Metodi in Neuroscienze II

In base a ciò che ci si prefigge di studiare diventa molto importante la scelta del

preparato (modello animale e/o cellulare) e del suo grado di complessità

Cervello isolato

Cervello intero isolato di porcellino d’india

Vantaggi rispetto alla slice: - Circuiti corticali interamente preservati Svantaggi: - possibilità di registrare artefatti

- registrazioni intra- ed extracellulari ma solo in current-clamp

Studi effettuati: - anatomici - immunoistochimici - vascolari - farmacologici - elettrofisiologici

50 µm

Probe al silicio a 16 canali Probe al silicio a 32 canali

750 µm 1550 µm

Esempi di probes a multielettrodi utilizzati per la registrazione contemporanea da diversi strati di tessuto

Registrazione dalla corteccia con un probe multielectrode

SlicesSezione di cervelletto

Preparazione di una slice di ippocampo

Registrazioni Extra- ed Intracellulari in una Slice di Ippocampo

stimolo stimolo

elettrodo di registr. intracellulare

elettrodo di registr. extracellulare

Whole-cell Patch Clamp in slice o fettina di tessuto sottile

Neuroni isolati• Dissociazione acuta di neuroni da tessuto adulto o embrionale

• Colture primarie (da embrione)

Vantaggi rispetto alla slice:Soprattuto per indagini elettrofisiologiche

- migliori voltage- e space-clamp;

- migliore farmacologia;

- possibilità di mantenere le cellule in coltura per giorni;

Linee cellulari stabilizzate di origine neuronale e non

Biologia MolecolareClonaggio ed espressione di geniMutagenesi sito-diretta

Biochimica

Elettrofisiologia

vantaggi

Plasmide +cDNA

NG108-15SHSY-5YHEK

Transfez.

Biologia Molecolare

Elettofisiologia

Clone esprimente stabilmente il gene transfettato

whole-cell

&single-chann.

Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari

Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

Viene fatta “esprimere” laproteina con una catena laterale alterata

Gene (DNA)

Ipotesi circa una importante catena laterale Vengono mutati i codons desiderati

Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico

misura

RNA o cDNA

Lab 1 Lab2 Lab 3 Lab 4

 Linee cellulariSlices

dissociazione acutaColture primarie

Patch-clampLinee cellulariPatch-clamp