KKAATTEEDDRRAA MMIIKKRROOBBIIOOLLOOGGIIEE,, VVÝÝŢŢIIVVYY AA DDIIEETTEETTIIKKYY FFAAKKUULLTTAA AAGGRROOBBIIOOLLOOGGIIEE,, PPOOTTRRAAVVIINNOOVVÝÝCCHH AA PPŘŘÍÍRROODDNNÍÍCCHH ZZDDRROOJJŮŮ ČČZZUU VV PPRRAAZZEE

ZZEEMMĚĚDDĚĚLLSSKKÁÁ MMIIKKRROOBBIIOOLLOOGGIIEE ((ssyyllaabbyy ppřřeeddnnááššeekk))

PPRROOFF.. IINNGG.. KKAARREELL VVOOŘŘÍÍŠŠEEKK,, CCSSCC..

PPRRAAHHAA,, ŘŘÍÍJJEENN 22000088

1

Váţení studenti,

s odvoláním na ţádosti studentů rozhodl jsem se vydat sylaby přednášek, které jsou

upraveným materiálem, pouţívaným při zpětné projekci během přednášek předmětu

„Zemědělská mikrobiologie“, „Mikrobiologie I“ a částečně v dalších předmětech KMVD.

Vaše poznámky a náměty k vylepšení této pomůcky budou uvítány (vorisek@af.czu.cz).

Velmi důrazně bych však chtěl upozornit, ţe se nejedná o komplexní oponovaný

studijní materiál, protoţe v řadě případů jsou uvedena jen hesla bez jakéhokoliv komentáře a

vysvětlení (velmi viditelné je to např. v kapitolách I a II). Také chybí celá řada obrázků,

schemat a dalších doprovodných materiálů, na některé je dokonce v textu odkazováno, ale

nejsou jeho součástí – je tím myšleno viz přednášky. Zvládnutí pouze těchto sylabů by proto

zřejmě nemuselo stačit k dobrým výsledkům u zkoušky – předpokládá se, ţe si je studenti

budou doplňovat při přednáškách případně z doporučené literatury.

Věřím však, ţe tato studijní pomůcka Vám studium tak zajímavého a pro lidskou

populaci uţitečného předmětu usnadní.

Praha, červen 2008

Prof. Ing. Karel Voříšek, CSc.

2

I. ÚVOD - PŘEHLED OKRUHŮ:

Obecná mikrobiologie

(historie, bakterie, houby, viry)

Bakteriální buňka

Metabolismus

Výţiva a rozmnoţování

Genetika

Koloběhy biogenních prvků (látek)

N – C – P - S

Mikrobiologie půdy

Mikrobiologie vody

Mikrobiologie krmiv

Mikroorganismy a ţivočichové

Doporučená literatura:

Růţek, Voříšek: Vybrané kapitoly z pedobiologie a mikrobiologie, PowerPrint 2003

Klaban: Svět mikrobů, Gaudeamus, 2001 (1999)

Klaban: Ilustrovaný mikrobiologický slovník. Galen 2005

Leitgeb: Mikrobiologie, MON 1988 (1983)(skriptum)

Marendiak a kol.: Polnohospodarska mikrobiologia, Priroda 1988

Káš: Zemědělská mikrobiologie, SZN 1983

Rozšiřující:

Kaprálek: Fyziologie bakterií, SPN 1986

Rozsypal a kol.: Obecná bakteriologie, SPN 1989

Brady, Weil: The nature and properties of soils, Prentice Hall 1999

Atlas: Principles of microbiology, WCB 1997

Paul, Clark: Soil microbiology and biochemistry, AP 1996

Paul: Soil mikrobiology, ecology and biochemistry, AP 2007

Tománková a kol.: Potravinářská mikrobiologie, PowerPrint 2006

3

I.1 Vymezení pojmů

Mikrobiologie (mikro = drobný, bios = ţivý, logos = věda)

Objekty mikrobiologie:

Priony – specifické bílkoviny, způsobující např. BSE

Viry – podbuněčné organismy

Bakterie – typické prokaryotické organismy

Houby – eukaryotické organismy vláknité či holokarpické

I.2. Základní historické údaje

Fracastorius (1546)

A. van Leeuwenhoek (1632-1723)

1674, 24.4.1676

Objevitel mikroskopu, popsal bakterie

L. Pasteur (1822-1895)

Fermentace, techniky, hnití, nemoci, vakcinace-imunisace

R. Koch (1843-1910)

Izolace bakterií v čisté kultuře, nemoci, 4 postuláty definující příčinný

vztah mezi patogenním mikroorganismem a chorobou

I.3. Zemědělská mikrobiologie, „půdní“ mikrobiologie

Kostyčev, Ivanovskij, Vinogradskij, Popov, Omelianskij, Mečnikov

4

II. MIKROBY V TEORII VZNIKU ŢIVOTA

Samoplození

Biogenese

Monomorfismus x pleomorfismus

Pasteur – odmítnutí samoplození

Ţivý systém = vysoce uspořádaný soubor látek (nukleové kyseliny, bílkoviny, tuky,

glycidy), stabilní, strukturní, výměna látek, růst, rozmnoţování, vývoj

Etapy evoluce (viz schema)

SYSTEMA NATURAE 2000

(kalsifikace)

BIOTA

- „viry“ (zahrnují např. viry, viroidy, priony)

- Bakterie (prokaryotická buňka)

- Archaea (prokaryotická buňka)

- Eucaryota (eukaryotická buňka)

Protozoa

Chromista

Houby

Rostliny

Ţivočichové

5

III. MORFOLOGIE BAKTERIÍ

1. Základní údaje

2. Koky

3. Tyčinky

4. Vláknité bakterie

5. Stavba bakteriální buňky

5.1. Bičík

5.2. Fimbrie (pily), glykokalyx

5.3. Pouzdro, kapsula, slizový obal

5.4. Buněčná stěna

5.5. Cytoplasmová membrána

5.6. Cytoplasma

5.7. Ribosomy

5.8. Nukleoid

5.9. Plasmidy

5.10. Mesozom

5.11. Inkluse

5.12. Spora, sporulace

6. Základy systematiky bakterií

III.1. Základní údaje

Prokaryotická buňka:

úplná samostatnost buňky

nepřítomnost jádra (chybí jaderná membrána, haploidní – 1 chromosom)

nepřítomnost buněčných organel

odlišná stavba ribosomů

příjem ţivin celým povrchem

peptidoglykan v buněčné stěně

anaerobiosa

schopnost vázat N2

velikost v mikrometrech: (0,2) – 0,4-10

velký aktivní povrch k objemu

1 g Escherichia coli = 1012

buněk = povrch 3 m2

Tvar: kulovitý (koky)

válcovitý (tyčinky)

vláknitý (aktinomycety a příbuz.)

(řada přechodných)

6

III.2. Koky

Kulovité, jednotlivě nebo ve shlucích

ø 1 µm 0,8 – 1,2 (3) µm

diplokoky Diplococcus

streptokoky Streptococcus

tetrády Micrococcus

sarcina Sarcina

stafylokoky Staphylococcus

Micrococcus

III.3. Tyčinky

Válcovitý tvar, morfologicky rozmanité

0,2-1,2 x (0,4) 1-10 µm 0,8-1 x 3-5µm

často bičíky, jejich umístění (počet) = důleţitá charakteristika

Sporulující („bacily“)

spóra = odolný klidový útvar

plektridium

klostridium

Rody: Bacillus (aerobní)

Clostridium (anaerobní)

Sporolactobacillus

Nesporulující

- rovné (bakterium) Pseudomonas

Lactobacillus

Escherichia

- vibrio Vibrio

- spirila Spirillum

- spirochéta Leptospira

III.4. Vláknité a příbuzné

„vláknité“ bakterie

buňky v dlouhých řetízkách často s povrchovou vrstvou – sirné b.

aktinomycety

dlouhá větvená jednobuněčná vlákna

ø cca 1 µm, délka i desítky mikrometrů

substrátové a vzdušné mycelium

tvorba konidií (vzdušné mycelium) = nepohlavní rozmnoţovací částice

typické půdní organismy, výroba antibiotik, některé jsou patogenní (alergenní)

Rody: Streptomyces, Nocardia, Actinomyces

7

plejomorfní tyčinky

nepravidelný tvar, často větvené

Rody: Rhizobium (fixace N2)

Mycobacterium (půdní, TBC)

Propionibacterium (sýry, vitaminy)

Eubacterium (trávicí trakt)

III.5. Stavba bakteriální buňky

Vnější struktury – postradatelné

Bičík (Flagellum)

Fimbrie, pily, glykokalyx

Pouzdro, kapsula, slizový obal

Buněčná stěna

Vnitřní struktury – nepostradatelné (většina)

Cytoplasmová membrána

Cytoplasma

Ribosomy

Nukleoid

(Plasmidy)

Mesozom

(Inkluse)

(Spora)

III.5.1. Bičík (Flagellum)

Pouze u některých bakterií

Orgán pohybu

Ukotven v cyt. membráně basálním tělískem

Sloţen z bílk. vláken – flagelin

ø cca 20 nm, délka aţ 15-20 µm

Antigenní vlastnosti („F“)

8

Umístění a mnoţství druhově specifické:

1. MONOTRICHA Vibrio cholerae

jeden bičík na jednom pólu

2. LOFOTRICHA Pseudomonas sp.

svazek bičíků na jednom pólu

3. AMFITRICHA Spirillum volutans

na kaţdém pólu jeden nebo i více bičíků

4. PERITRICHA Escherichia coli, Bacillus sp., Clostridium sp.,Proteus vulgaris

povrch buňky pokryt bičíky

III.5.2. Fimbrie, pily, glykokalyx

Povrchové vláknité struktury

Fimbrie

Aţ 1000, ø 3-10 nm, délka aţ 1 – aţ několik µm

Bílkovinné vlákno

Funkce: uchycení k povrchům

Pily

Podobné fimbriím, 1-10 na buňku

Silnější (9-10 nm)

Bílkovinné vlákno

Funkce: F-pily podmínkou konjugace

Receptor pro uchycení některých virů

Glykokalyx

Polysacharidová vlákna

Funkce: adherence na povrchy

vymezení prostoru pro exoenzymy

III.5.3. Pouzdro (kapsula), slizový obal, S-vrstva

Povrchové ochranné struktury

Pouzdro (kapsula)

Polysacharidy + další komponenty

Výrazně strukturní, vazba na buněč. stěnu

Výrazně zvyšuje odolnost (vnější podmínky, fagocytosa…)

Antigenní vlastnosti = „K“ antigen

9

Slizový obal

Hlavně polysacharidy

„Nestrukturní“, bez vazby na bun. stěnu

S-vrstva

Krystalická protein. vrstva (i archaebakterie)

Ochranná funkce

III.5.4. Buněčná stěna

Přítomna u většiny bakterií (ne Mycoplasma, některé archaebakterie), je ale

postradatelná

Peptidoglykan je typický komponent bakteriální buněčné stěny

N-acetylmuramová kys. + N-acetylglukosamin

(spojené můstky, vytváří „síťovinu“)

Dále D-aminokyseliny – např. DAP

Není u eukaryotů a archaebakterií

Tloušťka velmi variabilní (cca 10 – 80 nm)

Výrazný rozdíl v obsahu mezi G+ a G

- bakteriemi

Funkce:

Ochranná (osmotický tlak, chemické látky, aj.)

Určuje tvar buňky

Antigenní vlastnosti („O antigen“)

Regulace přijmu ţivin

Buněčná stěna G+ bakterií – (obarví se fialově)

Velmi silná, 20 – 80 nm, Ø cca 40 nm)

Relativně jednoduchá stavba, v podstatě jednovrstevná,

z cca 90% peptidoglykan

Často „protkána“ kyselinou teichoovou (rezervoár P)

Rody: Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus,

Streptococcus, Streptomyces

Buněčná stěna G- bakterií – (obarví se červeně)

Tenká, cca 10 nm

Obvykle trojvrstevná:

10

Vnější membrána, „dvojvrstevná“, 7-8 nm; vysoký podíl lipidů: tvořená

fosfolipidy, proteiny, lipopolysacharidy, lipoproteiny, poriny

(průchod ţivin)

Periplasmatický prostor – gel, tloušťka variabilní, významný prostor pro

metabolické reakce

Peptidoglykanová vrstva velmi tenká, cca 1 nm

Rody: Acetobacter, Azotobacter, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium,

Salmonella

III.5.5. Cytoplasmová membrána

Nepostradatelná struktura bakteriální buňky

Hlavní komponent = fosfolipidy tvořené fosfátovou skupinou a mastnými kyselinami -

spojeno glycerolem

Významný podíl proteinů rozloţený v matrixu membrány

Fosfát(-)

je hydrofilní (obvyklá orientace vně buňky)

Mastné kyseliny (NEPOLÁRNÍ)

jsou hydrofóbní

Působí dvojvrstevným dojmem – ale fluidní struktura

Tloušťka: 5-10 nm

Funkce:

Osmotická bariera

Selektivní bariera (semipermeabilita)

Transport ţivin

Metabolismus (respirace; fotosynthesa; synthesa tuků a buněčné stěny)

Přítomnost receptorů

Chemotaxe

III.5.6. Cytoplasma

Vyplňuje vnitřní prostor buňky

Prostor pro vnitřní struktury

Významná v metabolismu buňky

Sloţení (= cytosol): voda, bílkoviny

Protoplast = cytoplasma + cytopl. membrána

11

III.5.7. Ribozomy

Počet: obvykle 10000 (i více), souvisí s úrovní metabolické aktivity buňky

Velikost: 70S (eukaryota 80S)

Rozměry: cca 15 x 20 nm

Stavba: 2 zákl. subjednotky 50S a 30S;

50S = 23S rRNA + 5S rRNA + bílkoviny

30S = 16S rRNA + bílkoviny

Sloţení: cca 60% RNA + 40% bílkoviny

(v ribozomech cca 80% buněčné RNA, zbytek jako mRNA a tRNA)

Funkce: synthesa bílkovin

III.5.8. Nukleoid

Synonyma: chromatin, chromatinové tělísko, aj.

Tvořen dvouvlákennou DNA v kruhu

Jediný chromosom u většiny bakterií, délka aţ 1,4 mm

Bez jaderné membrány

Obsahuje 99 – 100 % buněčné DNA

V oblasti nukleoidu se nachází i bílkoviny a stopy RNA (transkripce)

Funkce: kóduje dědičnost (cca 3500 genů)

III.5.9. Plasmidy

Postradatelná součást buňky, zvyšuje genetickou variabilitu

Tvořeny kruhovou dvouvlákennou DNA (extrachromosomální DNA)

Počet: 0 – cca 100

Samostatný replikon – replikace nezávislá na dělení buňky resp. na replikaci

chromosomální DNA

„Curing“ = ztráta plasmidů při dělení

Typy plasmidů: Kompatibilní x nekompatibilní

F-plasmidy = konjugativní

R-plasmidy = kódují rezistenci (antibiotika, toxiny…)

Temperovaný = dočasná součást chromosomu

Metabolické plasmidy

Plasmidy virulence

Plasmidy – kód pro bakteriociny

12

Funkce - shrnutí:

dodatková genetická informace (obvykle < 30 genů)

významný nástroj genových manipulací

III.5.10 Mesozom

= intracelulární membranoidní struktura

Derivát (vychlípenina) cytopl. membrány

Funkce: nejasná – metabolismus, dělení buňky aţ názor, ţe se jedná o artefakt

III.5.11. Inkluse

Granule = uloţení sloučenin uvnitř buňky, některé s membránou

Např: zásobní materiál (polyhydroxybutyrát)

polyfosfáty (volutin)

metabolity (granule S)

III.5.12. Spora (sporulace)

= odolný klidový útvar vznikající uvnitř (endospóra) některých bakterií, Bacillus,

Clostridium, (Sporolactobacillus, Sporosarcina)

Ţivotné i po 500 letech (i tisíce?)

Umístění: centrální aţ terminální

Neslouţí k rozmnoţování, z 1 buňky 1 spora

Vysoká odolnost: teplo, UV záření, sucho, barviva, chemikálie…

„Ţivotní cyklus“ sporulujících bakterií: vegetativní b., sporulace, spora, klíčení,

vegetativní b.

Sporulace cca 10 hod v 7 fázích

Spora (odlišnosti od vegetativní buňky):

Stavba – více „obalů“: exosporium, plášť spory, kortex (peptidoglykan), stěna

spóry, cytoplasm. membrána

Chemismus – sníţený obsah volné vody, vysoký obsah kys. dipikolinové

Sníţený metabolismus („nulový“)

Nepřijímá ţiviny z vnějšku

Redukce ribozomů

13

III.6. Systematika a identifikace bakterií

Základní taxonomická jednotka - druh

= soubor buněk charakterizovaných stejnými morfologickými, kultivačními,

biochemickými a dalšími vlastnostmi

Podmínka při určování – čistá kultura, získáme nejlépe rozmnoţením 1 buňky

Morfologické vlastnosti:

Tvar buněk, seskupení, barvitelnost dle Grama (G+, G-), velikost (?),

bičíky, tvorba spor…

Tvar, barva a okraj kolonií; charakter růstu v tekutém prostředí

Kultivační (fyziologické) vlastnosti: (obvykle optimum a rozmezí)

Teplota, pH, vztah k O2, tolerance k chemikáliím (např. NaCl, ţlučové soli)

Biochemické (metabolické) vlastnosti:

Zdroje ţivin – C, N….

Enzymy - katalasa, hydrolasy

Metabolity (primární, sekundární).

Energetický metabolismus

Další vlastnosti:

DNA charakteristiky: % G+C v DNA, sloţení DNA (hybridizace, PCR)

Serologické vlastnosti

Systematika:

Obdobná dalším organismům

Druh – Rod – Čeleď – Řád – Oddělení - Říše

niţší jednotky neţ druh: poddruh, morfovar, biovar, patovar, serovar…

Základní název binární (vţdy jen jeden !?)

Lactobacillus plantarum

Escherichia coli

Pseudomonas fluorescens

Enterococcus faecium (pův. Streptococcus faecium)

14

Systémy bakterií

Celá řada přístupů

Fylogenetický systém

„Morfologický systém“ – původně zaloţen hlavně na morfologii, postupně převládly

další charakteristiky

Bergeyś Manual of Systematic Bacteriology, respektuje poznatky

z fylogenese bakterií, podrobný taxonomický popis

Bergeyś Manual of Determinative Bacteriology, „klíč“ pro určování;

zde bakterie rozděleny do 35 skupin – morfologie, Gram, vztah

k O2; např.

5.sk.– fakultat. anaerobní G- tyčinky

19.sk.–rovné nesporulující G+ tyčinky Numerická taxonomie

Zaloţena na sdruţování bakterií podle společných vlastností s vyuţitím

statistických metod, tvorba klastrů a dendrogramů

Taxonomie zaloţená na porovnávání shodnosti vlastností izolované bakterie s ideokmeny

rRNA taxonomie – RNA evolučně nejkonzervativnější součást buňky = „biologické

hodiny“, nejvíce se přibliţuje fylogenetické taxonomii

15

IV. MORFOLOGIE VIRŮ

1. Základní údaje

2. Reprodukce

3. Systematika

IV.1. Základní údaje

Virus – původně označován jako jed, později patogenní mikroorganismus

1892 Ivanovskij objevil virus mozaikové choroby tabáku

Podbuněčný (acelulární) organismus

Intracelulární obligátní parazit téměř bez vlastního enzymového vybavení, plně závislý

na hostitelské buňce

Velikost: 30 – 300 nm (elektronový mikroskop)

Virion: základní jednotka

Stavba:

Centrálně nukleová kyselina – DNA nebo RNA (= genetický kód, dědičnost)

Na obvodu proteinová kapsida sloţená z jednotlivých kapsomér. Prostorové

uspořádání typické – spirálovitý (helikální) a poly-edrální (mnohostěn – 16, 24,

32…)

Virový plášť (pouze u některých) – vnější lipidový obal

IV.2. Reprodukce

Vţdy v hostitelské buňce

Základní fáze:

Přichycení na receptor hostitele

Penetrace = průnik do hostitelské buňky (virion tím zaniká)

Dále dvě moţnosti

Lytický cyklus okamţité vyuţití metabolismu hostitelské buňky a reprodukce

virionů: synthesa nukleových kyselin, synthesa proteinů, kompletace virionů,

lýze buňky

Lyzogenní cyklus – virion se stává na omezenou dobu součástí chromosomu

hostitelské buňky = temperovaný virion: mnoţení buňky, dceřiné buňky

obsahují temperovaný virion, vydělení virionu, dále pokračuje lytický cyklus

16

IV.3. Systematika virů

Zaloţena na morfologických a dalších charakteristikách virionu

Stavba virionu – holý, s pláštěm

Stavba kapsidy

Typ nukleové kyseliny – DNA, RNA

Uspořádání NK – jednovlákenná, dvojvlákenná, přímá, kruhová (DNA)

Hostitelská buňka

Ţivočišná b.

Rostlinná b.

Mikrobní b.: bakteriofág

aktinofág

mykofág

17

V. HOUBY

1. Základní charakteristika

2. Systematika hub

3. Význam hub

(kvasinky a mikromycety)

V.1. Základní charakteristika

Typické eukaryotní organismy – plnohodnotné jádro

Mono-, di- a polykaryotické

Haploidní kromě zygoty

Buněčná stěna často chitin (občas celulosa)

Tvar: holokarpický, myceliární (vlaknitý), častá tvorba rozmnoţovacích orgánů

Vláknité houby: mycelium, stélky, hyfy

Velikost: jednotky aţ stovky mikrometrů

Jedno- a vícebuněčné, bez buněčných přep.

Převáţně aerobní (anaerobní bachorové h.)

Nefotosyntetizující

Heterotrofní

Chemoorganotrofní

Saccharomyces Holo 1 B 1 J

Penicillium Myc VB 1 J

Mucor Myc BP V J

Boletus Myc VB 2 J (1 J)

Rozmnoţování hub

- Vegetativní:

fragmenty mycelia, pučení

- Nepohlavní částice (spory):

oidie, chlamydospóry,

sporangiospóry (Zygomycota),

konidie (Deuteromycota resp. Ascomycota)

- Pohlavní:

pohlavní orgány – antheridium (samčí),

oogonium (samičí);

tvorba pohlavních spor (bez meoisy)

askospory

basidiospory;

18

pohlavní spory vytvoří mycelium;

fúzí pohl. mycelií vzniká dikaryotické mycelium;

následně fúze jader a redukční dělení

V.2. Systematika hub

Podobně jako u bakterií ve vývoji

Znaky: uspořádání buněk, rozmnoţování, tvar rozmnoţovacích částic

Hlavní třídy:

(Oomycetes)

Přeřazeny do Protista, resp. Chromalveolata

Nedělené mycelium, diploidní, zoospóry

Buněčná stěna - celulosa

Saprofytické, parasitické

Rod: Perenospora, Pythium, Phytophtora infestans

Chytridiomycota

Asexuální zoospóry, jednoduchá buňka aţ mycelium

Saprofytické, parasitické

Často ve vodě, na organických zbytcích

Rod: Synchytrium

Zygomycota

Mycelium mnohojaderné bez přepáţek

Rozmnoţování: nepohlavní – sporangiospory

pohlavní – zygospory

Převáţně saprofytní, rozklad jednoduchých glycidů

Některé parazitické

Rod: Mucor, Rhizopus

Ascomycota

Velmi rozsáhlá skupina

Mycelium jednak vláknité bohatě větvené, mnohobuněčné, jednak

holokarpické

Pohlavní askospory vznikají v asku (vřecku); sdruţeny do plodniček.

Kleistothecium – Perithecium - Apothecium

Saprofytické, parasitické

Rod: Saccharomyces (dříve Endomycetes), Chaetomium,

Xylaria, Erysiphe (parazitická)

(Deuteromycota) – umělá skupina

Synonyma: Fungi imperfecti, houby nedokonalé

Nyní hlavně Ascomycota (Basidiomycota)

19

Houby s „neznámým“ pohlavním rozmnoţováním

Typická tvorba nepohlavních rozmnoţovacích částic – konidie; konidiofor, fialida

Většina saprofytických, půdních; spory rovněţ ve vzduchu

Rod: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma, Alternaria

Basidiomycota

„Houby vyšší“, relativně sloţitý ţivotní cyklus:

- Produkce haploidních basidiosor (obvykle 4) na basidiu

- Spóry jednojaderné haploidní mycelium

- Fúze dvou mycelií dikaryotické mycelium, jeho růst

- Fúze jader (=zygota), meiosa, další dělení

- Vznik basidie a basidiospor

Rod: Agaricus, Boletus, Amanita

Význam hub

Půda = hlavní rezervoár

Mineralizace

Humifikace

Půdotvorné procesy

Detoxikace xenobiotik

Koloběhy biogenních prvků

Voda a vzduch

Většinou nepříznivé pro jejich růst

Zdroj šíření a kontaminace (spory)

Krmiva, potraviny (často neţádoucí)

Zhoršení organoleptických vlastností

Rozklad ţivin

Produkce metabolitů

Produkce mykotoxinů

Kancerogenní účinky

Součást „kulturní“ mikroflóry

Původci chorob – mykózy

Průmyslové vyuţití

Alkoholy

Organické kyseliny

Enzymy

Antibiotika

Detoxikace

Potravinářství

20

VI. PRVKOVÉ A LÁTKOVÉ SLOŢENÍ

1. Prvkové sloţení

2. Látkové sloţení

2.1. Voda

2.2. Sušina

2.2.1. N-látky

2.2.2. Polysacharidy

2.2.3. Tuky

2.2.4. Vitaminy

2.2.5. Enzymy

VI. 1. Prvkové sloţení (v sušině)

V mikrobních buňkách obdobné prvky s jinými organismy

průměr

C 40-63% 50

N 2-15% 8

H 7-8% 8

O 20-44% 30

Celkem C+N+H+O = 96%

P 3-5% 3

S 1% 1

Celkem P+S = 3,5%

Celkem C+N+H+O+P+S = 99,5%

K,Mg,Ca,Na… 0,4%

Celkem = 99,9%

Fe,Cu,Mn, Co, F, J.. 0,1%

Kaprálek uvádí:

C N H O P S

50 15 8 20 3 1 = 97%

21

VI.2. Látkové sloţení

Voda – sušina

VI.2.1. Voda

Obsah 73 – 90% ø 80%

Voda vázaná = důleţitá součást struktury buňky,

odebrání = poškození aţ zánik, cca 20%

Voda volná = voda postradatelná, moţno šetrně odstranit (lyofilizace), cca 60%

VI.2.2 Sušina

10 – 27 %

Dusíkaté látky

Velmi variabilní – s jednoduchostí stavby zastoupení roste

Obsah v sušině:

Viry 81 – 100%

Bakterie 50 – 94%

Kvasinky 31 – 63%

Plísně, Mikromycety 14 – 44%

N- látky - významná sloţka:

Bílkoviny (aminokyseliny) – stavební a metabolická funkce

DNA – genetický kód

RNA – syntesa bílkovin

Escherichia coli:

Bílkoviny 60%

DNA 3%

RNA 16%

Polysacharidy 3%

Lipidy 15%

Celkem 97%

Ostatní 3%

Celkem 100%

22

VI.2.3. Enzymy

= biokatalysátory

Sniţují aktivační energii

Pracují za normálního tlaku

V reakci se nespotřebovávají

E + S E-S E-P E + P

Velmi účinné (1 molekula E za 1sec. zpracuje aţ 50000 molekul substrátu)

Specifické

Bílkovina jednoduchá

sloţitá (bílk. + nebílk. část = kofaktor)

Holoenzym = koenzym + apoenzym

Koenzym = snadno oddělitelný kofaktor

Mikroorganismy (bakterie, houby) = hlavní zdroj průmyslových enzymů

Rozdělení enzymů

Podle místa působení

Exoenzymy – vylučovány vně buňky

Endoenzymy – působí uvnitř buňky

Podle přítomnosti v buňce

Konstitutivní – přítomny trvale

Adaptivní – indukovány substrátem

Třídy enzymů (6) - podle typu reakce

Oxidoreduktasy – oxidačně redukční reakce

A-H + B A + B-H (+E)

Ethanol + NAD Acetaldehyd + NADH

Př.: dehydrogenasy, oxygenasy, katalasa

Transferasy – přenos skupin -NH2, -CH3…

A-NH2 + B A + B-NH2

Př.: aminotransferasy (transaminasy), hexosokinasy

Hydrolasy – hydrolytické štěpení molekul

(zvláště glykosidická v., peptidická v.,…)

X-Y + H2O X-H + Y-OH

Glukosa 6-P + H2O Glukosa + MAP

Př.: proteasy, glykosidasy, lipasy

23

Lyasy – nehydrolytické štěpení vazeb (C-C, C-O, C-N…)

Často odštěpují (vnášejí) malé molekuly: H2O, CO2, NH3…

Př.: dekarboxylasy, deaminasy…

Isomerasy – vnitromolekulové přesuny = přeměny isomerů

Přeměna L-forem na D-formy (i opačně)

Ligasy – vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu

energeticky bohatých sloučenin (např. ATP)

Př.: syntetasy, polynukleotidsyntetasa (= DNA ligasa)….

24

VII. VÝŢIVA MIKROORGANISMŮ

1. Ţiviny

2. Transport ţivin

3. Způsoby výţivy a zisku energie

VII.1. Ţiviny

Funkce ţivin:

zdroj stavebních látek

zdroj energie (chemotrofové)

(ţiviny musí vstoupit do buňky)

Vyhraněné poţadavky C – N – P – S – O – H , přijímány jako součást

sloučenin nebo jako ionty

makromolekuly tráveny vně buňky

Uhlík

Základ všech organických sloučenin

Cca 50% ze sušiny buňky

- Organický

Lépe vyuţívány: -CH2OH, =CHOH, =COH (sacharidy, alkoholy…), zvláště

mono- a disacharidy, polysacharidy jen některé mikroorganismy

Hůře vyuţit redukovaný: -CH3, =CH2

Vůbec ne –COOH

Značná variabilita – významné v identifikaci bakterií

- Anorganický – CO2, = autotrofní

Pro asimilaci nutné značné mnoţství energie

Dusík

Nezbytný: aminokyseliny, bílkoviny, nukleové kyseliny…..

- Organický

nejvhodnější aminokyseliny (bílkoviny po hydrolyse) – přímo pro

synthesy či jako donor –NH2

- Anorganický

NH4+: často preferovaný iont

snadný průnik do buňky

synthesa aminokyselin

NO3-: méně frekventovaný zdroj N (nutná redukce)

v anaerobních podmínkách zdroj kyslíku

25

N2: omezeně vyuţitelný zdroj N

typické u diazotrofů

nitrogenasa

nutná redukce: N2

HN=NH

H2N-NH2

2 NH3

2 NH4+

následuje synthesa aminokyselin: (kys. glutamová či asparagová)

značná spotřeba energie

Rody: Clostridium, Azotobacter, Rhizobium

Fosfor

Nezbytný pro výstavbu sloučenin (nukleotidy, fosfolipidy, DNA, RNA),

energetiku (ATP)…

- minerální – tyto formy preferovány

H2PO4- > HPO4

2- > PO4

3-

- organický – před vyuţitím obvykle mineralizace (fosfatasy)

Síra

Nezbytná součást některých aminokyselin (cystin, cystein, metionin), vitaminů,

hormonů

- minerální – často preferovaná forma SO42-

- organická forma – (obvykle -S-S-, -SH) aminokyseliny (cystin, cystein,

metionin)

Ostatní biogenní prvky

Převáţně jako ionty K+, Na

+, Ca

2+, Cl

-, I

-……

26

VII.2. Transport ţivin

Průchod buněčnou stěnou a cytoplasmovou membránou

Pasivní transport (difuse)

Pohyb ve směru koncentračního spádu

Rychlost = koncentrační gradient + permeabilita membrány

Energeticky nenáročný

Malé molekuly voda, některé ionty

Zprostředkovaná difuse

Pohyb ve směru koncentračního spádu

Podstatně rychlejší

Zabezpečena specifickými proteiny (permeasy):

uchycení – přenos - uvolnění

Energeticky nenáročná

Silně rozvinuta u eukaryotů

Prokaryota - glycerol

Aktivní transport

Pohyb proti koncentračnímu spádu

Nutný přísun energie (ATP, gradient iontů)

Zabezpečen specifickými proteiny (permeasami):

uchycení – přenos – uvolnění

Např.: sacharidy, aminokyseliny…

Translokace skupin

Fosfoenolpyruvát/fosfotransferásový systém (PEP/PTS systém)

Typický pro eukaryota

Spojen s přeměnou přenášeného substrátu

Př.: přenos glycidů

glukosa (vně) glukosa-6P (uvnitř)

VII.3 Způsoby výţivy a zisku energie

C - Autotrofní

Zdroj uhlíku = CO2

Nezávislé na organické hmotě

Komplexní enzymový aparát

Vývojově starší

27

- Heterotrofní

Vyţadují organicky vázaný C

Vyţadují (často) růst. faktory

Mezerovitý enzymový aparát

Saprofyté – parazité – (symbiosa) – mutualismus

- Mixotrofní

Kombinované vyuţití CO2 a organického uhlíku

Donor H+ (e

-)

Litotrofní – donor anorganická l.

Organotrofní – donor organická l.

Zdroj energie

Fototrofní - záření, slunce

Chemotrofní – energie chemických vazeb

Příklady:

Fotolitotrofní E – světlo Cyanobakterie

autotrofové H+/e

- - anorg Purpurové b.

C – CO2

Fotoorganotrofní E – světlo Purpurové nesirné b.

heterotrofové H+/e

- - org Zelené nesirné b.

C – org (CO2)

Chemolitotrofní E – anorg Nitrifikační

autotrofové H+/e

- - anorg S-oxidující

C – CO2 Ţelezité

Vodíkové

Chemoorganotrofní E – org Houby

heterotrofové H+/e

- - org Mléčné b.

C – org Amonifikační

Celulolytické

aj.

28

VIII. METABOLISMUS CHEMOTROFŮ

1. Dvě stránky metabolismu

2. ATP, NAD, NADP

3. Katabolický = energetický metabolismus

3.1. Fermentace

3.2. Respirace

3.3. Katabolismus dalších látek

3.4. Vztah ke O2

4. Anabolický metabolismus = biosynthesy

5. Regulace metabolismu

VIII.1. Dvě stránky metabolismu

Vzájemně neoddělitelné + prolínající se

1) KATABOLISMUS

Převaha rozkladných procesů

Produkce meziproduktů (= ţiviny)

Hlavní varianty: fermentace, respirace

!! Zisk energie pro zabezpečení funkcí:

Biosynthesy

Pohyb

Příjem ţivin

Teplo

Bioluminiscence

Elektrický potenciál

Entalpie = energie uvolněná v reakci

Volná entalpie – energie vyuţitelná

Entropie – energie „ztrátová“

2) ANABOLISMUS = BIOSYNTHESY

Spotřeba energie + přijatých ţivin + meziproduktů z katabolismu

Výstup = synthesa látek

Náhrada opotřebovaných látek

Růst buněk

Rozmnoţování buněk

29

Významnou spojkou obou stránek metabolismu jsou přeměny ATP

Katabolismus

ADP + Panorg +E ATP

Anabolismus

Reakce: exergonické – samovolný průběh

endergonické – energii dodávat

VIII.2. ATP, NADP, NAD

ATP =Adenosintrifosfát – universální přenašeč energie

E - uloţena v energeticky bohatých vazbách

Adenosin ribosa P P P

1) 2) 2)

1) esterová vazba

2) anhydridová vazba (energet. bohatá)

ADP + Panorg +E ATP

2 hlavní varianty vzniku ATP

substrátová fosforylace (např. glykolysa)

oxidativní fosforylace (redukce NADH2)

Další př. energeticky bohatých sloučenin:

acetyl-KoA, cytosinfosfát…

NAD, NADP = nikotinamidadenindinukleotid (fosfát)

universální přenašeč H mezi redox systémy

AH2 + NAD+ A + NADH + H

+

B + NADH + H+ BH2 + NAD

+ + E

O2 často H2O

30

VIII.3. Katabolický metabolismus

Př.: Chemoorganotrofové

(viz koloběh uhlíku)

Sloţitá C - látka (celulosa)

hydrolysa

glukosa

glykol ysa, E - D, H - P

pyruvát

fermentace respirace

ethanolová úplná aerobní

mléčná neúplná aerobní

máselná anaerobní

propionová anorg. látek

acetonbuthanolová

31

GLYKOLYSA

etapy

glukosa

ATP ADP

glukosa 6-P

fruktosa 6-P fosforylace

ATP ADP

fruktosa 1,6-diP

glyceraldehyd 3-P vznik 2 trios

fosfodihydroxyaceton

4ADP 4ATP

pyruvát vznik pyruvátu

a energie

Energetický zisk („čistý“) glykolysy = 2 ATP

32

ENTNER-DOUDOROFFOVA DRÁHA

glukosa

ATP ADP

glu kosa 6 - P

fosfoglukonová kyselina

fosfoglyceraldehyd + pyruvát

2ADP 2ATP

pyruvát

HEXOSO(PENTOSO)FOSFÁTOVÁ DRÁHA

glukosa

ATP ADP

glukosa 6 - P

fosfoglukonová kyselina

CO 2

pentosofosfát

fosfoglyceraldehyd + ethanol

2ADP 2ATP

pyruvát

C 6 C 5 + C 1 (CO 2 )

C 5 C 3 (pyruvát) + C 2 (ethanol)

C 6 C 3 + C 2 + C 1

33

VIII.3.1. Fermentace

Donor i akceptor H+/e: organická látka

Typická pro anaerobní podmínky

Název podle koncových produktů

- ethanolová - ethanol + CO2

- mléčná – kyselina mléčná (+ případně další kyseliny+alkohol+CO2)

- máselná – kyselina máselná + další kys. + alkoholy + CO2

- propionová – kyselina propionová + CO2

- acetonbuthanolová – aceton + buthanol + další

VIII.3.2. Respirace

Donor H+/e organická i anorganická látka

Akceptor H+/e anorganická látka (často O2)

- Úplná aerobní respirace (akceptor O2)

Součástí Krebsův cyklus a dýchací řetězec

Energeticky nejvydatnější – aţ 38 ATP

Př.: octové a citronové kvašení (podle Pasteura nepravá kvašení)

pyruvát

CO 2 , NADH+H + dekarboxylace

acetylkoenzym A + oxaloctová

vstup do Krebsova cyklu

kyselina citronová

kys elina oxaloctová + 2CO 2 + 3(NADH+H + )+….

dýchací řetězec

cytochromoxidasový

nepřímý O 2

H 2 O

C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O +38ATP

- neuplná aerobní respirace

akceptor O 2

org. C - látka + O 2 jednodušší org.C - látka + H 2 O + (CO 2 ) + E

34

- anaerobní respirace

akceptorem O ze sloučenin

NO3- + H

+ NO2

- + H2O + E

denitrifikace

NO3- + H

+ N2 + H2O + E

desulfurikace

SO42-

+ H+ S

2- + H2O + E

- Respirace anorganických látek

(často spojována s anaerobní respirací)

akceptorem H+/e

- anorganická látka (ne kyslík)

Fe3+

Fe2+

S0 + H2 H2S

H2 + CO2 CH4 + H2O

H+ + NO3

- NH4

+ + H2O

VIII.3.3. Katabolismus dalších látek

- lipidy

zdroj energie podobně jako sacharidy

Hydrolysa – vznik glycerolu a mastných kyselin

Glycerol fosforylován glykolysa

Mastné k. – β oxidace , acetyl-KoA, Krebsův cyklus

- bílkoviny

Hydrolysa – proteasy (polypeptidy aţ aminokyseliny) – zuţitkování v anabolismu

Deaminace (transaminace)

C-skelet pyruvát, acetyl-KoA a dále fermentace či respirace

35

VIII.3.4. Vztah ke kyslíku

Významný znak při identifikaci

Aerob

Vyţaduje přítomnost O2 jako akceptoru H+/e

-

Energetická dráha = aerobní respirace

Př.: Bacillus, Penicillium

Obligátní anaerob

O2 nevyţaduje či „toxický“

Energetická dráha = fermentace, anaerobní respirace

Př.: Clostridium, Bacteroides, Paracoccus, Desulfovibrio

Fakultativní anaerob

Můţe ţít jak v přítomnosti tak v nepřítomnosti O2

2 varianty:

1) nemění metabolismus, energetická dráha = fermentace

např.: mléčné bakterie

2) mění metabolismus; +O2 aerobní respirace, - O2 fermentace

Př.: Saccharomyces

Mikroaerofilní

Vyţadují niţší parciální tlak O2 neţ v atmosféře

36

VIII.4. Anabolismus

Přijaté ţiviny, meziprodukty katabolismu + energie zuţitkovány pro synthesu:

1) náhrada opotřebovaných

2) nové látky pro rozmnoţování a růst

Asimilace N2 = postupná redukce (synthesa aminokyselin)

N2 aţ na 2NH4+ (viz kap. VII.1. - ţiviny

Synthesa aminokyselin

o aminace (vyuţití NH4+) ketokyselin

frekventované AK: glutamová, asparagová

o transaminace; AK v nadbytku donorem -NH2

ketokyselina akceptorem

Synthesa bílkovin

Místem synthesy ribosomy = translace

Účast m-RNA, t-RNA, r-RNA

Fáze: iniciace – elongace - terminace

anorg. molekuly CO 2 ,NH 3 ,H 2 O,PO 4 3 -

…

monomery nukleotidy,AK,cukry…

makromolekuly NK,proteiny,polysacharidy

supramolekulární membrány….

útvary

buněčné struktury nukleoid,ribosomy,bičíky

buňka

37

Asimilace CO2

Kalvinův cyklus, zpětná glykolysa

Energeticky velmi náročné

Synthesa glycidů

zpětná glykolysa, dodat energii (ATP)

Synthesa DNA, RNA

Předchází synthesa nukleotidů

Synthesa DNA = replikace, vlákno DNA matricí

Synthesa RNA = transkripce, matricí úsek vlákna DNA

VIII.5. Regulace metabolismu

Zaloţena především na regulaci enzymů

Koncentrace substrátu

Výrazný vliv nízkých koncentrací

Rovnice Michaelis-Mentenové

kde Ks je koncentrace s pro 0,5 vmax

Kompetitivní inhibice

Inhibitor „soutěţí“ se substrátem o aktivní místo enzymu

Vliv vnějších fyzikálně-chemických faktorů

Nejrychlejší reakce při optimální úrovni: pH, teplota….

Extrémní hodnoty vedou např. k denaturaci

Mnoţství enzymů

Regulováno především úrovní ribosomální synthesy

Kompartmentace

Distribuce enzymů, substrátu a metabolitů v buňce – vazba na určité bun.

struktury

Allosterická regulace

Inhibice či stimulace na základě ovlivnění prostorového uspořádání enzymu

Efektor se váţe na regulační část enzymu a tím mění konformaci místa

určeného pro substrát

s

V = v max

K s + s

38

Zpětná vazba (feedback efekt) = inhibice enzymové reakce konečným

produktem

E1 E2 E3 E4 E5 P

S M1 M2 M3 M4

Pasteurův efekt

O2 regulace metabolismu u některých fakultativních anaerobů

(Saccharomyces)

+O2 aerobní respirace

-O2 fermentace

Kyslíkový efekt

O2 reguluje metabolismus u některých anaerobů

+O2 blokuje metabolismus či dokonce toxický

Vliv kvality substrátu

Uplatnění konstitutivních či adaptivních enzymů

Sigma faktor

Iniciace synthesy (transkripce) m-RNA jako matrice pro synthesu enzymu v

ribosomech

39

IX. RŮST A MNOŢENÍ BAKTERIÍ

1. Ţivotní cyklus

2. Růst buňky

3. Mnoţení v populaci

3.1. Vsádková kultivace

3.2. Kontinuální kultivace

3.3. Další varianty

4. Kultivace smíšených kultur

XI.1. Ţivotní cyklus

= uspořádaná sekvence jednotlivých biochemických a morfologických událostí od

vzniku buňky do jejího rozdělení

A B C D E F

A E F

Doba mezi dvěma děleními buňky = generační doba

Hlavní součásti:

Synthesa buněčného materiálu

Replikace DNA

Vlastní rozdělení buňky

Doba pro replikaci nemusí být totoţná s generační dobou

IX.2. Růst buňky

- růst individuální buňky, tj- nárůst objemu, zvětšování velikosti, tím, ţe stavební

látky se ukládají v „růstových zónách“

- růst bakteriální populace („růstová křivka bakterií“) = nárůst počtu buněk

v mnoţící se populaci;charakterizována dobou zdvojení („T“) populace

IX.3.1. Vsádková kultivace

= statická kultivace = batch culture

Do mnoţící se populace se nezasahuje, prostředí je modifikováno pouze přítomnými

buňkami; uzavřený systém

Grafické vyjádření – semilogaritmicky (osa y = log počtu buněk, osa x = čas)

40

Hlavní fáze:

(1) Lag fáze

Buňky se přizpůsobují – synthesa enzymů

Buňky se nemnoţí (moţný pokles počtu) – synthesa nových komponentů

Délka – stáří buněk, sloţení prostředí, vnější faktory

(2) Fáze fyziologického mládí

Adaptace dokončena, začíná dělení

Kultura velmi citlivá na vnější vlivy

(3) Exponenciální (logaritmická) fáze

Intenzivní mnoţení – nejkratší doba zdvojení

Buňky nedorůstají maximální velikosti

Rychlost růstu konstantní („přímka“)

Intenzivní spotřeba ţivin

Maximální produkce primárních metabolitů (CO2, kyseliny, alkoholy...)

(4) Stacionární fáze

Počet ţivých buněk je konstantní

Počet umírajících = počtu vzniklých

Důvod: dosaţení „M“ koncentrace

spotřebovány ţiviny

nahromadění metabolitů

Doba zdvojení = 0

Intenzivní produkce sekundárních metabolitů

(5) Fáze odumírání

Počet buněk se sniţuje (logaritmicky)

Doba zdvojení < 0 (záporná)

Matematické charakteristiky

Délka lagu

Generační doba

Doba zdvojení (T)

Počet buněk (N)

Počet dělení (generací) 0 1 2 4 n

Počet buněk 1 2 4 8 2n

Obecná rovnice (pro exponen. fázi):

Nt = N0 * 2n kde Nt je počet buněk v čase t

N0 je počet buněk v čase t0

41

n = t/T n je počet generací

T je doba zdvojení

N = N0 * 2t/T

(důleţitá rovnice pro výpočet T)

Specifická růstová rychlost (μ)

= přírůstek počtu buněk (biomasy…) za časovou jednotku vztaţený k počátečnímu

mnoţství buněk (biomasy…)

μ = (dN/dt)/N0

μ = μMAX*S/(Ks + S)

Ks je saturační konstanta ţiviny S

Růstový výtěţek (Y)

= mnoţství biomasy na mnoţství spotřebované ţiviny (S)

Y = dN/dS

příklady vyuţití: etanol, antibiotika, jogurt….

IX.3.2. Kontinuální kultivace

Otevřený systém – regulace vybraných parametrů z vnějšku:

Mnoţství ţivin

Mnoţství metabolitů

Mnoţství buněk

Buňky udrţujeme v logaritmické fázi

Dva hlavní systémy

Chemostat

Regulace – chemické parametry

Sterilní medium je doplňováno a kultivační medium s buňkami odstraňováno

(konstantní rychlost)

Rychlost výměny určována spotřebou limitující ţiviny a dobou zdvojení

Turbidostat

Regulace – udrţení stanoveného počtu buněk v populaci

Rychlost doplňování je variabilní

Ţiviny obvykle v nadbytku

42

Výhody kontinuální kultivace: vyšší vyuţití biofermentoru

Nevýhody: horší vyuţití ţivin

Příklady: kyselina octová, čištění odpadních vod, trávicí trakt

IX.3.3. Další varianty kultivace

Submersní - růst v celém profilu prostředí

Povrchová – růst na povrchu substrátu

Diauxie (polyauxie) – sloţená růstová křivka, dáno postupným vyuţíváním ţivin

Synchronizovaná – většina buněk ve stejné části ţivotního cyklu (např. po

chladovém šoku = zabránění dělení, ale růst neomezen)

Homogenní – charakteristika ve všech částech fermentoru shodná

Heterogenní – koncentrace ţivin + buněk + metabolitů ve fermentoru rozdílná

Kultivace s imobilizovanými buňkami (enzymy) – buňky uchyceny na nosiči

(nejsou v mediu)

IX.4. Kultivace smíšených kultur

(dříve uvedená pravidla platí pro monokulturu) – ve směsných podstatně sloţitější

Symbiosa – vzájemný vztah 2 organismů:

mutualismus – pro oba výhodné

komensalismus – výhodné pro jednoho partnera, druhý není ovlivněn

parasitismus – jeden z partnerů zvýhodněn, druhý poškozován

antagonismus (amensalismus) – jeden z partnerů poškozován, druhý neovlivněn

kompetice – oba partneři poškozováni; např. soutěţení o ţiviny a prostor;

(competitive exclusion)

syntrofismus – vzájemná „spolupráce“ při produkci růstových faktorů, výměně

ţivin apod.

predace – jeden organismus slouţí jako „kořist“ druhému

Interakce:

organismus A B

mutualismus + +

syntrofismus + +

komensalismus + 0

parasitismus + -

antagonismus - 0

kompetice - -

43

X. PROMĚNLIVOST BAKTERIÍ

1. Fenotypové změny

2. Genotypové změny

3. Přenos genů

3.1. Konjugace

3.2. Transdukce

3.3. Transformace

3.4. Extrachromosomální přenos

4. Restrinkce, oprava DNA

5. Genové manipulace

Historicky – názor o úplné plejomorfii

Později monomorfismus

Relativně velká proměnlivost bakterií:

- reakce na vnější podmínky

- rychlost mnoţení

- haploidní chromosom

Obecné genetické zákony platí i pro bakterie

Nyní bakterie významný objekt genetiky

Geny: chromosomální X extrachromozomální (hlavně plasmidové)

Změny - zasahující genotyp – jsou dědičné (změna v DNA)

- zasahující fenotyp (= umoţnění fenotypové realizace vlastnosti)

X.1. Fenotypové změny

Mají dočasný ráz

Reakce na vnější podmínky

Zasahují celý soubor (většinu buněk), např.:

adaptivní enzymy – indukce enzymu substrátem

velikost buňky

přítomnost bičíků

disociace kolonií

změny morfologie kolonií spojené i se změnami některých vlastností

44

S – hlenovité – toxičtější, odolnější

R – drsné - (méně virulentní i niţší toxicita (u streptokoků 6 fází)

X.2. Genotypové změny – mutace

Změny v uspořádání nukleotidů v DNA

Delece – zařazení - přesmyk… 1 či více párů

Mutace: spontánní X indukované

Mutageny zvyšují frekvenci mutací – chemomutageny (bromouracil…), radiační mutace

(UV a γ záření)

Projev mutací vzhledem k haploiditě bakterií okamţitý (není recesivita)

Letální mutace znamenají okamţitou smrt buňky

Mutace:

- jsou dědičné (při replikaci informace přechází do dceřiných buněk)

- jsou diskontinuální (nárazovité)

- jsou řídké, zasahují malý počet jedinců, pravděpodobnost 1:106-10

9

- jsou specifické – zasahují určitý determinovaný znak

- jsou nezávislé

- mohou být spontánní (není známa příčina)

X.3. Přenos genů

U vyšších organismů – sexuální procesy (zygota nositelem vlastností obou rodičů

U bakterií sexuální procesy nejsou

Alternativou „parasexuální“ procesy

Pro většinu hub jsou sexuální procesy důleţitou součástí ţivotního cyklu

X.3.1. Konjugace

= předání informace z donora akceptorovi

Podmínky: rozdílnost buněk (přítomnost F plasmidu), sex-pily

Etapy:

(1) sex-pily vytvoří kanálek

(2) F plasmid se „otevře“ (DNA není jiţ kruhovitá)

(3) jedno vlákno koncem 5´vstupuje do akceptora (můţe být přerušeno)

(4) replikace – vznik 2. vlákna

45

Hfr konjugace: Plasmid je součástí chromosomu a při přestupu můţe přenést i část

chromosomální informace

X.3.2. Transdukce

Přenos genetické informace zabezpečen vektorem

V přírodních podmínkách hlavní vektor virus, který „omylem“ během své

replikace přijal DNA hostitele

Další vektory: plasmidy, kosmidy (umělé), aj.

Přenášena jen malá část DNA

Pravděpodobnost: 1:106-10

8

Tři typy příjmu:

- rekombinantní = fragment DNA se váţe na chromosom

- abortivní – DNA nevstupuje do chromosomu

- plasmidový

X.3.3. Transformace

= buňka recipienta přijímá volnou DNA z vnějšího prostředí a zabudovává ji do

chromosomu

Pravděpodobnost menší – DNA relativně velká a můţe být v buňce rozloţena

endonukleasami

Vstup moţný pro malý fragment (2000-5000 nukleotidových párů)

X.3.4. Extrachromosomální přenos genů

= přenos zabezpečený plasmidy zvláště R

Plasmid = dodatečná genetická informace

Autoreplikační jednotka nezávislá na replikaci chromosomální DNA

Výrazné zvýšení genetické variability

Při dělení buňky variabilita přechodu plasmidů do dceřinných buněk;

moţná i ztráta (curing)

X.4. Oprava DNA, restrinkce

= schopnost buňky opravit změněnou (poškozenou) DNA = podpora homeostase

poškozený nukleotid (např. guanin metylací, či thymin zdvojením) je

rozpoznán a změna je enzymaticky odstraněna

bakterie mají regulační systém pro opravy = SOS regulon

46

X.5. Genové manipulace

= řízená a cílená změna genomu

Převáţně zaloţeno na transdukci

Fáze genových manipulací:

Získání genu

(1) rozštěpení genomu donora restrinkčními endonukleasami (restrinktasami)

(2) prostřednictvím mRNA – slouţí jako matrice pro synthesu DNA reversní

transkriptasou

(3) synthesa genu podle jeho mapy (DNA synthetiser)

(4) nákup genu

výběr vhodného vektoru

nejčastěji R plasmid, nutná přítomnost vhodných markerů (resistence na

antibiotika), mapa plasmidu (znalost míst, kde je DNA plasmidu „otevřena“

restrinktasami

konstrukce rekombinantního plasmidu

otevření plasmidu restrinktasou

vloţení genu ligasou

výsledek: směs rekombinantních a původních plasmidů

konstrukce rekombinantní buňky

plasmidy vstupují do buněk akceptora

výsledek: směs 3 typů buněk (původní + s nezměněným plasmidem +

s rekombinantním plastidem)

výběr rekombinantní buňky

zaloţen na vyuţití markerů

klonování rekombinantní buňky

namnoţení se sledováním stability nové vlastnosti

vytvoření podmínek pro expresi genu

optimalizace prostředí a vnějších podmínek pro fenotypové uplatnění genu

47

XI. VLIV VNĚJŠÍCH FAKTORŮ

1. Úvod

2. Fyzikální faktory

3. Chemické faktory

XI.1. Úvod

Rozvoj mikroorganismů

Rozhodující úroveň: minimum – optimum – maximum

Omezení mikroorganismů

- cidní (fungicidní, baktericidní) = usmrcení (např. koagulací bílkovin)

- statický (bakteriostatický) = reverzibilní zabránění rozmnoţování =

blokace synthesy bílkovin

- lytický (bakteriolytický) = rozpad buňky

XI.2. Fyzikální faktory

Teplota

- psychrofilové – růst při 0°C,

optimum cca 15°C

nad 20 (25)°C nerostou

- mesofilové - obvykle ne pod 10°C

optimum 20 - 40°C

(typické teploty 25, 30, 37°C)

- termofilové optimum 45 - 70°C

- hypertermofilové růst při 70 - 90°C (1.sk.)

80 - 90°C (2.sk.)

(výjimečně i výše)

Vysoká teplota má často mikrobicidní vliv (vyuţito pro sterilaci), niţší teplota spíše

vliv mikrobistatický (vyuţito při skladování potravin)

pH

- alkalofilové – optimum při pH > 8

- neutrofilové – optimum při pH 6-7 (8) (většina mikroorganismů)

- acidofilové – optimum při pH < 6 (5) (např. thiobacily i pod 1)

48

- acidorezistentní – optimum kolem pH 7,0 - ale přeţívají i v kyselé oblasti

(plísně např. i pod 3,5)

Voda (vodní aktivita)

Voda - nezbytná jako stavební součást a pro příjem ţivin

Vodní aktivita – aw - (dostupnost vody) – rozhoduje o tom, zda

prostředí bude kolonizováno;

Rozsah 0 – 1, běţná media 0,95; pod 0,6 mikroorganismy nerostou

Osmotický tlak

Souvisí s koncentrací iontů: izotonické – hypotonické – hypertonické prostředí

Hydrostatický tlak

Mikroorganismy relativně necitlivé

Záření (ionizující a UV)

Ovlivňuje (poškozuje) DNA, zpočátku mutagenní charakter později mikrobicidní

Ionizující – tvorba volných radikálů

UV – tvorba dimérů thyminu

Oxidačně redukční potenciál – „EH“

Měří se v mV

Aerobové vyţadují +

Anaerobové vyţadují – (obvykle < -40 mV, častěji -200 mV aţ -400 mV

– methanogenní)

XI.3. Chemické faktory

Chemické látky prostředí - slouţí jako ţiviny

- negativní vliv

MIC = minimální inhibiční koncentrace (objektivní měřítko účinnosti)

Stanovení inhibiční zóny („antibiotický test“)

(A) Dělení podle cíle působení:

Antiseptika – usmrtí či inhibují růst mikroorganismů, netoxické pro

ţivé tkáně

Desinfekce – usmrtí mikroorganismy v neţivém prostředí – cílené

především na patogeny; pokud všechny = sterilace

(B) Dělení podle místa působení

In vitro – vně ţivých organismů

49

In vivo – uvnitř ţivých organismů = chemoterapeutika (synthetické,

antibiotika)

(C) Dělení podle mechanismu účinku:

Denaturace bílkovin

Ireverzibilní zásah způsobující koagulaci bílkovin

Etylalkohol – účinný při koncentraci cca 60-85%

Kyseliny a zásady – změna pH; (anorganické i organické kyseliny)

Blokáda a oxidace –SH a –NH2 skupin = tím poškození aminokyselin

Příklady:

Hg – výplachy, moření obilí (-SH)

Ag – desinfekce vody

Cu – proti řasám, houbám

Oxidační látky – sloučeniny Cl, Br, I, KMnO4, kyslík (H2O2, O3),

ethylenoxid

Alkylační – formaldehyd

Fenol

Působení na buněčné membrány

= poškození celistvosti; interakce mezi proteiny a lipidy,

poškození lipidů

Detergenty – látky s afinitou k povrchům

Nejúčinnější kationtové odvozené od NH4+, (vodíky nahrazeny

organickými radikály)

= „kvarterní amonné soli“ - ajatin

Ovlivnění biosynthes

= látky, které blokují normální metabolismus např. podobné substrátu,

koenzymu…

(D) Dělení podle chemických charakteristik

kyseliny, zásady, těţké kovy, oxidační látky, detergenty, alkoholy….

50

XII. PŘEMĚNY C-LÁTEK

1. Úvod

2. Fermentace

2.1. Etanolové kvašení

2.2. Mléčné kvašení

2.3. Máselné kvašení

2.4. Propionové kvašení

2.5. Acetonbutanolové kvašení

3. Respirace

3.1. Úplná aerobní respirace

3.2. Neúplná aerobní respirace

3.3. Přeměny sloţitých C-látek

3.4. Rozklad škrobu

3.5. Rozklad celulosy

3.6. Rozklad pektinových látek

3.7. Rozklad hemicelulos

3.8. Rozklad ligninu

XII.1. Úvod

Organismy = producenti – konzumenti - reducenti

Funkce mikroorganismů v koloběhu biogenních prvků je nezastupitelná = jsou hlavními

reducenty

Ve vzduchu cca 0,035% CO2, tj. 700.109 t

Roční spotřeba rostlin cca 20.109 t – při „nedoplňování“ zásob na 35 let

Zdroje: vulkanický CO2

spalování fosilních paliv

mineralizace organických látek

(85 - 97% mikroorganismy, z toho 85% půda a 12% voda)

XII.2. Fermentace

Navazuje na glykolysu

Donorem H+/e

- organická látka

Anaerobní proces

Energeticky méně výhodná oproti respiracím

51

XII.2.1. Etanolové kvašení

CH3COCOOH CH3COH + CO2 (dekarboxylace pyruvátu)

CH3COH + H+ CH3CH2OH (redukce acetaldehydu)

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

Podmínky:

Anaerobní, mezofilní

Jednoduché cukry (mono-, disacharidy)

Sloţité cukry (škrob) aţ po hydrolyse

Zdroj N – NH4+, případně organický

Dostatek P

Původci: kvasinky (Saccharomyces) a některé bakterie (Zymomonas)

Význam:

Produkce ethanolu (alkohol. nápoje, průmyslová surovina)

Pekařství

(Biomasa = zdroj vitamínů a bílkovin)

XII.2.2. Mléčné kvašení

CH3COCOOH + H+ CH3CHOHCOOH

Homofermentativní (HM) =

C6H12O6 2CH3CHOHCOOH (< 90%)

Heterofermentativní (HR) =

C6H12O6 CH3CHOHCOOH+CH3COOH + CH3CH2OH +

CH2OHCHOHCH2OH + CO2

Poţadavky:

Anaerobní (mikroaerofilní), ale vţdy fermentace (chybí cytochromy)

Mezofilní (termofilní)

Acidorezistentní

Náročné na prostředí

Zdroj C – mono- a disacharidy

Zdroj N – organické N-látky

Vyţadují růstové látky – vitaminy

Původci (= bakterie mléčného kvašení - BMK):

Lactococcus: HM; mléko, sýry

Lc. lactis, Lc. cremoris

52

Streptococcus: HM; jogurt

Sc. salivarius ssp. thermophilus

Enterococcus: HM; trávicí trakt, indikátor fekálního znečištění,

siláţování, probiotika

E. faecium, E. faecalis

Pediococcus: HM; mléko

Leuconostoc: HR; mléko, produkce polysacharidů

Lactobacillus: HM i HR

Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (HM), jogurt

Lb. acidophilus (HM), mléko, pochva, trávicí trakt, probiotika

Lb. plantarum (HM) rostliny, siláţ

Lb. fermentum, Lb. brevis (HR), siláţ, kyselé zelí

[Bifidobacterium (?BMK; „HR“; vysoký podíl kyseliny octové – 60%);

trávicí trakt, probiotika, mléčné výrobky

B. bifidum, B. animalis, B. longum

nepatří mezi bakterie mléčného kvašení]

Význam (viz rovněţ výše):

Mléko a mléčné výrobky

Ţivočichové: trávicí trakt (!+), nepatogenní

Konzervace: siláţ, zelenina, „domorodé produkty“

Probiotika

Výroba kyseliny mléčné

XII.2.3. Máselné kvašení

Široká škála produktů: kyselina máselná + k. octová + další org. kyseliny (valerová,

isovalerová, isomáselná) + (aceton) + alkoholy (buthanol) + plyny (CO2, H2)

4 C6H12O6 3CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + 8CO2 + 8H2

2CH3COCOOH CH3CH2CH2COOH + 2CO2

pyruvát acetyl-CoA + CO2 + H2

butyrát + acetát + buthanol + aceton + isopropanol

53

Poţadavky:

Anaerobní (bez cytochromů), mezofilní

Zdroj C – široké spektrum C-látek (monosacharidy aţ polysacharidy, pektiny,

aj.)

Zdroj N – organický N, NH4+, i N2

Původci:

Clostridium: G+ anaerobní sporulující tyčinka, bohatý enzymový aparát

Cl. pasteurianum, Cl. butyricum, Cl. felsineum, Cl. cellobioparum,

Cl. thermocellum…..

Význam:

(široké spektrum aktivit r. Clostridium)

Typická půdní bakterie – nejdůleţitější fermentace v půdě

Organická hnojiva (hnůj, kompost)

Rozklad sloţitých C-látek anaerobně

Anaerobní fixace N2

Anaerobní rozklad bílkovin

Patogenní, producent toxinů

Cl. perfringens, Cl. botulinum, Cl. tetani

Trávicí trakt – rozklad sloţitých C-látek

Čištění odpadních vod

Průmyslová produkce kyseliny máselné

XII.2.4. Propionové kvašení

hexosa pyruvát propionát + acetát + CO2 + H2O

laktát pyruvát propionát + acetát + CO2 + H2O

Původce: Propionibacterium

Poţadavky:

Jednoduché C-látky

Organické N-látky

Aerotolerantní

54

Význam: Trávicí trakt zvláště bachor

Kůţe ţivočichů

Výroba sýru – ementál („oka“, aroma)

Produkce vitamínů (B12)

Protiplísňový preparát

XII.2.5. Acetonbuthanolové kvašení

= modifikované máselné kvašení, kyselina máselná je redukována H+ na butanol

dominantní produkty: aceton, buthanol, (kyselina máselná - málo)

Původce: Clostridium acetobutylicum

Význam: fermentační produkce acetonu a buthanolu

XII.3. Respirace

V koloběhu C významná především aerobní respirace, kde akceptor H+ je O2

Úplná aerobní respirace

= úplná mineralizace širokého spektra C-látek (mono-, di-, polysacharidy,

tuky, „uhlíkaté skelety“ org. sloučenin, aj.)

(hydrolysa – glykolysa – redukce pyruvátu – Krebsův cyklus – dýchací řetězec)

Produkty: CO2, H2O (ATP)

Významný zdroj CO2 v ţivotním prostředí

Neúplná aerobní respirace (nepravá kvašení)

= neúplná mineralizace, zůstávají organické C-látky

- Octové kvašení

CH3CH2OH+O2 CH3COOH + H2O

Původce: Acetobacter

kaţení vína

výroba octa (ocetnice –imobilizované buňky, kontinuální kultivace)

- Citronové kvašení

glycidy kyselina citronová

Původce: Aspergillus niger

Význam: potravinářství – limonády, dţemy

55

XII.4. Rozklad sloţitých C-látek

Významný vliv poměru C:N – optimum 25:1

XII.4.1. Rozklad celulosy

Nejvýznamnější rostlinný polysacharid rozloţitelný pouze mikroorganismy

Celulosa aktivní celulosa celobiosa glukosa pyruvát (dále odlišné)

celulasy: C1 a Cx (glukanasy)

Tři hlavní varianty:

Aerobní rozklad v půdě

= úplná aerobní respirace s typickými produkty - CO2, H2O

Původci: Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas, Trichoderma aj.

Anaerobní rozklad v půdě

= máselné kvašení s typickými produkty

Původci: Clostridium thermocellum

Anaerobní v trávicím traktu

= modifikované máselné kvašení

Dominantní metabolit = kyselina octová

Další metabolity: organické kyseliny (máselná…), CO2, H2, alkoholy

Typické pro bachor a tlusté střevo

Původci: Fibrobacter, Butyrivibrio, Bacteroides, Clostridium cellobioparum

Cl. thermocellum

Bachor – vedle bakterií se rozkladu celulosy účastní ještě houby

(celulosa bez bakterií /hub/ nerozloţitelná)

XII.4.2. Rozklad škrobu

Snadno rozloţitelný

Začíná hydrolysou (α- a β-amylasy):

amylopektin + amylosa;

amylopektin + amylosa glukosa

amylopektin maltosa + dextriny ;

amylosa maltosa

56

Aerobní rozklad

= typická úplná aerobní respirace

Produkty: CO2, H2O

Původci: bakterie – Bacillus; houby – Aspergillus

Význam:

- typický půdní proces

- výroba lepidel

- produkce amylolytických enzymů (slad, sladidla)

Anaerobní rozklad

= typické máselné kvašení (kys. máselná, další org. kyseliny, buthanol,

CO2, H2)

Původci: Clostridium (Cl. pasteurianum, Cl. butyricum)

Význam:

- typický půdní proces

- přeměny škrobu v trávicím traktu

XII.4.3. Rozklad pektinových látek

Pektin = polygalakturonidy

Mezibuněčné prostory rostlinných buněk

Začíná hydrolysou – pektinolytické enzymy (pektinasy)

Meziprodukty = kyselina galakturonová, galaktosa, xylosa, arabinosa

Aerobní rozklad pektinových látek

= úplná aerobní respirace všech meziproduktů hydrolysy

Produkty: CO2, H2O

Původci: Bacillus, Mucor

Význam:

- půdní proces

- rosení lnu

- (produkce pektinolytických enzymů – potravinářství)

Anaerobní rozklad pektinových látek

Meziprodukty hydrolysy (s výjimkou kyseliny galakturonové) podléhají

máselnému kvašení

Produkty: kys. galakturonová, org. kyseliny (máselná, octová, a další),

alkoholy (buthanol), CO2, H2

57

Původci: Clostridium

Význam:

- půdní proces

- trávicí trakt

- máčení lnu (Cl. pectinovorum)

XII.4.4. Rozklad hemicelulos

Komplexní - polymery hexos, pentos, (uronové kyseliny); xylosy a manosy

„Čisté“ – relativně snadno rozloţitelné

Aerobně = aerobní respirace

Anaerobně = máselné kvašení

XII.4.5. Rozklad ligninu

Komplexní C-látka, obsahuje aromatická jádra (fenyl + propanyl)

Doprovází celulosu a hemicelulosu

Zahájen hydrolysou

Prioritní aerobní rozklad houbami (basidiomycota, částečně askomycota)

Phanerochaete, Pleurotus, později Aspergillus a Trichoderma

Doprovodně – aktinomycety (Streptomyces, Nocardia)

Dále i bakterie - Pseudomonas

Produkty: CO2 + H2O

Význam:

- půdní proces

- trávicí trakt - termiti

58

XIII. PŘEMĚNY N-LÁTEK

1. Úvod

2. Amonifikace

3. Nitrifikace

4. Denitrifikace

5. Fixace N2

6. Imobilizace

XIII.1. Úvod

N-látky – klíčová součást všech ţivých systémů

Funkce: stavební – nositel genetické informace – metabolická – (zásobní látky)…….

Zásoba biogenního N omezená – nutná „recyklace“

N v různém oxidačním stupni: N3-

aţ N5+

XIII.2. Amonifikace

= hlavní mineralizační reakce v koloběhu N

hlavní místo = půda; (další voda)

org. N látky NH4+, NH3

(aminokyseliny), proteiny, nukleové kyseliny, močovina, kyselina močová,

chitin, peptidoglykan…..

aerobní i anaerobní

(psychrofilní) – mesofilní – (termofilní)

„pravé“ bakterie, aktinomycéty, mikromycéty

Významný vliv poměru C:N:

Optimum cca 25:1 = vyváţený zdroj C + N +energie

< 25:1 rozklad rychlý, nadbytek N, únik NH3

> 25:1 (např. sláma 80:1), rozklad zpomalen, odčerpávání N

z jiných zdrojů = imobilizace

Vyuţití NH4+, NH3:

- synthesa aminokyselin (anabolismus)

- nitrifikace (zisk energie)

- (příjem rostlinami)

- volatisace

59

- vyplavení (povrchové a spodní vody)

- fyzikálně-chemická vazba na půdní komplexy (jílové minerály,

organická hmota)

- vazba na půdní částice

Amonifikace bílkovin

Hydrolysa peptidické vazby – proteinasy

proteiny poly- oligo- di- peptidy aminokyseliny

Dále deaminace: NH4+, NH3, ketokyselina

o Aerobní rozklad bílkovin

= výraznější mineralizace

Produkty: CO2, NH4+, NH3

Původci: aerobové a fakultativní anaerobové

Bacillus, Pseudomonas, Proteus

o Anaerobní rozklad bílkovin

Produkty: CO2, NH4+, NH3, skatol, indol, merkaptany, H2S….

Původci: Clostridium

Amonifikace močoviny

CO(NH2)2 CO2 + NH3

Původci: urobakterie; Micrococcus ureae, Planosarcina ureae

Typický proces pro stájové prostředí

Trávicí trakt (bachor!)

XIII.3. Nitrifikace

= oxidace redukovaných forem N

aerobní proces

Autotrofní nitrifikace

NH4+ NH2OH NO2

- NO3

-

Zdroj C = CO2 (Calvinův cyklus)

Typický půdní proces: neutrální reakce, aerace

Indikátor půdní úrodnosti

Původci: aerobní chemoautotrofové

60

o Nitritace

NH4+ + O2 NO2

- + 2H

++H2O + E

Původci: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus…

o Nitratace

NO2- + O2 NO3

- + E

Původci: Nitrobacter, Nitrococcus…

Heterotrofní nitrifikace

NH4+ NO2

- NO3

-

RNH2 NO2- NO3

-

Zdroj C = organická C-látka

Typický proces zvláště v kyselých půdách, méně výkonná neţ autotrofní

Původci: houby (Aspergillus), aktinomycety (Streptomyces), bakterie (Arthrobacter)

Význam nitrifikace:

- zdroj energie pro nitrifikační bakterie

- ţivina pro rostliny (hlavní zdroj N je NO3-)

- substrát pro denitrifikaci

- neţádoucí proces v chlévském hnoji

- nitráty silně pohyblivé, neakumulují se

- při nadbytku ztráty vyplavením

= moţnost vzniku nitrosoaminů (karcinogen)

= ztráta ţiviny

= zhoršená kvalita vody

povrchové vody – eutrofizace

spodní vody – zvýšený obsah NO3- neumoţňuje jejich vyuţití jako

pitné vody (methaemoglobinemie)

XIII.4. Denitrifikace

= redukce oxidovaných forem N

= anaerobní respirace (zdroj energie)

Typický anaerobní půdní proces

61

Disimilativní denitrifikace

NO3- + H

+ N2 + H2O + E

(NO3- NO2

- NO N2O N2)

Původci: široké spektrum anaerobů a fakultativních anaerobů

Pseudomonas, Paracoccus,

Propionibacterium, Thiobacillus…

Půda (org.hnojiva) - ztrátový proces

Voda - můţe být pozitivní, likvidace NO3-

- odstraňování NO3- z pitné vody

- odstraňování NO3- při čištění odpadních vod

Asimilativní denitrifikace

NO3- + H

+ NH4

+ + H2O + E

(NO3- NO2

- NH2OH NH3)

Půda – proces při nadbytku NO3- spíše pozitivní - menší pravděpodobnost ztrát

Poznámky:

(1) NO3- + H

+ NO2

- + H2O + E

velmi běţná redukce (nitrátreduktasa)

(2) NO3- + H

+ N2 + H2O + O2 + E

O2 – vyuţit pro aerobní respiraci organických sloučenin

(3) NO3- + H2O + S N2 + SO4

2- + H

+ + E

sirné bakterie (redukce nitrátů spojená s oxidací S)

XIII.5. Fixace N2

Objevena 1882 – diazotrofní bakterie

= redukce N2 NH4+

(N = N HN=NH H2N-NH2 2 NH3 2 NH4+ aminokyseliny

/glutamová, asparagová/)

N2+8e-+16ATP+10H

+ 2NH3+H2+16ADP+16Pi

Nitrogenasa (nif gen) – přenos H+ na N2 v anaerobních podmínkách

Hup+ gen - synthesa hydrogenasy zlepšuje hospodaření s H (nevzniká H2)

Energeticky náročné – ATP (dostatek P)

Fixace intenzivní především při nedostupnosti jiných zdrojů N

Význam: návrat N z atmosféry do koloběhu biogenních prvků – v přírodních ekosystémech

hlavní forma

62

Celkový input N do půdy: 320.1012

g/rok

z toho je: fixace 175.1012

g/rok

hnojiva 85.1012

g/rok

Rozdělení diazotrofních bakterií:

- volně ţijící v půdě: Azotobacter, Clostridium, Azotomonas….

- asociativní: Azospirillum ….

- symbiotické: Frankia, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium….

Diazotrofní bakterie zahrnují řadu skupin: organotrofní, fototrofní, cyanobakterie..

Vztah diazotrofů k O2: všechny varianty; aerobové aţ anaerobové

Azotobacter

Plejomorfní (diplokoky, tyčinky) aerobní mesofilní bakterie

Náročný na podmínky prostředí:

Neutrální půdní reakce (Ca2+

)

Vysoký obsah organických látek (zdroj E jednodušší C-látky)

Strukturní půdy (humus, vzduch)

Dobrá zásoba biogenních prvků (P, Ca, K…)

Fixace při nedostatku jiných zdrojů N

Výskyt jen v kvalitních půdách (vyuţíván jako indikátor)

Úroveň fixace 15-20 mg N/1g glukosy

Clostridium

Anaerobní sporulující mesofilní tyčinka (1 x 1,5-8 μm)

Menší náročnost na podmínky prostředí:

Výskyt i při mírně kyselé reakci

Méně aktivní ve fixaci N2

Zdroj C a E široké spektrum org. C-látek (E – máselné kvašení)

Úroveň fixace 10-12 mg N/1g glukosy

Výskyt ve většině půd

Rhizobium

Symbiotická fixace N

Aerobní nesporulující plejomorfní tyčinka

V kořenech jako bakteroidy (aţ T, Y – tvary)

63

Symbiosa s kořeny rostlin (Fabaceae) – pro fixaci obligatorní (volně v půdě a

v lab. podmínkách nefixuje) – zde vytváří hlízky (hlízkové bakterie)

Specifita – věrnost hostitelské rostlině

Pro fixaci nezbytná anaerobiosa – leghaemoglobin (vazba O2)

Mutualistický vztah : rostlina poskytuje glycidy, bakterie N-sloučeniny

Zvýšená zásoba půdního N omezuje fixaci

Nejvýkonnější diazotrofové:

(30) 50 – 200 (800) kg/ha; Ø 140 kg/ha

Účelná inokulace semen před výsevem - preparát Rizobin (ČR)

Průběh fixace:

Geneticky podmíněno – geny: nod, nif, fix

- rozpoznání kořene a adherence

- narušení kutikuly a průnik

- pohyb kořenovým systémem (infekční vlákno)

- tvorba hlízky

- vznik bakteroidů a zahájení fixace

- intenzivní fixace

- stárnutí bakteroidů, zánik, lýza

Důleţité vlastnosti rhizobií:

specifita – invazivita – virulence – efektivita – přeţívání v půdě

XIII.6. Imobilizace

= převod minerálních forem N do organických látek v ţivých buňkách; projevuje se

nárůstem biomasy (počet, velikost)

Silně souvisí s poměrem C:N (viz dříve)

Při širokém poměru nestačí N v rozkládané látce – odčerpáván N z půdní zásoby (roztoku)

Význam:

- nejedná se o ztrátu (jiná forma)

- moţná konkurence s rostlinami (negativní)

- stabilizace N v období vegetačního klidu

(Stabilizace N v půdě = humifikace)

64

XIV. PŘEMĚNY P-LÁTEK

1. Úvod

2. Mineralizace

3. Imobilizace

4. Solubilizace

5. Redukce PO43-

XIV.1. Úvod

P – důleţitá součást buněčných látek – nukleové kyseliny, enzymy, hormony

Speciální funkce v energeticky bohatých sloučeninách (ADP, ATP….)

XIV.2 Mineralizace

P-org. sloučeniny P-anorg. látky

Fosfatasy (alkalické, kyselé)

Zdroje: ATP – NK – fosfolipidy (fosfoproteiny) – fytáty

Produkty: H2PO4-, HPO4

2-, PO4

3-

Význam:

- nezastupitelná součást koloběhu biogenních prvků

- zdroj ţivin pro mikroorganismy a rostliny

XIV.3. Imobilizace

= převod anorg. P do buněk ţivých (mikro)organismů

anorg. P-sloučeniny org. P-látky

Nutný přísun energie

Nejběţnější: ADP + Pi + E ATP

Vznik NK…..

Určující poměr C:P:

> 100 : 1 podpora imobilizace

Význam:

- konkurence mikroorganismů s rostlinami

- sníţení pravděpodobnosti ztrát např. vyplavením

- nezbytný proces při nárůstu biomasy

65

XIV.4. Solubilizace

= zpřístupnění P organismům z málo rozpustných minerálních forem

/AlPO4, Ca3(PO4)2,…../

Vázáno na tvorbu kyselin při metabolismu mikroorganismů – minerální (H2CO3),

organických (octová)

PO43-

HPO42-

H2PO4-

Význam:

- doplňkový zdroj ţivin pro mikroorganismy a rostliny

XIV.5 Redukce PO43-

= zdroj kyslíku v anaerobních podmínkách (anaerobní respirace)

– tím zisk energie

66

XV. PŘEMĚNY S-LÁTEK

1. Úvod

2. Mineralizace

3. Imobilizace

4. Sulfurikace

5. Desulfurikace

XV.1. Úvod

Základní biogenní prvek – součást aminokyselin (methionin, cystin, cystein), enzymy,

hormony….

Funkce stavební, metabolická (enzymy), energetická (přeměny S-látek zdrojem E)

Mikroorganismy – příjem anorganické (SO42-

) i organické (aminokyseliny) formy S

Zdroje: organická hmota – minerály – atmosféra

XV.2. Mineralizace

org S-látky anorg. S-látky (SO42-

, H2S)

aerobně (SO42-

), anaerobně (H2S)

řada mikroorganismů – není specializace

Význam:

- zpřístupnění S pro organismy

- nezastupitelná součást koloběhu S

XV.3. Imobilizace

anorg. S-látky (SO42-

) org S-látky (např. sirné aminokyseliny)

zabudování S do ţivých (mikro)organismů

nutný přísun energie

poměr C:S > 400:1 výrazně podporuje imobilizaci

Význam:

- stabilizace S v prostředí

- moţná konkurence s rostlinami (v půdě)

67

XV.4. Sulfurikace

oxidace redukovanějších sloučenin S

H2S S S2O32-

SO42-

Aerobní proces

Nejčastěji

H2S (S2-

) + O2 SO42-

+ E

S

0 + O2 SO4

2- + E

Původci: sirné bakterie – Thiobacillus

Význam:

- zpřístupnění S organismům

- okyselení půd

- podíl na zvětrávání mateční horniny

XV.5. Desulfurikace

redukce oxidovanějších forem S

SO42-

S H2S

Anaerobní proces = anaerobní respirace, zdroj energie

Donorem H+ často organická látka

Př.: R-CH2OH+SO42-

R-COOH+H2O+S2-

+E

SO42-

+ H+

S0 + H2O + E

S0 + H

+ H2S + E

SO42-

+ H+ H2S + H2O + E

Původci: sirné bakterie – Desulfovibrio…

Význam:

- ztráta ţivin

- redukce toxicity Fe2+

a Mn2+

v „anaerobních“ půdách

68

XVI. MIKROBIOLOGIE PŮDY

1. Úvod

2. Hlavní skupiny mikrorganismů

3. Vztahy mezi půdními mikroorganismy a rostlinami

4. Funkce půdních mikroorganismů

4.1. Vznik půdy

4.2. Koloběh C-látek

4.3. Koloběh N-látek

4.4. Koloběh S-látek

4.5. Koloběh P-látek

4.6. Mineralizace

4.7. Imobilizace

4.8. Humifikace, humus

4.9. Samočištění

4.10. Detoxikace xenobiotik

4.11. Únava půdy

4.12. Produkce fytoalexinů

5. Moţnosti ovlivnění

XVI.1. Úvod

Půda:

- hlavní rezervoár mikroorganismů

- = „ţivý organismus“ - hlavní místo biotransformace biogenních prvků

Sloţky půdy:

- minerální podíl – cca 45% (skelet - písek - prach - jíl)

- organické látky – obvykle 1-3%, občas 8%, výjimečně více (organogenní aţ

80%); z toho organismy <1%, častěji <0,3%

- póry – 50% (optimální - voda 2/3, vzduch 1/3)

69

P

Ů

D

N

Í

O

R

G

A

N

I

C

K

Á

H

M

O

T

A

P

R

I

M

Á

R

N

Í

O

R

G.

H

M

O

T

A

E

D

A

F

O

N

Ţivá sloţka půdy

Mikroorganismy

Ţivočiši

Ţivé části rostlin

M

R

T

V

Ý

E.

Právě odumřelý

edafon

(rozpoznatelný

původ)

Snadno rozloţitelná

V Ø široký poměr

C:N

O

H

V

P

Ř

E

M.

Organická hmota

v transformacích

Uţší poměr C:N

(= výsledek

mineralizace)

H

U

M

U

S

H

U

M

U

S

Stabilizovaná OH

Uţší poměr C:N

Dlouhý poločas

rozkladu

Výsledný celkový poměr C:N v půdě: 10-12:1

XVI.1. Hlavní skupiny půdních mikroorganismů

- základní dělení

- podle výţivy

- podle získávání energie

- fyziologické skupiny

- systematicky

70

základní dělení

Bakterie (pravé, aktinomycety) – houby

POČET A HMOTNOST PROKARYOTNÍCH A EUKARYOTNÍCH PŮDNÍCH ORGANISMŮ

Vývojová linie Skupina Počet jedinců .g-1

Hmotnost t.ha-1

PROKARYOTÉ Bakterie < 109

0,450 – 4,500

Aktinomycety < 108

0,450 – 4,500

CELKEM 0,900 – 9,000

EUKARYOTÉ Houby (Mycota) < 106

1,120 – 11,200

Řasy (Algae) < 105 0,056 – 0,560

Prvoci (Protozoa) < 105 0,017 – 0,170

Hlísti (Nematoda) < 105 0,011 – 0,110

Ţíţaly (Lumbricidae) - 0,110 – 1,100

Ostatní bezobratlí a obratlovci - 0,017 – 0,170

CELKEM 1,331 – 13,310

(Brady, 1990)

Půdní bakterie 109. g

-1 2,5 t.ha

-1

9,5 t.ha-1

Půdní aktinomycety 108. g

-1 2,0 t.ha

-1

Půdní mikromycety 105. g

-1 5,0 t.ha

-1

(Kubát, 1992)

podle výţivy

- autotrofní: zdrojem C je CO2

- heterotrofní: zdrojem C je org. látka

- saprofytické: vyuţívají odumřelou organickou hmotu

- zymogenní: vyuţívají odumřelou rostlinnou hmotu

- oligotrofní: ţijí při nízkých koncentracích ţivin

- eutrofní (kopiotrofní): vyţadují prostředí bohaté ţivinami

- autochtonní: typické pro dané prostředí, vyskytují se pravidelně, mnoţí se

- alochtonní: mikroorganismy do prostředí zavlečené, kontaminující

71

podle získávání energie

- fototrofní: zdroj E světelné záření (fotolitotrofní, fotoorganotrofní)

- chemotrofní: zdroj E energie chemických vazeb (chemolitotrofní,

chemoorganotroní)

fyziologické skupiny

- koloběh C: celulolytické, amylolytické, máselné…

- koloběh N: amonifikační, nitrifikační, denitrifikační, diazotrofní…

- koloběh S: sulfurikační, desulfurikační, (sirné)…

- koloběh P: fosfáty solubilizující…

systematicky (rody)

- kokovité: Staphylococcus, Micrococcus...

- tyčinky sporulující: Bacillus, Clostridium

- tyčinky nesporulující (řada plejomorfních): Arthrobacter, Mycobacterium,

Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Rhizobium…

- aktinomycety: Streptomyces, Nocardia…

- houby: Mucor, Rhizopus; Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma…

XVI.3. Vztahy mezi mikroorganismy a rostlinami

Všechny varianty: od mutualismu po parasitismus

Spermosféra

= mikroflora povrchu semen

Můţe být antagonistou patogenních mikroorganismů

Můţe ohroţovat klíční rostlinku (zvláště houby)

Vyuţití chitinolytických mikroorganismů (Pseudomonas) pro regulaci

= biologické moření

Epifytní mikroflora

= mikroflora nadzemních částí rostlin

U zdravé rostliny často antagonista neţádoucích mikroorganismů

U poškozené se můţe podílet na neţádoucích procesech

Z hlediska krmivářského sloţení nepříznivé

Hnilobné bakterie (aţ 90%) – dominantní rod Pseudomonas

72

Mikromycety – zastoupení do 10%, negativní – rozklad ţivin a produkce mykotoxinů

(Mucor, Rhizopus; Aspergillus, Fusarium, Penicillium…)

Sporulující tyčinky – zastoupení aţ 10%, negativní - rozklad ţivin, produkce kyseliny

máselné (Bacillus, Clostridium)

Bakterie mléčného kvašení – obvykle do 1(3)% - pozitivní, významné pro siláţování

(Lactobacillus, Lactococcus)

Rhizosfera

= mikroflora povrchu kořenů a přiléhající půdy (< 1mm)

Ovlivněna kořenovými exudáty

Ovlivňuje výţivu rostlin

Můţe mít podíl na únavě půdy

Odlišné sloţení – dominantní nesporulující tyčinky

Odlišný počet (rhizosférní efekt = R/S), poměr výrazně > 1

(obvykle 10-100 /1000/x)

Mykorhiza

= mutualistické (symbiotické) souţití mycelia hub a kořenů rostlin, pro některé

rostliny aţ obligatorní

Různá úroveň vzájemného vztahu:

peritrofní mykorhiza – ektotrofní mykorhiza – endotrofní mykorhiza

VAM = vesikulo-arbuskulární mykorhiza, průnik vláken hub do buněk kořenu rostliny

Význam:

R - Zvětšení povrchu kořenů

R - Zlepšený příjem vody a ţivin

R – Zvýšení mineralizace v blízkosti kořenů ( dostupnost ţivin)

R – Zlepšená dostupnost P

H – Zlepšené zásobování glycidy

XVI.4. Funkce půdních mikroorganismů

XVI.4.1. Vznik půdy

Půda = přírodně historický útvar; vzniká působením půdotvorných činitelů na

mateční horninu

Půdotvorní činitelé: fyzikální, chemické, biologické (hlavně mikroorganismy)

73

Organismy ovlivňují:

- zvětrávání hornin – vznik kyselin (org. i anorg.)

- synthesu organických látek zvláště humusu

- rozklad org. látek

- tvorbu struktury (agregace)

- mísení org. a min. látek (hlavně makroedafon)

1 XVI.4.2. Koloběh C-látek

(viz poznámka pod čarou)

Úplná aerobní respirace

Máselné kvašení

XVI.4.3. Koloběh N-látek

Amonifikace

Nitrifikace

Denitrifikace

Fixace N2

Imobilizace

XVI.4.4 Koloběh S-látek

Mineralizace

Imobilizace

Sulfurikace

Desulfurikace

XVI.4.5. Koloběh P-látek

Mineralizace

Imobilizace

Solubilizace fosfátů

XVI.4.6. Mineralizace

úloha mikroorganismu nazastupitelná

C

- Úplná aerobní respirace

1 Kapitoly XVI.4.2. aţ XVI.4.6. – podrobnosti viz předchozí kapitoly

74

= org. C-látky CO2 + H2O + E

= úplná mineralizace

- Máselné kvašení

= org. C-látky CO2 + H2 + org. kyseliny (máselná..) + alkoholy

= neúplná mineralizace typická pro anaerobní podmínky, vysoký podíl

organických látek

N

Amonifikace = přeměna org.N látek NH4+

Aerobní i anaerobní proces

P

Org. P-látky minerální (H2PO4-, HPO4

2-, PO4

3-)

Aerobní i anaerobní proces

S

Org. S-látky minerální (H2S, SO42-

)

Aerobní i anaerobní proces

Priming efekt

(objeven při studiu mineralizace)

= urychlení mineralizace obtíţně mineralizovatelné látky v přítomnosti

snadno mineralizovatelné (po jejím přídavku)

Produkce CO2

Význam: rozklad sloţitých látek

detoxikace

Snadno Obtíţně Směs

_____________________________________ ___________

= priming efekt

75

XVI.4.7. Imobilizace

= příjem látek ţivými (mikro)organismy z půdního roztoku a jejich zabudování

do buněk

Výsledek = nárůst biomasy (počet buněk či jejich hmotnost)

Při nadbytku ţiviny v půdě jednoznačně pozitivní

Při nedostatku konkurence s rostlinami

Výrazně ovlivněna ve vazbě na obsah C-látek:

optimální poměry:

C:N 25 (30) : 1

C:P 100 : 1

C:S 400 : 1

Širší poměr znamená výraznější imobilizaci

XVI.4.8. Humifikace

= proces transformace primární organické hmoty na humus

Humus = stabilní organická hmota s uţším poměrem C:N a s dlouhým

poločasem mineralizace (proto nemůţe slouţit jako aktuální významný

zdroj ţivin)

Základní podmínky: přísun organické hmoty

vnější podmínky

přítomnost aktivních mikroorganismů

přísun organické hmoty (OH)

Organická hmota i zároveň zdroj meziproduktů (M) a zdrojem E pro

synthesy

Hlavní zdroje OH- především rostliny:

- kořenové exudáty (1300-1600 kg/ha), poločas rozkladu 1-3 dny,

zdroj E+

- odumřelé kořínky za vegetace (1000-1300 kg/ha), poločas

rozkladu 1-3 týdny, zdroj E+, M±

- odumřelé rostliny /posklizňové zbytky/ (3500-4000 kg/ha),

poločas rozkladu 6-40 měsíců, zdroj E+, M+

- organická hnojiva (dávka variabilní), poločas rozkladu:

močůvka 3-5 dnů, kejda 3-6 týdnů,hnůj 3-6 měsíců, kompost

10-40 měsíců; zdroj E i M

- odumřelý edafon – velmi variabilní (např. při 5t bakterií + 5t

hub/ha to můţe být cca 21t/ha), poločas rozkladu – dny

76

VÝZNAMNÝ VLIV CHEMICKÉHO SLOŢENÍ:

3 fáze přeměny organických látek:

1) transformace vodorozpustných látek

(značná část mineralizována Energie)

2) transformace nerozpustných látek (vznik fenol-proteinových

komplexů)

3) „zrání“ převáţně fyzikálně-chemické reakce: kondenzace,

polymerace, tím stabilizace

Vnější podmínky

- Teplota

Optimální mesofilní podmínky

Niţší teplota zpomaluje proces

Vyšší teplota urychluje humifikaci, ale vyšší mineralizace,

vzniká kvalitní humus v menším mnoţství

Vyšší teplota přispívá k hygienizaci (likvidace patogénů)

sniţuje klíčivost semen

- pH

Optimální kolem 7,0

Niţší zpomaluje humifikaci, zvýšený rozvoj mikromycet,

méně kvalitní humus

Velmi vysoké pH přispívá k hygienizaci (vápnění např. kalů,

ztráty NH3)

Zdroj Zdroj Mineralizace energie meziprod.

R ychlá Dobr ý Málo Glycidy

Proteiny

Hemicelul.

Celulosa

Tuky

Vosky

Lignin

(humus)

Pomalá Špatný Hodně

77

- Aerace

Vysoká aerace podporuje mineralizaci, vzniká méně ale

kvalitního humusu, proces rychlejší – dostatek energie

Nedostatečná aerace neposkytuje dostatek energie, více

meziproduktů, proces pomalejší, méně kvalitní humus ve

větším mnoţství

Doporučení – kombinace aerobních a anaerobních podmínek

s dominancí aerobních (překopávání kompostu)

- Vlhkost

Nutný faktor pro příjem ţivin

V protikladu s aerací (zaplnění pórů vodou)

Optimum – 60% max. vodní kapacity

V kompostu cca 65 rel. %

- Další faktory

Klimat, erose, půdotvorný substrát…

Přítomnost aktivních mikroorganismů

Nejsou specializované mikroorganismy

Nutná komplexní aktivní mikroflora

Zabezpečují řadu katabolických a anabolických procesů

Výsledek – humus = stabilní komplexní organická hmota

Stadia procesu: 1. bakterio-plísňové

2. aktinomycetové

HUMUS

Stabilní organická hmota s dlouhým poločasem rozpadu

Sloţení – pestrá chemická struktura, popis zaloţen na sráţení a

rozpouštění v alkaliích a kyselinách

Komponenty humusu:

Fulvokyseliny

Huminové kyseliny

Huminy

Hymatomelanové kyseliny

kapitoly XVI.4.9 – XVI.4.12 viz pouze prednášky

78

XVII. MIKROBIOLOGIE VODY

1. Úvod

2. Mikrobiologie pitné vody

3. Mikrobiologie povrchových vod

4. Mikrobiologie odpadních vod

4.1. Charakteristika odpadních vod

4.2. Čištění odpadních vod

XVI.1. Úvod

Výskyt mikroorganismů silně variabilní (0-109 v 1 ml)

Výskyt je určen zdrojem kontaminace a zároveň je určen mnoţstvím ţivin, hlavně

organických látek

Ţivá sloţka = plankton (megalo – aţ nanoplankton)

Autochtonní x alochtonní mikroorganismy

Zákon o vodách – č. 254/2001Sb.

XVI.2. Mikrobiologie pitné vody

Optimum – počet mikroorganismů 0 či blízký, většinou malé mnoţství přítomno

Normy:

- Zákon 258/2000Sb. o ochraně veřejného zdraví

- Vyhláška MZ ČR 252/2004Sb. platná od 1.5.2004 (nahrazuje vyhlášku

376/2000Sb.); /navazuje na Směrnici Rady EU 98/83/EC/; vychází

z 258/2000Sb., 274/2001Sb., 274/2003Sb.

- Vyhláška (§4) určuje rozsah a četnost odběrů

- ČSN ISO 5667-3, 5667-5, 5667-14 upravují odběr a manipulaci se vzorkem

Definice pitné vody: nově není

Definice z neplatné ČSN:

Voda zdravotně nezávadná, která při trvalém poţívání nevyvolává onemocnění

nebo poruchy….

79

Pojmy z vyhlášky:

- Hygienický limit – hodnota stanovená v přílohách vyhlášky, musí být dodrţen

v místech odběru; u balené v místě stáčení a po dobu minimální trvanlivosti (výjimka

KTJ/ml stanovené při 22°C – 500KTJ a 36°C – 100KTJ)

- Zásobovaná oblast – území ve kterém je lokalizována rozvodná síť, voda je dodávána

jedním provozovatelem

- Individuální zdroj pitné vody, zpravidla slouţí k zásobování podle §3 odst.2 písm. a)

zákona (např. studna)

- Výdejní automat – uměle instalovaná nádrţ, do které se voda dováţí nebo přivádí

z vhodného zdroje (nejedná se o automaty na balenou vodu)

- Balená pitná voda – 292/1997Sb., 241/1998Sb., 465/2000Sb.

- Mezní hodnota (MH) - její překročení obvykle nepředstavuje akutní zdravotní riziko;

(voda ztrácí kvalitu v daném ukazateli - konzumace nemusí být vyloučena, nutná

opatření)

- Nejvyšší mezní hodnota (NMH) – hodnota zdravotně závaţného ukazatele jakosti; při

jejím překročení je vyuţití vody jako pitné vyloučeno

- Doporučená hodnota = optimální koncentrace dané látky (pouze Ca, Ca+Mg)

- Při překročení limitů se neprodleně provede opakovaný rozbor pro potvrzení

výsledků; přijmou se rovněţ nápravná opatření

Mikrobiologické parametry pitné vody:

- Escherichia coli (EC), indikátor čerstvého fekálního znečištění, vzhledem k niţší

citlivosti na vnější vlivy neţ patogenní mikroorg. hlavní indikátor

- koliformní bakterie (KB), indikátor celkového fekálního znečištění

- enterokoky (EK), indikátor fekálního znečištění, (metabolicky BMK)

- Pseudomonas aeruginosa (PA) – potenciální patogen

- počty kolonií při 36°C (K36), zdrojem výkaly, půda, rostliny, prach…

- počty kolonií při 22°C (K22), zdrojem půda, rostliny, prach…

- Clostridium perfringens (CP) – potenciální patogen, stanovuje se při úpravě vody

z povrchové (MH: 0/100ml)

- další biologické ukazatele: mikroskopický obraz: počet organismů, abioseston, ţivé

organismy

- dále řada parametrů (52) fyzikálních a chemických

- (patogenní mikroorganismy se běţně nesledují)

80

Potenciálně přenosné patogenní mikroorg. ve vodě:

Campylobacter, E.coli, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia,

Pseudomonas, Aeromonas, viry, prvoci

HODNOTY PRO PITNOU VODU (KTJ)

skupina Pitná v. BV

EC NMH 0/100ml 0/250ml

KB***) MH 0/100ml 0/100ml

ENT NMH 0/100ml 0/250ml

PA NMH - 0/250ml

K36 MH 100/1ml**) -

K36 NMH - 20/1ml

K22 MH 200/1ml

500/1ml**)

-

K22 NMH - 500/1ml

CP*) MH 0/100ml -

*) pouze u pitných vod upravených z povrchových

**) pro náhradní zásobování, vodu dodávanou dopravními

prostředky a malé nedezinfikované zdroje do 5 m3/den

***) minimálně u 95% rozborů

Metody mikrobiologických stanovení:

- EC - ČSN EN ISO 9308-1

- KB - ČSN EN ISO 9308-1

- ENT - ČSN EN ISO 7899-2

- PE - ČSN EN 12780

- K22, K36 - ČSN EN ISO 6222

- CP – zákon 252/2004Sb.

Opatření při překročení mezních hodnot bakterií – desinfekce:

Ag, Cu, Cl (plynný, Savo, chloramin), O3, UV a γ záření

Dále ve vyhlášce limitní hodnoty

- pro teplou vodu

- pro teplou vodu z individuálního zdroje pro účely osobní hygieny

81

XVII.3. Mikroflóra povrchových vod

Mikroorganismy pravidelně přítomny ve variabilním mnoţství

Měřítkem znečištění saprobita: mnoţství organických látek

mnoţství bakterií

obsah O2

charakter procesů

Stupně saprobity:

- polysaprobní – vysoce znečištěné vody

mnoţství org.látek – vysoké

mnoţství bakterií – vysoké (cca 108/ml)

obsah O2 – nízký (blízký 0)

charakter procesů – anaerobní (redukční)

vyšší organismy téměř nepřítomny

- α-mesosaprobní – znečištěné vody

mnoţství org.látek – střední

mnoţství bakterií – vysoké (cca 106/ml)

obsah O2 – nízký

charakter procesů – silně anaerobní

přítomny nenáročné organismy

- β-mesosaprobní – mírně znečištěné voda

mnoţství org.látek – malé

mnoţství bakterií – vysoké (cca 104/ml)

obsah O2 – dobrý

charakter procesů – značně aerobní

vyhovuje značnému mnoţství ţivočichů

- oligosaprobní- čistá voda

mnoţství org.látek –blízké 0

mnoţství bakterií – nízké (< 103/ml)

obsah O2 – plná nasycenost

charakter procesů – silně aerobní

vyhovuje i náročným ţivočichům

Jakost povrchových vod definuje ČSN 75 7221 (říjen 1998):

Cca 46 kriterií; mezné hodnoty fyzikální, chemické, biologické

82

Norma vymezuje 5 tříd jakosti:

I. neznečištěná voda

II. mírně znečištěná voda

III. znečištěná voda

IV. silně znečištěná voda

V. velmi silně znečištěná voda

Biologické parametry:

Termotolerantní koliformní bakterie

Enterokoky

Saprobní index makrozoobentosu

Chlorofyl

Kontrola jakosti – ČSN 75 7220

XVII.4. Odpadní vody

XVII.4.1. Charakteristika

Vody polysaprobní, silně kontaminované, vysoký obsah organických látek –

nesmí do vodotečí, nutno ošetřit – vyčistit (speciální reţim pro vody

s toxickými látkami)

XVII.4.2. Čištění komunálních odpadních vod

Základem fyzikální a mikrobiální procesy

Členění: – mechanický stupeň

- biologický stupeň - aerobní

- anaerobní

Mechanický stupeň

- česla – zachycení hrubých nečistot (skládka spalování)

- lapák písku – odstranění písku (skládka)

- I. sedimentace

Povrch – plovoucí nečistoty (skládka, spálení)

Usazenina = surový kal anaerobní stupeň

Střed = mechanicky vyčištěná voda aerobní stupeň

Biologický aerobní stupeň

Princip: dodat maximum vzduchu (O2) a tím podpořit mineralizaci,

imobilisaci, aerobní respiraci, amonifikaci, nitrifikaci….

83

Technické varianty:

akumulační rybníky

závlahová pole

aerobní ţlaby

biofiltry (aerofiltry, rychlofiltry)

aktivační ţlaby

Aktivace – nejúčinnější varianta

Princip: mechanicky vyčištěná voda + aktivovaný kal + vzduch (O2)

Výsledek: vyčištěná voda + minerální metabolity + aktivovaný kal

II. sedimentace: odděluje aktivovaný kal od vody ( vodoteč)

Aktivovaný kal: část recyklována (pro další aktivaci);

přebytečný akt.kal anaer.stupeň

Na aktivaci také můţe navazovat denitrifikační stupeň, kde

v anaerobních podmínkách je NO3- (vzniklý při nitrifikaci)

denitrifikován na N2 + H2O

Biologický anaerobní stupeň

Princip: zabránit přístupu O2 a tím podpořit máselné kvašení,

acidogenesi, acetogenesi, metanogenesi…

Surový kal a přebytečný aktivovaný kal ve vyhnívacích nádrţích

(I a II), zde anaerobní mikrobiální procesy

Výsledek:

- anaerobně stabilizovaný kal, odvodnit a pouţít pro

kompostování, aplikaci do půdy, skládkování

- bioplyn – směs CH4, CO2 a stop dalších plynů

spalování – tepelná a elektrická energie

84

XVIII. MIKROBIOLOGIE KRMIV

1. Úvod

2. Mikroflóra objemných krmiv

3. Mikroflóra sena

4. Mikroflóra jadrných krmiv, krmných směsí

5. Mikrobiologie siláţe

XVIII.1. Úvod

Mikroorganismy často neţádoucí

– podíl na destrukci ţivin (zvláště při zhoršení skladovacích podmínek)

– produkce neţádoucích metabolitů

Výjimky:

– mléčné bakterie v siláţi a senáţi

– mikroorganismy (zvláště kvasinky) jako zdroj vitamínů a bílkovin

– probiotika – ţivý krmný mikrobní doplněk k optimalizaci mikroflory trávicího traktu

XVIII.2. Mikroflóra objemných krmiv

= mikroflora zelených částí rostlin

= epifytní mikroflóra

V průměru nepříznivé sloţení

Obvyklý počet 105 – 10

8/g

(podrobnosti viz kapitola XVI.3)

XVIII.3. Mikroflóra sena

Sníţení obsahu vody (na 12-16%) vede k omezení mikrobiálních aktivit a změně

Sloţení mikroflóry:

Mikroflóra vychází z epifitní:

- sníţení počtu (při optimálním sušení)

- přechod bakterií v anabiosu

- preference klidových stádií (spóry, konidie)

- typičtí představitelé – mikromycety, Bacillus

85

Přísun vody vede ke stimulaci mikrobních procesů

Samozahřívání - termogenese

termogenese = výsledek fyziologických a mikrobiálních procesů při

nepřiměřeném obsahu vody (i lokálně)

Hlavním zdrojem tepla mikroorganismy

- 5-10% substrátu = zdroj ţivin

- 95-90% substrátu pro produkci tepla

- (v půdě 20-40% ţiviny, 80-60% mineralizace – energie)

Fáze: fyziologická

mikrobiologická (mesofilové, termofilové)

chemická, suchá destilace samovznícení

XVIII.4. Mikroflóra jadrných krmiv

Základ - epifytní mikroflora

Zvýšený výskyt vţdy negativní

ČSN 46 70 11 „Metody zkoušení nezávadnosti krmiv“

ČSN 46 70 06 „Mikrobiologické zkoušení krmiv

Není norma stanovující konkrétní parametry

Hlavní kriteria kvality:

- bez patogenních mikroorganismů (např. Salmonella)

- bez mikromycet – producentů toxinů

Naše výsledky:

- celkový počet bakterií

do 103/g výborné

do 105/g vyhovující

- počet mikromycet

do 103/g dobré

do 104/g průměrné

nad 105/g plesnivějící (plesnivé)

Hlavní skupiny mikroorganismů:

- bakterie: Bacillus

Pseudomonas

Escherichia!

Salmonella !

86

- mikromycety Aspergillus!

Penicillium

Mucor

Alternaria

Fusarium!

Polská norma vymezuje počty:

Proteolytické b.

Amonifikační b.

Saprofytické houby

Toxiny produkující mikromycety

XVIII.5. Mikrobiologie siláţe

= konzervovaná objemná (zelená) píce činností mléčných bakterií

3 základní podmínky:

(1) anaerobní uloţení siláţované hmoty (velikost řezanky,

rychlost naskladnění, vytěsnění vzduchu, uzavření….)

(2) cukerné minimum (Zubrilin) = dostatek zkvasitelných

cukrů, aby pH pokleslo na cca 4,2 (odvislé od sušiny)

(3) přítomnost bakterií mléčného kvašení

Fáze siláţování

(1) fáze smíšené mikroflory (do 7 dnů) – rozvoj všech epifytních

bakterií, spotřebován O2, rozvoj anaerobů, počátek produkce

org.kyselin

(2) fáze bakterií mléčného kvašení – anaerobiosa umoţňuje

rozvoj BMK; zpočátku hlavně kokovité (podfáze mléčných

koků - Lactococcus) – rychle se mnoţí ale méně odolné vůči

pH; nahrazeny tyčinkami (podfáze ml.tyčinek –

Lactobacillus); při nízkém pH odumírání i tyčinek

(3) technologická zralost (cca po 8 týdnech) – mikrobní procesy

ustávají, píce je konzervována a získává dlouhodobou

skladovatelnost

Hlavní mikroorganismy siláţe

(1) Bakterie mléčného kvašení (BMK)

jediná pozitivní skupina v siláţi; fermentuje glycidy na

kyselinu mléčnou;

homofermentativní (preferovány) i heterofermentetivní.;

hlavní: Lactococcus (lactis), Lactobacillus (plantarum)

87

(2) Mikromycety (plísně)

Negativní – konkurenti BMK, rozklad ţivin, produkce toxinů;

Acidorezistentní, regulace anaerobiosou;

Aspergillus, Penicillium

(3) Bakterie máselného kvašení

Konkurenti BMK, produkce kys.máselné, tím zhoršení

organoleptických vlastností;

Anaerobní, regulace – nízké pH: < 4,9 (4,5);

Clostridium

(4) Hnilobné bakterie

Dominantní v epifytní mikroflóře, rozklad proteinů, vznik

neţádoucích metabolitů (NH4+);

Aerobní aţ anaerobní, regulace: nízké pH;

Pseudomonas, Escherichia

(5) Kvasinky

Konkurenti BMK (cukry fermentují na etanol + CO2);

V malém mnoţství nevadí;

Fakultativní anaerobové;

Regulace – dlouhá generační doba;

Saccharomyces

Regulace procesů v siláţi

(1) Anaerobiosa = nezastupitelná podmínka

(2) Očkování BMK – nutný ale dostatek glycidů

Polyvalentní x monovalentní preparáty

Enterococcus faecium (Lactisil); Lactobacillus

(3) Doplnění dalších mikroorganismů

Především jako zdroj hydrolas

Bacillus, Aspergillus…

(4) Kombinované přípravky

Obsahují enzymovou sloţku (hydrolysa polysacharidů –

např. amylasy) + BMK

(5) Doplnění glycidů

Melasa - dříve nejpouţívanější přísada

Kombinace snadno a obtíţně siláţovatelných rostlin

(6) Sníţení pH (nyní výjimečně)

Přídavek organických či anorganických kyselin nahradí určitý

nedostatek glycidů; (kys. mravenčí, H2SO4….)

88

(7) Regulace neţádoucích mikrobů (nyní výjimečně)

Soli organických kyselin, formaldehyd

Antibiotika (v současnosti jiţ zakázána) –

ČR dříve pouţívala pouze 2: bacitracin, chlortetracyklin

89

XIX. MIKROBIOLOGIE ŢIVOČICHŮ

1. Úvod

2. Mikrobiologie trávicího traktu (TT)

2.1. Hlavní skupiny mikroorganismů TT

2.2. Ekologie mikroorganismů TT

2.3. Bachor

2.4. Význam mikroorganismů TT

2.5. Moţnosti ovlivnění mikroflóry TT

3. Patogenní mikroorganismy a imunita

3.1. Patogenita

XIX.1. Úvod

Kaţdý ţivočich část ţivota v bezmikrobním stavu (děloha, vejce…)

Kontaminace v době porodu (líhnutí)

Rozdělení ţivočichů:

Gnotobiot = mikrobiologicky definovatelný

- bezmikrobní (germ-free, GF) – izolován od vnějšího prostředí, vše sterilní

- mono-, di-, poly-biot = kontaminovaný definovanými mikroorganismy

Konvenční ţivočich = mikrobiologicky nedefinovatelný

SPF (specific pathogen free) = prostý definovaných patogenních mikroorganismů

- nejčastěji odvozen od gnotobiotů

- odvozen od konvenčních ţivočichů

XIX.2. Mikroflora trávicího traktu

TT zpočátku sterilní – kontaminace: porodní cesty, skořápka, vzduch, potrava…

XIX.2.1. Hlavní skupiny mikroorganismů TT

Autochtonní

Dominantní anaerobní mikroorganismy, podstatně méně fakultativních anaerobů

Anaerobní bakterie

Především sacharolytické (škrob, celulosa), pektinolytické - Bacteroides,

Butyrivibrio, Clostridium, Fibrobacter, Peptococcus, Prevotella…

Bakterie mléčného kvašení

90

Výrazně pozitivní skupina: antagonisté neţádoucích mikroorganismů a

procesů

Hlavní představitelé:

- Lactobacillus (homo- i hetero-fermentativní),

L. acidophilus, L. reuteri, L. salivarius

- Enterococcus (homofermentativní)

- Bifidobacterium (60% octová, 40% mléčná),

dominantní u kojených mláďat,

B. bifidum, B. animalis, B. longum, aj.

Enterobakterie

G- bakterie, původně povaţovány za hlavní, ve skutečnosti několik %;

- Escherichia kdysi chápána jako nejdůleţitější rod zvláště v kaudální

části, od patogena aţ mutualista, rozlišení antigeny (K – kapsulární, O

– somatický, H - flagelární); synthesa vitaminů X, průjmy (smrt)

- Dále Klebsiella, Enterobacter

Alochtonní

(1) kontaminující (např. patogenní) – pak i velký počet

(2) přítomny pravidelně (např. kvasinky), ale pak malý počet, často <106/g

XIX.2.2. Ekologie mikroorganismů TT

Od ţaludku (ţlaznatého) počet mikroorganismů kaudálně roste;

aţ 1011

-1012

/g, tvoří aţ 30% chymu

Ústní dutina

Osídlení četné (i 1011

/g)

Diversita velká

Mikroflóra spíše neţádoucí (např. způsobuje kazivost zubů)

Vole

Mikroflóra bohatá (108/g)

Hlavně BMK

Konzervace potravy

Ţaludek

Mikrobně chudý (často < 106)

Regulace přijatých mikroorganismů

91

Tenké střevo

Hlavně enzymy hostitele

V dudodenu počet malý, dále kaudálním směrem roste

Tlusté střevo, výkaly

Hlavní místo výskytu u monogastrů

Počet běţně 1011

/g

Intenzivní mikrobní metabolismus

Problematické vyuţití produktů

XIX.2.3. Bachor

Populaci tvoří: bakterie, houby, protozoa

Hlavní procesy: fermentace a synthesy

Mikroflóra (bakterie)

Bakterie nepostradatelné, jsou schopny nahradit ostatní sloţky

Počet 1011

aţ téměř 1012

v 1 ml

Celulolytické (modifikované máselné kvašení s vysokým podílem kyseliny octové)

Amylolytické – štěpí škrob

Proteolytické – štěpí bílkoviny

Významní představitelé: Bacteroides, Butyvibrio, Clostridium, Fibrobacter,

Methanobacterium, Peptostrptococcus, Prevotella,

Ruminococcus, Selenomonas, Streptococcus

Mykoflóra (anaerobní houby)

Rozklad sloţitých C-látek (celulosy)

Významní představitelé: Neocallimastix, Piromonas

Mikrofauna (protozoa)

Hlavní funkce = synthesa bílkovin (kvalitní ţivočišné)

Částečně i přeměny glycidů

Popsáno cca 50 druhů, u jedince do 10

Celkový počet 103-10

6/ml

Významní představitelé: Entodinium, Diplodinium, Epidinium, Ophryoscolex,

Isotricha

XIX.2.4. Význam mikroorganismů TT

Přeměny potravy (+, -) – vyuţití mikrobních enzymů (hlavně hydrolasy)

Synthesa - aminokyselin, bílkovin, vitamínů (+)

92

Obranné reakce (+)

- Konstitutivní = vrozené, výhodné; vznik během fylogenese, např. řasinkový epitel,

schopnost synthetizovat globuliny, fagocytosa

Stejné u konvenčních a GF

- Adaptivní = mikroflora nezbytná k vyvolání, např. mnoţství sérových

globulinů

U konvenčních vyvinuté dobře proti GF

- Extrakorporální = mikroflora nezbytná k jejich manifestaci, antagonismus

autochtonních k alochtonním;

Kompetice o ţiviny a prostor;

Competitive exclusion (Nurmi koncept);

Vyuţití v probioticích

U GF chybí

Negativní funkce

- intestinální autointoxikace

- kompetice o ţiviny

- indukce karcinogenese

- zhoršení chorob

- zubní kazy

- bacilonosičství

Rozdělení ţivočichů podle významu MTT (modely):

- Kooperační (přeţvýkavci)

Mikroflóra nepostradatelná = zdroj enzymů

Zabezpečení důleţitých funkcí: rozklad potravy, synthesa aminokyselin

a vitaminů

Hlavní místo rozvoje - bachor

- Kompetitivní (masoţravci)

Sloţení potravy + mikrobů + ţivočicha je obdobné – konkurence o ţiviny

V ţaludku „sterilace“, dále působí hlavně enzymy ţivočicha

Mikroorganismy aţ v kaudálních částech – zde i synthesy

- kooperačně-kompetitivní (všeţravci)

I zde redukce v ţaludku a větší rozvoj v tlustém střevě, které je delší,

často výrazné slepé střevo

Přínos mikrobů jen průměrný

Koprofagie (prase, morče, králík, aj.) zlepšuje vyuţití látek z výkalů

93

XIX.2.5. Moţnosti ovlivnění mikroflory TT

Potrava

Při mírných a postupných změnách sloţení potravy je ovlivnění nevýrazné

„Chemická“ aditiva

- Antibiotika (v minulosti velmi frekventovaná – bacitracin, chlortetracyklin,

monensin), nyní silně regulována (pouze definovaná, ne jako růstové

stimulátory) – ovlivnění metabolismu, regulace patogenů (sub- a terapeutické

dávky)

Probiotika

Ţivý potravní mikrobní doplněk s cílem optimalizovat mikroflóru TT

Příklady:Lactobacillus (L. acidophilus), Enterococcus (E. faecium),

Bifidobacterium (B. bifidum, B. animalit, B. longum)

Význam: - redukce patogenů

- omezení karcinogenese

Prebiotika

Potravní doplněk s komponenty nevyuţitelnými makroorganismem (např.

inulin, oligosacharidy), které stimulují rozvoj pozitivní mikroflory

Synbiotika

= kombinace probiotika + prebiotika

„Functional food“

Potraviny obsahující doplňky zvyšující jejich uţitnou hodnotu s malým

přímým nutričním významem

XIX.3. Patogenní mikroorganismy a imunita

XIX.3.1. Patogenita

Schopnost vyvolat onemocnění podmíněno 3 vlastnostmi:

invazivita: schopnost překonat obranné bariery

virulence: schopnost ţít a rozmnoţovat se v organismu hostitele

toxicita: schopnost produkovat exo- nebo endo-toxiny

94

Exotoxin Endotoxin

Difuse z buňky Vazba na buňku

Bílkovina Lipid, sacharid..

Štěpen proteasami Neštěpen

Silně toxický Méně toxický

Silný antigen Slabý antigen

Termolabilní Termostabilní

Selektivní Neselektivní

Denaturace formaldehydem Ne

(vznik anatoxinu)

Patogenita- stanovení:

- ED 50 (Efective Dosis)= dávka antigenu při níţ onemocní (příznaky)

50% populace

- LD 50 (Lethal Dosis) = dávka antigenu při níţ zemře 50% populace

Imunita – schopnost organismu bránit se průniku a rozmnoţování patogena

Imunizace – cílené vyvolání obranných reakcí

Imunita vrozená – podmíněna geneticky (druhová, rasová…)

Imunita získaná = adaptivní (vzniká během ţivota)

- aktivní - synthesa imunoglobulinů hostitelem jako reakce na antigen

(očkování, prodělání choroby)

- pasivní – přijetí hotových protilátek (při vývoji v děloze, mlezivo, séra,

imunoglobuliny)

95

XX. MIKROBIOLOGIE MLÉKA

1. Fáze rozvoje mikroorganismů

2. Vyuţití mikroorganismů (kultury)

XX.1. Fáze rozvoje mikroorganismů

Mléko je obsahem bílkovin a glycidů vhodné prostředí pro mikroorganismy.

Fáze baktericidní

podmínkou nízký počáteční počet mikroorganismů a rychlé ochlazení (< 6°C,

pak počet v této fázi klesá a mléko je dále skladovatelné)

Fáze smíšené mikroflory

rozvoj všech přítomných bakterií; spotřeba O2 a přechod do anaerobiosy;

preference rozvoje BMK

Fáze BMK

intenzivní rozvoj BMK (Lactococcus, Lactobacillus)

pokles pH a výrazné omezení ostatních mikroorganismů

později pokles BMK a po jistou dobu stabilita

Fáze kvasinek

pozvolný rozvoj kvasinek, které odbourávají kyselinu mléčnou – tím vzestup

pH

Fáze hnilobných bakterií

sníţení kyselosti umoţní rozvoj hnilobných bakterií – proteolysa, peptonisace

– tím totální rozklad dokončen

XX.2. Vyuţití mikroorganismů (kultury)

Zpracování mléka je často zaloţeno na vyuţití různých kultur mikroorganismů.

Kysané mléčné výrobky (viz rovněţ cvičení)

- smetanová: Lactococcus lactis

- jogurtová: Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Sc. salivarius ssp. thermophilus

- acidofilová: Lb. acidophilus

- kefírová: Kluyveromyces + Candida + Torulopsis (kvasinky); homo-

i heterofermentativní BMK, Lactobacillus, Lactococcus

Sýrařské kultury

Směsné kultury BMK a dalších; např. mazové bakterie, proteolytické b.,

propionové b., Penicillium, aj.