innymi serologicznymi testami kiłowymi, powinny zostacprzebadane w kierunku obecnosci przeciwciał przeciw Borrelia.

Głowna zaleta odczynu FTA-Abs jest jego wysoka swoistosc i czułosc orazwczesna reaktywnosc. Wyniki sa wiarygodne i moga byc decydujace w watp-liwych przypadkach. Test FTA-Abs jest jednak czasochłonny i drogi; wymagadobrego wyszkolenia personelu przeprowadzajacego badanie i odczytujacegowyniki. Powinien wiec byc traktowany jako test potwierdzenia w przypadkachniepewnej diagnozy.

149

CZESC I

Materiały i odczynniki zawarte w zestawiedo odczynu FTA-Abs

Roztwor buforuSurowice kontrolne, dodatnia i ujemnaPrzeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom znakowane fluoresceina (ko-

niugat)Liofilizowany ekstrakt kretkow Reitera (sorbent)T. pallidum utrwalone na szkiełkach

Dodatkowe materiały i odczynnikipotrzebne do odczynu FTA-Abs

Szkiełka nakrywkoweMikroskop fluorescencyjny z UV iluminacja (× 40 obiektyw)Podłoze utrwalajaceBuforowana sol, pH 7,2 (PBS)Tween 80 (2%)-PBS

Odczyn FTA-Abs

1. Wyjac zestaw odczynnikow z lodowki i pozostawic do ogrzania dotemperatury pokojowej.

2. Pozostawic wymagana liczbe szkiełek przez 15 minut do ogrzania dotemperatury pokojowej.

3. Zmieszac 50 µl surowicy badanej z 0,2 ml sorbentu. Rownolegle rozcienczycdodatnia i ujemna surowice kontrolna: 1:5 z roztworem buforu i 1:5z sorbentem.

4. Na jedno szkiełko z kretkami nałozyc 10 µl roztworu buforu (kontrolakoniugatu), na drugie 10 µl sorbentu (kontrola sorbentu).

5. Na kazde kolejne szkiełko nałozyc 10 µl odpowiedniego rozcienczeniasurowicy badanej lub kontrolnej.

6. Umiescic szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzycpreparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynnosc powtorzyc. Spłukacwoda destylowana, odsaczyc i zostawic do wyschniecia w pojemniku napreparaty.

7. Nałozyc na wszystkie szkiełka po 10 µl przeciwciał przeciw immuno-globulinom ludzkim rozcienczonych zgodnie z zaleceniami producentaw buforze.

8. Umiescic szkiełka w wilgotnej komorze na 30 minut w 37°C. Zanurzycpreparaty na 5 minut w roztworze Tween-PBS. Czynnosc powtorzyc. Spłukacwoda destylowana, odsaczyc i zostawic do wyschniecia w pojemniku napreparaty.

9. Na kazde szkiełko nałozyc 2 krople podłoza utrwalajacego i szkiełkonakrywkowe.

10. Sprawdzic, czy koniugat, absorbent i ujemna surowica kontrolna niewykazuja fluorescencji:• Brak fluorescencji lub lekko zielonkawe kretki: reakcja ujemna.• Rozny stopien zielonej fluorescencji: reakcja dodatnia.

150


Fluorescencje mozna stopniowac:Ujemna 0Graniczna 1+, 2+, 3+Dodatnia 4+

Reakcja 2+ i wieksza wskazuje na zakazenie T. pallidum.

Wykrywanie aglutynin w goraczce

Lekarz, ktory leczy pacjenta z goraczka o nieustalonej przyczynie, czestozleca wykonanie serii badan serologicznych, wspolnie okreslanych nazwaodczynow aglutynacyjnych w goraczce, w celu potwierdzenia zakazen wywoła-nych przez Brucella (odczyn Wrighta), Salmonella typhi (odczyn Widala)i niektore riketsje (odczyn Weila-Felixa). Odczyny wykrywaja przeciwciałaaglutynujace skierowane przeciw somatycznemu antygenowi O i/lub rzeskowemuantygenowi H poszukiwanych drobnoustrojow lub, w przypadku odczynuWeila-Felixa, krzyzowo reagujace z antygenem somatycznym dwoch szczepowProteus vulgaris.

Odczyny Widala i Weila-Felixa, ze wzgledu na znaczna liczbe technicznychi interpretacyjnych problemow, nie sa obecnie zalecane do badan przesiewowych.Ujemna reakcja nie wyklucza aktywnego zakazenia, poniewaz zakazenie mozebyc w fazie inkubacji, w ktorej pacjent nie wytwarza jeszcze wykrywalnej liczbyprzeciwciał. Zjawisko prozony takze daje ujemne reakcje; zapobieganiu efektowiprozony słuzy stosowanie seryjnych rozcienczen surowicy. Dodatnia reakcjaz danym antygenem moze okazac sie niediagnostyczna ze wzgledu na wykazywa-ny podczas choroby wzrost wytwarzania heterologicznych aglutynin. Takiereakcje nosza nazwe nieswoistej odpowiedzi wtornej, w ktorej w odpowiedzi nastymulacje antygenowa pacjent wytwarza nieswoiste aglutyniny. Diagnostykaserologiczna oparta jedynie na stwierdzeniu wysokiego miana przeciwciał nie jestpewna i tylko serokonwersja z czterokrotnym wzrostem miana przeciwciałw seryjnych rozcienczeniach powinna byc traktowana jako dowod swiezegozakazenia.

Wiekszosc pacjentow z ostra bruceloza pod koniec drugiego tygodnia zakazeniawykazuje miano aglutynin 1:320 i wyzsze. Nawet rok po leczeniu u 20%pacjentow nadal wystepuja znaczace miana aglutynin Brucella. Wysokie mianaobserwowano sa rowniez u pacjentow zakazonych Francisella tularensis i Yer-sinia enterocolitica, u niedawno szczepionych na bruceloze i cholere lubbadanych testem skornym z brucelergina. Obserwowano je rowniez u pracow-nikow rzezni.

Poniewaz hodowle krwi przez wiele tygodni moga nie wykazywac obec-nosci drobnoustrojow, okreslenie miana aglutynin Brucella moze stanowicwstepna diagnoze ostrej brucelozy. Izolacja bakterii, zazwyczaj z krwi, do-starcza ostatecznych dowodow zakazenia. Przy podejrzeniu choroby i ujem-nym wyniku posiewu krwi, w celu potwierdzenia zakazenia, moznaprzeprowadzic hodowle szpiku kostnego pobranego z mostka. Pacjent zezlokalizowana bruceloza moze nie goraczkowac i nie wykazywac znaczacegomiana aglutynin Brucella. W tych przypadkach chorobe podejrzewa sie napodstawie danych epidemiologicznych i obecnosci zwapniałych wezłow chłon-nych w badaniach radiologicznych. Diagnoze nalezy jednak potwierdzic w hodo-wli krwi.

151

CZESC I

Szybki test szkiełkowy jest testem przesiewowym, przeznaczonym do wy-krywania aglutynin, podczas gdy test probowkowy jest testem potwierdzajacym,ktory słuzy do ilosciowej oceny aglutynin. Kazdy dodatni wynik otrzymanyw tescie szkiełkowym nalezy potwierdzic w tescie probowkowym.

Materiały i odczynniki zawarte w zestawiedo wykrywania aglutynin w brucelozie

Zawiesina antygenu (B. abortus, B. melitensis) w butelce z zakraplaczemUjemna surowica kontrolnaDodatnia surowica kontrolna

Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do wykrywaniaaglutynin w brucelozie

Aplikator patyczkowSzklana płytkaDermatografPipety, 50 – 1000 µlLinijkaSterylny roztwor NaCl (0,85%)Probowki i stojak na probowkiStoperŁaznia wodna z kontrolowana temperatura

Test szkiełkowy do wykrywania aglutynin w brucelozie

Preferowany w porownaniu z testem probowkowym jako mniej skompli-kowany.

1. Probka surowicy musi byc czysta, bez widocznych resztek tłuszczowych. Niepowinna wykazywac hemolizy ani byc zanieczyszczona przez bakterie. Niemoze byc inaktywowana przez podgrzewanie, poniewaz w ten sposobzniszczone zostałyby niektore termolabilne aglutyniny.

2. Przygotowac szklana płytke, rysujac za pomoca dermatografu i linijki dwarzedy 2,5-centymetrowych kratek. Kazdy rzad zawierajacy 5 kratek wystarczana przeprowadzenie badania antygenu z rozcienczeniami surowicy do 1:320.

3. Za pomoca 0,2-mililitrowej pipety naniesc 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 i 0,005 mlsurowicy w rzedzie kratek.

4. Do kazdej surowicy dodac 1 krople własciwej dla testu szkiełkowegozawiesiny dobrze wymieszanego antygenu.

5. Zaczynajac od najwyzszego rozcienczenia wymieszac patyczkiem mieszaninesurowica-antygen. Koncowe rozcienczenia sa zalezne od rozcienczen w mak-roskopowym odczynie probowkowym i wynosza odpowiednio 1:20, 1:40,1:80, 1:160 i 1:320.

6. Trzymajac płytke w obu dłoniach delikatnie wymieszac, wykonujac 15 – 20 ko-listych ruchow. Ogladac mieszanine w dobrym swietle przez 1 minute,poszukujac sladow aglutynacji. Reakcje pojawiajace sie pozniej moga byczwiazane z wysychaniem reagentow na szkiełku i powinny byc potwierdzonew tescie probowkowym.

152


7. Odczytac wyniki w ponizszy sposob:Całkowita aglutynacja 4+Około 75% zaglutynowanych komorek 3+Około 50% zaglutynowanych komorek 2+Około 25% zaglutynowanych komorek 1+Sladowa lub brak aglutynacji –

Probowkowy test wykrywajacy aglutyniny w brucelozie

Przygotowac seryjne rozcienczenia surowicy i surowice kontrolna w ponizejprzedstawiony sposob:1. Dla kazdej badanej surowicy umiescic po 8 probowek w stojaku.2. Do pierwszej probowki w kazdym rzedzie dodac pipeta 1,9 ml NaCl (0,85%),

do kolejnych po 0,5 ml.3. Do probowki z 1,9 ml NaCl dodac 0,1 ml surowicy.4. Dobrze wymieszac pipeta i przeniesc 0,5 ml roztworu do probowki drugiej.

Dokładnie wymieszac.5. Do kolejnych probowek w rzedzie, łacznie z siodma, dodac 1 krople

rozcienczonej surowicy. Wymieszac dokładnie. Z probowki 7. po wymiesza-niu usunac 0,5 ml roztworu. Probowka 8. jest kontrola antygenu.

6. Do kazdej z 8 probowek dodac 0,5 ml odpowiedniego antygenu. Wstrzasnacstatywem, mieszajac antygen z surowica. Kolejne rozcienczenia wynoszaodpowiednio od 1:20 do 1:1280.

7. Inkubowac w łazni wodnej w 37°C przez 48 godz., zgodnie z zaleceniamiproducenta.

8. Oceniac makroskopowo obecnosc aglutynacji w probowkach przez 1 minutew dobrym swietle na ciemnym tle. Przy odczycie nie wstrzasac probowek.Dodatnia reakcja wykazuje widoczna aglutynacje (granulacje); ujemna reakcjawykazuje zmetnienie zawiesiny bez aglutynacji. Najwyzsze rozcienczeniewykazujace aglutynacje jest mianem surowicy.

Odrzucic antygen, ktory nie aglutynuje z dodatnia surowica kontrolna lubaglutynuje z ujemna surowica kontrolna.

Aglutynacje mozna obserwowac w surowicy zdrowych osob, stad pojedynczesurowice o mianie nizszym niz 1:80 maja nieznaczna wartosc. Fałszywie dodatniewyniki otrzymuje sie takze u pacjentow zakazonych Francisella tularensis lubu szczepionych przeciw Vibrio cholerae. Za pomoca tego testu nie moznazroznicowac infekcji wywołanych B. abortus i B. melitensis.

Odczyn ASO

Zakazenia paciorkowcowe sa czeste i przeciwciała przeciw paciorkowcomwystepuja w duzym odsetku populacji. β-hemolizujace paciorkowce grupy Awytwarzaja dwie hemolizyny: wrazliwa na tlen streptolizyne O i tlenowo-stabilnastreptolizyne S. Jedynie zredukowana (nieutleniona) streptolizyna O jest immuno-genna i wykorzystywana w odczynie. Reakcja oparta jest na wytwarzaniu przezpacjenta zakazonego Streptococcus pyogenes (grupa paciorkowcow A) przeciw-ciał hamujacych aktywnosc hemolityczna streptolizyny O. Przeciwciała zwykleutrzymuja sie długo, stad pojedyncze stwierdzenie podwyzszonego miana nieswiadczy o aktywnej infekcji. Jedynie w przypadku czterokrotnego wzrostu mianaprzeciwciał w kolejnych probkach, pobranych w 10 – 14-dniowym odstepie,

153

CZESC I

nalezy rozwazyc obecnosc swiezego zakazenia. Test najczesciej wykorzystywanyjest w diagnostyce goraczki reumatycznej, ostrego kłebuszkowego zapalenianerek i innych chorob popaciorkowcowych.

Dostepne sa dwa typy komercyjnych zestawow do odczynu antystreptolizyny O:• Test lateksowej aglutynacji szkiełkowej ASO uzywany w badaniach przesiewo-

wych do identyfikacji podwyzszonych mian ASO (200 IU i wyzszych)w surowicy.

• Test probowkowy ASO jest odczynem zahamowania hemolizy, wykorzys-tywanym do okreslenia miana surowic dodatnich w tescie lateksowo-szkieł-kowym. Miano ponizej 50 IU nie potwierdza rozpoznania ostrej goraczkireumatycznej.

Materiały i odczynniki zawarte w zestawiedo lateksowego testu szkiełkowego ASO

Jednorazowe kartoniki, kazdy z 6 dołeczkamiJednorazowy zakraplaczDodatnia surowica kontrolnaUczulony odczynnik lateksowy (ze streptolizyna O)

Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do lateksowegotestu szkiełkowego ASO

Aplikator patyczkow

Lateksowy test aglutynacji szkiełkowej ASO

1. Rozcienczyc surowice 1:20.2. Umiescic 1 krople roztworu surowicy w dołeczku na jednorazowym kartoniku.3. Nowym zakraplaczem dodac 1 krople uczulonego odczynnika lateksowego.4. Patyczkiem wymieszac 2 krople i rozprowadzic je w dołeczku.5. Przez 2 minuty obserwowac obecnosc aglutynacji.

Dodatnia reakcja manifestuje sie drobnym kłaczkowaniem (aglutynacja) w ciagu2 minut.

Ujemna reakcja nie wykazuje aglutynacji.

Jesli aglutynacja pojawi sie w ciagu 2 minut, miano surowicy nalezy okreslicw tescie probowkowym antystreptolizyny O.

Materiały i odczynniki zawarte w zestawie do testuprobowkowego ASO

Dodatnia surowica kontrolnaZredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat)Erytrocyty baranieStandardowe przeciwciała przeciw streptolizynie O (suchy preparat, 20 IU/bu-

telka)Bufor do streptolizyny O (25 × koncentrat roztworu)

154


Dodatkowe materiały i odczynniki potrzebne do testuprobowkowego ASO

Woda destylowanaPipety (1 ml, 2 ml)ProbowkiŁaznia wodna

Test probowkowy ASO

1. Rozpuscic zredukowany antygen streptolizyny O (suchy preparat) w od-powiedniej objetosci wody destylowanej (w opisanej butelce), przygotowujacroztwor o stezeniu 2 IU w 1 ml. Roztwor nie zawiera konserwantow i musizostac wykorzystany w ciagu 6 godzin.

2. Rozpuscic standardowa antystreptolizyne O (suchy preparat, 20 IU/butelka)w 10 ml buforu streptolizyny O. Roztwor mozna przechowywac przez6 miesiecy w 4°C, pod warunkiem, ze nie uległ kontaminacji.

3. Przed uzyciem rozcienczyc bufor streptolizyny O (25 × koncentrat) w 480 mlwody destylowanej. Rozcienczony bufor nie wykorzystany w ciagu tygodnianalezy wyrzucic.

4. 1 ml erytrocytow baranich wypłukac trzykrotnie w buforze streptolizynyO i odwirowac, zebrac pipeta supernatant. Dodajac buforu streptolizyny Ouzyskac 8% zawiesine komorek.

5. Odczynniki i surowice pozostawic do ogrzania do temperatury pokojowej.6. Przygotowac w probowce rozcienczenie surowicy pacjenta 1:10 (0,1 ml

surowicy + 0,9 ml buforu streptolizyny O). Przygotowac dwa wyjscioweroztwory z rozcienczenia 1:10 w ponizej przedstawiony sposob:

7. Przygotowac nastepujace serie rozcienczen buforu streptolizyny O dla

kazdego z wyjsciowych roztworow:

8. Uporzadkowac probowki według wzrastajacych rozcienczen: 1:50, 1:200,1:300, 1:400, 1:600, 1:800.

9. Do probowki kontrolnej 7. dodac 1,5 ml buforu, do probowki kontrolnej 8.dodac 1 ml buforu.

10. Do wszystkich probowek, z wyjatkiem kontrolnej 7., dodac 0,5 ml roztworuzredukowanej streptolizyny O.

Surowica Bufor Rozcienczenie

0,2 ml (1:10) 1,8 ml 1:1001,0 ml (1:100) 0,5 ml 1:150

Probowka Surowica Bufor Rozcienczenie Zredukowanastreptolizyna O

1 0,2 ml (1:10) 0,8 ml 1:50 0,5 ml2 0,5 ml (1:100) 0,5 ml 1:200 0,5 ml3 0,5 ml (1:200) 0,5 ml 1:400 0,5 ml4 0,5 ml (1:400) 0,5 ml 1:800 0,5 ml5 0,5 ml (1:150) 0,5 ml 1:300 0,5 ml6 0,5 ml (1:300) 0,5 ml 1:600 0,5 ml7 0 1,5 ml — 08 0 1,0 ml — 0,5 ml

155

CZESC I

11. Wymieszac i chłodzic w 4°C przez dwie godziny, umozliwiajac przebiegreakcji antygen-przeciwciało.

12. Do wszystkich probowek, właczajac kontrolne probowki 7. i 8., dodac 0,5 ml8% zawiesiny erytrocytow, wymieszac i inkubowac w łazni wodnej w 37°Cprzez 30 minut.

13. Odwirowac probowki w 1000 g przez 2 minuty i obserwowac hemolize.W kontrolnej probowce 7. nie powinna zachodzic hemoliza, w kontrolnejprobowce 8. powinna zajsc całkowita hemoliza.

14. Miano ASO to najwyzsze rozcienczenie nie wykazujace hemolizy:• Jesli we wszystkich probowkach zachodzi hemoliza, wynik opisac ,,miano

ASO ponizej 200 IU’’.• Jesli w probowkach o wyzszym rozcienczeniu nie zachodzi hemoliza,

zanotowac wynik ,,ASO dodatnie z mianem’’.

Wykrywanie antygenow bakteryjnych

Lateksowy test aglutynacji i test koaglutynacji, wykrywajace antygeny bakte-ryjne, stosowane sa do identyfikacji mikroorganizmow i ich antygenow w ho-dowlach lub w probkach klinicznych. W tescie aglutynacji lateksowejczasteczki polimerow wykorzystuje sie jako nosnik fazy stałej; w tesciekoaglutynacji nosnikiem fazy stałej sa erytrocyty. Za pomoca testu lateksowegomozna wykryc antygeny polisacharydowe bakterii wywołujacych zapalenie oponmozgowo-rdzeniowych, w tym Haemophilus influenzae (tyb b), S. pneumoniae(omniwalentny), N. meningitidis (grupa A, B, C, Y i W135), E. coli (typ K1)i S. agalactiae (grupa B). Testy aglutynacji lateksowej sa przydatne doidentyfikacji paciorkowcow z grup Lancefield A, B, C, D, F i G. Odczynylateksowe mozna wykorzystac w jakosciowym tescie aglutynacji szkiełkoweji w ilosciowym tescie aglutynacji probowkowej oraz w typowaniu grupStreptococcus A-D, N. meningitidis, H. influenzae, Salmonella, Shigella, Vibriocholerae itp.

Do wykrycia antygenow polisacharydowych w probkach klinicznych niezbednyjest progowy poziom antygenu. Jesli w preparacie barwionym metoda Gramawidoczne sa drobnoustroje, zwykle, choc nie w kazdym przypadku, przekroczonyjest poziom progowy. W płynie mozgowo-rdzeniowym pacjentow z zakazeniemN. meningitidis wykrywana jest znacznie mniejsza liczba bakterii niz w zakaze-niach wywołanych innymi typami Neisseria spp., dlatego rzadziej osiagany jestprogowy poziom antygenow polisacharydowych.

Kilka serogrup N. meningitidis moze wywoływac zapalenie opon mozgowo--rdzeniowych. Serogrupy A, C, Y i W135 maja stabilny antygen, ktory moznawykazac za pomoca pojedynczego poliwalentnego odczynnika, podczas gdyantygen grupy B jest stosunkowo niestabilny i w zwiazku z tym trudniejwykrywalny. Nie mozna go zroznicowac z polisacharydowym antygenem K1E. coli, ktora wsrod E. coli jest głownym czynnikiem wywołujacym zapalenieopon mozgowo-rdzeniowych u noworodkow. Wykazanie w preparatach bar-wionych metoda Grama obecnosci Gram-ujemnych dwoinek sugeruje N. menin-gitidis grupy B, obecnosc Gram-ujemnych pałeczek wskazuje na E. coli.

W niektorych testach, polisacharydowe antygeny z drobnoustrojow uzyskiwanesa przed badaniem. Pozyskiwanie antygenow przeprowadza sie chemicznie lubenzymatycznie.

156


Do wykrywania antygenow słuza cztery rozne testy:• W tescie aglutynacji szkiełkowej antygen opłaszczony jest na czasteczkach

lateksu lub swoiste przeciwciała zwiazane sa na komorkach gronkowcow.Reagenty miesza sie recznie ciagłym ruchem kolistym przez 1 – 2 minutyi makroskopowo obserwuje reakcje aglutynacji.

• W testach ELISA roztwor probki i antygenu najpierw przepuszczany jest przezbłone opłaszczona przeciwciałami (zwykle monoklonalnymi). Nastepnie błoneumieszcza sie w roztworze zawierajacym kolejne (monoklonalne) przeciwciałazwiazane z enzymem. Obecnosc kompleksu antygen-przeciwciało z enzymemwykrywa sie w reakcji z barwnym substratem dodanym do roztworu.

• W ,,złotym’’ tescie immunologicznym roztwor probki i antygenu dyfunduje nabłonie, ktora nastepnie sie oglada.

• W optycznym tescie immunologicznym, przeciwciała zwiazane sa z silikonowapłytka o odblaskowych własciwosciach. Reakcja antygenu ze specyficznymprzeciwciałem powoduje zmiane w warstwie powierzchownej płytki i widocz-na roznice refleksu swiatła.

Procedury odczynow aglutynacji lateksoweji koaglutynacji

1. Dla zwiazanych antygenow komorkowych: uzywajac standardowej ezy prze-niesc czyste kolonie do kropli soli na szkiełku, uwaznie wymieszac douzyskania lekko opalizujacej zawiesiny. Obecnosc aglutynacji zwykle wska-zuje na szczepy szorstkie (R — ang. rough); szczepy gładkie (S — ang.smooth) nie wykazuja aglutynacji w soli. W takim przypadku nalezy dodacodczynniki i przejsc do punktu 4.Dla ekstrahowanych antygenow: uzywajac standardowej ezy przeniesc dobrzeizolowane kolonie do probowki zawierajacej roztwor ekstraktu, uzyskaczawiesine. Inkubowac zawiesine w 35°C lub zgodnie z zaleceniami producenta.Dla probek klinicznych (płyn mozgowo-rdzeniowy, mocz): podgrzac probke dotemperatury wrzenia lub według zalecen producenta. Schłodzic i odwirowacw 2000 g przez 5 – 10 minut.

2. Umiescic na płytce 1 krople nosnikow opłaszczonych przeciwciałami.3. Umiescic obok 1 krople zawiesiny antygenu.4. Wymieszac 2 krople i rozprowadzic w kratce.5. Przechylac szkiełko recznie, wykonujac ciagłe okrezne ruchy przez 1 minute.

Uwazac, aby mieszanina nie rozlała sie poza granice kratki.6. Po okreslonym przez producenta czasie obejrzec szkiełko i sprawdzic, czy

obecna jest aglutynacja. Dla uzyskania lepszej widocznosci trzymac szkiełkoblisko zrodła swiatła i ogladac na ciemnym tle.

7. Jako wynik dodatni uznaje sie obecnosc aglutynacji w mieszaninie antygenui przeciwciał, np. zawiesina wykazuje aglutynacje lub grudki. Aglutynacja jestnajlepiej widoczna przy delikatnym przechylaniu szkiełka, tak aby płynspływał wzdłuz dolnej granicy kratki.

157

Czesc II

Najwazniejsze podłozai odczynniki

158

Wprowadzenie

Laboratorium, wykorzystujac zaledwie niewielka ilosc materiału diagnostycz-nego, moze zidentyfikowac czynnik etiologiczny zakazenia, co ma istotny wpływna leczenie pacjenta. W wiekszosci rozwijajacych sie krajow działalnosclaboratorium bakteriologicznego jest ograniczona niedoborem podłozy hodow-lanych i podstawowych odczynnikow, ktorych import jest bardzo kosztowny.Podobnie jak w przypadku lekow, przeprowadzajac racjonalna selekcje, moznazredukowac liczbe koniecznych do zakupienia podłozy i odczynnikow. Dodat-kowo, niektore proste podłoza i odczynniki mozna wytwarzac lub przygotowywacna miejscu. Zastosowanie sie do tych dwoch wskazowek pozwoli znacznieograniczyc koszty, a takze poprawi dostepnosc materiałow laboratoryjnychniezbednych do diagnostyk i badan epidemiologicznych.

Rozdział został przygotowany w taki sposob, aby umozliwic kierownikomlaboratoriow podjecie własciwych decyzji o przeznaczeniu srodkow finansowychna zakup najwazniejszych podłozy i odczynnikow. Składa sie z dwoch czesci,z ktorych kazda zawiera wiele zestawien.

159

Patogeny, podłoza i odczynnikidiagnostyczne

Spodziewane patogeny

Patogeny wymieniono uwzgledniajac:– czestosc izolacji,– znaczenie kliniczne,– ciezkosc choroby,– prawdopodobienstwo wywołania epidemii,– wspołczynnik koszt–korzysc dla izolacji i/lub identyfikacji.

Wykaz nie jest przeznaczony do bezwarunkowego przestrzegania i moze roznicsie w roznych krajach czy laboratoriach, zaleznie od charakteru lokalniewystepujacych chorob, kompetencji laboratorium oraz dostepnych srodkow.

Podłoza i odczynniki diagnostyczneo nadrzednym znaczeniu

Uwzgledniajac pewien stopien elastycznosci przyjeto ponizsza gradacje podłozyi odczynnikow diagnostycznych:Stopien 1: Wysoko priorytetoweStopien 2: Srednio priorytetoweStopien 3: Nisko priorytetowe

Priorytet podłozy i odczynnikow zalezy od znaczenia patogenow, do izolacjii identyfikacji ktorych słuza. Istnieja jednak wyjatki. Jesli podłoze jest szerokostosowane do hodowli wielu patogenow, moze zostac ocenione wyzej niz podłozeprzeznaczone do izolacji tylko jednego z nich.

Stopien 1: Podłoza i odczynniki o wysokim priorytecie, ktore powinny bycdostepne we wszystkich laboratoriach przeprowadzajacych ogolna diagnostykebakteriologiczna. Najczesciej sa przeznaczone do ogolnego uzytku, proste doprzygotowania i stanowia nieliczna grupe.

Stopien 2: Podłoza i odczynniki o srednim priorytecie sa stosowane dodatkowo,w uzupełniajacej diagnostyce laboratoryjnej i przydatne w badaniach epidemiolo-gicznych; moga nie miec istotnego bezposredniego wpływu na leczenie pacjenta,np. surowice odpornosciowe do identyfikacji serogrup meningokokow.

Stopien 3: Podłoza i odczynniki o niskim priorytecie bardzo rzadko majaznaczenie w leczeniu pacjenta, natomiast sa przydatne w edukacji, pracachnaukowych i dodatkowych badaniach prowadzonych przez laboratoria referencyj-ne. Ta kategoria odnosi sie do podłozy i odczynnikow diagnostycznycho niekorzystnym wspołczynniku koszt:efekt, ktore sa zbyt drogie do stosowaniaogolnego lub wykorzystywane do izolacji i identyfikacji rzadko pojawiajacychsie, trudnych do izolacji drobnoustrojow.

Ponizej wymieniono patogeny, podłoza i odczynniki diagnostyczne stosowanew diagnostyce laboratoryjnej z uwzglednieniem sugerowanego priorytetu. Sto-

160

PATOGENY, PODŁOZA I ODCZYNNIKI DIAGNOSTYCZNE

pien waznosci nalezy przystosowac dla kazdego laboratorium, uwzgledniajacwarunki lokalne.

Krew


Bacteroides fragilisBrucellaBurkholderia pseudomalleiCandida albicans i Cryptococcus neoformansHaemophilus influenzaeNeisseria meningitidisPałeczki niefermentujace, inne niz Pseudomonas aeruginosaInne EnterobacteriaceaePseudomonas aeruginosaSalmonella typhi i nie-typhiStaphylococcus aureusPaciorkowce (S. pyogenes, S. pneumoniae, paciorkowce zieleniejace)

Podłoza i odczynniki diagnostyczne

Podłoza płynne do hodowli krwiPriorytet

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) moze zostac zastapiony innymwzbogaconym bulionem, np. bulionem z wyciagiem mozgowo--sercowym, kazdy z dodatkiem polianetolosulfonianu sodu (SPS),0,25 g/l 1

Bulion do hodowli beztlenowcow z krwi: podłoze płynne tioglikolano-we, bulion Schaedlera lub bulion beztlenowy Wilkins-Chalgrena 2

Podłoza do izolacji

Przesiew na agar z krwia, agar czekoladowy i agar MacConkeya 1

Odczynniki diagnostyczne

Krazek z bacytracyna 1Plazma do koagulazy 1Odczynnik do wykrywania β-laktamazy 1Krazek z optochina 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1Aglutynujace surowice odpornosciowe Salmonella 1Czynniki V i XV 2Surowica odpornosciowa Haemophilus influenzae typ b 3Surowica odpornosciowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swois-

ta dla grup A, B, C) 3

161

CZESC II

Płyn mozgowo-rdzeniowy


Cryptococcus neoformansEnterobacteriaceaeHaemophilus influenzaeListeria monocytogenesMycobacterium tuberculosisNeisseria meningitidisStreptococcus agalactiaeStreptococcus pneumoniae



PriorytetAgar z krwia (z posianym Staphylococcus) 1Agar czekoladowy 1Agar MacConkeya 1Podłoze Löwensteina-Jensena 2Agar Sabouraud 2


Tusz chinski 1Odczynnik do wykrywania β-laktamazy 1Krazek z optochina 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1Czynniki V i XV 2Surowica odpornosciowa Haemophilus influenzae typ b 3Surowica odpornosciowa Neisseria meningitidis (poliwalentna i swois-

ta dla grup A, B, C) 3

Szybkie testy diagnostyczne

Zestaw testow do szybkiego wykrywania bakterii wywołujacychzapalenie opon mozgowo-rdzeniowych 3

Mocz


Candida albicansEnterokokiEscherichia coliMycobacterium tuberculosis

162


Inne EnterobacteriaceaeInne gronkowcePseudomonas i inne niefermentujace pałeczkiStaphylococcus saprophyticus


Podłoza do izolacji i podłoza ilosciowe

PriorytetAgar z krwia 1Agar brolacynowy (moze byc zastapiony agarem z fioletem krystalicz-

nym i laktoza, agarem MacConkeya, agarem bez fioletu krystalicz-nego lub agarem eozynowym z błekitem metylenowym) 1

Agar CLED 1

Podłoza do identyfikacjii odczynniki diagnostyczne

β-glukuronidaza (PGUA) do identyfikacji E. coli 1Dla Gram-ujemnych pałeczek:

agar Kliglera (KIA) 1odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu 1podłoze ruch-indol-ureaza (MIU) 1odczynnik do wykrywania oksydazy 1podłoze płynne z lizyna (Möller) 2test ONPG 2podłoze Simmonsa z cytrynianem 2

Dla gronkowcow i enterokokow:test na obecnosc katalazy (H2O2) 1plazma do wykrywania koagulazy 1agar z zołcia i eskulina (dla enterokokow) 2krazek z nowobiocyna (5 µg) roznicujacy koagulazo-ujemne gron-

kowce 3

Kał


Aeromonas i PlesiomonasCampylobacter spp.Escherichia coli (enteropatogenne, enterotoksyczne, enteroinwazyjne i entero-

krwotoczne)Salmonellae spp. nie-typhi i EdwardsiellaSalmonella typhi i S. paratyphiShigellaVibrio cholerae serogrupa O1, przecinkowce nie wywołujace choleryYersinia enterocolitica

163

CZESC II


Podłoza transportowe

PriorytetPodłoze Cary’ego-Blaira (dla wszystkich patogenow) 1Buforowany roztwor soli i glicerolu (nie dla Vibrio lub Campylobacter) 2

Podłoza selektywne

Bulion seleninowy F 1Zasadowa woda peptonowa 2


Agar cytrynianowo-deoksycholowy (moze byc zastapiony agaremSalmonella-Shigella, agarem ksylozo-lizyno-deoksycholanowym(XLD)) 1

Agar MacConkeya (z fioletem krystalicznym) 1Agar TCBS 1Podłoze Campylobacter: podstawowy agar Columbia lub inny agar

z krwia zawierajacy lizat krwi i dodatek antybiotyku lub podłozepodstawowe na bazie aktywnego wegla 2

Podłoza do wstepnej hodowlii odczynniki diagnostyczne

Agar Kliglera (KIA) (dla patogenow jelitowych moze byc zastapionytrojcukrowym agarem zelazowym, TSI) 1

Odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu 1Podłoze ruch-indol-ureaza (MIU) (mozna zastapic podłozem do wy-

krywania ruchu + bulion peptonowy z mocznikiem) 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1

Podłoza selektywne i odczynniki diagnostyczne

Woda peptonowa (lub podstawowy bulion z czerwienia fenolowa) 2Podłoze płynne z lizyna (Möller) 2Test ONPG 2Podłoze Simmonsa z cytrynianem 2Krazek z czynnikiem wibriostatycznym O:129 2

Surowice do aglutynacjiPriorytet

Salmonella: poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi) 1surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi 2surowice anty-H: H:a, H:b, H:d, H:i, H:m, H:2 3surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2 3

164


Shigella: poliwalentne surowice: anty-dysenteriae, an-ty-flexneri, anty-boydii, anty-sonnei 1surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga) 1

Vibrio cholerae: poliwalentna surowica anty-O1 1surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba),anty-O:139 3

Haemophilus influenzae surowica typowa anty-b 3Neisseria meningitidis poliwalentna 3

surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C 3

Gorne drogi oddechowe


Candida albicans (jama ustna)Corynebacterium diphtheriae (gardło i nos)Haemophilus influenzae (ucho i zatoki)Moraxella catarrhalis (ucho i zatoki)Neisseria meningitidisPseudomonasStaphyloccoccus aureus (ucho i zatoki)Streptococcus pneumoniae (ucho i zatoki)Streptococcus pyogenes (grupa A, gardło)



PriorytetAgar z krwia (przygotowany na bazie bez glukozy) 1Agar czekoladowy 2Podłoze Löfflera z surowica lub podłoze jajeczne Dorseta 2Agar z krwia i tellurynem 2Zmodyfikowane podłoze Thayer-Martina dla gonokokow i menin-

gokokow 3


Krazek z bacytracyna 1Odczynniki do katalazy i koagulazy 1Krazek z optochina 1Podłoza do rozkładu cukrow dla Neisseria spp. 2Odczynnik do wykrywania oksydazy 2Czynniki X i XV (krazek lub pasek) 2Trojmaslan glicerylu (trojbutyryna) 3

Szybkie testy diagnostyczne

Zestawy do identyfikacji serogrup paciorkowcow β-hemolizujacych 3

165

CZESC II

Dolne drogi oddechowe


Candida albicansEnterobacteriaceaeHaemophilus influenzaeKlebsiella pneumoniaeMoraxella catarrhalisMycobacterium tuberculosisStaphylococcus aureusStreptococcus pneumoniae



PriorytetAgar z krwia 1Agar czekoladowy 1Agar MacConkeya 1Podłoze Löwensteina-Jensena 2Agar Sabouraud 3Selektywny agar z krwia dla Haemophilus (bacytracyna lub wan-

komycyna) 3


Krazek z optochina 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 2Czynniki X i XV (krazek lub pasek) 2Trojmaslan glicerylu (trojbutyryna) 3

Probki z układu moczowo-płciowegodo diagnostyki chorob przenoszonych drogakontaktow seksualnych


Candida albicans (badanie mikroskopowe)Chlamydia trachomatisGardnerella vaginalis (badanie mikroskopowe)1

Haemophilus ducreyiNeisseria gonorrhoeaeTreponema pallidum (mikroskopia w ciemnym polu)

1 Gardnerella vaginalis nie jest patogenem, lecz drobnoustrojem wskaznikowym bakteryjnejwaginozy.

166



Podłoza transportowe

PriorytetPodłoza transportowe Amiesa lub Stuarta 1


Zmodyfikowane podłoze Thayer-Martina (MTM) lub podłoze NewYork City (NYC) 1

czekoladowy agar Mueller-Hintona z krwia konska + wankomycyna+ IsoVitaleX dla H. ducreyi 3

Odczynniki do identyfikacji

Test nitrocefinowy lub inne testy do wykrywania β-laktamaz 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1

Ropa i wysieki


Bacillus anthracisBacteroides i inne bezwzgledne beztlenowceClostridium perfringensEnterobacteriaceaeMycobacterium tuberculosis, M. ulceransInne Mycobacterium spp.Pasteurella multocidaPseudomonas i inne pałeczki niefermentujaceStaphylococcus aureusStreptococcus pyogenesStreptococcus (inne gatunki)



PriorytetAgar z krwia 1Agar MacConkeya 1Agar z mannitolem 2Płynne podłoze tioglikolanowe (z indykatorem) (moze byc zastapione

podłozem z wyciagiem miesnym, bulionem Schaedlera lub bulionemWilkins-Chalgrena) 2

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) 2

167

CZESC II


Test na katalaze (H2O2) 1Osocze do wykrywania koagulazy 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1Generator wodoru do anaerostatu 2

Lista rekomendowanych podłozyi odczynnikow diagnostycznychdla laboratoriow mikrobiologicznycho srednim poziomie referencyjnosci

Podłoza hodowlane

Podłoze rekomendowane Alternatywne Stopienreferencyjnosci

Agar z zołcia i eskulina 1

Agar z krwia (patrz agar tryptozowo--sojowy) 1

Agar z brolacyna Agar z laktoza i fioletem krystalicz-nym, agar CLED 1

Zelazowy agar Kliglera (KIA) 1

Podłoze Löfflera z surowica Podłoze jajeczne Dorseta 1

Podłoze Löwensteina-Jensena 1

Agar MacConkeya (z fioletem krys-talicznym)

Eozynowy agar z błekitem metyle-nowym 1

Agar MacConkeya (bez fioletu krys-talicznego) 1

Podłoze ruch-indol-ureaza (MIU) Podłoze do wykrywania ruchu+ bulion ureazowy + woda pep-tonowa (tryptonowa) 1

Agar Mueller-Hintona 1

Dekstrozowy agar Sabouraud 1

Deoksycholanowy agar cytrynianowy Agar Salmonella-Shigella (SS) 1

Agar tryptozowo-sojowy (TSA) Agar Columbia 1

Bulion tryptozowo-sojowy (TSB) Bulion mozgowo-sercowy 1

TCBS 1

Podłoze transportowe (Amies) Podłoze transportowe (Stuarta lubCary’ego-Blaira) 1

Woda peptonowa Andrade Czerwony bulion fenolowy 2

Bulion z dekarboksylaza (Möller) 2

Agar z mannitolem (MSA) 2

Bulion z selenitem F 2

Agar cytrynianowy Simmonsa 2

Podłoze tioglikolanowe Bulion Schaedlera, bulion do ho-dowli beztlenowcow Wilkensa--Chalgrena, podłoze z wycia-giem miesnym 2

Agar z DNaza 3

168


Inhibitory i antybiotykistosowane jako dodatek do podłozylub odczynnik

Chloramfenikol (do izolacji grzybow) 1Antybiotyki dodawane do podłoza dla gonokokow: wankomycyna,

kolistyna, nystatyna (trimetoprim): VCN (VCNT) 1Dodatek antybiotykow do podłoza dla Campylobacter 2Roztwor tellurynu (do izolacji Corynebacterium diphtheriae) 2Bacytracyna (do izolacji Haemophilus spp.) 3Wankomycyna (do izolacji Haemophilus ducreyi lub H. influenzae) 3

Dodatki wzbogacajace podłoza

IsoVitaleX (Polyvitex, Vitox, suplement B, suplement VX, suplementCVA) 2

Polianetosulfonian sodu (SPS) 3

Krazki, tabletki lub paski

Krazek z bacytracyna 1Krazek z nitrocefina (Cefinaza) lub odczynnik 1Test ONPG 1Krazek z optochina 1Odczynnik do wykrywania oksydazy 1PGUA (β-glukuronidaza) 1Czynniki V i XV 2Krazek z nowobiocyna (5 µg) 3Test PYR 3Trojmaslan glicerylu (trojbutyryna) 3Krazek z czynnikiem wibriostatycznym O:129 3

Zestawy diagnostyczne

Zastaw do szybkiej serodiagnostyki bakterii wywołujacych zapalenieopon mozgowo-rdzeniowych 3

Zestaw do identyfikacji serogrup paciorkowcow hemolizujacych 3

Inne odczynniki diagnostyczne

Skala z siarczanem baru (dla metody Kirby-Bauera) (skala MacFarlan-da — przyp. tłum.) 1

Zestaw do barwienia metoda Grama 1Nadtlenek wodoru (H2O2) (katalaza) 1Odczynnik Kovacsa (do indolu) 1Odczynnik do wykrywania oksydazy (dimetyl-p-fenylenodiamina) 1Osocze (do testu na koagulaze i testu filamentacji) 1Zestaw do barwienia metoda Ziehl-Neelsena 1

169

CZESC II

Buforowany fizjologiczny roztwor soli z glicerolem (do transportukału) 2

Weglowodany: glukoza, laktoza, maltoza, mannitol, sacharoza 2Generator wodoru do anaerostatu 2Tusz chinski (do wykrywania otoczek) 2Lizyna (do wykrywania dekarboksylazy) 2

Krazki do oznaczania lekowrazliwosci

Lista waznych antybiotykow wg WHO (2002)

amoksycylinaampicylinabenzylopenicylinachloramfenikolciprofloksacynakotrimoksazol (sulfametoksazol-trimetoprim)kloksacylinaerytromycynagentamycynakanamycynakwas nalidyksowynitrofurantoinasulfonamidtetracyklina (lub doksycyklina)trimetoprim

Lista antybiotykow rezerwowych

amoksycylina/kwas klawulanowyamikacynacefalotynacefazolinacefotaksymceftazydymceftriaksoncefuroksymciprofloksacyna i inne fluorochinolonyklindamycynapiperacylinawankomycyna

Surowice do aglutynacjiPriorytet

Salmonella: poliwalentna surowica anty-O (A-I i Vi) 1surowice anty-O: O:2 (A), O:4 (B), O:9 (D), Vi 2surowice anty-H: H:a, H:b, H:d, H:i, H:m, H:2 3surowice anty-H fazy inwersji: H:b, H:i, H:1,2 3

170


Shigella: poliwalentne surowice anty-dysenteriae, an-ty-flexneri, anty-boydii, anty-sonnei 1surowica anty-dysenteriae typ 1 (Shiga) 1

Vibrio cholerae: poliwalentna surowica anty-Ol 1surowica anty-B (Ogawa), anty-C (Inaba),anty-O:139 3

Haemophilus influenzae: surowica typowa anty-b 3Neisseria meningitidis: poliwalentna 3

surowice grupowe anty-A, anty-B, anty-C 3

171

Wybrana literatura uzupełniajacaAugust M.J. et al.: Quality control and quality assurance practices in clinical microbiology.

Cumitech, 1990, 3A: 1 – 14.

Basics of quality assurance for intermediate and peripheral laboratories, 2nd ed.Alexandria, WHO Regional Office for the Eastern Mediterranean, 2000.

Baron E.J., Finegold S.M.: Diagnostic microbiology, 8th ed. St Louis, MO, The C.V.Mosby Company, 1990.

Blazevic D.J. et al.: Practical quality control procedures for the clinical microbiologylaboratory. Cumitech, 1976, 3: 1 – 12.

Cheesbrough M.: Medical laboratory manual for tropical countries. Vol. II: Microbiology.London, Tropical Health Technology/Butterworths, 1989.

Collins C.H., Lyne P.M.: Microbiological methods, 5th ed. London, Butterworths, 1985.

Gillies R.P., Paul J.: Bacteriology illustrated. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1983.

Howard B.J. et al.: Clinical and pathogenic microbiology. St Louis, MO, The C.V. MosbyCompany, 1987.

Koneman E.W.: Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed. Philadelphia,Lippincott, 1997.

Miller J.M.: Quality control in microbiology. Atlanta, GA, Centers for Disease Control andPrevention, 1987.

Miller J.M., Wentworth B.B.: Methods for quality control in diagnostic microbiology.Washington, DC, American Public Health Association, 1985.

Montefiore D.G. et al.: Tropical microbiology. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1984.

Murray P. et al.: Manual of clinical microbiology, 8th ed. Washington, DC, AmericanSociety for Microbiology, 2003.

Stokes E.J. et al.: Quality control. In: Clinical bacteriology, 7th ed. London, EdwardArnold, 1993.

Turk D.C. et al.: A short textbook of medical microbiology. London, Hodder & Stoughton,1983.

Summanen P. et al.: Wadsworth anaerobic bacteriology manual. Belmont, CA, StarPublishing Company, 1993.

172

SkorowidzAcinetobacter lwofii 20 – 22– spp., obraz hodowli 83– w wydzielinie z cewki moczowej u mez-

czyzn 90Actinomyces israelii 105Aerobacter butzleri, identyfikacja bioche-

miczna 67Aeromonas 162– caviae, biochemiczne reakcje 65– – wywoływane zakazenia 49– hydrophila, biochemiczne reakcje 65– – wywoływane zakazenia 49– sobria, wywoływane zakazenia 49– veroni, biochemiczne reakcje 65– wstepna identyfikacja 61Agar cefoksytyno-cykloseryno-fruktozowy

(CCFA), podłoze do hodowli patogenowjelitowych 54

– cysteinowo-tryptozowy (CTA), przecho-wywanie szczepow długoterminowe 26

– cytrynianowy Simmonsa 21– czekoladowy 21– – podłoze dla płynu mozgowo-rdzenio-

wego 38– deoksycholanowo-cytrynianowy (DCA),

podłoze do hodowli patogenow jelito-wych 53

– Hektoen (HEA), podłoze do hodowlipatogenow jelitowych 53

– Kliglera (KIA) 22– – procedura posiewu i odczytu 56 – 58– – reakcje typowe Enterobacteriaceae 61– ksylozo-lizyno-deoksycholanowy

(XLD), podłoze do hodowli patogenowjelitowych 53

– MacConkeya, podłoze do hodowli pato-genow jelitowych 53

– – podłoze dla płynu mozgowo-rdzenio-wego 38

– – z fioletem krystalicznym 21– Mueller-Hintona 21, 126– Salmonella-Shigella (SS agar) 21– – podłoze do hodowli patogenow jelito-

wych 53– siarczanowo-bizmutowy, podłoze do ho-

dowli patogenow jelitowych 53– Tayer-Martina 21, 90, 91– tellurynowy z krwia selektywny 77– z cytrynianem deoksycholanu 21– – tiosiarczanowym, solami zołci i sacha-

roza (TCBS), podłoze do hodowli pato-genow jelitowych 53

– z krwia 21– – podłoze dla płynu mozgowo-rdzenio-

wego 38

Agar, z mannitolem 21– z solami zołci (BSA), podłoze do hodo-

wli patogenow jelitowych 54– – i cytrynianem tiosiarczanowym 21– z zasadowym ekstraktem miesnym

(MEA), podłoze do hodowli patogenowjelitowych 54

– z zołcia i eskulina 21– zelazowy trojcukrowy – patrz Agar Kli-

glera Aglutynacja lateksowa, procedury156

– surowice 169Aglutyniny, wykrywanie w goraczce 150AIDS – patrz Zespoł nabytego niedoboru

odpornosciAmeby, poszukiwanie w płynie mozgowo-

-rdzeniowym 37Amikacyna 123, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Aminoglikozydy 125Amoksycylina 92, 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Ampicylina 92, 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Anaerostat, kontrola jakosci 18Angina Vincenta 74Antybiogram – patrz tez Lekowrazli-

wosc– jako narzedzie badan epidemiologicz-

nych 123– jako wskazowka do leczenia 122– karta kontroli jakosci 137– w hodowli z krwi 34Antybiotyki do rutynowego oznaczania

wrazliwosci 123– jako dodatek do podłozy 168– krazki 127– lista rezerwowych 169– okreslanie wrazliwosci, szablon 133– oznaczanie lekowrazliwosci 24, 118,

119, 127, 133– stezenie w krazkach 135– strefy zahamowania wzrostu 126, 132,

133– wazne wg WHO 169Antygen(y) bakteryjne, wykrywanie 155– do diagnostyki 23– H, procedura identyfikacji 70– somatyczny O, procedura identyfikacji

68– VDRL, przygotowanie 144, 145Antykoagulant 32Arcobacter butzleri, wywoływane zakaze-

nia 50Autoklaw, kontrola jakosci 18

173

SKOROWIDZ

Bacillus anthracis 102, 111, 166Bacteroides 166– fragilis 20, 21, 101, 113, 160– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zakazenia szpitalne 103– – identyfikacja 116, 118– melaninogenicus – patrz Prevotella me-

laninogenicaBacytracyna 168Badanie(a) bakteriologiczne 29– – rodzaje gwarancji jakosci 13– – zapewnienie jakosci 12– mikrobiologiczne 14, 15– serologiczne 138– – metody kontroli jakosci 138– – wyposazenie laboratorium 139Bakterie beztlenowe 20– – diagnostyka zakazen 114– – identyfikacja 116– – podłoza do hodowli 115– – posiew i izolacja 115– – przechowywanie długoterminowe 26– – wrazliwosc na antybiotyki 118– – zakazenia 113– Gram-ujemne kwasooporne 20– jelitowe, morfologia kolonii 60– – wstepna identyfikacja izolowanych

szczepow 56– kwasooporne, barwienie metoda Ziehl-

-Neelsena 38– mikroaerofilne 113– podział ze wzgledu na wymagania tleno-

we 113Bakteriemia 30, 113– przyczyny 31Barwienie kwasooporne (Ziehl-Neelsena)

106– – test jakosci 23– metoda Grama 105– – – test jakosci 23Barwniki 22Benzylopenicylina 84, 123, 124, 126, 169– działanie na Neisseria gonorrhoeae 92– stefy zahamowania wzrostu 132, 133Białko, stezenie w poszczegolnych ty-

pach zapalenia opon mozgowo-rdzenio-wych 38

Biegunki, czynniki etiologiczne 48– w zakazeniach HIV/AIDS 48Błonica 74Bordetella pertussis 142Borrelia burgdorferi 148Botulizm przyranny 102, 113Brucella 160– spp. a bakteriemia i fungemia 31– wykrywanie aglutynin 150Bruceloza, miano aglutynin 150– wykrywanie aglutynin, test probowko-

wy 152

Bruceloza, miano aglutynin, test szkiełko-wy 151

– zestaw do wykrywania aglutynin 151BSA – patrz Agar z solami zołciBulion azotanowy 21– do posiewu z krwi 32– malonianowy 21– Schaedlera 160– seleninowy 21– tioglikolanowy 21– tryptozowo-sojowy (TSB), 32, 160– – wybor podłoza dla płynu mozgowo-

-rdzeniowego 38– Wilkins-Chalgrena 160– z mocznikiem, lekko buforowany

(UREA), procedura posiewu i odczytu 56– z wyciagiem mozgowo-sercowym 160Burkholderia pseudomallei 160– – jako przyczyna bakteriemii i funge-

mii 31Butelki z podłozem do posiewu krwi 32

Calymmatobacterium granulomatis 96– – objawy zakazenia 89Campylobacter coli, identyfikacja bioche-

miczna 67– – identyfikacja koncowa 66– – – wstepna 61– – wywoływane zakazenia 50– fetus, identyfikacja biochemiczna 67– hyointestinalis, identyfikacja biochemi-

czna 67– jejuni 113– – identyfikacja biochemiczna 67– – – koncowa 66– – – wstepna 61– – wywoływane zakazenia 50– lari, identyfikacja biochemiczna 67– spp. 162– – badanie wizualne probek kału 52– – wybor podłoza 18– upsaliensis, identyfikacja biochemicz-

na 67– warunki inkubacji 54Candida albicans 20, 21, 95, 160, 161, 165– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zapalenie pochwy 93– – lekowrazliwosc 85– – objawy zakazenia 89– – obraz hodowli 83– a zapalenie gardła 75CCFA – patrz Agar cefoksytyno-cyklose-

ryno-fruktozowyCefaleksyna 125Cefalorydyna 125Cefalotyna 123 – 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Cefalozyna 126– strefy zahamowania wzrostu 132

174

SKOROWIDZ

Cefamandol 125– strefy zahamowania wzrostu 132Cefamycyna 125Cefapiryna 125Cefazolina 125, 169Cefoksytyna 125Cefotaksym 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Cefradyna 125Ceftazydym 123, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Ceftriakson 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Cefuroksym 123, 125, 126, 169– sodium, strefy zahamowania wzrostu 132Cewka moczowa u mezczyzn, zapalenie 90Chlamydia psittaci 142– trachomatis 89, 96, 165– – a odczyn immunofluorescencji 142– – a zapalenie cewki moczowej u mez-

czyzn 90– – – pochwy u dziewczynek 93– – – szyjki macicy 93, 95– – zakazenie w ciazy 93– – – objawy 89– wykrywanie 90Chloramfenikol 84, 118, 123, 124, 126,

168, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Chlorek sodu 140– zelaza/deaminaza fenyloalaniny 21Chłodziarka, kontrola jakosci 18Cholera 49– badanie wizualne probek kału 52Choroba(y) legionistow 79– z Lyme 148– przenoszone droga kontaktow seksual-

nych, 89– – probki do diagnostyki 165– – spodziewane patogeny 165Cieplarka, kontrola jakosci 18Ciprofloksacyna 123, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Citrobacter freundi 22– – biochemiczne reakcje 63– spp. a zapalenie opon mozgowo-rdzenio-

wych 36Clostridium botulinum 113– difficile, wstepna identyfikacja 61– – wywoływane zakazenia 50– perfringens 20, 102, 113, 166– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zakazenia szpitalne 102– – identyfikacja 116– spp. 93– tetani 113Corynebacterium diphtheriae 74, 142– – hodowla 77– – nosicielstwo 75

Cryptococcus neoformans 160, 161– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zapalenie opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– – posiew 39– – poszukiwanie w płynie mozgowo-

-rdzeniowym 37CTA – patrz Agar cysteinowo-tryptozowyCzas inkubacji a wielkosc strefy zahamo-

wania 134Czerwien metylowa/Voges-Proskauer 21Czerwonka pełzakowa, badanie wizualne

probek kału 52Czynnik V, test jakosci 23– XV, test jakosci 23

DCA – patrz Agar deoksycholanowo-cyt-rynianowy

Deaminaza fenyloalaniny/chlorek zelaza 21Dekarboksylaza lizyny 21– ornityny 21Dezynfekcja skory w miejscu wkłucia 31Diagnostyka mikrobiologiczna, etapy 14Dihydrolaza argininy 21Dikloksacylina 124Doksycyklina 169Drogi oddechowe dolne, spodziewane pato-

geny 165– – gorne, spodziewane patogeny 164– – – zakazenia 73

Edwardsiella tarda, biochemiczne reakcje63

Enterobacter cloacae 20– spp. a bakteriemia i fungemia 31– morfologia kolonii 60– wstepna identyfikacja 56Enterobacteriaceae 20, 160, 161, 162, 166– lekowrazliwosc 84, 123– na agarze zelazowym Kliglera (KIA) 60,

61– obraz hodowli 84– przechowywanie długoterminowe 25– wstepna identyfikacja 39, 57, 59– wybor podłoza 17– w wydzielinie z cewki moczowej u mez-

czyzn 90– zapalenie opon mozgowo-rdzeniowych

36Enterococcus faecalis 20, 21– – a bakteriemia i fungemia 31– – szczep kontrolny 127– faecium 122– spp., morfologia kolonii 60Enterokoki 161Erytromycyna 84, 123, 124 – 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Escherichia coli 20 – 22, 113, 161, 162– – a bakteriemia i fungemia 31

175

SKOROWIDZ

Escherichia coli, a zakazenia szpitalne 102– – a zapalenie oskrzeli 80– – – opon mozgowo-rdzeniowych 36– – badanie wizualne probek kału 52– – biochemiczne reakcje 63– – morfologia kolonii 60– – strefy zahamowania wzrostu 126– – szczepy standardowe do kontroli jako-

sci 136– – test β-glukuronidazowy do szybkiej

identyfikacji 47– – w moczu 122– – wstepna identyfikacja 56– – wykrywanie antygenow 155– – wywoływane zakazenia 49

Fenetycylina 124Fenoksymetylopenicylina 124Fermentacja dekstrozy bez oleju 21Flukloksacylina 124Francisella tularensis 152– – miano aglutynin 150Fungemia 30– przyczyny 31

Gardło, flora fizjologiczna 73– pobieranie materiału do badan 75– przesyłanie materiału do badan 75– zapalenie, czynniki bakteryjne 74Gardnerella vaginalis 95, 165– – objawy zakazenia 89– – zapalenie pochwy 93Gentamycyna 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Glicerol, przechowywanie szczepow dłu-

goterminowe 25Glukoza, stezenie w poszczegolnych ty-

pach zapalenia opon mozgowo-rdzenio-wych 38

β-Glukuronidaza (PGUA), test jakosci 23Gonokoki, przechowywanie szczepow krot-

koterminowe 26– zapalenie gardła 74Goraczka, wykrywanie aglutynin 150Gronkowce 101– identyfikacja 108– przechowywanie długoterminowe 25– wrazliwosc na benzylopenicyliny 133– w wydzielinie z cewki moczowej u mez-

czyzn 90Gruzlica płuc 79, 80Grzyby 20

Haemophilus 142– ducreyi 96, 165– – hodowla 98, 99– – objawy zakazenia 89– – pobieranie probki 97

Haemophilus influenzae 21, 108, 122, 160,161

– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zapalenie opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– – – oskrzeli 79, 80– – – płuc 80– – lekowrazliwosc 85– – obraz hodowli 83– – surowice do aglutynacji 164, 170– – typ b 20– – w aspiratach z jamy opłucnej 101– – wstepna identyfikacja 39– – wykrywanie antygenow 155– parainfluenzae 20– przechowywanie szczepow krotkotermi-

nowe 26Hafnia alvei, biochemiczne reakcje 63HBV – patrz Wirus zapalenia watroby

typu BHEA – patrz Agar HektoenHerpesvirus 96– a zapalenie cewki moczowej u mezczyzn

90HIV/AIDS – patrz Zespoł nabytego niedo-

boru odpornosciHodowla(e) 28– Corynebacterium diphtheriae 77– Mycobacterium tuberculosis 85, 87– Neisseria gonorrhoeae 91, 92, 95– patogenow jelitowych, podłoza 53– płynu mozgowo-rdzeniowego, wybor

podłoza 38– podłoza 17, 159– Streptococcus pyogenes 76– warunki beztlenowe 114– z krwi 31, 33

Identyfikacja antygenu H 70– – somatycznego O 68– Neisseria gonorrhoeae 92– serologiczna Yersinia enterocolitica 72– – Salmonella 67, 69– – – paratyphi A 70– – – typhi 70– – Shigella 71Indol (woda peptonowa) 21Inhibitory jako dodatek do podłozy 168Inoculum, gestosc a wielkosc strefy zaha-

mowania 134– przygotowanie 137Interpretacja wynikow badan, jakosc 13

Jama otrzewnej, drobnoustroje 101– zapalenie 113

Kał 48– badanie wizualne probek 52– – wstepna izolacja 54

176

SKOROWIDZ

Kał, identyfikacja biochemiczna gatunkowCampylobacter 67

– – koncowa mikrobiologiczna izolowa-nych szczepow 62

– – – serologiczna izolowanych szcze-pow 67

– – wstepna izolowanych szczepow 56– izolacja bakterii wstepna 54– pobieranie probek do badania 51– podłoza transportowo-wzbogacajace 53– posiew probek 53– przesyłanie probek do badania 51– spodziewane patogeny 162Kanamycyna 125, 169Kandydiaza pochwy 95Katalaza, test jakosci 23KIA – patrz Agar KligleraKiła 96– diagnostyka, odczyny serologiczne 142– odczyn VDRL 143Klebsiella pneumoniae 20, 21– – a zapalenie oskrzeli 80– – a zapalenie płuc 80– spp. a bakteriemia i fungemia 31– – morfologia kolonii 60– – wstepna identyfikacja 56Klindamycyna 118, 123, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Kloksacylina 124, 169Koaglutynacja, procedury 156Kolistyna 168Kontakty seksualne, przenoszone choroby

89Kontrola jakosci sprzetu 18– – standardowa procedura 136– – standardowe szczepy 136– – wewnetrzna 16– – zestaw szczepow 20– – zewnetrzna 27Kotrimoksazol 84, 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Krazek z bacytracyna, test jakosci 23– z optochina, test jakosci 23– z tellurydem, test jakosci 23Krazki 168– czas nałozenia a wielkosc strefy zahamo-

wania 134– do oznaczania lekowrazliwosci 169– z antybiotykami 127, 135– – nakładanie na płytke 137Krew 30– antybiogram 34– butelki z podłozem do posiewu 32– objetosc probki 31– pobieranie probek 31– podłoza do posiewu 32– – płynne do hodowli 160– prowadzenie hodowli 33– spodziewane patogeny 160

Krew, zakazenie a wrazliwosc antybioty-kow 123

Kretki Reitera 148– odczyn immunofluorescencji w modyfi-

kacji absorpcyjnej (FTA-Abs) 148Kryteria jakosci w mikrobiologii 14Kwas klawulanowy 123, 126, 169– – strefy zahamowania wzrostu 132– nalidyksowy 123, 126, 169– – strefy zahamowania wzrostu 132

Laboratoria referencyjne 27Laboratorium mikrobiologiczne, zapewnie-

nie jakosci badan 13– wyposazenie do badan serologicznych

139Legionella pneumophila 142– – metody badan 79Lekowrazliwosc bakterii wyhodowanych

z plwociny 84– krazki do oznaczania 169– oznaczanie na antybiotyki 133– – w moczu 47– – w płynie mozgowo-rdzeniowym 40– szczepow izolowanych z gardła 78Leukocytoza w poszczegolnych typach

zapalenia opon mozgowo-rdzeniowych38

Listeria monocytogenes 93, 161– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zapalenie opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– – wstepna identyfikacja 39

Łaznia wodna 139– – kontrola jakosci 18

MEA – patrz Agar z zasadowym ekstrak-tem miesnym

Meningokoki, przechowywanie szczepowkrotkoterminowe 26

Metoda dyfuzyjno-krazkowa – patrz Meto-da Kirby-Bauera

Metoda Grama, test jakosci barwienia 23Metoda Kirby-Bauera 119, 120– – czynniki techniczne 134– – zmodyfikowana 125– – – interpretacja stref zahamowania

wzrostu 132– NEO-SENSITABS 119Metronidazol 118Metycylina 124– badanie wrazliwosci Staphylococcus au-

reus 134Micrococcus spp. 113Mikrobiologia, kryteria jakosci 14Mikroorganizmy Gram-dodatnie jako przy-

czyna bakteriemii 31– – – – fungemii 31

177

SKOROWIDZ

Mikroorganizmy Gram-ujemne jako przy-czyna bakteriemii 31

– – – – fungemii 31Mikroskop, kontrola jakosci 18Mikroskopy 139MIL – patrz Podłoze ruch-indol-lizynaMinocyklina 124Mobiluncus spp. a zapalenie pochwy 93– – objawy zakazenia 89Mocz, badanie przesiewowe 43– – z uzyciem kalibrowanej ezy 44– – – paskow bibułowych 44– hodowla i interpretacja 43– identyfikacja drobnoustrojow 47– metody badan przesiewowych 43– oznaczanie lekowrazliwosci 47– pobieranie materiału do badania, 41, 42– – u niemowlat i dzieci 43– posiew ilosciowy i wstepna identyfikacja

44– – – interpretacja wynikow 46– spodziewane patogeny 161– zakazenie a wrazliwosc antybiotykow

123Mononukleoza zakazna 142Moraxella catarrhalis 20– – lekowrazliwosc 84– – obraz hodowli 83– – zapalenie oskrzeli 79Morganella, biochemiczne reakcje 63Mycobacterium fortuitum 107– fortuitum-chelonei 106– marinum 107– spp. 166– tuberculosis 101, 161, 166– – jako przyczyna zapalenia opon moz-

gowo-rdzeniowych 36– – hodowla 85, 87– – – interpretacja 88– – – zasady bezpieczenstwa 88– ulcerans 107, 166Mycoplasma pneumoniae 138– – metody badan 79

Naegleria fowleri, poszukiwanie w płyniemozgowo-rdzeniowym 37

Nafcylina 124Narzady płciowe zenskie, pobieranie pro-

bek 93– – – transport probek 93– – owrzodzenia 96– – – pobieranie probek 96Neisseria gonorrhoeae 20, 21, 122, 165– – a zapalenie cewki moczowej u mez-

czyzn 90– – – pochwy u dziewczynek 93, 95– – – szyjki macicy 93– – badanie wrazliwosci na antybiotyki 92– – hodowla 91, 92, 95

Neisseria gonorrhoeae, identyfikacja 92– – zakazenia, objawy 89– – – w ciazy 93– meningitidis 20, 21, 122, 160, 161– – nosicielstwo 75– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – – zapalenia opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– – surowice do aglutynacji 164, 170– – wstepna identyfikacja 39– – wykrywanie antygenow 155– przechowywanie szczepow długotermi-

nowe 26Netylmycyna 125Niemowleta, zapalenie opon mozgowo-

-rdzeniowych, przyczyny 36o-Nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd 23Nitrofurantoina 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Nocardia asteroides 108, 113Norfloksacyna 123– strefy zahamowania wzrostu 132NYC – patrz Podłoze New York CityNystatyna 168

Odczyn aglutynacji 141– ASO 152– FTA-Abs 149– immunofluorescencji 142– – kretkow w modyfikacji absorpcyjnej

(FTA-Abs) 148– kłaczkujacy 141– precypitacji 141– RPR 142, 146 – 148– – jakosciowy 147– – połilosciowy 147Odczyn VDRL 142 – 146– – połilosciowy 145– Weila-Felixa 150– Widala 150– Wrighta 150Odczynnik Nitrocefin 92Odczynniki 22, 126– diagnostyczne 159, 168– – do hodowli płynu mozgowo-rdzenio-

wego 161, 162– – – probek z układu moczowo-płciowe-

go 166– – – z dolnych drog oddechowych 165– – – z gornych drog oddechowych 164– – do kału 163– – w hodowli krwi 160– – – ropy 167– do badan serologicznych 140– testy jakosci 23Odczyny aglutynacji lateksowej, procedury

156– serologiczne 138– – w diagnostyce kiły 142

178

SKOROWIDZ

Odlezyny, owrzodzenia, pobieranie probek104

Oksacylina 84, 123, 124, 126– badanie wrazliwosci Staphylococcus au-

reus 134– strefy zahamowania wzrostu 132Oksydaza, test jakosci 23Oleandomycyna 125Olej mineralny, przechowywanie szczepow

długoterminowe 25ONPG – patrz o-Nitrofenylo-β-D-galakto-

piranozydOparzenia, drobnoustroje 101– pobieranie probek 104Opony mozgowo-rdzeniowe, przyczyny

zapalenia 36Oskrzela, zapalenie 80Osocze do koagulazy, test jakosci 23Owrzodzenia narzadow płciowych, badanie

bezposrednie probki 97– – – hodowla 98– – – pobieranie probek 96– odlezynowe, pobieranie probek 104– Buruli 107

Paciorkowce 160– α-hemolizujace jako przyczyna bakterie-

mii i fungemii 31– β-hemolizujace, roznicowanie 77– przechowywanie szczepow 26– w aspiratach z jamy opłucnej 101– zieleniejace 160– – a bakteriemia i fungemia 31Pałeczki beztlenowe Gram-dodatnie, wste-

pna identyfikacja 58– – Gram-ujemne, wstepna identyfikacja

59– Gram-ujemne 20Papilomavirus, objawy zakazenia 89Paski 168– bibułowe do badania moczu 44Pasteurella multocida 102, 110, 166Patogeny 159– jelitowe, podłoza do hodowli 53Peptostreptococcus, identyfikacja 117– magnus 113– spp. a ropien płuca 80– – jako przyczyna bakteriemii i fungemii

31PGUA – patrz β-GlukuronidazaPiperacylina 123, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Piwampicylina 125Plesiomonas 162– shigelloides, biochemiczne reakcje 63,

65Plwocina, badanie mikroskopowe 82– hodowla i interpretacja 82– ocena makroskopowa 81

Plwocina, pobieranie probek 81– podłoza do hodowli 83– ropna, badania 79Płuca, gruzlica 80– zapalenie 80Płyn mozgowo-rdzeniowy, badanie mikro-

skopowe 37– – barwienie preparatow metoda Grama

37– – cechy w zapaleniu opon 38– – ocena makroskopowa 37– – oznaczanie lekowrazliwosci 40– – pobieranie 36– – spodziewane patogeny 161– – transport probek 36Płytka hodowlana, sposob posiewu bakterii

45Pneumokoki w aspiratach z jamy opłucnej

101Podłoza do hodowli 17, 159– – bakterii beztlenowych 115– – kału 163– – płynu mozgowo-rdzeniowego 161– – z plwociny 83– do identyfikacji w hodowli płynu moz-

gowo-rdzeniowego 162– do izolacji w hodowli krwi 160– – – płynu mozgowo-rdzeniowego 162– – – probek z układu moczowo-płciowe-

go 166– – – ropy 166– – – z dolnych drog oddechowych 165– – – z gornych drog oddechowych 164– do posiewu krwi 32– gotowe, przechowywanie 20– hodowlane, dodatki wzbogacajace 168– – rekomendowane 167– płynne do hodowli krwi 160– przygotowywane, kontrola jakosci 20– testy kontrolne 21– z wyciagiem miesnym, przechowywa-

nie długoterminowe bakterii beztleno-wych 26

Podłoze agarowe Thayer-Martina modyfi-kowane 21, 90, 91

– jajeczne Dorseta 77– New York City 91– ruch-indol-lizyna, procedura posiewu

i odczytu 56, 57– suche, zamawianie i przechowywanie 18– tioglikolonowe płynne 160– z mocznikiem 22– z tellurynem, taurocholanem i zelatyna

(TTG) dla patogenow jelitowych 54– przygotowanie 20– skład a wielkosc strefy zahamowania

134, 135Porphromonas w aspiratach z jamy opłuc-

nej 101

179

SKOROWIDZ

Prevotella melaninogenica a ropien płuca80

– w aspiratach z jamy opłucnej 101Proteus mirabilis 20 – 22– spp. a bakteriemia i fungemia 31– – biochemiczne reakcje 63– – wstepna identyfikacja 56Proteus, morfologia kolonii 60– strefy zahamowania wzrostu 133– vulgaris 150Providencia, biochemiczne reakcje 63– spp. 60Przecinkowce w kale, reakcje biochemicz-

ne 65Przeciwciała, oznaczanie 138Przetoki, pobiernie probek 104Pseudobakteriemia, przyczyny 32Pseudomonas 162, 166– aeruginosa 20, 21, 101, 160– – a zapalenie oskrzeli 80– – – płuc 80– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – stefy zahamowania wzrostu 126– – szczepy standardowe do kontroli jako-

sci 136– – wrazliwosc na antybiotyki 123– jako przyczyna bakteriemii i fungemii 31– obraz hodowli 83– spp. w wydzielinie z cewki moczowej

u mezczyzn 90

Rany 100– ciete 102– drazace, pobieranie probek 104– drenujace wezłow chłonnych, pobieranie

probek 104– penetrujace 101, 102– pooperacyjne, pobieranie probek 104– probki chirurgiczne 100– zakazenia szpitalne 102Reakcje serologiczne 141Rickettsia spp. 142Riketsje, wykrywanie aglutynin 150Ropa, odczynniki diagnostyczne 167– podłoza do izolacji 166– spodziewane patogeny 166Ropien(nie) 100, 113– otorbiony, drobnoustroje 101– płuca 80– probki chirurgiczne 100– pobieranie i transport probek 103Ropniak opłucnej 113Rotawirusy 142– wywoływane zakazenia 50

Salmonella 122, 160, 162– arizonae, biochemiczne reakcje 63– biochemiczne reakcje 63– choleraesuis, biochemiczne reakcje 63

Salmonella, identyfikacja koncowa 62– – serologiczna 67, 68– – – wstepna 58– paratyphi A, biochemiczne reakcje 63– – identyfikacja serologiczna 71– spp., identyfikacja 56– – morfologia kolonii 60– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – – zapalenia opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– surowice do aglutynacji 163, 169– typhi, biochemiczne reakcje 63– – identyfikacja serologiczna 70– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – wstepna identyfikacja 56– – wykrywanie aglutynin 150– typhimurium 20– wykrywanie antygenow 155– wywoływane zakazenia 48Salmonelozy, badanie wizualne probek ka-

łu 52Schemat Kauffmanna-White’a 68Sepsa 30Serratia marcescens 20, 21– – biochemiczne reakcje 63Shigella 162– badanie wizualne probek kału 52– boydii 72– – biochemiczne reakcje 63, 64– dysenteriae 71– – biochemiczne reakcje 63, 64– flexneri 20 – 22, 72– – biochemiczne reakcje 63, 64– identyfikacja koncowa 65– – serologiczna 71– – wstepna 58– paratyphi 162– reakcje biochemiczne 63– sonnei 72– – biochemiczne reakcje 63, 64– spp., morfologia kolonii 60– – wstepna identyfikacja 56– surowice do aglutynacji 164, 170– typhi 162– typhimurium 21, 22– wykrywanie antygenow 155– wywoływane zakazenia 49Skaleczenia zakazone, pobieranie probek

104Skora, drobnoustroje 101Spiramycyna 125Sprzet laboratoryjny, dbałosc 17– – kontrola jakosci 18SS agar – patrz Agar Salmonella-ShigellaStaphylococcus agalactiae 20, 93– aureus 20, 21, 93, 107 – 110, 113, 142,

160, 166– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zakazenia szpitalne 102

180

SKOROWIDZ

Staphylococcus aureus, a zapalenie oskrzeli80

– – – płuc 80– – badanie wrazliwosci na metycyline

134– – – – na oksacyline 134– – lekoopornosc 112– – nosicielstwo 75– – obraz hodowli 83– – stefy zahamowania wzrostu 126– – szczepy standardowe do kontroli jako-

sci 136– epidermidis 20, 21, 108 – 110– – lekoopornosc 112– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– mitis 20– pneumoniae 20– pyogenes 20– roznicowanie szczepow 110– saprophyticus 108 – 110, 162– – spp. przyczyna zapalenia opon moz-

gowo-rdzeniowych 36– wrazliwosc na antybiotyki 123– wstepna identyfikacja 109Sterylizator szkła, kontrola jakosci 18Strefy zahamowania wzrostu, odczytywa-

nie wynikow 137Streptococcus 142, 166– agalactiae 161– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – – zapalenia opon mozgowo-rdzenio-

wych 36– – wstepna identyfikacja 39– – wykrywanie antygenow 155– α-hemolizujacy 21– pneumoniae 21, 160, 161– – a bakteriemia i fungemia 31– – a zapalenie oskrzeli 79– – – opon mozgowo-rdzeniowych 36– – – płuc 80– – lekowrazliwosc 84, 85– – obraz hodowli 83– – wykrywanie antygenow 155– – wstepna identyfikacja 39– pyogenes 21, 122, 142, 160, 166– – hodowla 76– – nosicielstwo 7– – odczyn ASO 152– – przyczyna bakteriemii i fungemii 31– – – zapalenia gardła 74Streptomycyna 125Sulfafurazol 125Sulfametoksazol 125, 169Sulfizoksazol 126– strefy zahamowania wzrostu 132Sulfonamidy 123, 125, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132, 133Surowica(e) 28, 140– do aglutynacji 169

Surowica(e), do aglutynacji w kale 163– Loefflera 77– odpornosciowe do diagnostyki 23Szczepy izolowane z gardła, badanie leko-

wrazliwosci 78– kontrolne, pozyskiwanie 24– – przechowywanie długoterminowe 25– – – krotkoterminowe 26– standardowe do kontroli jakosci 136Szyjka macicy, zapalenie 93

Tabletki 168Talampicylina 125TCBS – patrz Agar z cytrynianem tiosiar-

czanowym, solami zołci i sacharozaTemperatura inkubacji a wielkosc strefy

zahamowania 134Termin ,,oporny’’, definicja 120– ,,wrazliwy’’, definicja 120Test(y) aglutyncji lateksowy ASO, probow-

kowy 153, 154– – – – szkiełkowy 153, 156– – szkiełkowej 155– – – bezposredni 68– CAMP odwrotny 117– czułosc diagnostyczna 16– dyfuzji 120– ELISA 155, 156– FTA-Abs – patrz Odczyn immunofluore-

scencji kretkow w modyfikacji absorp-cyjnej

– β-glukuronidazowy do identyfikacjiE. coli 47

– hemaglutynacji posredniej 66– IFA (indirect fluorescent antibody)

– patrz Odczyn immunofluorescencji– kontrolne dla podłozy 21– laboratoryjne, gwarancja jakosci 13– – kontrola jakosci 13– – ocena jakosci 14– – wiarygodnosc 12– lekowrazliwosci, kontrola jakosci 136– na oksydaze, procedura 60– optyczny immunologiczny 156– probowkowy do wykrywania aglutynin

w brucelozie 152– rozcienczen 120– RPR 141– szkiełkowy do wykrywania aglutynin

w brucelozie 151– szybkie do hodowli płynu mozgowo-

-rdzeniowego 161– – – z gornych drog oddechowych 164– sluzowy, procedura 61– VDRL 141– wrazliwosci na polimiksyne B 66– z nitrocefina 92– z surowicami odpornosciowymi Shigel-

la 71

181

SKOROWIDZ

Test(y), swoistosc diagnostyczna 16– ,,złoty’’ immunologiczny 156Tetracyklina 84, 123, 124, 126, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Tezec 113– a rana penetrujaca 102Tiamfenikol 124Tkanka(i) podskorna, drobnoustroje 101– – zapalenie 113– zakazenie a wrazliwosc antybiotykow

123Tobramycyna 123, 125, 126– strefy zahamowania wzrostu 132Treponema pallidum 96, 141, 142, 148, 165– – badanie bezposrednie 97, 98– – objawy zakazenia 89– – pobieranie probki 96Trichomonas vaginalis a zapalenie cewki

moczowej u mezczyzn 90Trimetoprim 123, 125, 126, 168, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Trypanosoma, poszukiwanie w płynie moz-

gowo-rdzeniowym 37TSB – patrz Bulion tryptozowo-sojowyTTG – patrz Podłoze z tellurynem, tauro-

cholanem i zelatyna

Ugryzienia przez zwierzeta 102Układ moczowo-płciowy, probki do diag-

nostyki chorob przenoszonych drogakontaktow seksualnych 165

– pokarmowy, zakazenie a wrazliwosc an-tybiotykow 123

UREA – patrz Bulion z mocznikiem, lekkobuforowany

Ureaplasma urealyticum a zapalenie cewkimoczowej u mezczyzn 90

Utlenianie dekstrozy bez oleju 21

Vibrio cholerae 20, 162– – biochemiczne reakcje 65– – biotypy, roznice 65– – identyfikacja koncowa 65– – – wstepna 59, 61– – posiew kału 53– – surowice do aglutynacji 164, 170– – wykrywanie antygenow 155– – wywoływane zakazenia 49– fluvialis, biochemiczne reakcje 65– – wywoływane zakazenia 49– furnissii, biochemiczne reakcje 65– hollisae, biochemiczne reakcje 65– – wywoływane zakazenia 49– mimicus, biochemiczne reakcje 65– – wywoływane zakazenia 49– parahaemolyticus, wstepna identyfika-

cja 59– – wywoływane zakazenia 49– spp. 21

Vibrioparahaemolyticus, biochemiczne re-akcje 65

Voges-Proskauer – patrz Czerwien metylo-wa/Voges-Proskauer

Waginoza bakteryjna 93Wankomycyna 126, 168, 169– strefy zahamowania wzrostu 132Wezły chłonne, drobnoustroje 101Wirowka, kontrola jakosci 18Wirus cytomegalii, objawy zakazenia

89– Epsteina-Barr 142– HIV – patrz Wirus nabytego niedoboru

odpornosci– nabytego niedoboru odpornosci, objawy

zakazenia 89– opryszczki 96– – a zapalenie cewki moczowej u mez-

czyzn 90– – objawy zakazenia 89– rozyczki 142– zapalenia watroby typu B, objawy zaka-

zenia 89Woda peptonowa (indol) 21Wrzod miekki 96Wstrzasarki 139Wscieklizna 102Wydzielina(y) ropne 100– – badanie lekowrazliwosci 112– – – mikroskopowe105– – hodowla 107– – identyfikacja drobnoustrojow 108– – ocena makroskopowa 104, 105– z cewki moczowej u mezczyzn, transport

probek 90– – badanie bezposrednie i interpretacja

91– – pobieranie 90– z pochwy, badanie bezposrednie i inter-

pretacja 94– – hodowla 95– – nieprawidłowa, przyczyny 93Wykrywanie antygenow bakteryjnych

155Wymaz z odbytu, pobieranie 52Wymazowki 127Wyrostek robaczkowy, zapalenie 113Wysiek(i), drobnoustroje 101– komorkowy biegunkowego kału, bada-

nie 52– pobieranie probek 104– ropny 100– – probki chirurgiczne 100– spodziewane patogeny 166Wzorzec zmetnienia 127

XLD – patrz Agar ksylozo-lizyno-deok-sycholanowy

182

SKOROWIDZ

Yersinia enterocolitica 20, 21, 162– – biochemiczne reakcje 64– – identyfikacja koncowa 64– – – serologiczna 72– – – wstepna 56, 58– – miano aglutynin 150– – morfologia kolonii 60– wywoływane zakazenia 50, 51

– frederiksenii, biochemiczne reakcje 64– intermedia, biochemiczne reakcje 64– kristensenii, biochemiczne reakcje 64– pseudotuberculosis, biochemiczne reak-

cje 64

Zadrapania przez zwierzeta 102Zakazenia bakteriami beztlenowymi 113,

114– drog oddechowych dolnych 79– – – gornych 73– – – – hodowla i identyfikacja 76– – – – mikroskopia bezposrednia 76– ran szpitalne 102Zapalenie cewki moczowej u kobiet 93– – – u mezczyzn 90– gardła, czynniki bakteryjne 74– – gonokokowe 74– – martwicze, wrzodziejace 74

Zapalenie, jamy otrzewnej 113– narzadow miednicy u kobiet 93, 94– opon mozgowo-rdzeniowych, cechy pły-

nu 38– – – gruzlicze, posiew 38– – przyczyny 36– – typy 38– oskrzeli i płuc 80– – ostre 79– – przewlekłe 79– płuc 80– – pierwotne atypowe 79– – wywołane przez chlamydie 79– pochwy 93– – niespecyficzne – patrz Waginoza– szyjki macicy 93– tkanki podskornej 113– wyrostka robaczkowego 113Zespoł nabytego niedoboru odpornosci,

biegunki 48Zestawy diagnostyczne 168Zgorzel gazowa 113Ziarenkowce Gram-dodatnie 20Ziarniniak pachwiny 96– – pobieranie probki 97

Zelatynaza 21

podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii...

Documents